Summary
Nós desenvolvemos um sistema simples e versátil para alimentar carrapatos duro em coelhos de laboratório. Nosso protocolo não-laborioso usa materiais facilmente acessíveis e pode ser ajustado dependendo das exigências das diversas configurações experimentais. O método permite monitoramento confortável e/ou amostragem de carrapatos durante todo o período de alimentação.
Abstract
O uso de animais vivos em pesquisa de carrapato é crucial para uma variedade de fins experimentais, incluindo a manutenção de colônias de tiquetaque duro no laboratório. Em carrapatos, todas as fases do desenvolvimento (exceto ovo) são hematófagos e adquirir uma refeição de sangue quando anexado a seus hospedeiros vertebrados é essencial para a conclusão bem sucedida de seu ciclo de vida. Aqui vamos demonstrar um método simples que utiliza cápsulas facilmente openable para alimentação de carrapato duro em coelhos. As vantagens do método proposto incluem sua simplicidade, curta duração e sobretudo versátil ajuste às necessidades dos requisitos específicos de experimentais. O método possibilita o uso de múltiplas câmaras (de vários tamanhos) do mesmo animal, que permite a alimentação de vários estágios ou diferentes grupos experimentais, reduzindo a exigência geral de animais. Os materiais não-irritante e facilmente acessíveis usados minimiza o desconforto para os animais, que podem ser facilmente recuperados de um experimento e oferecido para adoção ou reutilizados se o protocolo ético permitir.
Introduction
Os carrapatos duro (Ixodidae) são conhecidos como artrópodes alimentação lentas e podem ser conectados em um host para vários dias, ou semanas, dependendo da espécie e do desenvolvimento fase1. Estes artrópodes hematófagos obrigatórios são vetores de uma grande variedade de agentes infecciosos, como bactérias, protozoários e vírus e, portanto, constituem um risco significativo para os seres humanos e animais saúde1. Quando estudando biologia carrapato ou avaliar novos métodos de controle, o estabelecimento de uma escala eficaz sistema de alimentação é crucial para efetivamente desenha os experimentos e realizar o objetivo (s) do estudo. Recentemente, vários sistemas de alimentação artificial de carrapato (evitando o uso de animais vivos) foram desenvolvidos2,3,4 e devem ser usados sempre que possível. No entanto, estes sistemas não foram capazes de substituir carrapato, alimentando-se de animais vivos, e eles não são substitutos adequados para muitas condições fisiológicas necessárias para estudos científicos. Portanto, em alguns casos, o uso de cobaias animais é crucial para garantir a relevância dos resultados experimentais.
Coelhos Nova Zelândia de laboratório têm mostrado os anfitriões mais adequados e acessíveis para vários ixodid carrapato espécie5,6,7,8,9. Duas estratégias comuns de carrapato, alimentando-se de coelhos foram usadas frequentemente: a) alimentar em orelhas de coelho, cobertas com algodão pano ou meias6,7e b) em sacos de algodão9, nylon garrafas10 ou neopreno câmaras11 colado à traseira do coelho. Alimentando-se de orelhas de coelho não é um sistema elegante, porque carrapatos (especialmente primeiros estágios, larvas ou ninfas) podem rastejar e anexar no fundo do canal auditivo, que é desconfortável para o animal e faz o acompanhamento da escala de alimentação e/ou a recuperação de ingurgitadas difícil de carrapatos. Este sistema também é limitado a apenas dois grupos de carrapato na orelhas totalmente cobertos por meias protegidas por colares Elizabetanos, representando um significativo desconforto para o animal. Outros sistemas9,10,11 são definitivamente mais avançados e adequados para a manutenção de colônia de tiquetaque duro. No entanto, eles são limitados no número de grupos experimentais colocados no coelho, bem como nas formas/tamanhos modificáveis das câmaras de alimentação. Além disso, esses protocolos exigem muitas vezes as pernas traseiras coelho para evitar coçar e o uso de colares elizabetanos para evitar o aliciamento a coxear.
