Summary
Vi etablere en kirurgiske teknikken for en i vivo enkelt leveren lobe perfusjon-modell i rotte som en forutsetning for å ytterligere studere i vivo delvis leveren engineering i fremtiden.
Abstract
Orgel engineering er en ny strategi å generere leveren orgel erstatter som potensielt kan brukes i transplantasjon. Nylig i vivo leveren engineering, inkludert i vivo organ decellularization etterfulgt av repopulation har dukket opp som en lovende tilnærming over ex vivo leveren engineering. Postoperative overlevelse var imidlertid ikke oppnådd. Målet med denne studien er å utvikle romanen kirurgisk teknikk i vivo selektiv leveren lobe perfusjon i rotter som en forutsetning for i vivo leveren engineering. Vi generere en krets bypass bare gjennom den venstre lateral lobe. Deretter er det venstre lateral lobe parfyme med heparinized saltvann. Eksperimentet utføres med 4 grupper (n = 3 rotter per gruppe) basert på ulike perfusjon ganger 20 min, 2 h, 3t og 4 h. overlevelse, samt macroscopically synlig endring av farge og histologisk bestemt fravær av blodceller i den portalen triad og sinusoids, tas som en indikator for et vellykket modell etablissement. Etter selektiv perfusjon av den venstre lateral lobe ser vi at den venstre lateral lobe, faktisk slått fra rød til svak gul. En histologiske vurdering, ingen blod celler vises i grenen av portalen blodåre, sentrale venen og sinusoids. Venstre lateral lobe rødt etter gjenåpningen blokkerte fartøyene. 12/12 rotter overlevde prosedyren for mer enn en uke. Vi er først til å rapportere en kirurgisk modell for i vivo enkelt leveren lobe perfusjon med en lang overlevelse på mer enn én uke. I motsetning til tidligere publiserte rapporten, viktigste fordelen av teknikken presenteres her er perfusjon av 70% av leveren er bevart gjennom hele prosedyren. Opprettelsen av denne teknikken gir et fundament i vivo delvis leveren Engineering i rotter, inkludert decellularization og recellularization.
Introduction
Indikasjoner for organtransplantasjon utvide stadig. I kontrast, faller orgel donasjon priser og kvaliteten organer, fører til en økende etterspørsel etter grafts. Antall kandidater til ventelisten levertransplantasjon fortsatte å øke (f.eksi USA, 11,340 pasienter ble lagt i 2016, sammenlignet med 10,636 i 2015)1. Til tross for betydelig innsats oppfyller antall tilgjengelige organer ikke kliniske behov. På grunn av den økte forekomsten av leversykdom, mange pasienter med sluttstadiet leversykdommer dø på venteliste før en donor organ transplantasjon blir tilgjengelig. For å møte den enorme etterspørselen etter giver leveren grafts, forfulgt alternative tilnærminger bruker leveren vev engineering prinsipper blir aktivt2. I dag, kunne en nyutviklet biologiske teknikk av leveren engineering potensielt overvinne denne mangel.
Leveren engineering består av to trinn: generering av en acellular skafottet, etterfulgt av en repopulation i stillaset. For å få et biologisk acellular leveren stillas, er explanted leveren perfused via vaskulære system med ionic eller ikke-ionisert vaskemidler, som kan fjerne cellulære materialet fra leveren. I de fleste tidligere studier, ble en biologisk acellular leveren stillaset oppnådd av perfusjon av leveren med en kombinasjon av natrium dodecyl sulfate og TritonX100. Som et resultat ble alle celler fjernet, mens strukturen til den ekstracellulære matrisen ble opprettholdt. Orgel stillasene var reseeded med eldre celler, hepatocellulært, samt endothelial cellelinjer og primære hepatocytter med eller uten samtidig bruk av endotelceller eller mesenchymal stamceller (MSC). De fleste forskere fokus på ex vivo leveren engineering3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Men i de fleste tidligere studier, ble bare små biter av nytt stillaset kuber transplantert inn i forskjellige heterotopic implantasjon nettsteder. I et par studier, ble delvis nytt stillaser transplantert som en ekstra pode. Maksimal rapporterte overlevelse tidspunktet var imidlertid bare 72 h8,14. Så vidt vi vet, har ennå ikke orthotopic transplantasjon av en repopulated full leveren pode er utført eller publisert om. Langsiktig funksjonen og transplantasjon utvikling organer er fortsatt i sin barndom. Derfor er en alternativ tilnærming til ex vivo leveren engineering nødvendig.
