Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

יצור אוטומטי למחצה של Hepatocyte כמו תאים מתאי גזע Pluripotent

Published: July 27, 2018 doi: 10.3791/57995
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1MRC Centre for Regenerative Medicine, University of Edinburgh

Summary

פרוטוקול זה מתאר גישה אוטומטית למחצה כדי לייצר hepatocyte כמו תאים מתאי גזע pluripotent אנושי בתבנית 96 צלחת טוב. תהליך זה הוא מהירה וחסכונית, המאפשר שהייצור של איכות מובטחת אצוות של תאים hepatocyte דמוי למחקר אנושי בסיסי ויישומי.

Abstract

גזע pluripotent האנושי מייצגות מקור מתחדשת של רקמה אנושית. המחקר שלנו מתמקדת ביצירת רקמת הכבד האנושי של תאי גזע עובריים (hESCs), המושרה בתאי גזע pluripotent (iPSCs). תהליכי התמיינות הנוכחית להפיק תאי hepatocyte דמוי אדם (HLCs) מציג תערובת של תכונות העובר ומבוגרים. כדי לשפר את התא פנוטיפ, מלא הגדרנו את הנהלים הבידול שלנו ואת הגומחה תא, וכתוצאה מכך הדור של אוכלוסיות תאים המציגים ביטוי גנים משופרת ותפקוד. בעוד מחקרים אלה לסמן התקדמות, היכולת להפיק כמויות גדולות של ריבוי הצלחות טוב להקרנה היה מוגבל הליכי עבודה אינטנסיבית, וריאציה אצווה כדי אצווה. כדי להתמודד עם בעיה זו, פיתחנו פלטפורמה חצי אוטומטיים כדי להתמיין זריעה תא HLCs. גזע גזע pluripotent, בידול בוצעו באמצעות טיפול בנוזלים ומערכות pipetting אוטומטי בתבנית 96-ובכן צלחת. בעקבות הבידול, תא פנוטיפ נותחו באמצעות מיקרוסקופ אוטומטיות ו- luminometer טוב של רב.

Introduction

Hepatocytes אנושי ראשוני (PHHs) מייצגים הסטנדרטי העכשווי למחקר ביורפואי בכבד. למרות היתרונות שלהם, PHHs מייצגים מקור מוגבל של hepatocytes בוגרת עם פנוטיפ לא יציב1. תאי גזע עובריים (ESCs), תאי גזע pluripotent המושרה אנושי (iPSC) הוצעו כמשאב עוצמה למחקר ביורפואי, מבטיח מקור מתחדשת של רקמה אנושית, כולל הכבד2,3,4 . תהליכי התמיינות hepatocyte הנוכחי לייצר תאים המבטאים סמנים hepatocyte, גנים, פונקציות דומות PHHs3,4,5,6,7, 8,9,10,11. לאחרונה, השימוש בחומרים המוגדרים מטריצות כגון laminins רקומביננטי, יש תא משופרת פנוטיפ הפארמצבטית ניסיוני5,12,13,14.

שיטות חקלאות מסורתית תא יסתמכו על pipetting ידנית, וזה זמן רב וגם מועדת לשגיאות. זה מגביל את התפוקה של וזמינותו ואת התבנית צלחת אחד יכול לעבוד עם. נכון להיום, רוב המחקרים המתארים את הדור של HLCs הם עבודה אינטנסיבית ואופיים, בקנה מידה קטן ולכן גודל15,16,17.

זרם מקדמות טיפול בנוזלים, מערכות pipetting, בשילוב עם מיקרוסקופ אוטומטית מכשירי מעבדה, אפשרו לפתח אשר לצמצם את הדרישה התערבות אנושית. יש לקחת את היתרון של טכנולוגיות אלה, פיתחה מערכת אוטומטית למחצה בידול כדי לייצר כמויות גדולות של רקמת הכבד האנושי לטירונות ואנו חלה המחקר הביו-רפואי. גישה זו יכולה להתבצע עם ESC האנושי והן iPSC קווים עם התאמות קלות הצורך, בהתאם לקו תא. שילוב מערכת זו עם ניתוח תוכן גבוהה, נדגים כי phenotyping סוללות היבריד יכול להיות פחות זמן רב והושמעה בקנה מידה18,19,20,21.

לסיכום, האוטומציה של טכניקות תרבות תא המתוארים בזאת הוביל שיפורים אמינות, ניהול זמן ניסיוני, תפוקה וזמינותו.

