Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para estabelecer uma indução de perda auditiva condutora replicável por meio de punção cirúrgica da membrana de tympanic e verificação por visualização de otoscópio e avaliação comportamental por verino de gonorreia.
Abstract
A perda auditiva condutiva (CHL) é um comprometimento auditivo prevalente em seres humanos. O objetivo do protocolo é descrever um procedimento cirúrgico simples para induzir CHL em roedores. O protocolo demonstra CHL por punção de membrana tympanic. A verificação da cirurgia de CHL foi por exame de otoscópio e avaliação comportamental por resposta ao vermão, tanto replicável quanto confiável, e são métodos simples para demonstrar que a perda auditiva ocorreu. O procedimento simples de CHL é vantajoso devido à sua reprodutibilidade e flexibilidade a diferentes atividades na pesquisa de perda auditiva. As limitações da indução de LCH por abordagem cirúrgica estão associadas à curva de aprendizagem para realizar o procedimento cirúrgico e a confiança no exame audiológico. Induzir uma deficiência auditiva por CHL permite que um estude prontamente as manifestações neurais e os resultados comportamentais da perda auditiva.
Introduction
A prevalência da perda auditiva em crianças e adultos é de aproximadamente 19,5%1 e 15,2%2, respectivamente. No entanto, aproximadamente 39,3% de todos os recém-nascidos com triagem auditiva anormal não recebem tratamento corretivo conforme relatado pelo Centers for Disease Control3. A perda auditiva é uma condição amplamente estudada, e o roedor é um modelo robusto para estudar distúrbios normais relacionados à audição e audição4,5,6,7,8,9 ,10,11,12,13,14,15. Distúrbios auditivos como perda auditiva condutiva (LE) levam a um aumento da depressão sináptica de curto prazo no córtex auditivo4,o que resulta em inclinações psicométricas mais rasas associadas a limiares de detecção de modulação de frequência 5. Modelos de perda auditiva condutora por remoção/deslocamento cirúrgico do malleus, punção da membrana tympanic (TM) ou tampão de ouvido são facilmente empregados e permitem a rápida indução do modelo de perda auditiva5,14 ,15,16,17,18. O objetivo do protocolo e método atual é demonstrar um modelo CHL simples e reproduzível em roedores.
O protocolo atual é barato (US$ 300 com todas as ferramentas) e prontamente alterado para diferentes atividades de pesquisa. O rato teve avaliações detalhadas da anatomia do ouvido médio19,20,21,22,23, abordagens cirúrgicas24, modelos em otitis media25, 26,27 e regeneração de perfuração TM16,17,18,28,29,30,tornando-se um modelo ideal para estudar perda auditiva. Aqui, um procedimento simples da indução de CHL é descrito com verificação pelo otoscope e pela avaliação com resposta do startle do aplauso no rato, que então pode ser usado para explorar sequelas adicionais da perda de audição. O procedimento de LE é induzido pela punção cirúrgica do TM. A verificação do procedimento de CHL é realizada por visualização de otoscópio para determinar a ausência do TM. A avaliação comportamental é realizada por um alto nível de pressão sonora (DB) (SPL) palmas. Este método foi aplicado previamente em uma variedade de roedores. É fácil de replicar, produz diferenças psicométricas robustas e mudanças nas respostas fisiológicas neurais4,5,16,17,18.
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Protocol
O presente estudo e procedimentos foram aprovados pelos comitês de ética em pesquisa animal da Universidade da Cidade de Hong Kong, da Universidade de Hong Kong e do Departamento de Saúde da Região Administrativa Especial de Hong Kong.
1. Animais
- Use ratos Sprague-Dawley (SD) de dois meses (N = 90, 200-250 g).
NOTA: Roedores foram fornecidos pela unidade animal do laboratório acreditada da universidade de Hong Kong. - Mantenha os ratos uma temperatura constante de 25 °C e umidade de 60-70% na Unidade de Pesquisa Animal do Laboratório.
- Casa de roedores em 12/12-h luz / ciclos escuros com acesso a alimentos e água potável, ad libitum.
- Aclimata roedores ao ambiente de carcaça no mínimo um dia antes da cirurgia de CHL.