I vivo leveren ingeniørvitenskap kan representere et alternativ å studere hepatic repopulation under fysiologiske forhold. Fordelene i vivo leveren engineering sammenlignet ex vivo leveren engineering er mange. I vivo nytt delvis leveren stillaset er utsatt for fysiologiske blodperfusjon med riktig temperatur, tilstrekkelig oksygen, næringsstoffer og vekstfaktorer i motsetning til ex vivo perfusjon med kunstig kultur medium. Videre opprettholder gjenværende delvis normal leveren funksjonen hepatic, hovedsakelig slik at langsiktig overlevelse. Siden en implantert ex vivo konstruert leveren pode er fortsatt i stand til å opprettholde den langsiktige overlevelsen av forsøksdyr av sin leveren funksjon8, vi ser at i vivo delvis lever engineeringwould til slutt bli en lovende modell å lære om utviklingen av konstruert lever med lengre overlevelse observasjoner enn ex vivo.
Nylig presentert en forskergruppe (Pan og kolleger), for første gang, teknikk i vivo leveren engineering15. De oppnådde den isolerte perfusjonen av den høyre dårligere leveren flik i levende rotter tross anatomiske og tekniske utfordringer. De rapporterte første intraoperativ resultatene i vivo repopulation bruker en rotte primære hepatocyte cellen linje. Imidlertid kirurgisk perfusjon i vivo modell av Pan et al. har ulemper. De oppnådde enkelt leveren lobe perfusjon i rotter på bekostning av fullstendig blokkere portalen blodåre og mindreverdig vena cava, som kan forårsake alvorlig skade på dyret. Eksperimentell rottene ble ofret etter bare 6 timer intraoperativ observasjon. Derfor trenger i vivo leveren lobe perfusjon teknikken ytterligere forbedring å oppnå postoperativ overlevelse.
Vi utviklet en roman overlevelse modell for i vivo leveren lobe perfusjon, basert på tidligere studier av hepatic anatomi av rotte16, portalen blodåre cannulation teknikken for hemodynamic overvåking i mus17, og lever bioteknologi 18 , 19. de viktigste trinnene fremgangsmåten er illustrert i figur 1A - 1E.
Denne teknikken er egnet for de som vil bruke dette eksperimentelle i vivo perfusjonsmåler modell for grunnleggende forskning på delvis orgel behandling av infusjon med narkotika, i vivo decellularization som en kjemisk resection for orgel sykdommer (f.eks , leverkreft), i vivo cellekultur i en decellularized matrise sammenligne ex vivo todimensjonal og tredimensjonale celle kultur, systemer,20,,21,,22,,23 , 24 , 25 , 26og i vivo leveren engineering ved decellularization og repopulation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Boliger og alle prosedyrer utført var i samsvar med tysk dyrs rettigheter lovgivning. Alle gasbind, dekker klær og Kirurgiske instrumenter er autoklaveres og forberedt før operasjonen. Alle prosedyrer blir utført under sterile forhold.
1. forberedelse av rotte til den kirurgiske prosedyren
- Plasser rotta i en induksjon kammer og bedøve rotte med 4% fordampede isoflurane og 100% oksygen på 0,5 L/min i ca 3 min, til rotta er helt anesthetized.
- Ta rotta ut av induksjon kammeret og måle sin kroppsvekt.
- Barbere pelsen til kirurgisk regionen på magen.
- Plass dyr bak i det isoflurane kammeret for en ekstra 2 minutter å utdype anestesi.
- Sett rotta på operasjonsbordet i supine posisjon.
- Fastsette anestesi masken til munnen regionen rotta og holde dyr anesthetized med en kontinuerlig gasstrømmen 2% fordampede isoflurane og 100% oksygen på en strømningshastighet på 0,5 L/min.
