Summary
Aquí, presentamos un protocolo para establecer una inducción de pérdida auditiva conductiva replicable a través de la punción quirúrgica de la membrana timpánica y la verificación por visualización del otoscopio y evaluación del comportamiento por golpe de aplauso.
Abstract
La hipoacusia conductiva (CHL) es una deficiencia auditiva prevalente en los seres humanos. El objetivo del protocolo es describir un procedimiento quirúrgico simple para inducir CHL en roedores. El protocolo demuestra CHL por punción de membrana timpánica. La verificación de la cirugía de CHL fue por examen de otoscopio y evaluación del comportamiento por respuesta de sobrescopio de aplausos, replicable y confiable, y son métodos simples para demostrar que se ha producido pérdida auditiva. El sencillo procedimiento de CHL es ventajoso debido a su reproducibilidad y flexibilidad para diferentes actividades en la investigación de pérdida auditiva. Las limitaciones de inducir CHL por un enfoque quirúrgico se asocian con la curva de aprendizaje para realizar el procedimiento quirúrgico y la confianza en el examen audiológico. Inducir una discapacidad auditiva por CHL permite estudiar fácilmente las manifestaciones neuronales y los resultados conductuales de la pérdida auditiva.
Introduction
La prevalencia de la pérdida auditiva en niños y adultos es de aproximadamente 19,5%1 y 15,2%2 respectivamente. Sin embargo, aproximadamente el 39,3% de todos los recién nacidos con un examen auditivo anormal no reciben tratamiento corrector según lo informado por los Centros para el Control de Enfermedades3. La pérdida auditiva es una condición ampliamente estudiada, y el roedor es un modelo robusto para estudiar trastornos normales relacionados con la audición y la audición4,5,6,7,8,9 ,10,11,12,13,14,15. Los trastornos auditivos como la hipoacusia conductiva (CHL) conducen a un aumento de la depresión sináptica a corto plazo en la corteza auditiva4,lo que da lugar a pendientes psicométricas más superficiales asociadas con umbrales de detección de modulación de frecuencia 5. Los modelos de pérdida auditiva conductiva por extracción quirúrgica/desplazamiento del malleus, la punción de la membrana timpánica (TM) o el tapón para los oídos se emplean fácilmente y permiten la inducción rápida del modelo de pérdida auditiva5,14 ,15,16,17,18. El objetivo del protocolo y método actual es demostrar un modelo CHL simple y reproducible en roedores.
El protocolo actual es barato (USD$300 con todas las herramientas), y fácilmente modificable para diferentes actividades de investigación. La rata ha tenido evaluaciones detalladas de la anatomía del oído medio19,20,21,22,23, enfoques quirúrgicos24, modelos en otitis media25, 26,27 y TM regeneración de pinchazos16,17,18,28,29,30, por lo que es un modelo ideal para estudiar pérdida auditiva. Aquí, un procedimiento de inducción de CHL simple se describe con la verificación por otoscopio y evaluación del comportamiento con respuesta de sobregolpe de aplausos en rata, que luego se puede utilizar para explorar secuencias adicionales de pérdida auditiva. El procedimiento de CHL es inducido por punción quirúrgica de la TM. La verificación del procedimiento CHL se realiza mediante visualización de otoscopio para determinar la ausencia de la TM. La evaluación del comportamiento se realiza mediante un aplauso manual de alto nivel de presión sonora (SPL) de decibelios (dB). Este método se ha aplicado previamente en una variedad de roedores. Es fácil de replicar, produce fuertes diferencias psicométricas y cambios en las respuestas fisiológicas neuronales4,5,16,17,18.
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Protocol
El presente estudio y procedimientos fueron aprobados por los comités de ética de investigación animal de la Universidad de la Ciudad de Hong Kong, la Universidad de Hong Kong y el Departamento de Salud de la Región Administrativa Especial de Hong Kong.
1. Animales
- Utilice ratas Sprague-Dawley (SD) de dos meses (N .90, 200-250 g).
NOTA: Los roedores fueron proporcionados por la Unidad de Animales de Laboratorio acreditada de la Universidad de Hong Kong. - Mantener las ratas bajo una temperatura constante de 25oC y 60-70% de humedad en la Unidad de Investigación Animal de Laboratorio.
- Casa de roedores en ciclos de luz/oscuridad de 12/12 h con acceso a alimentos y agua potable, ad libitum.
- Aclimatar a los roedores al entorno de la vivienda durante al menos un día antes de la cirugía de CHL.
