Summary
Hemos desarrollado un sistema sencillo y versátil para las garrapatas duras se alimentan de conejos de laboratorio. Nuestro protocolo no laborioso utiliza materiales fácilmente accesibles y se puede ajustar según los requerimientos de las diferentes configuraciones experimentales. El método permite cómodo monitoreo o muestreo de garrapatas durante todo el período de alimentación.
Abstract
El uso de animales vivos en la investigación de la garrapata es crucial para una variedad de propósitos experimentales incluyendo el mantenimiento de colonias de señal dura en el laboratorio. En garrapatas, todas las etapas del desarrollo (excepto el huevo) son hematófagos, y adquirir una comida de sangre cuando sus hospederos vertebrados es esencial para la realización de su ciclo de vida. Aquí se demuestra un método simple que utiliza cápsulas de fácilmente se puede abrir para la alimentación de garrapatas duras en conejos. Las ventajas del método propuesto incluyen su simplicidad, corta duración y lo más importante es versátil ajuste a las necesidades de los requisitos específicos de experimentales. El método hace posible el uso de múltiples cámaras (varios tamaños) en el mismo animal, que permite la alimentación de múltiples etapas o diferentes grupos experimentales reduciendo el requisito general de animales. Los materiales no-irritante y de fácil acceso minimiza las molestias a los animales, que pueden ser fácilmente recuperados de un experimento y ofrecidos para adopción o reutilizarse si lo permite el protocolo ético.
Introduction
Las garrapatas duras (Ixodidae) son conocidas como artrópodos alimentación lento y pueden ser atadas en un host durante varios días, o semanas, dependiendo de la especie y del desarrollo de la etapa1. Estos artrópodos hematófagos obligatorios son vectores de una gran variedad de agentes infecciosos, como bacterias, protozoos y virus y así presentan un riesgo significativo para los seres humanos y de salud animal1. Cuando estudiar biología de la garrapata o evaluación de nuevos métodos de control, el establecimiento de una marca eficaz sistema de alimentación es crucial para los experimentos de diseño efectivamente y lograr los propósitos del estudio. Recientemente, varios sistemas de alimentación artificial de la garrapata (evitando el uso de animales vivos) han desarrollado2,3,4 y deben usarse siempre que sea posible. Sin embargo, estos sistemas no han sido capaces de sustituir completamente la garrapata alimentándose de animales vivos, y no son sustitutos adecuados para muchas condiciones fisiológicas necesarias para estudios científicos. Por lo tanto, en algunos casos, el uso de los ejércitos de animales experimentales es fundamental para garantizar la pertinencia de los resultados experimentales.
Conejos Nueva Zelanda de laboratorio han demostrado ser la sede más conveniente y accesible para varios ixodid garrapatas especies5,6,7,8,9. Dos estrategias comunes de garrapatas que se alimentan de conejos se han utilizado con frecuencia: a) alimentación en orejas de conejo cubiertos con algodón paño o calcetines6,7y b) de alimentación en algodón bolsas9, nylon botellas10 o neopreno cámaras11 pegado a la parte posterior del conejo. La alimentación en las orejas del conejo no es un sistema elegante, porque las garrapatas (especialmente primeras etapas, las larvas o ninfas) pueden arrastrarse y coloque en el canal auditivo, que es incómodo para el animal y hace el seguimiento de la señal de alimentación o la recuperación de engorged garrapatas difícil. Este sistema también está limitado a sólo dos grupos de garrapata en oídos completamente cubiertos por calcetines protegidos por collares Elizabethan, que representa un malestar significativo para el animal. Otros sistemas9,10,11 son definitivamente más avanzado y muy adecuado para el mantenimiento de la colonia de garrapatas duras. Sin embargo, están limitados en el número de grupos experimentales al conejo, así como en las tamaños/formas modificables de las cámaras de alimentación. Además, estos protocolos requieren a menudo cojeando de las patas de conejo posterior para evitar el rascado y el uso de collares isabelinos para prevenir el grooming.