Neste documento, propomos um método simples, não-trabalhoso e muito eficaz para alimentar vários grupos de carrapatos duro nas câmaras fechadas colados o coelho volta coberto por uma jaqueta, eliminando a necessidade para os colares elizabetanos ou coxear durante o experimento. Especificamente, nosso sistema usa cápsulas elásticas, feita de uma folha de espuma do etileno-vinil acetato (EVA) abrangidos pela malha de mosquito e colado para o coelho raspado volta com cola látex de não-irritante rápida solidificação (3 min). Esta técnica permite a fixação de várias cápsulas de forma ou tamanho desejado, e poucas semanas após o experimento os coelhos são totalmente recuperados. O sistema é adequado principalmente para os estágios de ninfa e adultos tiquetaque duro, mas com uma pequena modificação pode ser usada para larvas de alimentação também. Os métodos baseados em espuma de EVA para tiquetaque duro de alimentação podem ser adaptados para outros tipos de hospedeiros vertebrados, por exemplo, carneiros (que são mostrados como uma das alternativas neste artigo).
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Protocol
Nota: Neste estudo, coelhos foram mantidos em gaiolas padrão com comida e água oferecidos ad libitum na agência francesa para a alimentação, meio ambiente e saúde ocupacional & segurança (ANSES) credenciado instalações animais em Maisons-Alfort, França. Os animais foram monitorados duas vezes diariamente por dois técnicos experientes por reações anormais da pele, problemas de saúde ou complicações. A sala experimental foi assegurada enquadrando o interior da porta com fita dupla-face para evitar fuga acidental de tiques. O método funciona melhor se duas pessoas trabalham como uma equipe, mas é possível completar única handedly por uma pessoa experiente. Apesar da maioria dos coelhos são dóceis e calmos, sinais de stress podem ocorrer durante a manipulação. Para garantir que um coelho não ferir-se por lutando, contenção manual pode ser realizada mantendo delicadamente da nuca do pescoço com uma mão enquanto a outra mão ele suporta quartos traseiros. A seis meses de idade, Rambouillet Ovinos fêmeas foi mantido no centro para instalações de pesquisa biomédica (CRBM) na escola nacional veterinária de Alfort (ENVA), onde água e comida foram fornecidos ad libitum, e isso foi verificado duas vezes ao dia.
Nota: Nosso laboratório recebeu permissão para usar coelhos e ovelhas para carrapato alimentação pelo Comitê de ética Animal experimentos ComEth Anses/ENVA/UPEC, permitir números 01741.01 e 11/10/16-5B, respectivamente. Desde que usamos apenas carrapatos isentos de agentes patogénicos em nossos experimentos, todos os coelhos utilizados neste estudo foram oferecidos para adoção através da Associação de coelho branco, Paris, França.
1. preparação das cápsulas
- Corte o tamanho desejado da cápsula da folha de espuma de EVA (Figura 1A). Ronda exterior cantos (Figura 1B) da cápsula para minimizar o desprendimento acidental quando a colagem é a pele de coelho.
Nota: A espessura do quadro da cápsula deve ser em torno de 8 mm. Use uma folha de espuma espessa de 5 mm para as larvas, ninfas e espécies adultas de pequena escala como Ixodes. Uma folha de espuma de espessura de 1 cm é apropriada para o tamanho grande carrapatos adultos como Amblyomma SP., Hyalomma SP., etc. , que o tamanho da cápsula varia com base nos requisitos experimentais. Por exemplo, para 20 casais adultos de Ixodes , 200 ninfas ou 1.000 larvas, usamos uma cápsula interna do tamanho de 5 x 5 cm2, 6 x 7 cm2 ou 7 x 9 cm2, respectivamente. - Corte o 8 mm de largura tiras auto-adesivas gancho de fita (ver Tabela de materiais) e fure-os ao quadro preparado de espuma de EVA (Figura 1C).
- Corte as tiras de tamanho mesmo auto-adesivos loop de fita (ver Tabela de materiais) e ligação-los para os lados do gancho anexado ao quadro de espuma de EVA (Figura 1D).