- Recoger el roedor por el escruff y anestesiar al roedor con un cóctel de ketamina y xilazina (80-100 mg/kg: 5-10 mg/kg, respectivamente) a través de inyección intraperitoneal (combinar 1,0 ml de ket de amina con 0,5 ml de xilazina como concentración final).
NOTA: Utilice una jeringa de 1 ml con una aguja de 23-25G. Inyectar aproximadamente 0,2 ml por 100 g de peso corporal de la rata durante 30 minutos de anestesia. - Realice el pellizco del dedo del dedo del dedo del dedo del rallado para verificar la sensación de dolor y para corroborar la anestesia adecuada. Una reacción al pellizco profundo del dedo del pies (por abstinencia de la extremidad posterior) indica anestesia insuficiente.
2. Configuración quirúrgica
- Esterilice todos los equipos en un esterilizador de cuentas de autoclave o vidrio caliente antes de comenzar la cirugía. Limpie el área quirúrgica con 70% de etanol.
- Use guantes de látex y bata de laboratorio antes de iniciar el procedimiento.
- Coloque una cortina quirúrgica estéril en el banco limpio(Figura 1A).
- Esterilizar microtijeras y un otoscopio antes de la cirugía para minimizar la infección del oído(Figura 1B).
- Coloque las microtijeras y el otoscopio en el área estéril.
- Coloque el roedor en el campo quirúrgico y alineado con el cirujano.
- Proceder con la inducción quirúrgica de CHL.
3. Inducción quirúrgica de la hipoacusia conductiva
- Coloque la cola y la cabeza del roedor alineados en una posición propensa, la cabeza más cercana al cirujano.
- Visualizar el oído izquierdo y derecho del roedor bajo el otoscopio para asegurar una membrana timpánica saludable(Figura 2a). Evalúe el oído derecho e izquierdo de cada roedor para verificar la condición saludable antes de la inducción de CHL.
- Agarre la hélice del oído y extienda el canal auditivo externo (es decir, canal auditivo, carnoso auditivo externo, canal auditivo aquí) para hacer que el interior se oscurezca y ennegrezca por la profundidad. Aquí, el canal auditivo se hace perpendicular a la superficie de la TM.
NOTA: Asegúrese de que el cannel auditivo sea directamente paralelo ahora y que la TM forme un ángulo recto con el eje de inserción de las microtijeras. Se visualizará como un tubo negro sin luz. A veces, el canal auditivo necesita ser inclinado en un ángulo leve, aproximadamente 15o a la superficie plana del cráneo. Esto garantiza que la mano del cirujano sea perpendicular a la superficie de la TM. - Introducir las microtijeras en el centro del canal auditivo prestando atención a no desnatar o rasgar el tejido del canal auditivo y proceder ligeramente, aproximadamente a 5 mm del centro de la oscuridad, empujando hacia adelante suavemente a través del centro de la TM.
NOTA: La punción TM puede ser confirmada por un sonido pop cuando las puntas de la micro-tijera perforan la TM. El sonido de estallido se puede escuchar a aproximadamente 2 min 52 s en el video. Esto no es un sonido de tijera; este es un sonido de punción TM. Como se mide el post-análisis, el "pop" es aproximadamente 20 dB SPL mayor que el sonido de fondo grabado por un micrófono de alta frecuencia. No hay necesidad de verificar el sonido "pop" en esta medida, la visualización del otoscopio es suficiente. Es posible que el investigador tenga que practicar para asegurarse de que se escucha un "pop" durante cada procedimiento de CHL. - Abra inmediatamente las microtijeras de resorte y gire tres veces después de puntuar la TM para asegurar el desplazamiento de la cabeza del malleus lejos de la TM (sólo si se desea desplazamiento de malleus).
- Retire las microtijeras y coloque el roedor debajo del otoscopio para su visualización.
NOTA: Es importante tener en cuenta que no debe producirse ningún sangrado significativo después del procedimiento quirúrgico. Eutanasia al roedor y no proceda a la evaluación del comportamiento si se produce sangrado. - Inducir chL bilateral procediendo como arriba en el oído opuesto.
4. Visualización del otoscopio
- Confirme una cirugía exitosa de CHL con un otoscopio utilizando un espéculo de diámetro pequeño para visualizar el oído medio del roedor.
- Evalúe cada roedor antes y después del procedimiento quirúrgico de CHL debajo del otoscopio. Asegurar la confirmación de TM normal(Figura 2a)y TM dañada después de la inducción de CHL(Figura 2b).
