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Biology

实验家兔硬蜱的多用途模型

doi: 10.3791/57994 Published: October 6, 2018

Summary

我们开发了一个简单和多功能的系统, 以满足实验兔的硬蜱。我们的非费力协议使用容易接近的材料并且可以根据不同的实验设置的要求调整。该方法允许舒适的监测和/或取样的蜱在整个喂养期间。

Abstract

在蜱的研究中使用活的动物对于各种实验目的, 包括在实验室中维持硬蜱菌落是至关重要的。在蜱, 所有发育阶段 (除了鸡蛋) 是 hematophagous, 并获得一个血餐时, 附着在他们的脊椎动物寄主是必不可少的, 成功地完成他们的生命周期。在这里, 我们演示了一个简单的方法, 使用方便可开启式胶囊喂养的硬蜱在兔子。所提出方法的优点包括简单性、工期短和对特定实验要求的需要进行最重要的多功能调整。该方法使在同一动物上使用多个腔 (各种大小) 成为可能, 允许多阶段或不同实验组喂养, 同时减少整体动物需求。使用的非刺激性和容易接近的材料减少了对动物的不适, 这可以很容易地从实验中恢复, 并提供通过或重用, 如果伦理协议允许它。

Introduction

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硬蜱 (硬蜱科) 是众所周知的缓慢喂养节肢动物, 可以附加在主机上数天, 或几周, 取决于物种和发育阶段1。这些强制性的 hematophagous 节肢动物是多种传染性药物的载体, 如细菌、原生动物和病毒, 从而对人类和动物健康造成重大风险1。在研究蜱生物或评估新的控制方法时, 建立有效的蜱进给系统是至关重要的, 以便有效地设计实验并完成研究的目标。最近, 一些人工蜱喂养系统 (避免使用活的动物) 已经开发了2,3,4 , 他们应该尽可能使用。然而, 这些系统无法完全取代活体动物的蜱喂养, 而且它们不适合用于科学研究所需的许多生理条件。因此, 在某些情况下, 实验动物宿主的使用对于保证实验结果的相关性至关重要。

新西兰兔的实验室已证明是最适合和可访问的主机为几个 ixodid 蜱物种5,6,7,8,9。常用的两种方法是对家兔进行蜱喂养: a) 用棉布或袜子覆盖的兔耳喂养67和 b) 在棉袋中喂养9, 尼龙瓶10或氯丁橡胶11室粘在兔子的背上。喂养兔子的耳朵不是一个优雅的系统, 因为蜱 (特别是早期阶段, 幼虫或若虫) 可能爬行和附着在耳道深, 这是不舒服的动物, 使监测蜱喂养和/或恢复肿胀蜱很难。这个系统也仅限于两个刻度组的耳朵完全覆盖的袜子保护的伊丽莎白的衣领, 代表了一个很大的不适的动物。其他系统9,10,11肯定更先进, 非常适合于硬蜱殖民地维护。然而, 它们的数量有限的实验组放置在兔子, 以及在可修改的大小/形状的喂养室。此外, 这些协议往往需要蹒跚的后兔腿, 以避免擦伤和使用伊丽莎白的衣领, 以防止梳理。

在此, 我们提出了一个简单的, 非费力的和非常有效的方法, 以满足多组的硬蜱在封闭室粘着的兔子背部覆盖的夹克, 消除了对伊丽莎白时代的衣领或在实验中步履蹒跚的需要。具体来说, 我们的系统使用的弹性胶囊由乙烯-醋酸乙烯酯 (EVA) 泡沫板覆盖的蚊帐和粘附到剃光兔背部与快速固化 (3 分钟) 无刺激性乳胶胶水。这种技术允许附着多个理想大小或形状的胶囊, 并在实验后的几周内完全恢复家兔。该系统主要适用于若虫和成人硬蜱阶段, 但对幼虫喂养也有少许修改。以 EVA 泡沫为基础的硬蜱喂养方法可以适应其他类型的脊椎动物宿主, 例如绵羊 (这是本文所示的替代品之一)。

