Summary
ウサギをハードのダニを餌にシンプルで汎用性の高いシステムを提案します。私たち非骨の折れるプロトコルやすい材料を使用して、さまざまな実験的設定の要件に応じて調整することができます。メソッドでは、快適な監視および/または全体の給餌期間中にダニのサンプリングをことができます。
Abstract
ダニ研究の動物の使用は、さまざまな実験室でマダニの植民地の維持を含む実験の目的のため重要です。ダニ、(卵) を除くすべての発達段階は、吸血性、血食事、脊椎動物のホストに接続されている場合を取得自分の生活サイクルが正常に完了のために不可欠。ウサギのハードのダニの餌に簡単に開閉式のカプセルを使用する単純な方法を示します。提案手法の利点には、そのシンプルさ、短い期間と実験の特定の要件のニーズに最も重要な汎用性の高い調整があります。メソッドになります動物全体的な要件を軽減しながら複数の段階または別の実験グループの供給を可能にする同じ動物に (各種サイズ) の複数室の使用可能。非刺激性、簡単にアクセスできる材料を使用ことができます簡単に実験から回復し採用のために提供または倫理的なプロトコルは、それを許可されている場合を再利用、動物に不快感を最小限に抑えます。
Introduction
ハード タイマー刻み (された) 低速送り節足動物としてよく知られているし、数日間ホストに付けることができるまたは週間、種に応じて、発達段階1。これらの義務の吸血性節足動物はさまざまな細菌、原虫、ウイルスなどの病原菌の媒介し、このように人間と動物の健康1に重大なリスクを提示します。ときダニの生物学を勉強したり、新しい制御法の評価、飼養管理方式の効果的な目盛りの確立は効果的に実験を設計し、研究の目的を達成するために重要。最近、(生きている動物の使用を避ける) いくつかの人工チック給餌システムの開発2,3,4をされている、可能な限り使用されるべきであります。しかし、これらのシステムは、ティック、生きている動物の給餌を完全に置き換えることができるしていない、彼らは科学的な研究に必要な多くの生理学的な条件のための適切な代替ではありません。したがって、いくつかのケースで実験動物のホストの使用は、実験結果の妥当性を保証することが重要です。
研究所ニュージーランドのウサギは、いくつかマダニ マダニ種5,6,7,8,9の最も適切なアクセス可能なホストに示されています。ウサギの餌目盛りの 2 つの一般的な戦略が頻繁に使用されている: a) コットン布や靴下6、7で覆われているウサギの耳に餌と b) 綿袋9、ナイロン ボトル10またはネオプレンで給餌部屋11ウサギの背中に釘付け。ウサギの耳に餌はエレガントなシステム タイマー刻み (特に初期段階、幼虫や幼虫) 可能性がありますクロールし、動物のために快適ではないし、ダニの餌やのリカバリの監視は、外耳道の奥深くに添付充血ダニは難しい。このシステムは動物のためのかなりの不快感を表すエリザベスつばによって保護されたソックスで覆われて完全に耳に 2 つだけのティック グループも。他システムの9,10,11は間違いなくより高度なマダニ植民地維持のために適して。しかし、ウサギは、実験グループの数だけでなく、授乳室の変更のサイズ/形状に制限されます。さらに、これらのプロトコルがよく傷および手入れをすることを防ぐためにエリザベス朝の首輪の使用を避けるために後部のウサギの足をちょこちょこ必要があります。
ここエリザベス カラーの必要性を除去する実験中にちょこちょこチャンバ ジャケットで覆われて戻ってウサギに釘付けのハード タイマー刻みの複数のグループをフィードする単純な非骨の折れると非常に効果的な手法を提案します。具体的には、当社のシステムは、蚊メッシュで覆われ、剃毛のウサギに戻って高速凝固 (3 分) 非刺激性ラテックス接着剤で接着エチレンビニル アセテート (EVA) 発泡シートから作られた弾性のカプセルを使用します。このテクニックにより、望みの大きさや形の複数のカプセルの添付ファイルと実験後の数週間、ウサギが完全に回復します。システムは主にマダニ幼虫および大人の段階に適したが、少しの変更で幼虫も餌の使用することができます。供給ハードのティックの EVA フォーム ベースの方法は、脊椎動物のホスト (本稿での選択肢の 1 つとして示されて) いる羊などの他の種類に適応する可能性があります。
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Protocol