- Fastsette lemmer med stykker bånd.
- Bruke vet salve på begge øynene å hindre tørrhet.
- Administrere buprenorfin 0,05 mg/kg subcutaneously, å lindre smerte i operasjonen perioden.
- Desinfiser kirurgiske feltet av magen med 3 runder av jod skjr etterfulgt av 2 runder med 70% alkohol.
- Sted sterilisert gasbind rundt området der i snitt vil bli gjort bare la feltet operasjon i magen utsatt.
- Fortsette å utføre operasjonen når den toe-klype uttak refleks av rotte er fraværende.
2. laparotomy av rotte
- Gjøre en tverrgående abdominal hud og muskel snitt ved hjelp av saks og en elektrisk coagulator.
- Fastsette og dra xiphoid prosessen mot hodet med en 4-0 polypropylen Sutur.
Merk: Vær oppmerksom løft xiphoid prosessen loddrett for å bedre utsett leveren, men fortsette med forsiktighet for å unngå alvorlig åndedretts begrensning og kvelning. - Åpne bukhulen ved å trekke begge sider av abdominal veggene mot hodet med to sirkulerer kroker å avsløre leveren.
- Dekke tolvfingertarmen og tynntarmen i bukhulen med en fuktet gasbind å unngå tørking.
- Løft venstre og høyre median lobes ved hjelp av en fuktet gasbind og holde dem mot thorax å bedre avsløre hilum i leveren.
- Sett rotta under en stereomicroscope (8 X forstørrelse).
- Slipp noen varmt saltvann i magen og på overflaten av leveren og tarmen hver flere minutter, for å hindre tørking under hele prosedyren.
3. etablering av en Bypass passasje i den venstre Lateral Lobe
- Dissekere venstre portalen blodåre, og ligate det med en 6-0 silke Sutur på basen (figur 2A).
- Blokkere venstre hepatic arterien, den venstre galle duct venstre median portalen blodåre, venstre median hepatic arterien og det venstre median galle duct mikro festing å hindre en strøm av perfusate det venstre median lobe (figur 2B).
- Skill den venstre lateral lobe av klipping av omkringliggende leddbånd i lobe med mikro saks.
- Blokkere venstre lateral hepatic venen ved clamping ved foten av den venstre lateral lobe mikro festing (figur 2C).
Merk: Pass på ikke å klemme venstre portalen blodåre samt ved en feil. - Bruk mygg klemmer å holde ligatur av venstre portalen blodåre og holde venen med riktig spenning for senere cannulation.
- Nøye gjøre et snitt i foran veggen av venstre portalen blodåre ved punktering det med en 24-G p-bolig kateter ( figur 3A).
Merk: Hvis du vil opprette en bypass, vaskulære tilgangspunkter på venstre portalen blodåre og venstre hepatic venen er nødvendig. For dette trinnet, er det foretrukket å opprette vaskulær tilgang ved punktering fartøyene med en nål i stedet for å lage en større snitt ved hjelp av saks. Dette reduserer risikoen for blødning og senere stenose. - Ta ut kateter og ta nålen av kateter for å få en p-free 24-G kateter.
- Koble kateter slik perfusjon av som det andre endepunktet kobles til en 20 mL sprøyte med 15 mL 40 U/mL heparinized saltvann på en perfusjonsmåling pumpe.
- Slå på pumpen for perfusing røret for å utvise luften ut av røret og kateter p-free.
- Slå av perfusjon pumpen.
- Igjen, inn i p-free kateter den venstre portal blodåre via punktert innsnitt på venen (figur 3B).
Merk: På grunn av det er svært begrenset plass for å feste kateter, det er ikke faste på dette punktet. Derfor kirurgen bør bruke omsorg å unngå forskyvning av cannulated kateter. - Nøye gjør en snitt på marginen av regionen eksponert i venstre lateral hepatic venen ved punktering det med en 22 - eller 24-G p-bolig kateter (Figur 3 c).
Merk: Det anbefales at kateter være litt mindre enn fartøyet. - Ta ut kateter og ta nålen av kateter for å få en p-free 22-G kateter.