- Cortar o tamanho apropriado da malha fina de mosquito (malhagem inferior a 50 µm) para o tamanho do quadro de espuma de EVA e colá-la ao lacete autoadesivo (Figura 1E e 1F). Se necessário, corte as saliências.
Nota: Este tipo de cápsula pode ser usado para alimentar ninfas e adultos de espécies de carrapato duro, enquanto um sistema de fecho diferente das cápsulas é necessária para alimentação larval (Supplemental Figura 1) para evitar a fuga acidental das larvas através do arrumações lado do gancho-e-laço.
2. preparação do coelho antes de infestação de carrapato
- Raspe a região das costas de coelho e os lados para ser usado com tesoura(Figura 2).
- Aplique a cola de látex não-irritante para toda a superfície da cápsula preparada e esperar 1 min (Figura 2B).
- Cola a cápsula pressionando na pele (especialmente nos cantos) com os dedos por cerca de 3 minutos (Figura 2 e 2D).
Nota: Quando a colagem de mais de uma cápsula, certifique-se de manter pelo menos 5 mm de espaço entre elas (Figura 2E e 2F). Nós geralmente evitar a região da coluna vertebral, mas pode ser usado se necessário. - Levante ligeiramente as cápsulas para verificar visualmente o seu apego à pele. Se encontram-se as regiões não-inscritos, aplique a cola com uma espátula e pressione por mais 3 minutos.
- Aplique a fita protetora para as patas traseiras do coelho para não danificar o revestimento (Figura 2G).
Nota: Este passo é opcional e é principalmente para evitar danos de jaqueta, nem danos para a cápsula de carrapato. - Coloque o casaco de coelho, colocando as patas dianteiras através das aberturas e apertar o pescoço, fazendo certo coelho permanece confortável a respirar. Não coloque as pernas traseiras através os cercos elásticas para esta etapa e deixar o zíper aberto (Figura 2H).
3. tick infestação
- Coloque os carrapatos em uma seringa de plástico (1 ou 5 mL dependendo do número de indivíduos) com o fim de agulha corte e obstruídos com algodão (Figura 1G). Se uma pequena quantidade de carrapatos deve ser infestados, use fórceps.
Nota: Para permitir a manutenção de colônia de carrapato o carrapato ingurgitado female(s) a pôr ovos com incubação subsequentes dentro da seringa (5 ou 10 mL) abrangida pelo mosquito malha envolvida por uma faixa de borracha12 para evitar a manipulação laboriosa das larvas no momento eles estão aplicado para o host (Figura 1-H). Também, totalmente ingurgitadas larvas podem muda na seringa (Figura suplementar 1I; 5 ou 10 mL) para a infestação direta do coelho com ninfas. - Coloque a seringa profundamente a cápsula via a céu aberto de canto e inocular os carrapatos, empurrando o êmbolo da seringa. Gire lentamente o êmbolo em direção à pele de coelho para remover os carrapatos restantes anexados para o êmbolo e simultaneamente retirá-lo da cápsula (Figura 2eu).
Nota: Se alguns dos indivíduos rastejaram para fora da cápsula, devolvê-los usando fórceps. - Feche a cápsula após o gancho-e-laço de fita.
- Coloque as pernas traseiras do coelho na parte traseira elásticos cercos da jaqueta e do fecho de correr fechados.
Nota: Certifique que um dedo pode caber entre o pescoço do casaco e o coelho para garantir o conforto e também para evitar mastigar a jaqueta. - Retorne o coelho para a gaiola (Figura 2J).
Nota: O tempo de infestação para coleta de carrapatos repletos variam entre carrapato diferentes espécies e as fases do desenvolvimento. Por exemplo, para Ixodes scapularis e Ixodes ricinus, as durações de alimentação para adultos, ninfas e larvas são 6 – 9, 3-4 e 2-3 dias, respectivamente. Uma lista de referências para 29 tiquetaque duro diferentes ciclos de vida em condições de laboratório pode ser encontrada em Levin e Shumacher (2016)9.
