Summary
Abbiamo sviluppato un sistema semplice e versatile per zecche dure si nutrono di conigli di laboratorio. Il nostro protocollo non laborioso utilizza materiali facilmente accessibile e può essere regolata a seconda delle esigenze delle varie impostazioni sperimentali. Il metodo consente monitoraggio confortevole e/o campionamento di zecche durante l'intero periodo d'alimentazione.
Abstract
L'uso di animali vivi nella ricerca di segni di graduazione è cruciale per una varietà di scopi sperimentali, compreso il mantenimento di colonie di zecca Dura in laboratorio. In segni di graduazione, tutti gli stadi di sviluppo (ad eccezione di uovo) sono ematofagi e acquisire un pasto di sangue quando collegato ai loro ospiti vertebrati è essenziale per il completamento del loro ciclo di vita. Qui dimostriamo un metodo semplice che utilizza capsule facilmente apribile per l'alimentazione delle zecche dure sui conigli. I vantaggi del metodo proposto sono la sua semplicità, la breve durata e la regolazione soprattutto versatile per le esigenze delle specifiche esigenze sperimentali. Il metodo rende possibile l'uso di camere multiple (di varie dimensioni) sull'animale stesso, che consente l'alimentazione di più fasi o differenti gruppi sperimentali riducendo il requisito generale degli animali. I materiali non-irritante e facilmente accessibili utilizzati riduce al minimo disagio agli animali, che può essere facilmente recuperato da un esperimento e offerto per adozione o riutilizzati se il protocollo etico lo consente.
Introduction
Le zecche dure (Ixodidae) sono ben note come artropodi alimentazione lente e possono essere fissate su un host per diversi giorni, o settimane, a seconda della specie e dello sviluppo della fase1. Questi artropodi ematofagi obbligatoria sono vettori di un'ampia varietà di agenti infettivi, quali batteri, protozoi e virus e quindi presentano un rischio significativo per gli esseri umani e di salute degli animali1. Quando studiando biologia tick o valutare nuovi metodi di controllo, l'istituzione di una zecca efficace sistema di alimentazione è fondamentale per progettare esperimenti efficacemente e di realizzare l'obiettivo dello studio. Recentemente, diversi sistemi di alimentazione artificiale tick (evitando l'uso di animali vivi) sono stati sviluppati2,3,4 e devono essere utilizzate quando possibile. Tuttavia, questi sistemi non sono in grado di sostituire completamente la zecca nutrendosi di animali vivi, e non sono sostituti adatti per molte condizioni fisiologiche necessarie per gli studi scientifici. Pertanto, in alcuni casi, l'uso degli eserciti animale sperimentale è fondamentale per garantire la pertinenza dei risultati sperimentali.
Conigli di laboratorio della Nuova Zelanda hanno dimostrato di essere i padroni di casa più adatte e accessibile per diversi Ixodidae zecche specie5,6,7,8,9. Due strategie comuni di zecca nutrendosi di conigli sono state usate frequentemente: a) che si alimenta sul coniglio orecchie coperte con cotone panno o calzini6,7e b) di alimentazione in neoprene, nylon bottiglie10 o cotone sacchetti9 camere11 incollato alla parte posteriore del coniglio. L'alimentazione sulle orecchie di coniglio non è un sistema elegante, perché le zecche (soprattutto nelle prime fasi, larve o ninfe) possono strisciare e allegare profondo nel condotto uditivo, che è a disagio per l'animale e rende il monitoraggio del battito di alimentazione e/o il recupero di engorged zecche sono difficili. Questo sistema è anche limitato a solo due gruppi di segni di graduazione su orecchie completamente coperte da calze protetti da collari elisabettiani, che rappresenta un notevole disagio per l'animale. Altri sistemi9,10,11 sono decisamente più avanzato e ben si adatta per la manutenzione di Colonia di zecca Dura. Tuttavia, sono limitati nel numero di gruppi sperimentali collocato sul coniglio, così come nelle dimensioni/forme modificabili delle sezioni d'alimentazione. Inoltre, questi protocolli richiedono spesso zoppicando le gambe posteriori coniglio per evitare graffi e l'uso di collari elisabettiani per impedire di governare.