-
Cuidado postoperatorio para el roedor
- Coloque el roedor en la jaula de casa bajo una lámpara caliente.
- Observe la inducción posterior a CHL del roedor hasta que el roedor se eniture.
- Inyectar el roedor con suero de glucosa (dextrosa/salina) para recuperar la conciencia y colocar el roedor en la jaula natal para su recuperación.
NOTA: Utilice una aguja de 23G con una jeringa de 10 ml para inyectar 5 ml de salina después de la cirugía de CHL. - Inyectar el roedor a través de intramuscular con Enrofloxacino antibacteriano 0,05 mg/kg dos veces durante el período de recuperación de 24 horas.
- Observe al roedor regularmente para ver si el comportamiento o los síntomas del dolor después de la cirugía.
5. Evaluación del comportamiento (validación de la inducción de CHL) - respuesta de sobresmáxima de aplausos
- Corroborar CHL (después de la confirmación del otoscopio) 24 h después de la cirugía con la evaluación conductual que consiste en la prueba de aplauso-arranque.
- Coloque la rata inducida por CHL junto a una rata normal en dos jaulas adyacentes separadas.
- Coloque a los roedores en una habitación silenciosa.
- Permanecer de pie aproximadamente a 0,5 m de distancia de los roedores y proceder a aplaudir en duraciones igualmente espaciadas un número de veces (5 aplausos fueron elegidos y espaciados más de 1 segundo).
NOTA: El sobresalto de aplausos producido por el aplauso de mano medido a 40 dB SPL mayor que el sonido de fondo grabado por un micrófono de alta frecuencia.
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Representative Results
El sencillo procedimiento de CHL se realizó en 90 ratas y de este grupo 2 tuvo sangrado significativo y 2 no tuvieron pérdida de audición al día siguiente, según lo evaluado por el contragolpe de aplausos conductuales. Estas cuatro ratas fueron descartadas. Las ratas deben descartarse como se describe por las razones en la discusión debido a complicaciones. Inducir la punción y/o el desplazamiento/eliminación de la TM (Figura 2B) provoca CHL, lo que resulta en manifestaciones conductuales (es decir, CHL - no hay respuesta a un fuerte sobrearranque de DB SPL). Las ratas deben ser revisadas por otoscopio antes de la cirugía para asegurar la membrana timpánica normal y después de la cirugía para asegurar la punción de la membrana timpánica (Figura 2; Figura complementaria 1). Tenga en cuenta que no debe producirse sangrado o inflamación significativa (FiguraSuplementaria 2 ). El roedor inducido por CHL no responderá a un fuerte sonido de aplauso sPL dB, mientras que un compañero de jaula auditiva de control saltará al fuerte aplauso. La rata CHL no es sorda para sonar, pero tiene un CHL y por lo tanto las manifestaciones conductuales sutiles ocurren5. Un roedor auditivo de control reacciona vigorosamente con saltos a un fuerte sonido dB SPL, como el sobresalto de aplausos. La respuesta de salto/desfachate es claramente visible en el vídeo de la pareja de la jaula auditiva, mientras que la rata inducida por CHL no responde. El comportamiento de una rata CHL puede ser más sutil. Demostramos el reflejo general de sobresalto de aplausos para una rata CHL representativa y una rata auditiva de control. Con el tiempo, la cirugía post-CHL, algunas ratas pueden recuperar la respuesta de sobrestonante de aplausos.
Usando el procedimiento de CHL, estudios anteriores han investigado las manifestaciones neuronales de la pérdida auditiva. Por ejemplo, el grado de pérdida auditiva después del procedimiento se ha cuantificado midiendo las posibilidades auditivas evocadas15,16,17, las grabaciones de ventanaredonda4,18y umbrales de audición conductual5. La actividad neuronal después de CHL se ha estudiado con el método 2-desoxiglucosa y las grabaciones de células enteras4,16,17. La actividad del nervio auditivo también se ha examinado con grabaciones de ventana redonda18. Los umbrales de detección de modulación de frecuencia se han estudiado de forma conductual5. Este procedimiento de CHL es claramente compatible con una amplia gama de métodos experimentales para estudios detallados de la pérdida auditiva.