4. recolha e monitorização de carrapatos
- Tirar o coelho da gaiola para o banco e descompacte o casaco.
- Suavemente, coibir o coelho com as mãos. Abrir a cápsula, desapertando a gancho-e-laço fita (Figura 2 K e 2L) e coletar os carrapatos de escovar as larvas ingurgitadas (Supplemental Figura 1) ou ninfas para um prato de plástico ou usar fórceps para adultos (Figura 2L ). Se parcialmente alimentados (não repleta) carrapatos são necessários, use uma twister carrapato ou fórceps para desanexá-los.
Nota: Se a manutenção das colônias de carrapato, por favor, consulte a observação passo 3.1. Manter os carrapatos ingurgitados em apropriado úmidos e condições de temperatura, de acordo com a espécie de carrapato particular. - Se necessário, apertá-novamente a gancho-e-laço fita para fechar a cápsula.
5. recuperação do coelho
- Retire completamente a malha de mosquito a cápsula e deixa o casaco no coelho (Figura 2M).
- Esperar 3-4 semanas e tentar remover a cápsula aparando delicadamente um dos cantos (Figura 2N). Se a cápsula está ainda firmemente ligada, repita este passo uma semana mais tarde.
- Remova o casaco e deixar que o coelho recupera na gaiola.
Nota: Uma vez que a cápsula está desligado, verifique a pele do coelho para reações anormais. Embora normalmente nenhum tratamento é necessário, uma loção emoliente pode ser usada em caso de irritação. - Se o protocolo e experimentos permitem, o coelho recuperado (Figura 2O) pode ser reutilizado ou oferecido para adoção.
Nota: Coelhos foram mostrados para adquirir resistência de carrapato, uma vez exposta a infestações de carrapato repetidas13; Portanto, reinfestations não são recomendados, a menos que o experimento requer.
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Representative Results
Aqui propomos pela primeira vez um método detalhado passo-a passo de tiquetaque duro alimentação em espuma EVA cápsulas aplicadas à traseira de um coelho raspada, coberto por uma jaqueta (Figura 1 e Figura 2). Este protocolo é apropriado para vários tipos de experimentos, quando grupos de escala diferentes no mesmo host são necessários e também podem ser usados para a criação em massa de carrapatos duro. O carrapato de sucesso no laboratório de alimentação principalmente baseia-se na aptidão dos indivíduos carrapato e adequação do host de coelho para a espécie de carrapato específico, em vez da técnica em si. Nosso sistema usando espuma de EVA cápsulas colados à volta do coelho tem sido provados para ser altamente bem sucedido quando alimentar diferentes estádios de desenvolvimento do tiquetaque duro várias espécies (tabela 1) e pode também ser adaptado para outro tipo de hosts de laboratório, tais como ovelhas ( A Figura 3).
As principais vantagens deste método são a simplicidade, materiais facilmente acessíveis (Tabela de materiais) e, mais importante, um sistema de abre-fecha confortável permitindo fácil monitorização dos carrapatos durante a alimentação. Além disso, este método versátil oferece a possibilidade de uma variedade de diferentes configurações experimentais baseada o número modificável, forma e composição das cápsulas no host (Figura 2D-F), responder aos desafios do estudo particular. O uso da cola látex altamente eficaz, secagem rápida e não-irritante garante que a cápsula está firmemente colada em três minutos e permanece ligada pelo menos três semanas. Este procedimento também permite a completa recuperação do coelho anfitriões após os experimentos (Figura 2O).