- Pegue o roedor pela nuca e anestesiar o roedor com um coquetel de cetamina e xilacina (80-100 mg/kg: 5-10 mg/kg, respectivamente) via injeção intraperitoneal (combinar 1,0 mL de cetamina com 0,5 mL de xilazine como uma concentração final).
NOTA: Use um 1 mL de seringa com uma agulha 23-25G. Injete aproximadamente 0,2 mL por 100 g de peso corporal do rato por 30 min de anestesia. - Executar a pitada do dedo do pé para verificar a sensação de dor e para corroborar a anestesia adequada. Uma reação à pitada profunda do dedo do pé (pela retirada do membro traseiro) indica anestesia insuficiente.
2. Configuração cirúrgica
- Esterilizar todos os equipamentos em um esterilizador de contas de vidro quente ou autoclave antes do início da cirurgia. Limpe a área cirúrgica com 70% de etanol.
- Use luvas de látex e jaleco antes de iniciar o procedimento.
- Coloque uma cortina cirúrgica estéril no banco limpo(Figura 1A).
- Esterilizar microtesouras e um otoscópio antes da cirurgia para minimizar a infecção do ouvido(Figura 1B).
- Coloque a micro-tesoura e otoscópio na área estéril.
- Coloque o roedor no campo cirúrgico e em alinhamento com o cirurgião.
- Prossiga com a indução cirúrgica de CHL.
3. Indução cirúrgica de perda auditiva condutiva
- Coloque a cauda e a cabeça do roedor alinhadas em uma posição propensa, cabeça mais próxima do cirurgião.
- Visualize a orelha esquerda e direita do roedor o ostocópio para garantir a membrana de tympanic saudável (Figura 2a). Avalie a orelha direita e esquerda de cada roedor para verificar a condição saudável antes da indução de CHL.
- Pegue a hélice do ouvido e estenda o canal auditivo externo (ou seja, canal auditivo, carne auditiva externa, canal auditivo) para fazer com que o interior fique obscurecido e enegrecido pela profundidade. Aqui, o canal auditivo é feito perpendicular à superfície do TM.
NOTA: Certifique-se de que o cannel auditivo esteja diretamente paralelo agora e a TM forma um ângulo reto com o eixo de inserção da microtesoura. Ele será visualizado como um tubo preto sem luz. Às vezes, o canal auditivo precisa ser inclinado em um ângulo leve, aproximadamente 15° para a superfície planar do crânio. Isso garante que a mão do cirurgião é perpendicular à superfície do TM. - Introduza a micro-tesoura no centro do canal auditivo prestando atenção para não roçar ou cortar o tecido do canal auditivo e proceder ligeiramente, aproximadamente 5 mm do centro da obscuridade, empurrando para a frente suavemente através do centro da TM.
NOTA: A punção de TM pode ser confirmada por um som pop quando as pontas da micro-tesoura perfuram o TM. O som de estalo pode ser ouvido aproximadamente em 2 min 52 s no vídeo. Este não é um som de tesoura; este é um som de punção TM. Medida após a análise, o "pop" é aproximadamente 20 dB SPL maior do que o som de fundo, conforme registrado por um microfone de alta frequência. Não há necessidade de verificar o som "pop" a este ponto, visualização de otoscópio é suficiente. O investigador pode precisar de praticar garantir que um 'pop' seja ouvido durante cada procedimento de CHL. - Abra imediatamente a micro-tesoura carregada de mola e gire três vezes após a punção do TM para garantir o deslocamento da cabeça do malleus longe do TM (somente se o deslocamento malleus é desejado).
- Retire a micro-tesoura e coloque o roedor o otoscópio para visualização.
NOTA: É importante notar que nenhum sangramento significativo deve ocorrer após o procedimento cirúrgico. Eutanásia do roedor e não proceder à avaliação comportamental se ocorrer sangramento. - Induzir chl bilateral, procedendo como acima no ouvido oposto.
4. Visualização de otoscópio
- Confirme uma cirurgia bem sucedida de CHL com um otoscópio usando um speculum de pequeno diâmetro para visualizar a orelha média do roedor.
- Avalie cada roedor antes e depois do procedimento cirúrgico do CHL debaixo do otoscópio. Garantir a confirmação do TM normal(Figura 2a)e tm danificado após a indução CHL(Figura 2b).
-
Cuidados pós-operatórios para o roedor
- Coloque o roedor na gaiola em casa uma lâmpada quente.