Aquí proponemos un método simple, no laborioso y muy eficaz para alimentar a varios grupos de garrapatas duras en cámaras cerradas pegados al conejo nuevamente cubierto por una chaqueta, eliminando la necesidad de collares isabelinos o cojeando durante el experimento. Específicamente, nuestro sistema utiliza cápsulas elásticas de una hoja de espuma Etileno vinilo acetato (EVA) cubierto por malla de mosquito y pegado al conejo depilado con pegamento látex no irritante solidificación rápida (3 minutos). Esta técnica permite múltiples cápsulas del tamaño deseado o el forma y pocas semanas después el experimento de los conejos se recuperan completamente. El sistema es adecuado principalmente para las etapas nymphal y adulto marca duro, pero con una pequeña modificación puede ser utilizado para las larvas que se alimenta tan bien. Los métodos basados en espuma de EVA para señal dura la alimentación pueden adaptarse a otros tipos de huéspedes vertebrados, por ejemplo ovejas (que se muestran como una de las alternativas en este papel).
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Protocol
Nota: En este estudio, los conejos se mantuvieron en jaulas estándar con alimentos y agua ofreció ad libitum en la agencia francesa para la alimentación, medio ambiente y salud ocupacional y seguridad (ANSES) acreditados instalaciones en Maisons-Alfort, Francia. Animales fueron monitoreados dos veces al día por dos técnicos experimentados por reacciones anormales de la piel, problemas de salud o las complicaciones. La sala experimental fue asegurada por la estructura del interior de la puerta con cinta de doble cara para evitar el escape accidental de las garrapatas. El método funciona mejor si dos personas trabajan en equipo, pero es posible hacer solo sin ayuda por una persona experimentada. Aunque la mayoría los conejos son dóciles y tranquilas, signos de tensión pueden ocurrir durante la manipulación. Para asegurar que un conejo no herir a sí mismo por luchar, moderación manual puede lograrse manteniendo suavemente de scruff del cuello con una mano mientras la otra mano soporta cuartos traseros. Los seis meses de edad, Rambouillet ovejas hembra se mantuvieron en el centro de servicios de investigación biomédica (CRBM) en la Escuela Nacional Veterinaria de Alfort (envie), donde agua y alimentos fueron suministrados ad libitum, y se comprobó dos veces al día.
Nota: Nuestro laboratorio ha recibido permiso para usar conejos y ovejas para la señal de alimentación por el Comité de ética Animal experimentos viene Anses/envie/UPEC, permiso número 01741.01 y 11/10/16-5B, respectivamente. Puesto que utilizamos las garrapatas sólo libre de patógeno en nuestros experimentos, todos los conejos utilizados en este estudio fueron ofrecidos para su adopción a través de la Asociación de conejo blanco, París, Francia.
1. preparación de las cápsulas
- Cortar el tamaño deseado de la cápsula de la hoja de la espuma de EVA (figura 1A). Ronda exterior esquinas (figura 1B) de la cápsula para minimizar el desprendimiento accidental cuando pegado a la piel de conejo.
Nota: El grueso del marco de la cápsula debe ser aproximadamente 8 mm. uso una hoja de espuma gruesa de 5 milímetros para las larvas, ninfas y adultos especies pequeñas garrapatas Ixodes. Una hoja de espuma de 1 cm de espesor es adecuada para garrapatas adultas como Amblyomma SP., Hyalomma SP., etc. que el tamaño de la cápsula varía según los requerimientos experimentales de gran tamaño. Por ejemplo, para 20 parejas de adultos de Ixodes , 200 ninfas o 1.000 larvas, utilizamos un tamaño interior de la cápsula de 5 x 5 cm2, 6 x 7 cm2 o 7 x 9 cm2, respectivamente. - Cortar tiras de 8 mm de ancho de gancho auto-adhesivo de cinta (véase Tabla de materiales) y péguelos en el bastidor de espuma EVA preparado (figura 1C).
- Corte las tiras del tamaño mismo de lazo auto-adhesivo (véase Tabla de materiales) de la cinta y atan a los lados del gancho se une a la estructura de la espuma de EVA (figura 1D).