- Slå på perfusjon pumpen å perfuse heparinized saltvann i den venstre lateral lobe via 24-G cannulated p-free kateter av venstre portalen blodåre på en strømningshastighet på 0,5 mL/min.
- Bruke tørr gasbind for å absorbere ut flytende avfall væske rundt såret området venstre lateral hepatic venen.
- Cannulate den venstre lateral hepatic blodåre via punktert innsnitt i venen med 22-G p-free kateter, generere en væske utløp for å minimere intra-abdominal forurensning (figur 3D).
Merk: Det er teknisk vanskelig å fastsette den cannulated kateter til leveren lobe. Kirurgen bør derfor ta hensyn til unngå forskyvning av kateter. Alternativt, uten cannulation i venstre lateral hepatic venen med et kateter, avfall væske kan også bli absorbert i regionen snitt i venen bare med en tørr gasbind. - Holde perfusing den venstre lateral flik med heparinized saltvann i rundt 20 min (gruppe 1) og så bare med saltvann for 2 h og 3t 4 h (gruppe 2, gruppe 3 og gruppe 4, henholdsvis).
- Slå av pumpen for å stoppe perfusjonen.
4. fysiologiske Reperfusion av den venstre Lateral Lobe
- Ta av både katetre fra venstre portalen blodåre og venstre lateral hepatic venen.
- Stenge incision over venstre portalen blodåre med en 11-0 polyamid Sutur.
- Stenge incision i venstre lateral hepatic venen med en 11-0 polyamid Sutur også.
- Løsne venstre lateral hepatic venen.
- Løsne den venstre median portalen blodåre, venstre galle duct og venstre hepatic subclavia.
- Avskåret ligatur på venstre portalen blodåre åpne venen.
5. nedleggelsen av bukveggen
- Nærheten muskel laget av bukveggen avbrutt suturing med en 4-0 absorberbare polyglactin 910 Sutur.
- Nærheten huden laget av bukveggen avbrutt suturing med en 4-0 absorberbare polydioxanone Sutur.
- Etter stengetid magen, Desinfiser den hud snittet med 70% alkohol.
6. postoperativ behandling av rotte
- Plassere dyret på en oppvarming pad for resuscitation i ca 10 min og deretter sette det inn i en ny bur.
- Administrere buprenorfin 0,05 mg/kg subcutaneously 2 x en dag for en rad 3 d postoperatively å slippe smerte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tolv mann (alderen 12 - 13 uker) Lewis rotter ble brukt til å vurdere effekten av selektiv leveren lobe perfusjon. Eksperimentet ble gjennomført i fire grupper (n = 3 rotter per gruppe). Bruker ulike perfusjon perioder med 20 minutter, oppnådd 2 timer, 3 timer og timer, følge fremgangsmåten beskrevet ovenfor, vi i vivo enkelt lobe perfusjon.
I Vivo Perfusjon av den venstre Lateral Lobe:
Nøyaktig anatomiske identifikasjon av venstre portalen blodåre venstre lateral hepatic venen og vellykket venstre portalen blodåre og venstre lateral hepatic blodåre cannulation kan bekreftes etter perfusjon med heparinized saltvann. Den første indikatoren vellykket identifikasjon og cannulation var observasjon at blod blandet med perfusate var strømmer ut av den venstre lateral lobe via væske uttaket (figur 4A). Vellykket kirurgisk perfusjonsmåler modell ble ytterligere bekreftet ved å observere endringen av den venstre lateral lobe farge etter perfusjon med heparinized saltvann. Fargen på den venstre lateral lobe endret fra rød til svak gul, indikerer fjerning av blod fra den venstre lateral lobe. For å bekrefte vedlikehold av fysiologiske perfusjon av gjenværende lobes, ble fargen på gjenværende leveren lobes stadig observert under perfusjon av den venstre lateral lobe. Den riktige perfusjonen av den venstre lateral lobe resulterte i flik snu svak gul mens resterende leveren lobes opprettholdt sin lyse røde farge gjennom hele prosessen (figur 4B).