- Observe a indução do roedor após o CHL até que o roedor se alegre.
- Injete o roedor com soro de glicose (dextrose/soro soro) para recuperar a consciência e colocar roedores na gaiola para recuperação.
NOTA: Use uma agulha 23G com uma seringa de 10 mL para injetar 5 mL de soro para soro após a cirurgia de CHL. - Injete o roedor via intramuscular com enrofloxacina antibacteriana 0,05 mg/kg duas vezes durante o período de recuperação de 24 h.
- Observe o roedor regularmente para o comportamento ou os sintomas da dor após a cirurgia.
5. Avaliação comportamental (validação da indução de CHL) - resposta do início do aplauso
- Corroborar chl (após a confirmação do otoscópio) 24 h pós-cirurgia com a avaliação comportamental consistindo no clap-startle-teste.
- Coloque o rato induzido chl ao lado de um rato normal em duas gaiolas adjacentes separadas.
- Coloque os roedores em uma sala silenciosa.
- Fique a aproximadamente 0,5 m de distância dos roedores e continue a bater palmas em durações igualmente espaçadas várias vezes (5 palmas foram escolhidas e espaçadas acima de 1 segundo).
NOTA: O vermão de palmas produzido pelo aplauso medido - 40 dB SPL maior do que o som de fundo, como registrado por um microfone de alta freqüência.
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Representative Results
O procedimento simples do CHL foi executado em 90 ratos e fora deste grupo 2 teve o sangramento significativo e 2 não teve a perda da audição o next day como avaliado pelo startle comportável do clap. Estes quatro ratos foram descartados. Os ratos devem ser descartados conforme descrito pelas razões da discussão devido a complicações. Induzir a punção e/ou o deslocamento/ou a remoção do malleus do TM(figura 2B)elicia CHL, que conduz às manifestações comportáveis (isto é CHL - nenhuma resposta ao startle alto do dB SPL). Os ratos devem ser verificados por otoscópio antes da cirurgia para garantir a membrana normal do tympanic e após a cirurgia para garantir a punção da membrana do tympanic (Figura 2; Figura suplementar 1). Nota, não deve ocorrer sangramento ou inflamação significativa (FiguraSuplementar 2). O roedor induzido CHL não vai responder a um som alto dB SPL clap enquanto um companheiro de gaiola de audição de controle vai saltar para o aplauso alto. O rato CHL não é surdo ao som, mas tem um CHL e, portanto, sutis manifestações comportamentais ocorrem5. Um roedor da audição do controle reage vigorosa com pulos a um som alto do SPL do dB, tal como o toque do aplauso. A resposta jump/startle é claramente visível no vídeo do companheiro de gaiola auditiva, enquanto o rato induzido por CHL não responde. O comportamento de um rato CHL pode ser mais sutil. Demonstramos o reflexo geral do início do aplauso para um rato de chl representativo e rato ouvinte de controle. Ao longo do tempo pós-CHL cirurgia alguns ratos podem recuperar a resposta clap startle.
Usando o procedimento de CHL, estudos anteriores investigaram as manifestações neurais de perda auditiva. Por exemplo, o grau de perda auditiva após o procedimento foi quantificado pela medição de potenciais auditivos evocados15,16,17, gravações de janela redonda4,18,e audição comportamental limiares5. A atividade neural após chl tem sido estudada com o método de 2-desoxiglicose e gravações de células inteiras4,16,17. A atividade auditiva do nervo foi examinada igualmente com gravações redondas da janela18. Os limiares de detecção de modulação de frequência foram estudados comportamentalmente5. Este procedimento de LCh é claramente compatível com uma ampla gama de métodos experimentais para estudos detalhados de perda auditiva.