- Corta el tamaño apropiado de la malla de mosquito fina (malla de menos de 50 μm) con el tamaño de la estructura de espuma EVA y pegarla al lazo auto-adhesivo (Figura 1E y 1F). Si fuese necesario, corte los salientes.
Nota: Este tipo de cápsula se puede utilizar para alimentar a las ninfas y adultos de la especie de garrapata dura, mientras otro sistema de sellado de las cápsulas es necesario para la alimentación de larvas (figura 1 complementaria) para prevenir el escape accidental de las larvas mediante el sujetado gancho y lazo lateral.
2. preparación del conejo antes de infestación de la señal
- Afeite la zona de la espalda de conejo y los lados para ser utilizado con máquinas de cortar (figura 2A).
- Aplique pegamento de látex no irritante en toda la superficie de la cápsula preparada y esperar 1 minuto (figura 2B).
- Pegue la cápsula presionando sobre la piel (especialmente en las esquinas) con los dedos durante unos 3 minutos (figura 2 y 2D).
Nota: Al pegar más de una cápsula, asegúrese de mantener al menos 5 mm espacio entre ellas (Figura 2E y 2F). Generalmente evitamos la región de la columna vertebral, pero puede utilizarse si es necesario. - Levantar ligeramente las cápsulas para comprobar visualmente su adhesión a la piel. Si las regiones no inscritos se encuentran, aplique el pegamento con una espátula y presione durante otros 3 minutos.
- Aplique cinta protectora en las patas traseras del conejo para evitar daños de la chaqueta (figura 2G).
Nota: Este paso es opcional y es principalmente para prevenir el daño de la chaqueta, no dañar a la cápsula de la garrapata. - Poner en la chaqueta de conejo colocando las patas delanteras a través de las aberturas y apretar el cuello, hacer conejo su respiración sigue siendo cómoda. No coloque las patas traseras a través de los cerramientos elástico en este paso y dejar la cremallera abierta (figura 2H).
3. infestación de la señal
- Colocar las señales en una jeringa de plástico (1 ó 5 mL dependiendo del número de los individuos) con el extremo de la aguja cortada y tapada con algodón (figura 1G). Si una pequeña cantidad de garrapatas infestadas, use pinzas.
Nota: Para mantenimiento de Colonia garrapata permite la garrapata congestionan female(s) a poner huevos con incubación posterior dentro de la jeringa (5 o 10 mL) cubierta por la malla de mosquito envuelta por una banda de goma12 para evitar la manipulación laboriosa de las larvas en el momento son aplicado al host (figura 1H). También, completamente congestionan las larvas pueden permitir mudar en la jeringa (suplementario figura 1I; 5 o 10 mL) para la infestación directa del conejo con ninfas. - Coloque la jeringa en la cápsula a través de la apertura del ángulo e inocular las garrapatas empujando el émbolo de la jeringa. Gire lentamente el émbolo hacia la piel de conejo para quitar las garrapatas restantes Unidas al émbolo y al mismo tiempo tirar hacia fuera de la cápsula (figura 2).
Nota: Si algunas de las personas arrastran fuera de la cápsula, devolverlos con unas pinzas. - Ligando la cinta de gancho y lazo para cerrar la cápsula.
- Coloque las patas traseras del conejo en la parte posterior elásticas recintos de la chaqueta y zip cerrados.
Nota: Asegúrese de que un índice puede encajar en el cuello de la chaqueta y el conejo para asegurar comodidad y también para evitar la masticación en la chaqueta. - Devuelva el conejo en la jaula (figura 2J).
Nota: El tiempo de la infestación a colección de garrapatas repletas varían entre especies de garrapatas diferentes y las etapas de desarrollo. Por ejemplo, scapularis de Ixodes ricinus de Ixodesy la duración de la alimentación de adultos, ninfas y larvas es 6-9, 3, 4 y 2-3 días, respectivamente. Una lista de referencias para 29 señal dura diferentes ciclos de vida en condiciones de laboratorio se puede encontrar en Levin y Shumacher (2016)9.