注: この研究では、食物と一緒に標準ケージの中で維持されたウサギと水提供食品、環境・衛生・安全 (ANSES) 認定動物施設カルカソンヌ、フランスでのフランス語代理店の自由。動物が異常な皮膚反応や健康上の問題の合併症のための 2 つの経験豊富な技術者が 2 回毎日。実験室は、タイマー刻みの偶発的なエスケープを避けるために両面テープで戸口のインテリアをフレーミングによって確保されました。二人は、チームとして仕事しますが、1 つの経験豊富な人の手を借りずシングルを完了することは、メソッドが最適です。ほとんどのウサギがおとなしい、穏やかな、ストレスの兆候の操作中に発生します。ウサギは苦労して自体を傷つけていないことを確保するため、マニュアルの束縛が軽く片方の手で首の首筋の押しながらもう一方の手でサポートされている遂行されるかもしれない後部の四分の一。6 ヶ月歳、ランブイエ、水や食料が供給されたアドリブと毎日 2 回チェックされた雌の羊がアルフォール国立獣医学校 (ENVA) で生物医学的研究 (CRBM) 施設のセンターで保たれました。
注: 当研究室は、それぞれ動物実験が来る Anses/ENVA/UPEC、許可番号 01741.01、11/10/16-5 b、倫理委員会による供給目盛りにウサギや羊を使用する許可を受けています。実験では病原体フリーの目盛りのみを使用、白兎会、パリ、フランスでの養子縁組のためこの研究で使用されるすべてのウサギが提供されました。
1. カプセルの調製
- EVA 発泡シート (図 1A) からカプセルの希望のサイズをカットします。外側丸 (図 1B) をウサギの皮膚に接着することと、偶発的な剥離を最小限に抑えるためにカプセルのコーナーします。
注: カプセルのフレームの厚さでなければならない約 8 mm 幼虫、若虫、マダニなど小さなダニ大人の種に使用 5 mm 厚発泡シート。1 cm 厚の発泡シートは大型実験的要件に基づいてタカサゴキララマダニの sp、 Hyalomma sp.などカプセルのサイズ変化などアダルト チックに適しています。たとえば、20マダニ大人カップル、200 ニンフまたは 1,000 の幼虫は、我々 内部カプセルのサイズを使用 5 × 5 cm26 × 7 cm2 7 × 9 cm2、それぞれ。 - カット幅 8 mm ストリップ粘着フック (材料の表を参照) をテープし、準備の EVA 発泡体フレーム (図 1C) に貼っています。
- カットは、自己接着ループから同じサイズのストリップ (材料の表を参照) をテープやフックの両側にバインドは、EVA 発泡体フレーム (図 1D) に接続されています。
- EVA 発泡体フレームのサイズに細かい蚊メッシュ (メッシュ サイズより小さい 50 μ m) の適切なサイズをカットし、(図 1Eと1 f) 自己接着ループに固執します。必要な場合は、オーバー ハングをカットします。
カプセルのこの型を使用経由で、留められた幼虫の偶発的な脱出を防ぐために幼虫の餌 (補足図 1) カプセルの異なるシーリング システムが必要ですが、ニンフとマダニ種の大人をフィードする注。フックとループ側。
2. マダニ寄生する前にウサギの準備
- ウサギのバックとサイド バリカン (図 2A) に使用するための領域を剃る。
- 非刺激性ラテックス接着剤を準備されたカプセルの表面全体に適用し、1 分 (図 2B) を待ちます。
- (図 2および2 D) 約 3 分指で (特に角の部分) で肌に押して、カプセルを接着します。
メモ: 複数のカプセルを接着するとき (図 2 eおよび2 f) それらの間に少なくとも 5 mm のスペースを維持することを確認してください。我々 は通常、背骨の領域を避けるため、必要な場合にそれを使用するかもしれない。 - やや皮膚への愛着を視覚的に確認するカプセルを持ち上げます。非添付領域がある場合は、別の 3 分押すし、へらを使用して接着剤が適用されます。
- ジャケット損傷 (図 2G) を防ぐためウサギのリアの足に保護テープを適用します。
注: この手順はオプションであり、ティック カプセルに損傷しないジャケット損傷を防ぐため、主に。 - 開口部から前足を置き、快適なままの呼吸を確認してウサギを作って首を絞めるウサギのジャケットを置きます。この段階で弾性エンクロージャを通じて後ろ足を配置しないし、ジッパー オープン (図 2H) を残します。
3. マダニ寄生
- 針端をカットし、(図 1G) 綿と差し込まれる (1 または 5 mL によって、個体数の) プラスチック注射器に目盛りを配置します。タイマー刻みの少量を出没する場合は、鉗子を使用します。
注: ティック コロニー維持できる吸血ダニ female(s) その後孵化時に幼虫の面倒な操作を避けるためゴム バンド12で包まれた蚊メッシュで覆われてシリンジ (5 または 10 mL) 中彼らの卵を産むため、します。ホスト (図 1H) に適用されます。注射器に脱皮する完全に飽血幼虫を許可可能性がありますまた、(補足図 1I; 5 または 10 mL) ニンフとウサギの直接侵入のため。 - 場所に注射器を介して開いているカプセルに深くコーナー、シリンジのプランジャーを押すことにより、ダニを接種します。プランジャーに接続されている残りのダニを削除するウサギ皮膚に向かってプランジャーをゆっくりとツイストし、同時に (図 2私) カプセルから引き出します。