Fysiologiske Reperfusion av den venstre Lateral Lobe:
For å vurdere patency av cannulated fartøyene etter lukke snittene av fartøyene og åpne fartøyene, ble fargeendring av den venstre lateral lobe observert. Noen røde flekker vist på overflaten av den perfused svak gul venstre lateral lobe etter gjenåpningen venstre lateral hepatic blodåre, som angir første retrograd perfusjon i venstre lateral flik (figur 5A). Overflaten av de målrettede lobe senere viste enda røde flekker etter utgivelsen av mikro klemmer av venstre hepatic subclavia igjen galle duct og forlot median portalen blodåre, noe videre fysiologiske perfusjon av den venstre lateral lobe via den gjenåpnet fartøy (figur 5B). Overflaten av de målrettede leveren lobe slått mørkerøde etter gjenåpningen venstre portalen blodåre, bekrefter at de målrettede leveren lobe gjenvant sin full fysiologiske perfusjon via venstre portalen blodåre (figur 5C).
Histology av Perfused venstre Lateral Lobe:
Etter endt heparinized saltvann eller saltholdig perfusjon, ble den selektivt perfused venstre lateral lobe (som eksperimentell) og den normale dårligere caudate flik (som kontroll) kappet og fast med formaldehyd og deretter utsatt for en histologiske undersøkelse (H & Estaining). I venstre lateral flik er det ingen åpenbare blod celler vises i grenen av portalen blodåre, sinusoids og sentrale blodåre. Som forventet, var røde celler synlige i grenen av hepatic arterien (figur 6A og 6 C). I normal dårligere caudate flik (som kontroll), ble blod celler betydelig observert i grenen av portalen blodåre, sinusoids og sentrale venen (figur 6B og 6 D).
Overlevelse:
Tolv av tolv eksperimentelle rotter resulterte i en 1-week overlevelse på 100%. Men 3 eksperimentelle rotter som gjennomgikk 4 timer av perfusjon LED midlertidig av diaré og utslipp blodig fra øynene på andre eller tredje dag postoperatively.
Figur 1 : Av den kirurgisk i vivo enkelt leveren lobe perfusjonsmåler modell. (A) Dette er en skjematisk tegning av rotte leveren anatomien. (B) dette panelet viser blokkeringen av venstre portalen blodåre, venstre hepatic arterien, den venstre galle duct, venstre median portalen blodåre og venstre lateral hepatic venen. (C) dette panelet viser cannulation venstre portalen blodåre og venstre lateral hepatic venen med katetre for væske innløp og utløp. (D) dette panelet viser perfusjon av den venstre lateral flik med heparinized saltvann av en perfusjonsmåling pumpe. (E) dette panelet viser fysiologiske reperfusion av den venstre lateral lobe etter gjenåpningen blokkerte fartøyene til lobe. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Intraoperativ bilder viser blokkeringen av fartøyene leverer og drenering den venstre lateral lobe. (A) dette panelet viser ligation av venstre portalen blodåre. (B) dette panelet viser blokkeringen av venstre hepatic arterien, venstre gallekanalen og venstre median portalen blodåre/hepatisk arterien/galle duct mikro festing. (C) dette panelet viser blokkeringen av venstre lateral hepatic venen mikro festing (hvit pil). Skala barer er 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Intraoperativ bilder viser omkjøringsvei sirkulasjon gjennom den venstre lateral lobe. (A) dette panelet viser innsnitt i venstre portalen blodåre (hvit pil) ved punktering det med en 24-G p-bolig kateter. (B) dette panelet viser cannulation av venstre portalen blodåre for en væske vik med en 24-G p-free kateter (hvit pil). (C) dette panelet viser innsnitt i venstre lateral hepatic venen (hvit pil) av punktering det med en 22-G p-bolig kateter. (D) dette panelet viser cannulation i venstre lateral hepatic venen for en væske stikkontakt med en 22-G p-free kateter (hvit pil). Skala barer er 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Intraoperativ bilder viser perfusjon av den venstre lateral lobe. (A) dette panelet viser perfusate strømmer inn i den venstre lateral lobe via innløp (gul kateter) og strømmer ut av den venstre lateral lobe via utgangen (blå kateter). Den venstre lateral lobe var