4. recolección y control de garrapatas
- Tomar el conejo de la jaula a la banca y abra la chaqueta.
- Frenar suavemente el conejo con las manos. Abrir la cápsula soltando la cinta de gancho y lazo (figura 2 K y 2 L) y recoger las garrapatas por cepillado la congestionan las larvas (figura 1 complementaria) o ninfas a un plato de plástico o con unas pinzas para los adultos (figura 2L ). Si parcialmente alimentado (no lleno), las garrapatas están necesarias, utilice un twister de garrapata o fórceps para separarlos.
Nota: Si mantiene las colonias de garrapatas por favor ver la nota en el paso 3.1. Mantener la garrapatas engorged en apropiado húmedas y la temperatura según la especie de garrapata particular. - Si es necesario, vuelva a conectar la cinta de gancho y lazo para cerrar la cápsula.
5. recuperación del conejo
- Retire completamente la malla de mosquito de la cápsula y dejar la chaqueta en el conejo (figura 2M).
- Esperar 3-4 semanas y tratar de quitar la cápsula con cuidado cortar una de las esquinas (figura 2N). Si la cápsula está firmemente conectada, repita este paso una semana más tarde.
- Quite la chaqueta y dejar que recupera el conejo en la jaula.
Nota: Una vez que la cápsula está apagado, revise la piel del conejo para las reacciones anormales. Aunque normalmente no se requiere tratamiento, se puede utilizar una loción emoliente en caso de irritación. - Si permiten el protocolo y los experimentos, el conejo recuperado (figura 2O) puede reutilizar u ofrecido para su adopción.
Nota: Los conejos han demostrado que adquieren resistencia de la garrapata una vez expuesta a infestaciones de garrapatas repetido13; por lo tanto, reinfestations no se recomiendan a menos que el experimento requiere.
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Representative Results
Aquí proponemos por primera vez un método detallado paso a paso de la señal dura alimentación en espuma EVA cápsulas aplicados a la parte trasera de un conejo depilado, cubierto por una chaqueta (figura 1 y figura 2). Este protocolo es adecuado para varios tipos de experimentos cuando grupos diferentes de garrapatas en el mismo host son necesarios y también pueden utilizarse para la cría masiva de garrapatas duras. La marca éxito en el laboratorio de alimentación principalmente se basa en la aptitud de los individuos de la garrapata y la conveniencia de la hostia de conejo para la especie de garrapata particular, más bien que la propia técnica. Nuestro sistema usando la espuma de EVA cápsulas pegadas a los conejos hacia atrás han demostrado para ser altamente exitoso cuando alimentación diferentes etapas de desarrollo de la garrapata dura varias especies (tabla 1) y puede también ser adaptado para otro tipo de hosts de laboratorio, como ovejas ( Figura 3).
Las principales ventajas de este método son la simplicidad, materiales fácilmente accesibles (Tabla de materiales) y, lo más importante, un cómodo sistema de abrir-cerrar que permite fácil control de las garrapatas durante la alimentación. Además, este método versátil ofrece la posibilidad de una variedad de diferentes entornos experimentales basado en el número modificable, la forma y la composición de las cápsulas en el host (figura 2D-F), frente a los retos de la estudio en particular. El uso del pegamento látex altamente eficaz, secado rápido y no-irritante asegura que la cápsula se pega firmemente en tres minutos y permanece conectada durante al menos tres semanas. Este procedimiento también permite una recuperación completa del conejo anfitriones después de los experimentos (figura 2O).