注: 個人のいくつかはカプセルからクロールする場合に返品して鉗子を使用します。 - フックとループのテープを refastening してカプセルを閉じます。
- ウサギの後ろ足をジャケットと zip の弾性筐体を閉じた後部に配置します。
注: ください、快適さを確保するため、またジャケットを噛んでを避けるためには、ジャケットの首とウサギの間の人差し指を合うことができます。 - ウサギをケージ (図 2J) に戻ります。
注: 侵入からいっぱいダニのコレクションまでの時間は別のカチカチ種、発達段階によって異なります。たとえば、イクソデススカプラリスマダニ ヒマの成虫、幼虫と幼虫の餌の期間はそれぞれ 6-9、3-4、2-3 日。(2016)9レビン、Shumacher の実験室の条件の下で 29 の異なるマダニのライフ サイクルへの参照のリストを見つけることが。
4. コレクションとダニの監視
- ベンチにケージからウサギを取るし、ジャケットを解凍します。
- 優しく両手でウサギを抑制します。カプセルを開くフックとループのテープ (図 2 Kと2 L) を緩めるには、し、飽血幼虫 (補足図 1) またはプラスチックの皿にニンフをブラッシングまたは大人のため (図 2L 鉗子を使用してダニを収集).部分的に供給 (十分にない) 場合ダニが必要、それらをデタッチするティック体操や鉗子を使用します。
注: 場合維持して目盛りのコロニーは 3.1 の手順でメモを参照してください。充血したダニの適切な湿気のあるおよび特定のカチカチ種によると温度条件を維持します。 - 必要な場合は、カプセルを閉じるにフックとループのテープを締め。
5. ウサギの回復
- カプセルから完全に蚊メッシュを削除し、ウサギ (図 2M) にジャケットを残します。
- 3-4 週間待つし、優しく角 (図 2N) のいずれかをトリミングすることによって、カプセルを削除してみてください。カプセルがまだしっかりと接続されている場合は、1 週間後にこの手順を繰り返します。
- ケージでウサギを回復させジャケットを削除します。
メモ: カプセルがオフ、異常反応、ウサギの皮膚を確認します。通常治療は必要ない、エモリエント ローションは刺激の場合使用できます。 - プロトコルや実験ができるように、回復したウサギ (図 2O) を再利用か、養子縁組のために提供することができます。
注: ウサギは、繰り返されるダニのインフェ ステーション13; 一度露出されるダニの抵抗性を獲得するに示されています。したがって、実験が必要としない限り、reinfestations は推奨されません。
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Representative Results
ここで提案する初めてのマダニは EVA 発泡体の供給の詳細なステップバイ ステップ法 (図 1および 図 2) のジャケットで覆われて剃毛ウサギの背中に適用されるカプセル。このプロトコルは、同じホスト上の別のティック グループが必要とマダニの大量飼育にも使える各種実験に適しています。研究室で主に吸血ダニはマダニ個体の適合技術自体よりもむしろ特定のカチカチ種のウサギ ホストの適合性に依存します。EVA 発泡体を用いてウサギをバックに釘付けのカプセルは羊 (など、研究室のホストの他のタイプに適応する種 (表 1) と 5 月も様々 なマダニのさまざまな発達段階を供給する非常に成功した証明されています。図 3)。
この方法の主な利点は、シンプルさ、簡単にアクセスできる材料 (材料表) と、最も重要なは、授乳中にダニを簡単に監視できるように快適な開閉システムです。この汎用性の高いメソッドがの課題変更可能な数、形状、およびホスト (図 2D F) のカプセルの組成に基づくさまざまな実験設定の様々 な可能性を提供していますさらに、特定の研究。非常に効果的、速乾性、かつ非刺激性のラテックス接着剤の使用によりカプセルが 3 分でしっかりと接着されているし、少なくとも 3 週間はアタッチしたままになります。この手順は、またできますウサギの完全な回復を実験 (図 2O) の後のホストに。