Qui proponiamo un metodo semplice, non faticoso e molto efficace per nutrire più gruppi di zecche dure in camere chiuse incollate al coniglio torna coperto da una giacca, eliminando la necessità di collari elisabettiani o zoppicando durante l'esperimento. In particolare, il nostro sistema utilizza capsule elastiche fatto da un foglio di schiuma di etilene vinil acetato (EVA) protette con rete di zanzara e incollato al coniglio rasato indietro con rapida solidificazione (3 min) colla di lattice non irritante. Questa tecnica permette il collegamento di più capsule di forma e dimensione desiderata, e poche settimane dopo l'esperimento i conigli sono completamente recuperati. Il sistema è adatto soprattutto per le fasi di zecca Dura Ninfale e adulto, ma con una piccola modifica può essere utilizzato per le larve di alimentazione pure. I metodi di base di schiuma di EVA per battito duro d'alimentazione possono essere adattati ad altri tipi di vertebrati host, ad esempio le pecore (che sono indicate come una delle alternative in questa carta).
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Protocol
Nota: In questo studio, i conigli sono stati mantenuti in gabbie standard con cibo e acqua offerti ad libitum presso l'Agenzia francese per il cibo, Environmental and Occupational Health & sicurezza (ANSES) accreditati strutture per animali a Maisons-Alfort, France. Gli animali sono stati controllati due volte al giorno da due tecnici esperti per eventuali reazioni anomale della pelle, problemi di salute o complicazioni. La camera sperimentale era garantita da inquadrare all'interno della porta con nastro biadesivo per evitare la fuga accidentale di segni di graduazione. Il metodo funziona meglio se due persone lavorano come una squadra, ma è possibile completare single pensatoio da una persona con esperienza. Anche se la maggior parte dei conigli sono docile e calmo, segni di stress possono verificarsi durante la manipolazione. Per garantire che un coniglio non ferire sé lottando, moderazione manuale può essere compiuta tenendo delicatamente della collottola del collo in una mano mentre l'altra mano sostiene quarti posteriori. L'anziano di sei mesi, Rambouillet pecore femminile era tenuta presso il centro di ricerca biomedica (CRBM) presso la scuola nazionale veterinaria di Alfort (ENVA), dove acqua e cibo sono stati forniti ad libitum ed è stato controllato due volte al giorno.
Nota: Il nostro laboratorio ha ricevuto il permesso di utilizzare conigli e pecore per tick alimentazione dal comitato etico per animale esperimenti ComEth Anses/ENVA/UPEC, permesso di numeri 01741.01 e 11/10/16-5B, rispettivamente. Dato che abbiamo usato solo le zecche esenti da patogeni nei nostri esperimenti, tutti i conigli utilizzati in questo studio sono stati offerti per adozione tramite l'associazione di coniglio bianco, Parigi, Francia.
1. preparazione delle capsule
- Tagliare la dimensione desiderata della capsula dal foglio di schiuma EVA (Figura 1A). Tondo l'esterno gli angoli (Figura 1B) della capsula per ridurre al minimo il distacco accidentale durante l'incollaggio per la pelle di coniglio.
Nota: Lo spessore del telaio della capsula dovrebbe essere circa 8 mm. uso una lastra di gomma piuma spessa 5 mm per le larve, ninfe e specie adulto del piccolo battito come Ixodes. Un foglio di schiuma di spessore 1cm è adatto per grande battiti dell'adulto come Amblyomma SP., Hyalomma SP., ecc. , che la dimensione della capsula varia in base ai requisiti sperimentali. Ad esempio, per 20 coppie di adulti di Ixodes , 200 ninfe o 1.000 larve, usiamo una dimensione interna di capsula di 5 x 5 cm2, 6x7 cm2 o 7 x 9 cm2, rispettivamente. - Tagliare la larghezza di mm 8 strisce del gancio adesivo nastro (Vedi Tabella materiali) ed incollarle al telaio di schiuma EVA preparato (Figura 1C).
- Tagliare le strisce di dimensioni stesso dal ciclo autoadesivo nastro (Vedi Tabella materiali) e li legano ai lati gancio fissato al telaio della schiuma di EVA (Figura 1D).