Protocol

1. זריעת תאי גזע Pluripotent (hPSCs) לתוך 96 טוב צלחות עבור Hepatocyte בידול אנושי

הערה: ריאגנטים וציוד המשמשים פרוטוקול זה רשומה בטבלה1. מדיה המשמשת עבור ניסוי זה חייב להיות סטרילי, בטמפרטורת החדר במשך תרבית תאים. כל אמצעי האחסון ריאגנט/הפתרון המתואר בחלק זה של הפרוטוקול מבוססים על טוב יחיד של צלחת 96-ובכן, אלא אם צוין אחרת.

  1. להכין laminin מצופה לוחות טוב 96.
    1. הפשרת בקבוקון של recombinant laminin 521 (100 µg/mL) (LN-521) עבור 2 h ללון ב 4 º C.
    2. הכן µg 5/mL פתרון על ידי דילול LN-521 כקרח 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח של Dulbecco (DPBS) (עם Ca2 +/Mg2 +).
    3. השתמש של נוזל אוטומטי טיפול מתקן עם צינור סטנדרטי dispensing קלטת כדי להוסיף 50 µL של הפתרון LN-521 לכל טוב של צלחת טוב 96.
      הערה: כל אמצעי האחסון dispenses מבוצעות באמצעות מתקן טיפול בנוזלים אוטומטית עם צינור סטנדרטי dispensing קלטת אלא אם צוין אחרת. פריים הפתרון עד שהוא מגיע לסוף שחולק הקלטת, ולאחר מכן להמשיך לוותר. לוחות מרובים 96-ובכן ניתן להכין על אותו ניסוי על-ידי חזרה על התהליך כמה פעמים לפי הצורך.
    4. דגירה הלוחות מצופים LN521-37 °C/5% CO2 עבור 2-4 h.
      הערה: צלחות מצופה LN521 ניתן לאחסן שבועיים, 4 מעלות צלזיוס. שמור את הצלחות חתומות על משטח שטוח כדי למנוע אידוי וזיהום.
  2. חממו המספר הנדרש של צלחות מצופה מראש ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי 1 h.
  3. האחות הפתרון LN-521 הנותרים של המשטח מצופה באמצעות מתאם השאיפה ערוץ 8.
    הערה: חיוני כדי להימנע מכל מגע עם פני השטח מצופה כדי למנוע השפלה ציפוי.
  4. מיד להוסיף µL 50 לכל טוב של בינוני mTeSR1 בתוספת 10 מיקרומטר קינאז הקשורים רו (רוק) מעכב Y27632 ולהשאיר את הצלחת בחממה עד תא זריעה-37 °C/5% CO2.
    הערה: אל תאפשר את הבארות מצופים laminin להתייבש.
  5. להכין השעיה תא של 3 x 105 תאים למ"ל בינוני mTeSR1 בתוספת 10 מיקרומטר רוק מעכבי Y27632.
    הערה: צפיפות זריעה עבור כל קו תא ידרוש אופטימיזציה.
    1. האחות המדיום של צלחת פטרי עם תרבות מובחן של hPSCs כ 75%-85% confluency תרבותי-LN-521 תיאר כאמור12.
      הערה: hPSCs מתורבתים ב- LN-521 ב mTSER1 עם המדיום השתנה כל 24 שעות, passaged באופן סדיר פעם התאים להגיע 80% confluency כמו שתואר לעיל12.
    2. לשטוף את התאים עם 5 מ של טמפרטורת החדר 1 x DPBS (ללא Ca2 +/Mg2 +), לשאוב המאגר.
    3. הוסף 5 מ של 1 x ריאגנט עדין של דיסוציאציה התא לתאים, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 6 עד 8 דקות עבור תא דיסוציאציה.
      הערה: כדי לעצור את התגובה, לבחון בניתוק של תאים מן המטריצה מתחת למיקרוסקופ. התאים צריך להיות מנותקת חלקית מהצלחת. אם לא, להרחיב את הדגירה למשך דקות תוספת 1 עד 2.
    4. לסיים את התגובה על ידי כ רפה בעברית הכימית דיסוציאציה תא עדין ולהוסיף 5 מיליליטר בינוני mTeSR1 טרי בתוספת 10 מעכב רוק מיקרומטר Y27632 לתאים. להשתמש במגרדת תא להרים את התאים מטריקס, פיפטה למעלה ולמטה באמצעות טיפ P1000 מספר פעמים כדי לערבב.
    5. לספור את התאים קיימא באמצעות hemocytometer בהתבסס על Trypan Blue מכתים אי-הכללה של שיטת והכן התליה תא עם ריכוזים הנדרש.
    6. Pipette מספר התאים הרצוי לתוך שפופרת צנטרפוגה סטרילי, 15 מ"ל או 50 מ ל, ספין התאים למטה על-ידי צריך שתוציאו אותם ב x 115 g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: עבור 96 אחד טוב צלחת, 5 מ של mTeSR1 בינוני המכיל 3 x 105 תאים למ"ל נדרש עבור שורת תאים H9.
    7. וארוקן את תגובת שיקוע, בעדינות resuspend בגדר תא עד מתקבל פתרון הומוגני ב 37 מעלות צלזיוס בינוני mTeSR1 בתוספת 10 מיקרומטר רוק מעכבי Y27632.
      הערה: השימוש של רוק מעכב מומלצת שכן היא משפרת את התא הישרדות פוסט מחדש ציפוי.
  6. הוסף µL 50 של התליה תא לצלחת טוב 96 המכיל 50 µL של mTeSR1 עם 10 מיקרומטר רוק מעכבי Y27632.
  7. לאחר זריעה, להחזיר את הצלחות החממה תא-37 °C/5% CO2 במשך 24 שעות ביממה לאפשר את התאים לצרף.
  8. לבחון את התאים למחרת ולסגת מעכב רוק לאחר הקימה הקשר מתא לתא. ב- 40% confluency, לעבור התמיינות בינוני (איור 1B).
    הערה: אם תא confluency גבוהה מ- 40%, הלוחות אינם מתאימים עבור בידול סוללות היבריד עם הקו תא H9.