faktisk selektivt parfyme, som vist av farge endring av lobe (hvit pil). (B) Merk fargeendring av venstre lateral lobe til svak gul etter perfusjon med heparinized saltvann, mens de resterende leveren flikene være røde (hvite piler). Skala barer er 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Fysiologiske reperfusion av den venstre lateral lobe. (A) dette panelet viser retrograd perfusjon av den venstre lateral lobe etter gjenåpningen venstre lateral hepatic venen (hvit pil). (B) dette panelet viser fysiologiske reperfusion venstre lateral lobe (hvit pil) etter frigir mikro klemmer på venstre median portalen blodåre og venstre hepatic subclavia. (C) dette panelet viser komplett reperfusion av den venstre lateral lobe (rød pil) etter gjenåpningen venstre portalen blodåre og ischemia av den venstre median lobe (blå pil). Skala barer er 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Histologiske vurderinger (H & E farging). (A og C) disse panelene viser en histologiske vurdering av den heparin-saltholdig-perfused venstre lateral lobe (eksperimentell lobe) viser fraværet av blodceller i (A) portalen blodåre og sinusoids, og (C) sentrale venen. (A) men røde celler er synlig i hepatic arterien (svart pil) som forventet. (B og D) disse panelene viser en histologiske vurdering av den normale dårligere caudate lobe (kontroll) avsløre tilstedeværelsen av blodceller i alle vaskulære strukturer: (B) portalen blodåre, hepatic arterien og sinusoids (svarte piler), og (D) sentrale vene (svart pil). Skala barer er 250 µm.
| Parametere | Resultater | |
| Forskningsgruppen | Pan et al 2016 [15] | Egen gruppe |
| I vivo | ja | ja |
| Målet leveren flik | Høyre dårligere flik
|
Venstre lateral flik
|
| Blokkering av vena cava og viktigste portalen blodåre | ja
|
nei
|
| Ischemia av gjenværende flikene | ja | Bare venstre median flik |
| Cannulation vena cava | ja | nei |
| Cannulation av viktigste portalen blodåre | ja | nei |
| Portal hypertensjon | ja | nei |
| 1 uke overlevelse | Ofret intraoperatively | 100% |
Tabell 1. Sammenligning mellom ulike modeller av i vivo lever engineering. Denne tabellen viser viktige forskjeller i de to modell bedriftene mellom Pan et al. 15 og vår forskningsgruppe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved å blokkere og cannulating venstre portalen blodåre med et kateter som en flytende vik og venstre lateral hepatic venen med en annen kateter som en flytende utløp, generert vi har en i vivo væske omkjøringsvei i den venstre lateral lobe, indikerer at men teknikken er svært utfordrende den lille størrelsen på skipene i cannulation og en høy risiko for forårsaker blødninger, er det mulig. Selv rotter gjennomgår en lang Perfusjonsperiode 4 timer overlevd minst 1 uke, viser at rottene kunne tolerere denne kirurgiske prosedyren.
I avsnittet beskriver vi de tre teknisk vanskeligste og kritisk trinnene og vellykket mestrer. Først under separasjon og ligation av venstre portalen blodåre, på grunn av tett romlige forhold målrettet portalen blodåre med omkringliggende leveren parenchyma, har isolering av fartøyet høy risiko for forårsaker blødninger. Vi anbefaler å bruke mikro tang i stedet for saks for å skille venstre portalen blodåre, ved nøye rive i stykker i tilkoblede avascular vevet rundt venstre portalen blodåre. For det andre, når det gjelder snitt foran veggen av venstre portalen blodåre, en oversize snitt foran veggen av venstre portalen blodåre kan øke vanskeligheten av snitt reparasjon og sjansen for forårsaker stenose etter vaskulær anastomose. Vi anbefaler at du bruker en nål-bolig kateter i stedet for saks for å lage en riktig størrelse snitt. For det tredje angående blokkeringen av venstre lateral hepatic blodåre, hvis utsatt regionen venstre lateral hepatic venen blokkeres feil, vil det ikke være tilstrekkelig eksponert plass på venstre lateral hepatic venen for senere cannulation. Vi foreslår klemmekraften skal utføres nær den venstre median lobe ikke i regionen eksponert i venstre lateral hepatic venen.