図 1: EVA 発泡カプセルやダニの準備。(A, B)EVA 発泡体からカプセルを切断します。(C) カプセルに粘着フック テープのストリップを置きます。(D) 結合ループ側帯とファスナーからテープをはがします。(E, F)接着ストリップに蚊メッシュのこだわり。(G) 綿で覆われてカット針端とシリンジ (5 mL) 中アダルト マダニの例です。蚊メッシュで覆われてカット針端と注射器の中の新鮮な孵化幼虫の (H) 例はゴムのバンドで行われて。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: ウサギにカプセルを接着、カチカチのインフェ ステーション/回復とカプセルの取り外しです。(A) ウサギの背中を剃毛します。(B) 接着剤の準備の EVA 発泡カプセルへの応用。(C, D)ウサギに異なるサイズのカプセルの添付ファイル。(E, F)それぞれ、背面に接続されている 2 つまたはいくつかの部屋を見せてウサギの背面。テープ (G) は、リアの足の周りに配置されます。前脚や首から始まって、ジャケット (H) が適用され、後部は開いたまま。カプセルのコーナーを開くも表示されます。(私) 注射器を使用して開いているコーナーでカプセルに目盛りを配置すること。(J) ジャケットが完全に圧縮し、ウサギをケージに移転します。(K) カプセルを開くことによって彼らの餌にダニを監視します。(L) 鉗子を使用して十分に備えているダニを収集します。(M) カチカチの取り外しの後の空のカプセルです。ウサギから (3-4 週間) 後のカプセルの (N) 剥離。(O) は完全にウサギを回復この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: EVA 発泡羊に適応システム。(A) のバックの羊の側で剃毛、洗浄エリアに発泡カプセルの添付ファイル。(B) 寄生後、添付のカプセルはジャケット代わりに包帯 (整形外科メリヤス) で覆われています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| ダニ種 | 出没するタイマー刻み/吸血ダニ (%) 数の数 | ||
| 幼虫 | ニンフ | 女性 | |
| マダニ ヒマ | - | 692/557 (80.49%) | 670/592 (88.35%) |
| イクソデススカプラリス | - | - | 40/34 (85%) |
| カクマダニ属学 | 3,550/3255 (91.7%) | 900/803 (89.22%) | 323/305 (94.42%) |
| クリイロコイタマダニ appendiculatus | 3,300/2822 (85.52%) | 490/421 (85.91%) | 370/362 (97.83%) |
| クリイロコイタマダニ pulchelus | - | 1,920/1831 (95.36%) | 282/257 (91.13%) |
| アムブリオマ カエンネンセ | 332/225 (67.77%) | 404/308 (76.24%) | 207/146 (70.53%) |
| キララマダニ属の americanum | - | 140/134 (比率は 95.71%) | 31/27 (87.1%) |
| Hyalomma 漏斗 | 1,000 * | 510 * (58.8%) | 380/313 (82.36%) |
表 1:EVA 発泡体のカプセルの中にウサギの餌のハードのカチカチ種のさまざまな発達段階の充血率。H. 漏斗の未熟な段階の高速の脱皮プロセスに起因飽血幼虫 (データは示されていない) は、その後同じカプセルで充血した幼虫に脱皮に残っていた。
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Discussion
このプロトコルの全体の最も重要なステップは、剃毛肌にしっかりとカプセルを接着することです。このため、少なくとも 3 分間一定の圧力は、コーナーで特に重要です。それはそれらを適用する重要なカプセルにダニを接種シールの中にカチカチのエスケープを避けるためにオープンされているものから反対側の隅に深く。実験を計画するときは、すべてのカプセルが咀嚼や傷によって損傷を避けるためにジャケットで覆われていることを確認します。ジャケットの頸部はウサギが快適なまま、十分に緩いが追突しないようにタイトな十分なことを確認します。
記載した技術の主な利点の 1 つは、そのシンプルさとサイズの面でその変更とカプセルの数を使用することができます。私たちの実験中にカプセル、皮膚の剥離は認められなかった。ただし、時折ウサギ ジャケット (しかしないカプセル) 被害が発生します。
ウサギでは、我々 は、カプセルに入って、完全に充血した戸建のタイマー刻み (幼虫と若虫など主に未熟な段階) 脱水高速ウサギの温度を観察しました。このため、特定のカチカチ種と、剥離後すぐに充血したティック コレクションを計画する段階、飼育期間の期間の見積もりをお勧めします。当社のシステムは、様々 なハードのカチカチ種 (表 1) の供給のためテストされています、ウサギはすべてマダニ種14の自然なホストではありません。特定ハードのカチカチ種に適した他の動物のホストにこのシステムを適応させることによってこの制限を克服する可能性があります。ここで我々 は、 I. ヒマ(図 3) のすべての発達段階のフィードを羊に適応した EVA 発泡システムの使用を報告しました。この特定のケースで羊を剃毛し、皮膚の表面で現在の油を除去するために 70% エタノールを含浸させた綿で洗浄する必要があります。その後ウサギの説明と同じ手順が続いたが、ジャケットの代わりに図 3に示すようは、背部のまわりで綿包帯の使用されました。