Figura 1: Configuración quirúrgica. A)Coloque el roedor en un área bien iluminada con una lámpara quirúrgica. Anestesia al roedor. Prepara una variedad de microtijeras, si la más pequeña no funciona, un par más grande puede asegurar un pinchazo TM. Asegúrese de que el otoscopio esté listo. B) Microtijeras cargadas con resorte. Las pinzas serán suficientes si el experimentador puede controlar la apertura y el cierre. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Membrana timpánica representativa. A) Membrana timpánica (TM) antes de la punción. B) TM después de la punción. Al realizar la confirmación de punción CHL y TM con el otoscopio, es imperativo anotar primero la cabeza del malleus y después de la inducción de CHL, una eliminación exitosa y punción de TM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Información Suplementaria Figura 1: Antes y después de la cirugía de CHL según lo visualizado por un otoscopio. Visualización del otoscopio antes y después de la cirugía de CHL (inmediata) en rata idéntica. La columna izquierda de figuras son canales auditivos de ratas representativas visualizados antes del procedimiento CHL por el otoscopio con osículos normales de TM y oído medio. La columna derecha de figuras son canales auditivos de ratas representativas visualizados después del procedimiento de CHL por el otoscopio con TM perforado y osículos desplazados del oído medio. El sangrado significativo consiste en acumulación de sangre en los oídos. Estudiar la anatomía del oído medio de los roedores antes de realizar el procedimiento19,20,21,22,23,24,25, 26,27,28,29. La visualización del otoscopio se llevó a cabo 24 horas después de la cirugía. Haga clic aquí para descargar esta figura.
Información Complementaria Figura 2: Control y después de la cirugía de CHL rat rat auditory canal según lo evaluado por histología. Vista histológica del oído medio en control y después de la cirugía de CHL (Bar a 500 m). Los canales auditivos fueron procesados por hematoxilina y eosina (H&E) y tinción tricroma (MT) de Masson en control y 24 horas después de la CHL. La columna izquierda de figuras son secciones histológicas representativas del canal auditivo en ratas de control. La columna derecha de figuras son secciones histológicas representativas del canal auditivo después del procedimiento DE CHL. Tenga en cuenta que no se produce una inflamación significativa después de la cirugía de CHL. No se notó ninguna diferencia hasta una semana. Haga clic aquí para descargar esta figura.
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Discussion
Describimos una simple inducción quirúrgica de CHL con verificación utilizando la visualización del otoscopio y la respuesta de sobregolpe de aplausos conductuales en rata. Aquí demostramos el método en rata y anteriormente este método se ha aplicado a jerbos y ratones. El método se puede adoptar fácilmente a otros roedores. La inducción de CHL permite el estudio de una forma sutil de pérdida auditiva que se manifiesta en alteraciones corticales auditivas y hallazgos psicofísicos del comportamiento4,5,16,17,18 .
La falta de inducción de CHL podría deberse a varias razones como se indica a continuación. En cada caso, recomendamos desechar la rata. Eutanasia a la rata si una de las orejas está sangrando. El sangrado indica que las tijeras hicieron contacto con el canal auditivo y el enfoque quirúrgico no estaba limpio. De lo contrario, puede significar que la punción fue más profunda de lo preferido, causando daño interno, posiblemente daño cerebral. El daño interno podría significar una inserción profunda o el abrojo del canal auditivo. El procedimiento es una membrana timpánica mínimamente invasiva y/o eliminación/desplazamiento del malleus; por lo tanto, no debe producirse ningún sangrado significativo(Figura Suplementaria 1). Si se produce un sangrado significativo, eutanasia a la rata. Si no se oye ningún sonido "pop" durante la punción de la membrana timpánica, esto podría indicar un CHL pobre, lo que significa que las tijeras no hicieron contacto directo con la membrana timpánica. Deseche el roedor del grupo y eutanasia. Usando el otoscopio, si la visualización confirma que el oído medio es similar a los oídos de control, esto indica que la membrana timpánica no ha sido perforada. No se indujo CHL y, por lo tanto, el roedor debe ser desechado. Si el roedor responde a la prueba de sonido de aplausos, debe descartarse. Si un roedor inducido por CHL salta o salta después de los sonidos de aplausos, similar a su compañero de jaula, esto indica que el procedimiento quirúrgico no tuvo éxito. Una respuesta a un sonido de aplauso indica que no se ha producido CHL y la rata debe descartarse o eutanasiarse. Las limitaciones de inducir CHL por un enfoque quirúrgico se asocian con la curva de aprendizaje para realizar el procedimiento quirúrgico y la confianza en el examen audiológico19,20,22,23, 27,28,29. Además, este protocolo no utilizó ABR o DPOAE para evaluar la pérdida auditiva15 con el fin de establecer un protocolo simple para los científicos que no están familiarizados con los procedimientos audiológicos. Los procedimientos audiológicos ABR y DPOAE se pueden utilizar para los científicos que desean una evaluación adicional de CHL15.