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Protocol

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注: 在本研究中, 在法国老字号 Alfort 的法国食品、环境和职业健康 & 安全机构 (ANSES) 认可的动物设施中, 兔子被保存在标准笼子里, 食物和水都提供广告随意。两名经验丰富的技术人员每天对动物进行两次监测, 以应对任何异常的皮肤反应、健康问题或并发症。实验室通过用双面胶带在门的内部构筑, 以避免意外的蜱逃逸。如果两个人作为一个团队工作, 这种方法是最好的, 但有经验的人可以独力完成。虽然大多数兔子是温顺和镇静的, 在操作过程中可能出现压力的迹象。为了确保兔子不会通过挣扎而伤害自己, 手动克制可以通过轻轻地握住颈部的颈背, 而另一只手支撑它后部来完成。六月大的, 布朗布的雌性绵羊被保存在生物医学研究中心 (CRBM) 的 Alfort 国家兽医学校 (ENVA), 那里的水和食物提供广告随意,每天检查两次。

注: 我们的实验室已获得许可使用兔和绵羊蜱喂养的动物实验伦理委员会 Anses/ENVA/UPEC, 允许数字01741.01 和 11/10/16-5B, 分别。由于我们在实验中只使用无菌蜱, 所以这项研究中使用的所有兔子都是通过白兔协会, 巴黎, 法国提供的。

1. 胶囊的制备

  1. 从 EVA 泡沫片中切割出所需的胶囊尺寸 (图 1A)。圆形的外角 (图 1B) 的胶囊, 以尽量减少意外剥离时, 粘到兔皮肤。
    注: 该胶囊的框架厚度应约8毫米. 使用5毫米厚的泡沫板为幼虫, 若虫, 和小蜱成虫种, 如Ixodes。1厘米厚的泡沫片适用于大尺寸成人蜱, 如Amblyomma sp, Hyalomma sp. 胶囊的大小根据实验要求而变化。例如, 对于 20 Ixodes成年夫妇, 200 若虫, 或1000幼虫, 我们使用内囊大小 5 x 5 厘米2, 6 x 7 厘米2或 7 x 9 厘米2, 分别。
  2. 切割8毫米宽条的自粘钩胶带 (见材料表), 并坚持他们准备 EVA 泡沫框架 (图 1C)。
  3. 从自粘环胶带上剪下相同尺寸的小条 (见材料表), 并将它们绑定到附加到 EVA 泡沫框架的挂钩边上 (图 1D)。
  4. 切割适当大小的细蚊子网 (网格大小小于50µm) 到 EVA 泡沫框架的大小, 并坚持到自粘循环 (图 1E1F)。必要时切下悬垂。
    注: 此类胶囊可用于喂养若虫和成人的硬蜱种类, 而不同的胶囊密封系统的幼虫喂养需要 (补充图 1), 以防止意外逃逸的幼虫通过固定钩环边。

2. 兔子在蜱虫出没前的准备工作

  1. 剃须的兔背部和两侧的区域将使用与剪刀 (图 2A)。
  2. 在所制备的胶囊的整个表面应用无刺激性乳胶胶, 等待1分钟 (图 2B)。
  3. 用手指按压皮肤 (特别是拐角处), 将胶囊粘附3分钟 (图 2C2D)。
    注: 在粘附多个胶囊时, 请确保在它们之间保持至少5毫米的间距 (图 2E2F)。我们通常避免脊柱的区域, 但如果需要, 可以使用。
  4. 稍微提起胶囊, 以目视检查其附着皮肤。如果发现未连接区域, 请使用刮刀涂抹胶水, 再按3分钟。
  5. 将保护胶带贴在兔子的后爪上以防止夹克损坏 (图 2G)。
    注意: 这一步是可选的, 主要是防止夹克损坏, 不损害蜱胶囊。
  6. 穿上兔子夹克, 将前腿放在开口处, 收紧颈部, 确保兔子的呼吸保持舒适。不要将后腿放在这个步骤的弹性外壳, 并保持拉链打开 (图 2H)。