Figura 1 : Preparación de la cápsula de la espuma de EVA y las garrapatas. (A, B) Cortar la cápsula de la espuma de EVA. (C) colocación de las tiras de cinta auta-adhesivo del gancho a la cápsula. (D) el lazo lateral Bieses y pelar la cinta de los sujetadores. (E, F) Pegar la malla mosquito las tiras adhesivas. (G) ejemplo de garrapatas adultas duras dentro de la jeringa (5 mL) con aguja-extremo cortado cubierto por algodón. (H) ejemplo de recién eclosión las larvas dentro de la jeringa con la aguja extremo cortado, cubierto por la malla de mosquito sujeta por una goma. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Pegado a la cápsula para el conejo, marque eliminación/recuperación de infestación y cápsula de. (A) afeita la parte posterior del conejo. (B) aplicación del pegamento a la cápsula preparada de espuma EVA. (C, D) Accesorio de cápsulas de diferentes tamaños a los conejos. (E, F) Vista dorsal de un conejo mostrando dos o varias cámaras atados a la espalda, respectivamente. (G) la cinta se coloca alrededor de las patas traseras. (H) la chaqueta se aplica a partir de la patas delanteras y el cuello y la parte posterior se deja abierta. También se indica la apertura de la esquina de la cápsula. () Colocar las garrapatas a la cápsula a través de la esquina abierta usando la jeringa. (J) la chaqueta es con cremallera totalmente y el conejo se traslada a la jaula. (K) control las garrapatas durante su alimentación con la apertura de la cápsula. (L) recolección de garrapatas repletas con el fórceps. (M) cápsula vacía después de la eliminación de la garrapata. (N) la separación de la cápsula (3-4 semanas después) del conejo. (O) recuperado conejo haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Sistema adaptado a las ovejas de la espuma de EVA. (A) fijación de las cápsulas de espuma a un área de depilado y limpio en la parte lateral de las ovejas hacia atrás. (B) después de la infestación, las cápsulas adjuntadas están cubiertas con un vendaje (ortopédico stockinette), en lugar de una chaqueta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Especie de garrapata | Número de garrapatas infestada/número de garrapatas congestionan (%) | ||
| Larvas | Ninfas | Hembras | |
| Ixodes ricinus | - | 692/557 (80.49%) | 670/592 (88.35%) |
| Ixodes scapularis | - | - | 40/34 (85%) |
| Dermacentor reticulatus | 3.550/3255 (91.7%) | 900/803 (89.22%) | 323/305 (94.42%) |
| Rhipicephalus appendiculatus | 3.300/2822 (85.52%) | 490/421 (85.91%) | 370/362 (97.83%) |
| Rhipicephalus pulchelus | - | 1.920/1831 (95.36%) | 282/257 (91.13%) |
| Amblyomma variegatum | 332/225 (67.77%) | 404/308 (76.24%) | 207/146 (70.53%) |
| Americanum de Amblyomma | - | 140/134 (el 95.71%) | 31/27 (87,1%) |
| Hyalomma excavatum | 1.000 * | 510 * (58,8%) | 380/313 (82.36%) |
Tabla 1: Tasa de congestión de las diferentes etapas del desarrollo de especies de señal dura alimentarse de conejos dentro de cápsulas de espuma EVA. * Debido al rápido proceso de muda de H. excavatum inmaduras, las larvas congestionan (datos no mostrados) fueron dejadas para mudar a ninfas que engorged posteriormente en la misma cápsula.
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Discussion
El paso más importante en este conjunto del protocolo es pegar la cápsula firmemente a la piel afeitada. Por esta razón, una presión constante durante al menos 3 minutos es fundamental, especialmente en las esquinas. Al inocular las garrapatas en la cápsula, es importante aplicar profundamente en la esquina opuesta a la abierta para evitar escape de garrapatas durante el sellado. Al planificar los experimentos, asegúrese de que todas las cápsulas están cubiertas por la chaqueta para evitar daño por masticación o arañazos. Asegúrese de que la región del cuello de la chaqueta es lo suficientemente apretada como para evitar la masticación pero lo suficientemente floja que el conejo sigue siendo cómodo.
Una de las principales ventajas de la técnica descrita es su simplicidad y modificaciones en cuanto a tamaño y número de las cápsulas puede ser utilizado. Durante nuestros experimentos, no se observó separación de cápsulas de piel. Sin embargo, puede ocurrir daño ocasional de la chaqueta (pero no la cápsula) por el conejo.
