Summary
Nous avons mis au point un système simple et versatile pour nourrir les tiques dures sur des lapins de laboratoire. Notre protocole non-laborieux utilise des matériaux facilement accessibles et peut être ajusté selon les besoins des divers paramètres expérimentaux. La méthode permet de surveillance confortable et/ou un échantillonnage des tiques pendant toute la période d’alimentation.
Abstract
L’utilisation d’animaux vivants dans la recherche de tiques est cruciale pour une variété de fins expérimentales, y compris le maintien des colonies de tiques dures en laboratoire. Tiques, tous les stades de développement (à l’exception de le œuf) sont hématophages, en acquérant un repas de sang lorsqu’il est attaché à leurs hôtes vertébrés est essentiel pour la réussite de leur cycle de vie. Nous démontrons ici une méthode simple qui utilise des capsules facilement ouvrables pour l’alimentation des tiques dures sur les lapins. Les avantages de la méthode proposée sont sa simplicité, de courte durée et de surtout polyvalent ajustement aux besoins des conditions expérimentales spécifiques. La méthode rend possible l’utilisation de chambres multiples (de différentes tailles) sur le même animal, permettant l’alimentation de plusieurs étapes ou différents groupes expérimentaux, tout en réduisant la condition animale dans l’ensemble. Les matériaux non irritant et facilement accessibles minimise la gêne pour les animaux, qui peuvent être facilement récupérées à partir d’une expérience et proposés pour adoption ou réutilisées si le protocole éthique lui permet.
Introduction
Les tiques dures (Ixodidae) sont bien connus comme les arthropodes alimentation lentes et peuvent être fixés sur un hôte pendant plusieurs jours ou semaines, selon les espèces et le développement étape1. Ces arthropodes hématophages obligatoires sont des vecteurs d’une grande variété d’agents infectieux, tels que les bactéries, protozoaires et virus et donc présentent un risque important pour l’homme et de la santé animale1. Quand étudie la biologie de la tique ou évaluation de nouvelles méthodes de contrôle, la mise en place d’une tique efficace système d’alimentation est cruciale pour efficacement les expériences de conception et accomplir les objectifs de l’étude. Récemment, plusieurs systèmes d’alimentation artificielle tique (évitant l’utilisation d’animaux vivants) ont été développés2,3,4 , et ils devraient être utilisés chaque fois que possible. Toutefois, ces systèmes n’ont pas été en mesure de remplacer complètement les tiques se nourrissent des animaux vivants, et ils ne sont pas des substituts appropriés pour de nombreuses conditions physiologiques nécessaires à des études scientifiques. Par conséquent, dans certains cas, l’utilisation d’hôtes animaux expérimentaux est cruciale pour garantir la pertinence des résultats expérimentaux.
Lapins néo-zélandais de laboratoire ont montré pour être les hôtes plus appropriées et accessibles pour plusieurs piqûre tique espèces5,6,7,8,9. Deux stratégies communes de tique se nourrissant de lapins ont été fréquemment utilisés : un) se nourrissant des oreilles de lapin recouverts de coton tissu ou chaussettes6,7et b) alimentation en coton sacs9, nylon bouteilles10 ou néoprène chambres11 collée au dos du lapin. L’alimentation sur les oreilles du lapin n’est pas un système élégant, car les tiques (surtout les débuts, larves ou nymphes) peuvent ramper et attacher profondément dans le conduit auditif, ce qui est mal à l’aise pour l’animal et rend le contrôle des tiques alimentation et/ou la récupération des engorgés tiques sont difficiles. Ce système est également limité à seulement deux groupes de tique sur oreilles entièrement couverts par les chaussettes protégés par collier élisabéthain, ce qui représente une gêne importante pour l’animal. Autres systèmes9,10,11 sont certainement plus avancées et bien adapté pour l’entretien de colonie de tiques dures. Cependant, ils sont limités dans le nombre de groupes expérimentaux placés chez le lapin, ainsi que dans les tailles/formes modifiables des chambres alimentation. En outre, ces protocoles exigent souvent clopinant les pattes arrière de lapin afin d’éviter les rayures et l’utilisation de colliers élisabéthains pour empêcher le toilettage.