3. 蜱虫出没

  1. 将刻度插入塑料注射器 (1 或5毫升, 取决于个人的数量) 与针端切割和插入棉花 (图 1G)。如果有少量的蜱虫出没, 使用镊子。
    注: 对于蜱虫群的维护, 允许肿胀蜱雌性 (s) 产卵与随后孵化内的注射器 (5 或10毫升) 覆盖的蚊子网包由橡胶带12 , 以避免费力地操纵幼虫时, 他们是应用于主机 (图 1H)。此外, 完全肿胀的幼虫可能被允许在注射器中蜕皮 (补充图 1I; 5 或10毫升) 为直接出没的兔子与若虫。
  2. 将注射器放到胶囊中, 通过打开的角落, 并通过推动注射器柱塞接种蜱。慢慢地扭向兔皮的柱塞, 以除去附着在柱塞上的剩余刻度, 同时将其从胶囊中拉出 (图 2I)。
    注: 如果某些人爬出胶囊, 用镊子将其退回。
  3. 通过 refastening 钩环胶带关闭胶囊。
  4. 将兔子的后腿放到夹克的后部弹性外壳中, 并关闭拉链。
    注意: 使食指可以适合在夹克和兔子的颈部, 以确保舒适, 也避免嚼在夹克上。
  5. 将兔子送回笼子 (图 2J)。
    注: 在不同蜱种和发育阶段, 从虫蛀到收集的时间各不相同。例如, 对于Ixodes scapularisIxodes 蓖麻, 成人、若虫和幼虫喂养的持续时间分别为6–9、3–4和2–3天。在实验室条件下, 29 种不同的硬蜱生命周期的参考文献清单可以在莱文和 Shumacher (2016)9中找到。

4. 蜱的收集和监测

  1. 把兔子从笼子里带到板凳上, 把夹克拉开。
  2. 用手轻轻地抑制兔子。通过 unfastening 钩环胶带 (图 2K2L) 打开胶囊, 并通过将肿胀的幼虫 (补充图 1) 或若虫刷到塑料碟上或使用成人钳来收集刻度 (图 2L).如果需要部分喂养 (不是充满) 蜱, 使用蜱捻机或钳分离它们。
    注意: 如果维护蜱菌落, 请参阅步骤3.1 中的说明。根据特定的蜱种, 在适当的潮湿和温度条件下保持肿胀蜱。
  3. 如果需要, refasten 钩环胶带关闭胶囊。

5. 兔子的恢复

  1. 完全从胶囊中取出蚊帐, 把夹克放在兔子身上 (图 2M)。
  2. 等待3-4 周, 并尝试通过轻轻修剪一个角落 (图 2N) 删除胶囊。如果胶囊仍牢固附着, 一周后重复此步骤。
  3. 脱掉夹克, 让兔子在笼子里恢复。
    注: 一旦胶囊关闭, 检查兔皮肤异常反应。虽然通常不需要治疗, 但在刺激的情况下可以使用润肤化妆水。
  4. 如果协议和实验允许, 恢复的兔子 (图 2O) 可以被重用或提供给收养。
    注意: 兔子已被证明获得蜱抵抗一旦暴露在重复蜱侵扰13;因此, 除非实验需要, 否则不推荐 reinfestations。

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Representative Results

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在这里, 我们第一次提出了一个详细的分步方法的硬蜱喂养的 EVA 泡沫胶囊适用于剃光兔的背部, 覆盖在夹克 (图 1 图 2)。该协议适用于各种类型的实验, 当同一主机上的不同刻度组是必需的, 也可以用于大规模饲养的硬蜱。蜱喂养成功在实验室里主要依赖于蜱个体的适用性和兔子宿主对特定蜱种的适用性, 而不是技术本身。我们的系统使用 EVA 泡沫胶囊粘附到兔背部已被证明是非常成功的, 当喂养不同的发展阶段的各种硬蜱品种 (表 1), 也可以适应其他类型的实验室宿主, 如绵羊 (图 3)。