Figura 1 : Preparação da cápsula de espuma de EVA e carrapatos. (A, B) Corte a cápsula de espuma EVA. (C) colocar as tiras de fita autoadesiva de gancho para a cápsula. (D) ligação as tiras do lado de laço e descascando a fita de fixadores. (E, F) Furando a malha de mosquito para as tiras adesivas. (G) exemplo de adultos carrapatos duro dentro da seringa (5 mL), com o corte final-agulha coberta pelo algodão. (H) exemplo de recém eclosão as larvas dentro da seringa com a agulha corte final-abrangida pela malha mosquito mantido no lugar por um elástico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Colagem da cápsula para o coelho, assinale a remoção/recuperação de infestação e cápsula. (A) raspado atrás do coelho. (B) aplicação da cola para a cápsula de espuma de EVA preparada. (C, D) Penhora de cápsulas de tamanho diferente para o coelho. (E, F) Vista dorsal de um coelho mostrando duas ou várias câmaras conectadas à parte traseira, respectivamente. (G), a fita é posicionado ao redor os pés traseiros. (H), a jaqueta é aplicado a partir as pernas dianteiras e o pescoço e a parte traseira é deixada em aberto. Abrir o canto da cápsula também é mostrado. (eu) colocando os carrapatos da cápsula através de canto aberto, utilizando a seringa. (J), a jaqueta é compactado completamente e o coelho é transferido para a gaiola. (K) monitorando os carrapatos durante sua alimentação através da abertura da cápsula. (L) coleta de carrapatos repletos, usando a pinça. (M) cápsula vazia após a remoção do tiquetaque. (N) descolamento da cápsula (após 3-4 semanas) de coelho. (O) totalmente recuperado coelho clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Sistema adaptado às ovelhas da espuma de EVA. (A) fixação uma área depilada e limpa no lado lateral da ovelha volta das cápsulas de espuma. (B) após a infestação, as cápsulas anexadas são cobertas com uma bandagem (malha tubular ortopédica), ao invés de um casaco. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Espécie de carrapato | Número de carrapatos/número infestado de carrapatos ingurgitados (%) | ||
| Larvas | Ninfas | Fêmeas | |
| Ixodes ricinus | - | 692/557 (80.49%) | 670/592 (88.35%) |
| Ixodes scapularis | - | - | 40/34 (85%) |
| Dermacentor reticulatus | 3.550/3255 (91,7%) | 900/803 (89.22%) | 323/305 (94.42%) |
| Rhipicephalus appendiculatus | 3.300/2822 (85.52%) | 490/421 (85.91%) | 370/362 (97.83%) |
| Rhipicephalus pulchelus | - | 1.920/1831 (% de 95.36) | 282/257 (91.13%) |
| Amblyomma variegatum | 332/225 (67.77%) | 404/308 (76.24%) | 207/146 (70.53%) |
| Amblyomma americanum | - | 140/134 (95.71%) | 27/31 (87,1%) |
| Hyalomma excavatum | 1.000 * | 510 * (58,8%) | 380/313 (82.36%) |
Tabela 1: Taxa de ingurgitamento de diferentes estádios de desenvolvimento das espécies de carrapato duro, alimentando-se de coelhos dentro de cápsulas de espuma de EVA. * Devido ao rápido processo de muda dos estágios imaturos de H. excavatum , as larvas ingurgitadas (dados não mostrados) foram deixadas para muda em ninfas que ingurgitadas posteriormente na cápsula do mesma.
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Discussion
O passo mais importante no presente protocolo inteiro é colar a cápsula com firmeza para a pele depilada. Por esta razão, pressão constante pelo menos 3 minutos é crítica, especialmente nos cantos. Quando vacinar os carrapatos na cápsula, é importante aplicá-los profundamente no canto oposto do aberto para evitar a fuga de carrapato durante a selagem. Quando o planejamento de experimentos, certifique-se de que todas as cápsulas são cobertas pelo casaco para evitar danos por mastigar ou coçar. Certifique-se que a região do pescoço da jaqueta é apertada o suficiente para evitar mastigar mas suficientemente solta que o coelho continua a ser confortável.
Uma das principais vantagens da técnica descrita é sua simplicidade e que modificações em termos de tamanho e número das cápsulas pode ser usado. Durante nossos experimentos, desprendimento de cápsulas de pele não foram observadas. No entanto, ocasionais de jaqueta (mas não a cápsula) pelo coelho poderá ficar danificada.