Dans les présentes, nous proposons une méthode simple, non-laborieux et très efficace pour nourrir plusieurs groupes de tiques dures dans les chambres fermées collés au lapin retour couvert par une veste, éliminant le besoin de colliers élisabéthains ou clopinant pendant l’expérience. Plus précisément, notre système utilise des élastiques gélules composées d’une feuille de mousse d’éthylène-vinyle acétate (EVA) couvertes par le filet de moustique et collés sur le lapin rasé revient avec la solidification de rapide (3 min) de colle latex non irritant. Cette technique permet la fixation de plusieurs capsules de forme ou de taille désirée, et quelques semaines après l’expérience les lapins sont complètement rétablis. Le système est destiné principalement aux stades larvaire et adulte tiques dures, mais avec une petite modification, il peut être utilisé pour les larves aussi bien. Les méthodes de base mousse EVA pour tique dure d’alimentation peuvent être adaptées à d’autres types de vertébrés hôtes, par exemple les moutons (qui apparaît comme l’une des alternatives dans le présent document).
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Protocol
Remarque : Dans cette étude, les lapins ont été gardés en cages standards avec de la nourriture et l’eau offert ad libitum à l’Office Français pour la nourriture, de l’environnement et hygiène et sécurité (ANSES) accrédité animaleries à Maisons-Alfort, France. Animaux ont été suivies deux fois par jour par deux techniciens expérimentés réactions cutanées anormales, des problèmes de santé ou des complications. La chambre expérimentale a été assurée en encadrant l’intérieur de la porte avec du ruban double-face pour éviter une fuite accidentelle de tiques. La méthode fonctionne mieux si deux personnes travaillent en équipe, mais il est possible de compléter single handedly par une personne expérimentée. Bien que la plupart des lapins sont dociles et calmes, les signes de stress peuvent se produire pendant la manipulation. Pour s’assurer qu’un lapin ne pas blesser lui-même en luttant, retenue manuelle peut être effectuée par tenant doucement de la peau du cou dans une main tandis que l’autre main il supporte croupe. Les six mois, Rambouillet ovins femelles a été maintenu au Centre pour les installations de recherche biomédicale (CRBM) à l’Ecole nationale vétérinaire d’Alfort (ENVA), où l’eau et nourriture ont été fournis ad libitum, et il a été vérifié deux fois par jour.
NOTE : Notre laboratoire a reçu l’autorisation d’utiliser des lapins et des moutons pour tique d’alimentation par le Comité d’éthique pour des expériences de l’Animal vient Anses/ENVA/UPEC, permis numéros 01741.01 et 11/10/16-5 b, respectivement. Puisque nous avons utilisé uniquement les tiques exempts de micro-organismes pathogènes dans nos expériences, tous les lapins utilisés dans cette étude ont été proposés pour adoption par l’intermédiaire de l’Association du lapin blanc, Paris, France.
1. préparation des gélules
- Couper la taille désirée de la capsule de la feuille de mousse EVA (Figure 1A). Autour de l’extérieur dans les coins (Figure 1B) de la capsule afin de minimiser le détachement accidentel lors de coller à la peau de lapin.
Remarque : L’épaisseur de la capsule doit être environ 8 mm. utiliser une feuille de mousse épaisse de 5 mm pour les larves, nymphes et petites tiques adultes espèces tels que Ixodes. Une feuille de mousse épaisseur 1 cm est adaptée aux grandes tailles tiques adultes tels que Amblyomma SP., Hyalomma SP., etc. , que la taille de la capsule varie basés sur les conditions expérimentales. Par exemple, pour 20 Ixodes couples adultes, 200 nymphes ou 1 000 larves, nous utilisons une taille capsule intérieure de 5 x 5 cm2, 6 x 7 cm2 ou 7 x 9 cm2, respectivement. - Couper le 8 mm de large bandes de crochet autocollant l’entrée tape (voir Table des matières) et collez-les à cadre en mousse EVA préparé (Figure 1C).