这种方法的主要优点是简单, 容易接近的材料 (材料表), 最重要的是, 一个舒适的开放关闭系统, 允许在喂养过程中容易监测蜱。此外, 这种多才多艺的方法提供了各种不同的实验设置的可能性, 根据可修改的数量, 形状, 和组成的胶囊在主机 (图 2D F), 迎接挑战的特别的研究。使用高效、快速干燥、无刺激性的乳胶胶, 可确保胶囊在三分钟内牢固粘合, 并保持至少三周的附着。此过程还允许在实验后完全恢复兔子主机 (图 2O)。

Figure 1
图 1: 制备 EVA 泡沫胶囊和蜱.(A、B)从 EVA 泡沫中切割出胶囊。(C) 将自粘钩胶带放在胶囊上。(D) 将回路侧条和剥离紧固件的胶带粘合在一起。(E、F)把蚊子的网眼粘在胶条上。(G) 在注射器 (5 毫升) 内成人硬蜱的例子, 用棉花覆盖的割针端。(H) 在注射器内的新鲜孵化幼虫的例子, 其切口针端由橡皮带在原处放置的蚊子网覆盖。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 把胶囊粘在兔子身上, 蜱虫感染/恢复和胶囊去除.() 把兔子的背剃了。(B) 胶水在制备的 EVA 泡沫胶囊中的应用。(C、D)把不同大小的胶囊附着在兔子身上。(E、F)一只兔子的背观, 显示两个或几个房间, 分别附着在后面。(G) 胶带位于后脚周围。(H) 夹克从前腿和颈部开始应用, 后部左开。打开胶囊的角落也显示。(I) 使用注射器将刻度通过开角放置在胶囊上。(J) 夹克完全拉链, 兔子被重新安置在笼子里。(K) 通过打开胶囊来监测进食过程中的蜱虱。(L) 使用镊子收集充满蜱。(M) 清除蜱后的空胶囊。(N) 从兔子 (3–4周后) 脱离胶囊。(O) 完全恢复的兔子请点击这里查看这个数字的更大版本.

Figure 3
图 3: EVA 泡沫系统适合绵羊.(a) 将泡沫胶囊附着在羊背侧的剃毛和清洁的区域内。(B) 感染后, 附着的胶囊用绷带 (矫形 stockinette) 覆盖, 而不是夹克。请单击此处查看此图的较大版本.

蜱类 被感染蜱的数量/肿胀蜱数 (%)
幼虫 若虫 女性
Ixodes 蓖麻 - 692/557 (80.49%) 670/592 (88.35%)
Ixodes scapularis - - 40/34 (85%)
革 reticulatus 3550/3255 (91.7%) 900/803 (89.22%) 323/305 (94.42%)
Rhipicephalus 采收 3300/2822 (85.52%) 490/421 (85.91%) 370/362 (97.83%)
Rhipicephalus pulchelus - 1920/1831 (95.36%) 282/257 (91.13%)
Amblyomma variegatum 332/225 (67.77%) 404/308 (76.24%) 207/146 (70.53%)
Amblyomma 美洲 - 140/134 (95.71%) 31/27 (87.1%)
Hyalomma 漏斗 1000 * 510 * (58.8%) 380/313 (82.36%)

表 1:充血在 EVA 泡沫胶囊中不同发育阶段对家兔的喂养率.* 由于漏斗不成熟阶段的快速蜕皮过程, 肿胀的幼虫 (未显示的数据) 被留下来蜕皮成若虫, 随后在同一胶囊中肿胀。

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Discussion

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这整个协议中最重要的一步是将胶囊牢固地粘在剃光的皮肤上。因此, 恒定的压力至少3分钟是关键的, 特别是在角落。当接种的蜱进入胶囊, 这是重要的是要把它们深入到对面的角落, 从开放的, 以避免蜱逃逸期间的密封。在计划实验时, 确保所有的胶囊都被夹克覆盖, 以避免咀嚼或刮伤。确保夹克的颈部区域足够紧, 以防止咀嚼, 但足够松, 使兔子保持舒适。

所描述的技术的主要优点之一是它的简单性和修改的大小和数量的胶囊可以使用。在实验中, 没有观察到从皮肤上分离出的胶囊。然而, 兔子可能会偶尔损坏夹克 (但不是胶囊)。