Nos coelhos, temos observado que, na cápsula, totalmente ingurgitadas-desanexado carrapatos (estágios principalmente imaturos como larvas e ninfas) desidratam mais rápido devido à temperatura do coelho. Por esta razão, nós sugerimos para estimar a duração do período de alimentação das espécies de carrapato particular e palco, para planejar a coleção de carrapato ingurgitadas imediatamente após o seu destacamento. Embora nosso sistema foi testado para a alimentação de várias espécies de carrapato duro (tabela 1), o coelho não é um hospedeiro natural para todas as espécies de tiquetaque duro14. Esta limitação pode ser superada por adaptar este sistema para outros hospedeiros animais apropriados para uma espécie particular de tiquetaque duro. Aqui nós relatamos o uso do sistema de espuma de EVA, adaptado às ovelhas para alimentar todas as fases do desenvolvimento de I. ricinus (Figura 3). Neste caso em particular, a ovelha precisa ser raspado e lavado com algodão impregnado com etanol a 70% para eliminar o óleo presente na superfície da pele. Depois seguiu-se o mesmo procedimento como aquele descrito por coelhos, mas ao invés de um casaco, uma bandagem de algodão foi usada por trás como mostrado na Figura 3.
Ao desenvolver este sistema, nós pagamos a atenção especial para minimizar a quantidade de materiais utilizados e as etapas do procedimento. Em comparação com outros métodos, não usamos anestesia, coelho colares, meias orelha ou mancando das pernas traseiras5,6,7,8,9,10. Além disso, o presente protocolo não é trabalhoso, e nenhum treinamento intensivo é necessário familiarizar-se com esta técnica. O carrapato com base de espuma de EVA, alimentando o sistema detalhado neste estudo é esperado para ser usado para uma variedade de diferentes experiências quando estudando biologia carrapato, interações patógeno-hospedeiro-vector, ou avaliar controle diferente medidas como acaricidas ou vacinas. Nosso rumo vai ser adaptar-se a cápsula de espuma de EVA sistema de alimentação para o modelo do rato para alimentar estágios imaturos de carrapatos duro.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Reconhecemos a assistência técnica de Evelyne Le Naour, francês Instituto Nacional de pesquisa agrícola (INRA), Alain Bernier (INRA) e Océane Le Bidel (ANSES). Consuelo Almazán foi apoiado por uma bolsa do laboratório de excelência, Integrativa biologia of Emerging Infectious Diseases (LabEx IBEID), Instituto Pasteur. Os coelhos e ovelhas foram compradas pela ANSES. Parte deste trabalho foi financiado pelos institutos nacionais de subsídio de saúde RO1AI090062 para Y. Park. Dr. Jeffrey L. Blair é reconhecido para revisar o manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| New Zealand Rabbits (2.5-3.5 kg) | Charles River | Strain Code 571 | |
| Rambouillet sheep | Local provider-tick free farm | Female 6 months old | |
| EVA foam 5 mm thick | Cosplay Shop | EVA-PE451kg (950mm x 450mm) | 10 mm PE45 kg foam from the Cosplay Shop may be used for the large adult tick species |
| Foam Sheet 9" X 12" 6 mm-White | Amazon | FOAMSHT6-20 | 6 mm-EVA foam ca be ordered via Amazon as an alternative to the foam from Cosplay Shop |
| Full length rabbit jackets | Harvard Apparatus, Inc. | 620077- medium, 6270078 - large | |
| Non-toxic latex glue | Tear mender | Fabric & Leather Adhesive | |
| Tubular cotton orthopedic stockinette | BSN Medical | 9076 (12-15 cm wide) | |
| Mosquito mesh | Loisirs Creatifs | Very fine filter nylon mesh fabric | Any mosquito mesh, or curtain material with the mesh size less than 50 μm is suitable. |
| Leukoplast | BSN medical S.A.S | LF 72361-02 | |
| Adhesive hook-and-loop tape | AIEX store | AIEX 39.37 Feet/12m Hook and Loop Self Adhesive Tape Roll, 20 mm width, white colour | Fullfiled by Amazon |
| Fast drying glue | Fixtout | Superglue |
References
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