- Couper les bandes de même taille de boucle autocollante l’entrée tape (voir Table des matières) et lient aux côtés crochet fixé au cadre EVA-mousse (Figure 1D).
- Couper la taille appropriée de la maille fine de moustique (maillage inférieur à 50 µm) à la taille du cadre en mousse EVA et collez-la à la boucle autocollante (Figure 1E et 1F). Si nécessaire, couper les surplombs.
Remarque : Ce type de capsule peut servir à nourrir les nymphes et les adultes des espèces de tiques dures, tandis qu’un autre système d’étanchéité des capsules est nécessaire destinés à l’alimentation larvaire (la Figure 1) pour empêcher la fuite accidentelle des larves via l’attaché auto-agrippante côté.
2. préparation du lapin avant l’Infestation de tiques
- Raser la zone du lapin dos et côtés pour être utilisé avec une tondeuse (Figure 2A).
- Enduire de colle au latex non irritant la totalité de la surface de la capsule préparée et attendre 1 min (Figure 2B).
- Coller la capsule en appuyant sur la peau (surtout dans les coins) avec les doigts pendant 3 minutes environ (Figure 2 et 2D).
Remarque : Lors du collage de plus d’une capsule, assurez-vous de garder au moins 5 mm d’espace entre eux (Figure 2E et 2F). Nous évitons habituellement la région de la colonne vertébrale, mais elle peut être utilisée si nécessaire. - Soulevez légèrement les capsules pour vérifier visuellement leur attachement à la peau. Si les régions non inscrits se trouvent, appliquer la colle à l’aide d’une spatule, puis appuyez sur pour 3 autres minutes.
- Appliquer du ruban adhésif protecteur pour les pattes arrière du lapin pour éviter tout dégât veste (Figure 2G).
Remarque : Cette étape est facultative et est principalement pour éviter tout dégât de veste, pas de dommages à la capsule de la tique. - Mettre sur la veste de lapin en plaçant les pattes à travers les ouvertures et en serrant le cou, rendre sûr lapin respiration reste confortable. Ne pas placer les pattes arrière à travers les enceintes élastiques à cette étape et laissez la fermeture éclair ouverte (Figure 2H).
3. Infestation de tiques
- Placez les tiques dans une seringue en plastique (1 ou 5 mL selon le nombre d’individus) avec l’aiguille bout couper et bouchées avec du coton (Figure 1G). Si une petite quantité de tiques est infestés, utiliser des pinces.
Remarque : Pour entretien de colonie tique permettent la tique engorgée ou à pondre avec ultérieures d’incubation à l’intérieur de la seringue (5 ou 10 mL) couverte par le maillage de moustique encapsulé par une bande de caoutchouc12 pour éviter la manipulation laborieuse des larves au moment où ils sont appliqué à l’hôte (Figure 1H). En outre, entièrement gorgée de larves peuvent être autorisés à muer dans la seringue (Figure supplémentaire 1I; 5 ou 10 mL) d’infestation directe du lapin par des nymphes. - Placer la seringue profondément dans la capsule par l’intermédiaire de l’open des décideurs et ensemencer les tiques en poussant le piston de la seringue. Tourner lentement le piston vers la peau de lapin pour enlever les tiques restants attachés au plongeur et tirez simultanément de la capsule (Figure 2j’ai).
NOTE : Si certains des individus rampent hors de la capsule, les retourner avec une pincette. - Fermer la capsule en assujettissant la bande auto-agrippante.
- Placer les pattes arrière du lapin dans l’arrière élastiques enclos de la veste et zip fermés.
Remarque : Assurez-vous que l’index peut s’insérer entre le col de la veste et le lapin pour assurer confort et aussi d’éviter la mastication sur la veste. - Retourner le lapin à la cage (Figure 2J).
NOTE : Le temps de l’infestation à la collection de pleine de tiques varient selon les espèces de tiques différentes et les stades de développement. Par exemple, pour Ixodes scapularis et Ixodes ricinus, les durées d’alimentation pour adultes, nymphes et larves sont entre 6 et 9, 3 et 4 et 2 à 3 jours, respectivement. Une liste de références pour 29 cycles de vie différents tiques dures conditions de laboratoire se trouvent dans Levin et Shumacher (2016)9.