在家兔, 我们观察到, 在胶囊中, 完全肿胀分离蜱 (主要是不成熟的阶段, 如幼虫和若虫) 脱水更快, 由于温度的兔子。因此, 我们建议估计特定蜱种和分期喂养期的持续时间, 以便在分离后立即计划肿胀蜱的收集。虽然我们的系统已经测试, 以喂养各种硬蜱品种 (表 1), 兔子不是一个自然宿主所有的硬蜱物种14。这一限制可以通过将这个系统适应于特定的坚硬蜱种的其他动物宿主来克服。在这里, 我们报告了使用 EVA 泡沫系统适应绵羊喂养的所有发展阶段的 i.蓖麻(图 3)。在这个特殊的情况下, 绵羊需要剃光和洗涤与棉花浸渍70% 乙醇, 以消除目前在皮肤表面的油。之后与为兔子描述的一个做法跟随了, 但不是夹克, 棉花绷带在后面使用了如图 3所示。

在开发这一系统时, 我们特别注意尽量减少所用材料的用量和程序的步骤。与其他方法相比, 我们不使用麻醉, 兔项圈, 耳袜或蹒跚的后腿5,6,7,8,9,10。此外, 本议定书并不费力, 也不需要进行深入的培训来熟悉这种技术。本研究中详细介绍的 EVA 泡沫蜱喂养系统, 在研究蜱生物学、寄主-病原体相互作用或评估不同的控制措施如杀螨剂或疫苗时, 预计将用于各种不同的实验。我们未来的方向将是适应 EVA 泡沫胶囊喂养系统的小鼠模型, 以满足不成熟阶段的硬蜱。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

我们感谢法国国立农业研究研究所 (INRA)、阿兰伯尼尔 (INRA) 和 Océane Evelyne (Bidel) 的技术援助。肯翠萝 Almazán 得到了来自实验室的研究, 来自于巴斯德研究所的新兴传染病 (LabEx IBEID) 的综合生物学。兔子和绵羊是由 ANSES 购买的。这项工作的一部分由国立卫生研究院资助 RO1AI090062 公园。杰弗里. 布莱尔博士因审阅手稿而被承认。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
New Zealand Rabbits (2.5-3.5 kg) Charles River  Strain Code 571
Rambouillet sheep Local provider-tick free farm Female 6 months old
EVA foam 5 mm thick  Cosplay Shop EVA-PE451kg (950mm x 450mm) 10 mm PE45 kg foam from the Cosplay Shop may be used for the large adult tick species
Foam Sheet 9" X 12" 6 mm-White Amazon FOAMSHT6-20 6 mm-EVA foam ca be ordered via Amazon as an alternative to the foam from Cosplay Shop
Full length rabbit jackets  Harvard Apparatus, Inc.  620077- medium, 6270078 - large 
Non-toxic latex glue  Tear mender  Fabric & Leather Adhesive
Tubular cotton orthopedic stockinette BSN Medical 9076 (12-15 cm wide)
Mosquito mesh  Loisirs Creatifs Very fine filter nylon mesh fabric Any mosquito mesh, or curtain material with the mesh size less than 50 μm is suitable.
Leukoplast  BSN medical S.A.S LF 72361-02
Adhesive hook-and-loop tape AIEX store AIEX 39.37 Feet/12m Hook and Loop Self Adhesive Tape Roll, 20 mm width, white colour Fullfiled by Amazon
Fast drying glue   Fixtout  Superglue

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Almazán, C., Bonnet, S., Cote, M., Slovák, M., Park, Y., Šimo, L. A Versatile Model of Hard Tick Infestation on Laboratory Rabbits. J. Vis. Exp. (140), e57994, doi:10.3791/57994 (2018).More

Almazán, C., Bonnet, S., Cote, M., Slovák, M., Park, Y., Šimo, L. A Versatile Model of Hard Tick Infestation on Laboratory Rabbits. J. Vis. Exp. (140), e57994, doi:10.3791/57994 (2018).

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