Figura 1:Configuração cirúrgica. A)Coloque roedor em uma área bem iluminada com uma lâmpada cirúrgica. Anestesie o roedor. Prepare uma variedade de micro-tesouras, se o menor não funcionar, um par maior pode garantir a punção de TM. Certifique-se de que o otoscópio está pronto. B) Mola carregado micro-tesouras. Pinças serão suficientes se experimentador pode controlar a abertura e fechamento. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2:Membrana representativa do tympanic. A) Membrana tympanic (TM) antes da punção. B) TM após punção. Ao realizar a confirmação de punção de CHL e TM com o otoscópio, é imperativo primeiro anotar o chefe do malleus e após a indução de CHL, uma remoção bem sucedida e punção de TM. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura de Informação Suplementar 1: Antes e depois da cirurgia de CHL visualizada por um otoscópio. Visualização de otoscópio antes e depois da cirurgia de CHL (imediata) em rato idêntico. A coluna esquerda das figuras são canais auditivos representativos do rato visualizados antes do procedimento do CHL pelo otoscope com tm normal e ossículos da orelha média. A coluna direita das figuras é canais auditivos representativos do rato visualizados após o procedimento do CHL pelo otoscope com TM perfurado e ossículos deslocados da orelha média. Sangramento significativo consiste em acúmulo sanguíneo nas orelhas. Estudar anatomia do ouvido médio de roedores antes de realizar o procedimento19,20,21,22,23,24,25, 26,27,28,29. A visualização do otoscópio foi realizada 24 horas após a cirurgia. Por favor, clique aqui para baixar este número.
Figura suplementar da informação 2:Controle e apóso canal auditivo do rato da cirurgia de CHL como avaliado pela histologia. Visão histológica do ouvido médio no controle e após a cirurgia de CHL (Bar = 500 μm). Os canais auditivos foram processados por hematoxilina e eosina (H&E) e a coloração Trichrome (MT) de Masson no controle e 24 horas após a cirurgia de CHL. A coluna esquerda das figuras é seções histológicas representativas do canal auditivo em ratos de controle. A coluna direita das figuras é seções histológicas representativas do canal auditivo após o procedimento do CHL. Note-se que nenhuma inflamação significativa ocorre após a cirurgia de CHL. Nenhuma diferença foi notada até uma semana. Por favor, clique aqui para baixar este número.
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Discussion
Descrevemos uma simples indução cirúrgica de CHL com verificação usando visualização de otoscópio e resposta comportamental de verniz em ratos. Aqui demonstramos o método em rato e anteriormente este método foi aplicado a gerbils e camundongos. O método pode ser facilmente adotado para outros roedores. A indução da CHL permite o estudo de uma forma sutil de perda auditiva que se manifesta em alterações corticais auditivas e achados comportamentais psicofísicos4,5,16,17,18 .
A falta de indução de CHL pode ser devido a várias razões listadas abaixo. Em cada caso, recomendamos descartar o rato. Eutanásia do rato se uma das orelhas está sangrando. Sangramento indica que a tesoura fez contato com o canal auditivo e a abordagem cirúrgica não estava limpa. Caso contrário, pode significar que a punção foi mais profunda do que o preferido, causando danos internos, possivelmente danos cerebrais. Danos internos podem significar uma inserção profunda ou roubar o canal auditivo. O procedimento é uma membrana tympanic minimamente invasiva e/ou remoção/deslocamento do malleus; portanto, não deve ocorrer sangramento significativo(Figura Suplementar 1). Se ocorrer sangramento significativo, eutanásia do rato. Se nenhum som "pop" é ouvido durante a punção da membrana tympanic, isso poderia indicar um CHL pobre, o que significa que a tesoura não fez contato direto com a membrana tympanic. Descarte o roedor do grupo e eutanasiado. Usando o otoscópio, se a visualização confirmar que a orelha média é semelhante às orelhas de controle, isso indica que a membrana do tympanic não foi perfurada. Nenhum CHL foi induzido e conseqüentemente o roedor deve ser rejeitado. Se o roedor responde ao clap-sound-test, ele deve ser descartado. Se um roedor induzido por CHL salta ou salta após sons de aplausos, semelhante ao seu companheiro de gaiola, isso indica que o procedimento cirúrgico não foi bem sucedido. Uma resposta a um som de aplausoindica que não ocorreu chl e o rato deve ser descartado ou eutanasiado. As limitações da indução de LCh por abordagem cirúrgica estão associadas à curva de aprendizagem para realizar o procedimento cirúrgico e confiança no exame audiológico19,20,22,23, 27,28,29. Além disso, este protocolo não utilizou a ABR ou a DPOAE para avaliar a perda auditiva15, a fim de estabelecer um protocolo simples para cientistas não familiarizados com procedimentos audiológicos. Os procedimentos audiológicos ABR e DPOAE podem ser usados para cientistas que querem uma avaliação mais aprofundada do CHL15.