このシステムを開発するとき使用される材料の量との手順を最小限に抑えるために特別な注意を払いました。他の方法と比較して、我々 は麻酔、ウサギの襟、耳のソックスまたは後ろ足5,6,7,8,9,10のほぶ切りを使用しないでください。さらに、議定書は、面倒ではないと、このテクニックを理解する集中的な訓練は必要ありません。ティック生物学、宿主-ベクター-病原体相互作用を勉強するときさまざまな異なる実験用に供給システムの詳細は本研究では EVA 発泡体による目盛りを期待や評価の異なる管理の措置は殺だに剤やワクチンのような。私たちの今後の方向性には、飼養管理方式のマウス モデル ハード ダニの幼虫を養うために EVA 発泡カプセルが適応されます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
我々 は、イブリン ル Naour、研究所フランス国立農業研究 (INRA)、アラン ・ ベルニエ (INRA) ホテル ル Bidel (ANSES) ・の技術的な支援を認めます。コンスエロ ・ Almazán は、卓越性、統合的な生物学の新興感染症 (LabEx IBEID)、パスツール研究所の研究室から奨学金によって支えられました。ウサギと羊が ANSES によって購入されました。この仕事の一部健康グラント RO1AI090062 Y の公園に国立衛生研究所によって資金を供給されました。博士ジェフリー ・ l ・ ブレアは、原稿のレビューに認められています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| New Zealand Rabbits (2.5-3.5 kg) | Charles River | Strain Code 571 | |
| Rambouillet sheep | Local provider-tick free farm | Female 6 months old | |
| EVA foam 5 mm thick | Cosplay Shop | EVA-PE451kg (950mm x 450mm) | 10 mm PE45 kg foam from the Cosplay Shop may be used for the large adult tick species |
| Foam Sheet 9" X 12" 6 mm-White | Amazon | FOAMSHT6-20 | 6 mm-EVA foam ca be ordered via Amazon as an alternative to the foam from Cosplay Shop |
| Full length rabbit jackets | Harvard Apparatus, Inc. | 620077- medium, 6270078 - large | |
| Non-toxic latex glue | Tear mender | Fabric & Leather Adhesive | |
| Tubular cotton orthopedic stockinette | BSN Medical | 9076 (12-15 cm wide) | |
| Mosquito mesh | Loisirs Creatifs | Very fine filter nylon mesh fabric | Any mosquito mesh, or curtain material with the mesh size less than 50 μm is suitable. |
| Leukoplast | BSN medical S.A.S | LF 72361-02 | |
| Adhesive hook-and-loop tape | AIEX store | AIEX 39.37 Feet/12m Hook and Loop Self Adhesive Tape Roll, 20 mm width, white colour | Fullfiled by Amazon |
| Fast drying glue | Fixtout | Superglue |
References
- Sonenshine, D. E., Roe, M. Ticks, People and Animals. Biology of Ticks, Vol I. , Oxford University Press. (2014).