2. להבדיל hPSCs לתאי Hepatocyte דמוי רקומביננטי Laminins ב 96 טוב צלחות

  1. הכינו הבידול גורמים בינוני וצמיחה.
    1. להכין Activin A אנושי מניות פתרון (100 µg/mL) על ידי המסת אבקת Activin A אנושי סטרילי 0.2% שור אלבומין (BSA) ב- PBS. Aliquot המניה וחנות ב-20 ° C. השתמש ב- 1:1, 000.
    2. להכין את העכבר Wnt3a מניות פתרון (10 µg/mL) על ידי המסת אבקה Wnt3a העכבר ב- BSA 0.2% סטרילי. Aliquot המניה וחנות ב-20 ° C. השתמש ב- 1:200.
    3. להכין hepatocyte האנושי גורם הגדילה (דבורה שחר) מניות פתרון (10 µg/mL) על ידי המסת אבקה דבורה שחר האנושי ב- BSA 0.2% סטרילי. Aliquot המניה וחנות ב-20 ° C. השתמש ב- 1:1000.
    4. להכין Oncostatin M (OSM) מניות פתרון (20 µg/mL) על ידי המסת האבקה ב- BSA 0.2% סטרילי. Aliquot המניה וחנות ב-20 ° C. השתמש ב- 1:1, 000.
    5. האנדודרם סופית: להכין האנדודרם בידול בינוני, בהיקף של 2% B27 תוספת (x 50, ללא אינסולין), 1% פניצילין/סטרפטומיצין (ריכוזים הסופי: 100 IU/mL ו- 100 µg/mL, בהתאמה) נוספו רוזוול פארק אנדרטת המכון 1640 ( RPMI 1640) בינוני הבזליים. לאחסן ב 4 ° C ולהשתמש תוך שבועיים. בכל שינוי בינוני, תוספת האחסון הנדרש עם Activin ו Wnt3a-הריכוז הסופי של 100 ננוגרם למ"ל ו 50 ng/mL, בהתאמה.
    6. בידול Hepatoblast: להכין hepatoblast בידול בינוני, בהיקף של 20% נוקאאוט סרום חלופי (אופנוע), 0.5% חלופה תוספת לגלוטמין, חומצות אמינו שאינן הכרחיות 1% (NEAA), מ מ 0.1 בטא-mercaptoethanol, דימתיל סולפוקסיד 1% ו- 1% פניצילין/סטרפטומיצין (ריכוזים הסופי ב 100 IU/mL ו- 100 µg/mL, בהתאמה) נוספו נוקאאוט DMEM (KO-DMEM). לסנן תחת ואקום ולאחסן ב 4 º C. השתמש בתוך שבועיים.
    7. בידול hepatocyte: להכין hepatocyte בידול בינוני, בהיקף של 1% חלופה תוספת לגלוטמין, 10 מיקרומטר הידרוקורטיזון 21-hemisuccinate נתרן מלח (HCC), 1% פניצילין/סטרפטומיצין (ריכוזים הסופי ב 100 IU/mL, µg 100/mL, בהתאמה) נוספו HepatoZYME בינונית. לאחסן את המניה ב 4 ° C ולהשתמש תוך שבועיים. עבור כל שינוי בינוני, שמשלימה את אמצעי האחסון הדרושים עם דבורה שחר, OSM (ריכוזים הסופי ב 10 ng/mL ו 20 ng/mL, בהתאמה).
  2. פוסט 24 שעות זריעה, בזהירות להסיר את המדיום באמצעות מערכת אוטומטית ערוץ אלקטרוניים ידניים פיפטה ולהוסיף µL 100 של מדיום האנדודרם-לקרקע טרי בתוספת 100 ננוגרם למ"ל Activin A ו- 50 ננוגרם למ"ל Wnt3a.
    הערה: תהליך התמיינות מתחילה ברגע המדיום האנדודרם סופית נוספה. לאחר זריעה התא הוא אופטימלי התמיינות מאותחלת בדרך כלל בתוך 24 שעות. בינוני כל השינויים מתבצעים על ידי הסרת המדיום עם מערכת פיפטה אוטומטי ערוץ אלקטרוניים ידניים, מחלק µL 100 בינוני טריים באמצעות מתקן טיפול בנוזלים אוטומטית עם תקן צינור קלטת שחולק אלא אם אחרת שצוין. מערכת אוטומטית ערוץ אלקטרוניים ידניים פיפטה שימש עם 96 ראש טוב, באמצעות טיפים µL 300. בקצרה, 90 µL היו aspirated מ טוב הימנעות מכל מגע עם תאי, חשוב לא לייבש את התאים במהלך שינוי בינונית להפחתת מתח התא.
  3. תאי גזע עובריים (hESCs), החליפו המדיום בידול האנדודרם מדי יום למשך שלושה ימים. אם הבידול מבוצע עבור האדם המושרה גזע pluripotent (hiPSCs), להרחיב את הבמה האנדודרם מוחלטת במשך יומיים נוספים באמצעות רק Activin.
  4. לאחר אינדוקציה האנדודרם סופית, להחליף אופנוע/דימתיל סולפוקסיד לבינוני עבור מפרט hepatoblast ולאחר שנה המדיום כל יומיים במשך 5 ימים.
    הערה: אם ישנם מספר של תאים שאינם מצורפים בבאר, השתמש שאינם בתוספת קו-DMEM לרחוץ את התאים פעם אחת לפני השינוי בינוני הבא. בשל משך הזמן של השלב השני של הפרוטוקול (5 ימים), יהיו שינויים בינוני 3 עם האחרון ביום האחרון של מפרט hepatoblast.
  5. בעקבות הבידול hepatoblast, לעבור HepatoZYME בינונית עבור hepatocyte ההבשלה. לשטוף את התאים פעם אחת עם HepatoZYME ללא תוספת לאחר הסרת אופנוע/דימתיל סולפוקסיד בינונית, להוסיף 100 µL של HepatoZYME בינוניים בתוספת 10 ננוגרם למ"ל דבורה שחר ו 20 ng/mL OSM.
  6. לשנות את המדיום כל 48 שעות 7 עד 10 ימים. -יום 18 של הבידול, לאפיין HLCs על-ידי ניתוח CYP P450 פעילות חילוף החומרים של ביטוי גנים.