En conejos, hemos observado que, en la cápsula, las garrapatas totalmente engorged-adosado (principalmente inmaduros como larvas y ninfas) desecar más rápido debido a la temperatura del conejo. Por esta razón, sugerimos para estimar la duración de la alimentación de la especie de garrapata particular y etapa, plan garrapata congestionan colección inmediatamente después de su separación. Aunque nuestro sistema ha sido probado para la alimentación de varias especies de señal dura (tabla 1), el conejo no es un hospedero natural para todas especies de señal dura14. Esta limitación puede superarse, adaptando este sistema a otros hospedadores animales adecuados para una especie de garrapata dura particular. Aquí divulgamos el uso del sistema de espuma EVA adaptado a ovejas para alimentar a todas las etapas del desarrollo de I. ricinus (figura 3). En este caso particular, la oveja tiene que ser afeitado y lavar con algodón impregnado con etanol al 70% para eliminar el aceite presente en la superficie de la piel. Luego siguió el mismo procedimiento descrito para los conejos, pero en lugar de una chaqueta, un vendaje de algodón fue utilizado alrededor de la parte posterior como se muestra en la figura 3.
En el desarrollo de este sistema, prestó especial atención para reducir al mínimo la cantidad de los materiales utilizados y los pasos del procedimiento. En comparación con otros métodos, no usamos anestesia, conejo cuellos, calcetines de oído o cojeando de las patas traseras5,6,7,8,9,10. Además, el presente Protocolo no es laborioso, y no una formación intensiva es necesaria para familiarizarse con esta técnica. La señal de base de espuma de EVA en este estudio el sistema de alimentación debe ser utilizado para una variedad de diferentes experimentos al estudiar la biología de la garrapata, vector-huésped-patógeno, o evaluación control diferentes medidas como acaricidas o vacunas. Nuestra dirección futura será adaptar la cápsula de espuma EVA sistema de alimentación para el modelo de ratón para alimentar Estados inmaduros de las garrapatas duras.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Reconocemos la asistencia técnica de Evelyne Le Naour, Instituto Nacional de investigaciones agrícolas (INIA), Alain Bernier (INRA) y Océane Le Bidel (ANSES). consuelo Almazán fue apoyado por una beca del laboratorio de excelencia, integradora biología de las enfermedades infecciosas emergentes (LabEx IBEID), Instituto Pasteur. Los conejos y las ovejas fueron compradas por ANSES. Parte de este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de la subvención de salud RO1AI090062 y parque. El Dr. Jeffrey L. Blair es reconocido por revisar el manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| New Zealand Rabbits (2.5-3.5 kg) | Charles River | Strain Code 571 | |
| Rambouillet sheep | Local provider-tick free farm | Female 6 months old | |
| EVA foam 5 mm thick | Cosplay Shop | EVA-PE451kg (950mm x 450mm) | 10 mm PE45 kg foam from the Cosplay Shop may be used for the large adult tick species |
| Foam Sheet 9" X 12" 6 mm-White | Amazon | FOAMSHT6-20 | 6 mm-EVA foam ca be ordered via Amazon as an alternative to the foam from Cosplay Shop |
| Full length rabbit jackets | Harvard Apparatus, Inc. | 620077- medium, 6270078 - large | |
| Non-toxic latex glue | Tear mender | Fabric & Leather Adhesive | |
| Tubular cotton orthopedic stockinette | BSN Medical | 9076 (12-15 cm wide) | |
| Mosquito mesh | Loisirs Creatifs | Very fine filter nylon mesh fabric | Any mosquito mesh, or curtain material with the mesh size less than 50 μm is suitable. |
| Leukoplast | BSN medical S.A.S | LF 72361-02 | |
| Adhesive hook-and-loop tape | AIEX store | AIEX 39.37 Feet/12m Hook and Loop Self Adhesive Tape Roll, 20 mm width, white colour | Fullfiled by Amazon |
| Fast drying glue | Fixtout | Superglue |
References
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