4. la collecte et le suivi des tiques
- Prenons le lapin de la cage sur le banc et décompressez la veste.
- Doucement retenir le lapin avec les mains. Ouvrir la capsule en détachant la bande auto-agrippante (Figure 2 K et 2 L) et recueillir les tiques en brossant les larves gorgées (la Figure 1) ou nymphes dans un plat en plastique ou avec une pincette pour les adultes (Figure 2L ). Si partiellement alimenté (non remplie) tiques sont nécessaires, utiliser un twister tique ou une pince à détacher.
Remarque : Si maintenant les colonies de tiques s’il vous plaît voir la note à l’étape 3.1. Maintien des conditions de température selon l’espèce de tique particulière et les tiques gorgées dans approprié humides. - Si nécessaire, fixez de nouveau la bande auto-agrippante pour fermer la capsule.
5. récupération du lapin
- Retirer le filet de moustique complètement de la capsule et laisser le manteau chez le lapin (Figure 2M).
- Attendre 3-4 semaines et essayer d’enlever la capsule en taillant délicatement un des coins (Figure 2N). Si la capsule est encore solidement attachée, répétez cette étape une semaine plus tard.
- Enlever la veste et le laissez que le lapin récupérer dans la cage.
Remarque : Une fois que la capsule est éteint, vérifiez la peau du lapin pour des réactions anormales. Bien que normalement, aucun traitement n’est nécessaire, une lotion émolliente peut être utilisée en cas d’irritation. - Si le protocole et les expériences permettent, le lapin récupéré (Figure 2-O) ou peut être recyclé offerts pour adoption.
NOTE : Lapins auraient dû être divulgués en vue d’acquérir la résistance tique une fois exposée à des infestations de tiques répétés13; par conséquent, reinfestations ne sont pas recommandées à moins que l’expérience exige.
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Representative Results
Ici, pour la première fois, nous proposons une méthode détaillée étape par étape de tiques dures alimentation en mousse EVA capsules appliqués au dos du lapin rasé, couvert par une gaine (Figure 1 et Figure 2). Ce protocole est adapté aux différents types d’expériences où tique différents groupes sur le même hôte sont nécessaires et peuvent également être utilisés pour l’élevage de masse des tiques dures. La tique alimentation surtout les succès en laboratoire s’appuie sur l’aptitude des individus tique et les qualités de l’accueil de lapin pour l’espèce de tique particulière, plutôt que la technique elle-même. Notre système à l’aide de mousse d’EVA capsules collées sur le lapin de retour sont est avérés pour être très réussi quand nourrir des stades de développement différents des tiques dures diverses espèces (tableau 1) et peut aussi être adapté pour d’autres type d’hôtes de laboratoire, tels que les moutons ( La figure 3).
Les principaux avantages de cette méthode sont la simplicité, matériaux facilement accessibles (Table des matières) et, surtout, un système d’ouverture et de fermeture confortable permettant un suivi facile des tiques pendant l’alimentation. En outre, cette méthode polyvalente offre la possibilité d’une variété de différents paramètres expérimentaux basés sur le nombre modifiable, la forme et la composition des capsules sur l’hôte (Figure 2D-F), relever les défis de la étude particulière. L’utilisation de la colle latex hautement efficace, séchage rapide et non irritant assure que la capsule est solidement collée en trois minutes, mais reste attachée pendant au moins trois semaines. Cette procédure permet aussi une récupération complète du lapin hôtes après les expériences (Figure 2-O).