- Tagliare la dimensione appropriata della maglia fine zanzara (maglie di dimensione inferiore a 50 µm) per la dimensione del riquadro di schiuma EVA e incollarla al loop autoadesive (Figura 1E e 1F). Se necessario, tagliare gli strapiombi.
Nota: Questo tipo di capsula utilizzabile per alimentare le ninfe e gli adulti delle specie di zecca Dura, mentre un diverso sistema di chiusura delle capsule è necessario per alimentazione larvale (Supplemental figura 1) per impedire la fuga accidentale delle larve via fissato laterale e velcro.
2. preparazione del coniglio prima infestazione del battito
- Radere la zona di coniglio retro e lati per essere utilizzato con i clippers (Figura 2A).
- Applicare la colla in lattice non irritante per l'intera superficie della capsula preparata e attendere per 1 min (Figura 2B).
- Incollare la capsula premendo sulla pelle (specialmente agli angoli) con le dita per circa 3 minuti (Figura 2 e 2D).
Nota: Durante l'incollaggio più di una capsula, assicurarsi di tenere almeno 5 mm di spazio tra di loro (Figura 2E e 2F). Evitiamo di solito la regione della colonna vertebrale, ma può essere usato se necessario. - Sollevare leggermente le capsule per controllare visivamente il loro attaccamento alla pelle. Se vengono trovate regioni non iscritti, applicare la colla con una spatola e premere per altri 3 minuti.
- Applicare il nastro protettivo per le zampe posteriori del coniglio per evitare danni di giacca (Figura 2G).
Nota: Questo passaggio è facoltativo ed è principalmente quello di evitare danni di giacca, non danno alla capsula tick. - Metti la giacca di coniglio posizionando le zampe anteriori attraverso le aperture e che stringe il collo, rendendo sicuro coniglio respirazione rimane confortevole. Non posizionare le gambe posteriori attraverso i recinti elastici in questo passaggio e lasciare la cerniera aperta (Figura 2H).
3. tick infestazione
- Posizionare le zecche in una siringa di plastica (1 o 5 mL a seconda del numero degli individui) con l'estremità dell'ago tagliato e collegato con cotone (Figura 1G). Se una piccola quantità di segni di graduazione sono di essere infestato, usare il forcipe.
Nota: Per manutenzione Colonia tick permetterà il battito engorged female(s) a deporre le uova con successive da cova dentro la siringa (5 o 10 mL) coperta dalla zanzara maglia avvolta da un nastro di gomma12 per evitare la manipolazione laborioso delle larve al momento essi sono applicato all'host (Figura 1H). Inoltre, le larve completamente gonfio possono essere consentite di muta nella siringa (Supplemental figura 1I; 5 o 10 mL) per infestazione diretto del coniglio con le ninfe. - Posizionare la siringa in profondità la capsula via all'aperto angolo e inoculare le zecche spingendo lo stantuffo della siringa. Ruotare lentamente lo stantuffo verso la pelle di coniglio per rimuovere le zecche rimanenti collegate allo stantuffo e contemporaneamente tirare fuori dalla capsula (Figura 2ho).
Nota: Se alcuni degli individui strisciare fuori la capsula, restituire loro usando il forcipe. - Chiudere la capsula di riaggancio il velcro e nastro.
- Posizionare le gambe posteriori del coniglio nella parte posteriore elastici recinzioni della giacca e zip chiusa.
Nota: Assicurarsi che una barretta di indice possono adattarsi tra il collo della giacca e il coniglio per garantire comfort e anche per evitare di masticare sulla giacca. - Restituire il coniglio alla gabbia (Figura 2J).
Nota: Il tempo dall'infestazione all'insieme di segni di graduazione piene variare tra le specie di zecche diverse e le fasi di sviluppo. Ad esempio, per Ixodes scapularis e Ixodes ricinus, le durate di alimentazione per gli adulti, ninfe e larve sono 6 – 9, 3-4 e 2 – 3 giorni, rispettivamente. Un elenco di riferimenti per 29 Zecca dura diversi cicli di vita in condizioni di laboratorio può essere trovato in Levin e Shumacher (2016)9.