Uma modificação da técnica está usando a punção de TM com deslocamento do malleus. Para um novato isso pode ser difícil de estabelecer, mas o malleus é claramente visualizado com um otoscópio em quase todas as orelhas de roedores. O TM é uma membrana fibrosa com uma aparência pellucid que transmita a luz. Prática verificação do otoscópio para estabelecer visualização consistente com base na literatura anterior19,20,22,23,27,28,29 . Depois que um está confiável na visualização malleus, seu deslocamento durante a cirurgia é facilmente confirmado por um 'pop' alto como pode ser ouvido em 2 min 52 s. Este pop é uma mudança de spl dB alto no arquivo de áudio de aproximadamente 20 dB SPL antes da torção da mola-carregado micro-tesoura. O pop alto confirma punção TM e sucesso sem danificar o canal auditivo. Dois aspectos do procedimento cirúrgico devem ser realizados com cuidado: 1) garantir que as microtesouras sejam colocadas no centro do canal auditivo e 2) garantam que o ângulo da microtesoura seja paralelo ao canal auditivo durante a punção para baixo. Certifique-se de que o movimento de punção é rápido e aproximadamente 5 mm de impulso para baixo da abertura do canal auditivo. Gire e abra a micro-tesoura para deslocamento malleus se desejável.
Os principais passos do protocolo CHL são garantir a punção de TM e verificar o início comportamental do gonorreia. Garantir a verificação da remoção/punção do TM confirma que a CHL foi realizada. A verificação é feita através de exame otoscópico. Os passos críticos para a avaliação comportamental são para garantir uma gonorreia alta o suficiente para que o roedor seja assustado. As diferenças foram anotadas quando um rato de CHL é coloc em uma gaiola similar como um rato da audição; aqui, um rato é surpreendido pelo outro, mesmo que o rato não possa ouvir o som. Um rato assustado / roedor, muitas vezes, saltar ou hop, mas este não é um critério. Como pode ser observado, o rato CHL não se move para o aplauso. Uma vez que a punção TM é um CHL, diferentes níveis de sons db SPL podem ser ouvidos pelo roedor5.
O significado primário deste método simples de CHL é que ele pode ser realizado por uma ampla gama de pesquisadores, mesmo com apenas recursos modestos. A verificação da perda auditiva é realizada pela visualização de otoscópio e resposta comportamental do início do gonorreia em rato. Aqui demonstramos o método em rato e anteriormente este método foi aplicado a gerbils e camundongos. O método pode ser facilmente adotado para outros roedores. A indução da CHL permite o estudo de uma forma sutil de perda auditiva que se manifesta em alterações corticais auditivas e achados comportamentais psicofísicos4,5,16,17,18 A técnica atual pode ser combinada com a eletrofisiologia e técnicas comportamentais para determinar as conseqüências corticais da perda auditiva, o que é de grande interesse para a pesquisa de perda auditiva31.
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Disclosures
Os autores declaram nenhum conflito de interesses financeiroou não financeiro.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado em parte pelo Hong Kong Research Grants Council, Early Career Scheme, Project #21201217 a C. L., para o projeto Brain mapeamento eletrofisiologia guiada com aplicações em audição e pesquisa de poluição sonora. Agradecemos ao Posgrado en Ciencias Biomédicas, ao Instituto de Neurobiologiía da Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), ao Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) México pela Bolsa de Pós-Graduação 578458 à FAM Manno.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Latex, polyvinyl or nitrile gloves | AMMEX | Use unpowdered gloves 8-mil | |
| Micro spring scissors (see Fig. 1b) | RWD Life Science | S11035-08 | 8.0 cm total length, with 3.5mm cutting edge, or similar micro forceps. Standard tweezers with spring action will suffice |
| Otoscope mini 3000 | HEINE | D-008.70.120M | Standard LED otoscope will suffice |
| Rat or mouse | JAX labs | Any small rodent | |
| Small rodent cage | Tecniplast | 1284L | Need two cages to separate CHL rodent from hearing rodent. If rodents are in direct contact with one-another, they will startle each other. Cage dimensions 365 x 207 x 140 mm, floor area: 530 cm2/82.15 in2 |
References
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