Figure 1 : Préparation de la capsule de mousse EVA et les tiques. (A, B) Couper la capsule de la mousse EVA. (C) plaçant des morceaux de bande autocollante crochet à la capsule. (D) contraignant les bandes latérales de boucle et éplucher le ruban de la visserie. (E, F) Coller le maillage de moustiques pour les bandes adhésives. (G) exemple d’adultes tiques dures à l’intérieur de la seringue (5 mL) avec l’aiguille-extrémité coupée recouverte de coton. (H) exemple de fraîchement éclosion de larves à l’intérieur de la seringue avec l’aiguille-extrémité coupée couvert par le maillage de moustique est maintenu en place par un élastique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Collage de la capsule pour le lapin, cocher retrait/récupération d’infestation et de capsule. (A) rasé le dos du lapin. (B) Application de la colle à la capsule de mousse EVA préparée. (C, D) Fixation des capsules de taille différente pour le lapin. (E, F) Vue dorsale d’un lapin montrant deux ou plusieurs chambres, attachés à l’arrière, respectivement. (G), le ruban est positionné autour des pieds arrière. (H), la veste est appliqué à partir des pattes avant et le cou et la partie arrière est laissée ouverte. Ouverture de l’angle de la capsule est également indiqué. (j’ai) plaçant les tiques à la capsule par le coin ouvert à l’aide de la seringue. (J), la veste est entièrement zippé et le lapin est réinstallé à la cage. (K) contrôle les tiques pendant leur alimentation par l’ouverture de la capsule. (L) collecte les tiques remplies à l’aide de la pince. (M) capsule vide après le retrait de la tique. Détachement (N) de la capsule (après 3 à 4 semaines) du lapin. (O) entièrement recouvrés lapin s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Mousse EVA système adapté aux moutons. (A) fixation des capsules mousse à une zone rasée et nettoyée dans la face latérale de la brebis à l’arrière. (B) après l’infestation, les capsules ci-joint sont recouvertes d’un pansement (Jersey orthopédique), au lieu d’une veste. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Espèces de tiques | Nombre de tiques/nombre infestée de tiques gorgées (%) | ||
| Larves | Nymphes | Femelles | |
| Ixodes ricinus | - | 692/557 (80,49 %) | 670/592 (88.35 %) |
| Ixodes scapularis | - | - | 40/34 (85 %) |
| Dermacentor reticulatus | 3 550/3255 (91,7 %) | 900/803 (89.22 %) | 323/305 (94.42 %) |
| Rhipicephalus appendiculatus | 3 300/2822 (85.52 %) | 490/421 (85.91 %) | 370/362 (97,83 %) |
| Rhipicephalus pulchelus | - | 1 920/1831 (95,36 %) | 282/257 (91.13 %) |
| Amblyomma variegatum | 332/225 (67,77 %) | 404/308 (76,24 %) | 207/146 (70.53 %) |
| Amblyomma americanum | - | 140/134 (95,71 %) | 31/27 (87,1 %) |
| Hyalomma excavatum | 1 000 * | 510 * (58,8 %) | 380/313 (82.36 %) |
Tableau 1 : Taux d’engorgement des différentes étapes du développement d’espèces de tiques dures se nourrissant de lapins à l’intérieur de capsules de mousse d’EVA. * En raison de la mue rapide processus de H. excavatum stades immatures, les larves gorgées (données non présentées) ont été laissés pour muer en nymphes qui engorgent ultérieurement dans la même capsule.
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Discussion
L’étape la plus importante dans cet ensemble du protocole est de coller la capsule fermement sur la peau rasée. Pour cette raison, une pression constante pendant au moins 3 minutes est essentielle, surtout dans les coins. Lorsque inoculer les tiques dans la capsule, il est important de les appliquer dans le coin opposé de celui ouvert afin d’éviter les tiques s’échapper durant l’étanchéité. Lorsque vous planifiez les expériences, s’assurer que toutes les capsules sont couverts par la veste pour éviter tout dommage dû à mâcher ou les égratignures. S’assurer que la région du cou de la veste est suffisamment serrée pour empêcher la mastication mais suffisamment lâche que le lapin reste confortable.
Un des principaux avantages de la technique décrite est sa simplicité et cette modification en termes de taille et nombre des capsules peut être utilisé. Au cours de nos expériences, détachement de capsules de peau n’a pas été observé. Toutefois, les dommages occasionnels de la veste (mais pas la capsule) par le lapin peuvent se produire.