4. raccolta e monitoraggio dei cicli
- Prendere il coniglio dalla gabbia al banco e decomprimere la giacca.
- Delicatamente e frenare il coniglio con le mani. Aprire la capsula di slacciare il velcro e nastro (Figura 2 K e 2 L) e raccogliere le zecche mediante spazzolatura le larve engorged (Supplemental figura 1) o ninfe in un piatto di plastica o usando il forcipe per adulti (Figura 2L ). Se parzialmente alimentato (non pieno) le zecche sono necessari, utilizzare un tick twister o il forcipe per staccarli.
Nota: Se mantenere le colonie di segni di graduazione si prega di consultare la nota al punto 3.1. Mantenere i engorged zecche in appropriato umide e le condizioni di temperatura secondo la specie del battito particolare. - Se necessario, fissare nuovamente il nastro di velcro e per chiudere la capsula.
5. il recupero del coniglio
- Rimuovere completamente la rete di zanzara dalla capsula e lasciare la giacca sul coniglio (Figura 2M).
- Attendere 3-4 settimane e tenta di rimuovere la capsula tagliando delicatamente uno degli angoli (Figura 2N). Se la capsula è ancora saldamente attaccata, ripetere questo passaggio una settimana più tardi.
- Staccare la giacca e lasciare che il coniglio recupera nella gabbia.
Nota: Una volta che la capsula è spento, controllare la pelle del coniglio per reazioni anormali. Anche se normalmente nessun trattamento è richiesto, una lozione emolliente può essere utilizzata in caso di irritazione. - Se il protocollo e gli esperimenti permetteranno, il coniglio recuperato (Figura 2O) possa essere riutilizzato o offerti per l'adozione.
Nota: I conigli sono stati indicati per acquisire tick resistenza una volta esposto a tick ripetute infestazioni13; Pertanto, reinfestations non sono raccomandati a meno che l'esperimento richiede.
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Representative Results
Qui vi proponiamo per la prima volta un metodo dettagliate passo a passo di zecca Dura alimentazione in schiuma EVA capsule applicati alla parte posteriore di un coniglio rasato, coperto da una giacca (Figura 1 e Figura 2). Questo protocollo è adatto per vari tipi di esperimenti, quando gruppi di zecche diverse sullo stesso host sono necessari e possono essere utilizzati anche per l'allevamento di massa di zecche dure. Il segno di spunta alimentazione successo in laboratorio per la maggior parte si basa sulla fitness degli individui tick e idoneità dell'host coniglio per la specie del battito particolare, piuttosto che la stessa tecnica. Il nostro sistema usando schiuma EVA capsule incollati al coniglio indietro hanno dimostrati di essere altamente riuscita quando alimentazione diverse fasi di sviluppo della Zecca dura varie specie (tabella 1) e può anche essere adattato per altro tipo di host di laboratorio, come la pecora ( Figura 3).
I principali vantaggi di questo metodo sono la semplicità, materiali facilmente accessibili (Tabella materiali) e, soprattutto, un comodo sistema di apertura-chiusura che permette il facile controllo delle zecche durante l'alimentazione. Inoltre, questo metodo versatile offre la possibilità di una varietà di diverse impostazioni sperimentale basato su modificabile numero, forma e composizione delle capsule nell'host (Figura 2D-F), affrontare le sfide della studio particolare. L'uso della colla in lattice altamente efficace, rapida asciugatura e non irritante assicura che la capsula è saldamente incollata in tre minuti e rimane attaccata per almeno tre settimane. Questa procedura permette anche il recupero completo del coniglio padroni di casa dopo gli esperimenti (Figura 2O).