Vi sammenligner de to modellene av selektiv i vivo leveren perfusjon mellom Pan et al. 15 og vår (tabell 1). Først anses valg av de målrettede leveren lobe en mest avgjørende skritt for modell etablering. Vi valgte en ganske isolert lobe, den venstre lateral lobe, som målrettet lobe for i vivo kirurgisk perfusjonsmåler modell etablissement. Derimot valgt forskningsgruppen av Pan rett dårligere lobe for model14. Manglene ved å velge den høyre dårligere lobe er som følgende: for det første de måtte inngå kompromisser ved å fullstendig blokkere og cannulating vena cava for en væske utløp, som kan negativt påvirke blodsirkulasjonen til dyret. Dernest måtte de blokkere og cannulate viktigste portalen blodåre for en vik, som forårsaket iskemi gjenværende leveren fliker og portal hypertensjon. Idet sammenlignet med lobe målrettet her, den venstre lateral lobe, vi blokkert og cannulated venstre lateral hepatic blodåre i stedet for vena cava for en væske stikkontakt. Vi utviklet en flytende vik ved å velge venstre portalen blodåre, som har en ganske stor diameter, tilrettelegge disseksjon, blokkering, og cannulation. Derfor unngås direkte blokkerer blodstrømmen til vena cava og viktigste portalen blodåre i modellen presenteres her, som er avgjørende for overlevelse av rotte.
Til tross for det store potensialet for i vivo leveren lobe perfusjon har denne teknikken noen begrensninger. Først er iskemi av den venstre mediale lobe uunngåelig, på grunn av blokkeringen av venstre median portalen blodåre under prosessen. For det andre, basert på midlertidig blokkering ved foten av den venstre lateral lobe ved hjelp av mikro klemmer, dette kan føre til skade i leveren parenchyma rundt lobar base og uunngåelig føre til en liten lekkasje i perfusjon med heparinized saltvann. Tre eksperimentelle rotter som ble utsatt for en Perfusjonsperiode 4 timer LED midlertidig diaré og blodig okulær utslipp, antyder at 4 timer kan være det maksimum Perfusjonsperiode for rotte uten lidelse mer komplikasjoner. Til vår kunnskap kreves det minst 3 timer for decellularization en hel rotte leveren ex vivo18. Derfor ville 4 timer med perfusjon tid vi skal oppnå være tilstrekkelig for ytterligere leveren lobe decellularization, som er en forutsetning for leveren engineering av cellen repopulation i en leveren stillaset.
I fremtiden, kan denne teknikken for en i vivo perfusjonsmåler modell potensielt brukes i eksperimentell forskning for delvis orgel behandling av infusjon med narkotika, i i vivo delvis organ decellularization som kjemisk resection, som en " i vivo celle kultur-systemet ", og, kanskje viktigst, in vivo delvis orgel engineering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne gjerne takke Jens Geiling fra Institutt for anatomi I Jena universitetssykehus, for å produsere skjematisk tegninger av rotte leveren anatomi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusion Pump | |||
| Perfusor VI | B. Braun, Melsungen | ||
| Catheter | |||
| Versatus-W Catheter | Terumo | SR+DU2419PX | 24G, 0.74×19mm |
| Versatus-W Catheter | Terumo | SR+DU2225PX | 22G, 0.9×25mm |
| micro surgical instrument | |||
| micro scissors | F·S·L | No. 14058-09 | |
| micro serrefine | F·S·L | No.18055-05 | |
| Micro clamps applicator | F·S·L | No. 18057-14 | |
| Straight micro forceps | F·S·L | No. 00632-11 | |
| Curved micro forceps | F·S·L | No. 00649-11 | |
| micro needle-holder | F·S·L | No. 12061-01 | |
| general surgical instruments | |||
| standard sissors | F·S·L | ||
| mosquito clamp | F·S·L | ||
| serrated forcep | F·S·L | ||
| teethed forcep | F·S·L | ||
| needle-holder | F·S·L | ||
| suture | |||
| 4-0 prolene | ethicon | ||
| 4-0 ETHICON*II | ethicon | ||
| 6-0 silk | ethicon | ||
| 11-0 polyamide | ethicon |
References
- Kim, W. R., et al. OPTN / SRTR 2016 Annula Data Report: Liver. American Journal of Transplantation. Suppl. 1, 172-253 (2018).