Una modificación de la técnica es el uso de la punción TM con desplazamiento de malleus. Para un principiante esto puede ser difícil de establecer, pero el malleus se visualiza claramente con un otoscopio en casi todos los oídos de roedores. La TM es una membrana fibrosa con un aspecto pelúcida que transmite luz. Practicar la verificación del otoscopio para establecer una visualización coherente basada en la literatura anterior19,20,22,23,27,28,29 . Después de que uno confía en la visualización del malleus, su desplazamiento durante la cirugía es fácilmente confirmado por un fuerte "pop" como se puede escuchar a 2 min 52 s. Este pop es un fuerte cambio de dB SPL en el archivo de audio de aproximadamente 20 dB SPL antes de la torsión de las microtijeras de resorte. El pop fuerte confirma la punción TM y el éxito sin dañar el canal auditivo. Dos aspectos del procedimiento quirúrgico deben realizarse con cuidado: 1) asegurarse de que las microtijeras se colocan en el centro del canal auditivo, y 2) asegurarse de que el ángulo de las microtijeras es paralelo con el canal auditivo durante la punción descendente. Asegúrese de que el movimiento de punción sea rápido y de aproximadamente 5 mm hacia abajo desde la apertura del canal auditivo. Gire y abra las microtijeras para el desplazamiento de malleus si es deseable.
Los pasos clave del protocolo CHL son asegurar la punción TM y verificar el sobrearranque de aplausos conductuales. Asegurar la verificación de la eliminación/punción del maléodeo de la TM confirma que se ha realizado CHL. La verificación se realiza mediante un examen otoscópico. Los pasos críticos para la evaluación del comportamiento son asegurar un aplauso lo suficientemente fuerte como para que el roedor se asuste. Se han observado diferencias cuando una rata CHL se coloca en una jaula similar a la de una rata auditiva; aquí, una rata es sorprendida por la otra, incluso si la rata no puede oír el sonido. Una rata/roedor sorprendido a menudo saltará o saltará, pero esto no es un criterio. Como se puede observar, la rata CHL no se mueve al aplauso. Dado que la punción TM es un CHL, el roedor5puede escuchar diferentes niveles de sonidos db SPL.
La importancia principal de este sencillo método CHL es que puede ser realizado por una amplia gama de investigadores, incluso con recursos modestos. La verificación de la pérdida auditiva se realiza mediante la visualización del otoscopio y la respuesta de sobregolpe de aplausos conductuales en ratas. Aquí demostramos el método en rata y anteriormente este método se ha aplicado a jerbos y ratones. El método se puede adoptar fácilmente a otros roedores. La inducción de CHL permite el estudio de una forma sutil de pérdida auditiva que se manifiesta en alteraciones corticales auditivas y hallazgos psicofísicos del comportamiento4,5,16,17,18 La técnica actual se puede combinar con la electrofisiología y las técnicas conductuales para determinar las consecuencias corticales de la pérdida auditiva, que es de gran interés para la investigación de pérdida auditiva31.
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Disclosures
Los autores no declaran conflictos de intereses financieros o no financieros.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado en parte por el Consejo de Becas de Investigación de Hong Kong, Early Career Scheme, Project #21201217 a C. L., para el proyecto Brain mapping guided electrophysiology with applications in hearing and noise pollution research. Agradecemos a Posgrado en Ciencias Biomédicas, el Instituto de Neurobiología de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) México por la Beca de Posgrado 578458 a FAM Manno.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Latex, polyvinyl or nitrile gloves | AMMEX | Use unpowdered gloves 8-mil | |
| Micro spring scissors (see Fig. 1b) | RWD Life Science | S11035-08 | 8.0 cm total length, with 3.5mm cutting edge, or similar micro forceps. Standard tweezers with spring action will suffice |
| Otoscope mini 3000 | HEINE | D-008.70.120M | Standard LED otoscope will suffice |
| Rat or mouse | JAX labs | Any small rodent | |
| Small rodent cage | Tecniplast | 1284L | Need two cages to separate CHL rodent from hearing rodent. If rodents are in direct contact with one-another, they will startle each other. Cage dimensions 365 x 207 x 140 mm, floor area: 530 cm2/82.15 in2 |
References
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