- Kröber, T., Guerin, P. M. In vitro feeding assays for hard ticks. Trends in Parasitology. 23 (9), 445-449 (2007).
- Bonnet, S., Jouglin, M., Malandrin, L., Becker, C., Agoulon, A., L'hostis, M., Chauvin, A. Transstadial and transovarial persistence of Babesia divergens DNA in Ixodes ricinus.ticks fed on infected blood in a new skin-feeding technique. Parasitology. 134 (2), 197-207 (2007).
- Bonnet, S., Liu, X. Laboratory artificial infection of hard ticks: A tool for the analysis of tick-borne pathogen transmission. Acarologia. 52 (4), 453-464 (2012).
- Khols, G. M. Tick rearing methods with special reference to the Rocky Mountain Wood Tick, Dermacentor andersoni Stiles. Culture methods for invertebrate animals. , Dover Pubs. New York. (1937).
- Faccini, J. L. H., Chacon, S. C., Labruna, M. B. Rabbits (Oryctolagus cuniculus) as experimental hosts for Amblyomma dubitatum Neumann (Acari: Ixodidae) [Coelhos (Oryctolagus cuniculus) como hospedeiros experimentais de Amblyomma dubitatum Neumann (Acari: Ixodidae). Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia. 58 (6), 1236-1239 (2006).
- Chacon, S. C., Freitas, L. H. T., Barbieri, F. S. Relationship between weight and number of engorged Amblyomma cooperi. Nuttal (sic) and Warburton, 1908 (Acari: Ixodidae) larvae and nymphs and eggs from experimental infestations on domestic rabbits. Brazilian Journal of Veterinary Parasitology. 13, 6-12 (2004).
- Sonenshine, D. E. Maintenance of ticks in the laboratory. Maintenance of Human, Animal, and Plant Pathogen Vectors. , Science Publishers Inc. Enfield. (1999).
- Levin, M. L., Schumacher, L. B. M. Manual for maintenance of multi-host ixodid ticks in the laboratory. Experimental and Applied Acarology. 70 (3), 343-367 (2016).
- Bouchard, K. R., et al. Maintenance and experimental infestation of ticks in the laboratory setting. Biology of Disease Vectors. , Elsevier. San Diego. (2005).
- Jones, L. D., Davies, C. R., Steele, G. M., Nutall, P. A. The rearing and maintenance of ixodid and argasid ticks in the laboratory. Animal Technology. 39, 99-106 (1988).
- Slovák, M., Labuda, M., Marley, S. E. Mass laboratory rearing of Dermacentor reticulatus ticks (Acarina, Ixodidae). Biologia, Bratislava. 57 (2), 261-266 (2002).
- Rechav, Y., Dauth, J. Development of resistance in rabbits to immature stages of the Ixodid tick Rhipicephalus appendiculatus. Medical and Veterinary Entomology. 1, 177-183 (1987).
- Zacarias do Amaral, M. A., Azevedo Prata, M. C., Daemon, E., Furlong, J. Biological parameters of cattle ticks fed on rabbits. Brazilian Journal of Veterinary Parasitology. 21 (1), 22-27 (2012).