- Palakkan, A. A., Hay, D. C., Anil Kumar, P. R., Kumary, T. V., Ross, J. A. Liver tissue engineering and cell sources: issues and challenges. Liver International. 33, 666-676 (2013).
- Hynes, R. O. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326, 1216-1219 (2009).
- Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation. Nature Methods. 2, 119-125 (2005).
- Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47, 1394-1400 (2008).
- Ren, H., et al. Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold. Liver International. 33, 448-458 (2013).
- Yagi, H., et al. Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach. Cell Transplantation. 22, 231-242 (2013).
- Jiang, W. C., et al. Cryo-chemical decellularization of the whole liver for mesenchymal stem cells-based functional hepatic tissue engineering. Biomaterials. 35, 3607-3617 (2014).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).
- Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53, 604-617 (2011).
- Bruinsma, B. G., Kim, Y., Berendsen, T. A., Yarmush, M. L., Uygun, B. E. Layer-by-layer heparinization of decellularized liver matrices to reduce thrombogenicity of tissue engineered grafts. Journal of Clinical and Translational Research. 1 (1), (2015).
- Park, K. M., et al. Decellularized Liver Extracellular Matrix as Promising Tools for Transplantable Bioengineered Liver Promotes Hepatic Lineage Commitments of Induced Pluripotent Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 22, 449-460 (2014).
- Ko, I. K., et al. Bioengineered transplantable porcine livers with re-endothelialized vasculature. Biomaterials. 40, 72-79 (2015).
- Bao, J., et al. Construction of a portal implantable functional tissue-engineered liver using perfusion-decellularized matrix and hepatocytes in rats. Cell Transplantation. 20, 753-766 (2011).
- Pan, J., et al. In-vivo organ engineering: Perfusion of hepatocytes in a single liver lobe scaffold of living rats. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 80, 124-131 (2016).
- Madrahimov, N., et al. Marginal hepatectomy in the rat: from anatomy to surgery. Annals of Surgery. 244, 89-98 (2006).
- Mussbach, F., Settmacher, U., Dirsch, O., Dahmen, U. Bioengineered Livers: A New Tool for Drug Testing and a Promising Solution to Meet the Growing Demand for Donor Organs. European Surgical Research. 57, 224-239 (2016).
- Mussbach, F., Settmacher, U., Dirsch, O., Dahmen, U. Liver engineering as a new source of donor organs: A systematic review. Der Chirurg. 87, 504-513 (2016).
- Xie, C., et al. Monitoring of systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice. Journal of Visualized Experiments. (92), e51955 (2014).
- Zhou, P., et al. Decellularization and Recellularization of Rat Livers With Hepatocytes and Endothelial Progenitor Cells. Artificial Organs. 40, E25-E38 (2016).
- Yagi, H., et al. Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach. Cell Transplantation. 22, 231-242 (2013).
- Otsuka, H., Sasaki, K., Okimura, S., Nagamura, M., Nakasone, Y. Micropatterned co-culture of hepatocyte spheroids layered on non-parenchymal cells to understand heterotypic cellular interactions. Science and Technology of Advanced Materials. 14, 065003 (2013).
- Bale, S. S., et al. Long-term coculture strategies for primary hepatocytes and liver sinusoidal endothelial cells. Tissue Engineering Part C: Methods. 21, 413-422 (2015).
- Wu, Q., et al. Optimizing perfusion-decellularization methods of porcine livers for clinical-scale whole-organ bioengineering. BioMed Research International. , 785474 (2015).
- Barakat, O., et al. Use of decellularized porcine liver for engineering humanized liver organ. Journal of Surgical Research. 173 (1), e11-e25 (2012).
- Navarro-Tableros, V., et al. Recellularization of rat liver scaffolds by human liver stem cells. Tissue Engineering Part A. 21 (11-12), 1929-1939 (2015).