Figura 1 : Preparazione della capsula di schiuma EVA e le zecche. (A, B) Tagliare la capsula dalla schiuma EVA. (C) Posizionare le strisce di nastro adesivo gancio alla capsula. (D) vincolanti le strisce laterali di loop e peeling il nastro dagli elementi di fissaggio. (E, F) Attaccare la zanzara mesh per le strisce adesive. (G) esempio di adulte zecche dure all'interno della siringa (5 mL) con ago-estremità tagliata rivestita da cotone. (H) esempio di appena schiusa le larve all'interno della siringa con ago-estremità tagliata coperti dalla maglia zanzara tenuto da un elastico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Incollaggio la capsula al coniglio, barrare la casella rimozione infestazione/recupero e capsula. (A) rasato schiena di coniglio. (B) applicazione della colla per la capsula di schiuma EVA preparata. (C, D) Allegato di dimensioni diverse capsule al coniglio. (E, F) Vista dorsale di un coniglio mostrando due o parecchi alloggiamenti attaccate alla parte posteriore, rispettivamente. (G), il nastro viene posizionato attorno al piede posteriore. (H), la giacca è applicato a partire dal collo e zampe anteriori e la parte posteriore è lasciata aperta. L'angolo della capsula di apertura è anche mostrato. (io) ponendo le zecche alla capsula tramite l'angolo aperto usando la siringa. (J), la giacca è compresso completamente e il coniglio è trasferito alla gabbia. (K) le zecche di controllo durante la loro alimentazione aprendo la capsula. (L) raccogliendo piene zecche utilizzando il forcipe. (M) capsula vuota dopo rimozione del battito. (N) distacco della capsula (dopo 3 – 4 settimane) dal coniglio. (O) completamente ha recuperato il coniglio Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Sistema adattato alle pecore in schiuma EVA. (A) allegato delle capsule schiuma a zona rasata e pulita nella parte laterale delle pecore indietro. (B) dopo l'infestazione, le capsule allegate sono coperti con una benda (ortopedico rasata), invece di una giacca. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Specie del battito | Numero di infestati zecche/numero di segni di graduazione engorged (%) | ||
| Larve | Ninfe | Femmine | |
| Ixodes ricinus | - | 692/557 (80,49%) | 670/592 (88.35%) |
| Ixodes scapularis | - | - | 40/34 (85%) |
| Dermacentor reticulatus | 3.550/3255 (91,7%) | 900/803 (89,22%) | 323/305 (94.42%) |
| Rhipicephalus appendiculatus | 3.300/2822 (85.52%) | 490/421 (85.91%) | 370/362 (97,83%) |
| Rhipicephalus pulchelus | - | 1.920/1831 (95.36%) | 282/257 (91,13%) |
| Amblyomma variegatum | 332/225 (67,77%) | 404/308 (76,24%) | 207/146 (70.53%) |
| Amblyomma americanum | - | 140/134 (95,71%) | 31/27 (87,1%) |
| Hyalomma pectus | 1.000 * | 510 * (58,8%) | 380/313 (82.36%) |
Tabella 1: Tasso di ingorgo di diversi stadi di sviluppo delle specie di zecca Dura nutrendosi di conigli all'interno della schiuma di EVA capsule. * Dovuto il veloce processo di muta di stadi immaturi H. pectus , le larve engorged (dati non mostrati) sono state lasciate a muta in ninfe che successivamente irrorati nella capsula stessa.
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Discussion
Il passo più importante in questo intero protocollo è quello di incollare la capsula con fermezza alla pelle rasata. Per questo motivo, una pressione costante per almeno 3 minuti è critica, specialmente agli angoli. Quando inoculare le zecche nella capsula, è importante applicare loro in profondità l'angolo opposto da quello aperto per evitare la fuga di graduazione durante la sigillatura. Quando si pianificano gli esperimenti, assicurarsi che tutte le capsule sono coperto dalla giacca per evitare danni da masticare o graffiare. Assicurarsi che la regione del collo della giacca è stretta abbastanza per impedirgli di masticare ma sufficientemente allentati che il coniglio rimane confortevole.
Uno dei vantaggi principali della tecnica descritta è la sua semplicità e che modifiche in termini di dimensioni e numero delle capsule può essere utilizzato. Durante i nostri esperimenti, distacco di capsule da pelle non sono stati osservati. Tuttavia, potrebbero verificarsi danni occasionali della giacca (ma non la capsula) dal coniglio.