Chez le lapin, nous avons observé que, dans la capsule, les tiques complètement engorgés individuelles (stades surtout immatures tels que les larves et nymphes) dessèchent plus rapidement en raison de la température du lapin. Pour cette raison, nous suggérons d’estimer la durée de la période d’alimentation des espèces de tiques particulière et les étapes, de planifier des tiques gorgées collection immédiatement après leur détachement. Bien que notre système a été testé pour l’alimentation des différentes espèces de tiques dures (tableau 1), le lapin n’est pas un hôte naturel de toutes les tiques dures espèce14. Cette limitation peut être surmontée en adaptant ce système à d’autres hôtes animaux convenant à une espèce de tique dure particulière. Ici, nous avons signalé l’utilisation du système de mousse EVA adaptée aux moutons pour nourrir tous les stades de croissance de I. ricinus (Figure 3). Dans ce cas précis, le mouton doit être rasé et lavé avec du coton imprégné d’éthanol à 70 % pour éliminer l’huile présente à la surface de la peau. Par la suite la même procédure que celle décrite pour les lapins a été suivie, mais au lieu d’une veste, un bandage de coton a été utilisé autour de l’arrière, comme illustré à la Figure 3.
Lors de l’élaboration de ce système, nous avons porté une attention particulière afin de minimiser la quantité de matériaux utilisés et les étapes de la procédure. Par rapport aux autres méthodes, nous n’utilisons pas l’anesthésie, colliers de lapin, oreille chaussettes ou clopinant des pattes arrière5,6,7,8,9,10. En outre, le présent protocole n’est pas laborieux, et aucune formation intensive n’est nécessaire afin de vous familiariser avec cette technique. La tique de mousse EVA basé système décrites en détail dans cette étude d’alimentation devrait être utilisé pour une variété d’expériences différentes, lorsque l'on étudie la biologie de la tique, interactions hôte-pathogène-vecteur, ou les mesures de contrôle différente évaluation comme acaricides ou des vaccins. Notre orientation future sera s’adapter à la capsule de mousse EVA système d’alimentation pour le modèle de souris pour nourrir les stades immatures de tiques dures.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous reconnaissons l’assistance technique de Evelyne Le Naour, Français Institut National de recherche agronomique (INRA), Alain Bernier (INRA) et Océane Le Bidel (ANSES). Consuelo Almazán a été soutenu par une bourse de recherche du laboratoire d’Excellence, biologie intégrative des maladies infectieuses émergentes (LabEx IBEID), l’Institut Pasteur. Les lapins et les moutons ont été achetés par l’ANSES. Partie de ce travail a été financé par les instituts nationaux de la subvention RO1AI090062 de santé au parc d’y.. Dr Jeffrey L. Blair est reconnu pour la révision du manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| New Zealand Rabbits (2.5-3.5 kg) | Charles River | Strain Code 571 | |
| Rambouillet sheep | Local provider-tick free farm | Female 6 months old | |
| EVA foam 5 mm thick | Cosplay Shop | EVA-PE451kg (950mm x 450mm) | 10 mm PE45 kg foam from the Cosplay Shop may be used for the large adult tick species |
| Foam Sheet 9" X 12" 6 mm-White | Amazon | FOAMSHT6-20 | 6 mm-EVA foam ca be ordered via Amazon as an alternative to the foam from Cosplay Shop |
| Full length rabbit jackets | Harvard Apparatus, Inc. | 620077- medium, 6270078 - large | |
| Non-toxic latex glue | Tear mender | Fabric & Leather Adhesive | |
| Tubular cotton orthopedic stockinette | BSN Medical | 9076 (12-15 cm wide) | |
| Mosquito mesh | Loisirs Creatifs | Very fine filter nylon mesh fabric | Any mosquito mesh, or curtain material with the mesh size less than 50 μm is suitable. |
| Leukoplast | BSN medical S.A.S | LF 72361-02 | |
| Adhesive hook-and-loop tape | AIEX store | AIEX 39.37 Feet/12m Hook and Loop Self Adhesive Tape Roll, 20 mm width, white colour | Fullfiled by Amazon |
| Fast drying glue | Fixtout | Superglue |
References
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