Nei conigli, abbiamo osservato che, nella capsula, zecche completamente gonfio-indipendente (stadi principalmente immaturi come larve e ninfe) ed essicca più velocemente a causa della temperatura del coniglio. Per questo motivo, si consiglia di stimare la durata del periodo d'alimentazione di specie del battito particolare e fase, per pianificare la collezione battito engorged immediatamente dopo la loro separazione. Anche se il nostro sistema è stato testato per l'alimentazione di varie specie di zecca Dura (tabella 1), il coniglio non è un ospite naturale per tutte le specie di zecca Dura14. Questa limitazione può essere superata adattando questo sistema ad altri host animale adatto per una specie di zecca Dura particolare. Qui abbiamo segnalato l'uso del sistema schiuma EVA adattato alle pecore per alimentare tutte le fasi di sviluppo di I. ricinus (Figura 3). In questo caso particolare, le pecore deve essere rasato e lavato con cotone impregnato con etanolo al 70% per eliminare l'olio presente sulla superficie della pelle. In seguito è stata seguita la stessa procedura come quella descritta per i conigli, ma invece di una giacca, una benda di cotone è stata usata intorno alla parte posteriore, come mostrato nella Figura 3.
Durante lo sviluppo di questo sistema, abbiamo prestato particolare attenzione per ridurre al minimo la quantità di materiali utilizzati e le fasi della procedura. Rispetto ad altri metodi, non usiamo l'anestesia, collari di coniglio, orecchio calzini o zoppicando delle gambe posteriori5,6,7,8,9,10. Inoltre, il presente protocollo non è laborioso, e nessuna formazione intensiva è necessaria per acquisire familiarità con questa tecnica. La zecca di base in schiuma EVA sistema dettagliato in questo studio di alimentazione dovrebbe essere utilizzato per una varietà di diversi esperimenti quando studiando biologia tick, interazioni ospite-vettore-patogeno, o misure di controllo differente valutazione come acaricidi o vaccini. La nostra direzione futura sarà essere adattando la capsula di schiuma EVA sistema di alimentazione per il modello del mouse per sfamare gli stadi immaturi delle zecche dure.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Riconosciamo l'assistenza tecnica di Evelyne Le Naour, Istituto nazionale francese di ricerca agronomica (INRA), Alain Bernier (INRA) e Océane Le Bidel (ANSES). Consuelo Almazán è stato sostenuto da una borsa di studio dal laboratorio di eccellenza, integrativa biologia of Emerging Infectious Diseases (LabEx IBEID), Istituto Pasteur. I conigli e le pecore sono state acquistate dall'ANSES. Parte di questo lavoro è stato finanziato dagli istituti nazionali di sovvenzione di salute RO1AI090062 a Y. Park. Dr. Jeffrey L. Blair è riconosciuto per la revisione del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| New Zealand Rabbits (2.5-3.5 kg) | Charles River | Strain Code 571 | |
| Rambouillet sheep | Local provider-tick free farm | Female 6 months old | |
| EVA foam 5 mm thick | Cosplay Shop | EVA-PE451kg (950mm x 450mm) | 10 mm PE45 kg foam from the Cosplay Shop may be used for the large adult tick species |
| Foam Sheet 9" X 12" 6 mm-White | Amazon | FOAMSHT6-20 | 6 mm-EVA foam ca be ordered via Amazon as an alternative to the foam from Cosplay Shop |
| Full length rabbit jackets | Harvard Apparatus, Inc. | 620077- medium, 6270078 - large | |
| Non-toxic latex glue | Tear mender | Fabric & Leather Adhesive | |
| Tubular cotton orthopedic stockinette | BSN Medical | 9076 (12-15 cm wide) | |
| Mosquito mesh | Loisirs Creatifs | Very fine filter nylon mesh fabric | Any mosquito mesh, or curtain material with the mesh size less than 50 μm is suitable. |
| Leukoplast | BSN medical S.A.S | LF 72361-02 | |
| Adhesive hook-and-loop tape | AIEX store | AIEX 39.37 Feet/12m Hook and Loop Self Adhesive Tape Roll, 20 mm width, white colour | Fullfiled by Amazon |
| Fast drying glue | Fixtout | Superglue |
References
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