3. אפיון Hepatocyte כמו תאים הבדיל על רקומביננטי Laminins

  1. לאתר את הביטוי של סמנים hepatocyte ספציפיים וסמנים קיטוב באמצעות immunostaining.
  2. מבחן hepatocyte פונקציה מטבולית באמצעות מבחני CYP P450 כמתואר לפני12.
  3. לקבוע את הווריאציה צלחת, לספור את המספר הכולל של תאים לכל טוב לכל צלחת.

4. תפוקה גבוהה Immunocytochemistry ורכישת תמונות

  1. ביום 18 של בידול, לשטוף את הבארות שלוש פעמים עם 1 x DPBS, לתקן את HLCs על-ידי שחולק 50 µL של 4% paraformaldehyde (PFA), דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 עד 30 דקות. לאחר הקיבעון, לשטוף שלוש פעמים עם PBST (0.1% tween) (ללא Ca2 +/Mg2 +) באמצעות דסקית צלחת אוטומטית.
    הערה: כל שוטף בסעיף זה מבוצעות באמצעות דסקית צלחת אוטומטי אלא אם צוין אחרת. כל שוטף נעשים בעקבות באותו הפרוטוקול.
  2. Permeabilize את הקרום על ידי שחולק µL 100 של PBST (ללא Ca2 +/Mg2 +), תקופת דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לבצע חסימת חלבון מאת שחולק 100 µL של BSA 10% ב- PBST, תקופת דגירה של h 1 לוחצים בעדינות בעזרת מטרף צלחת. לאחר חסימת חלבון, להוסיף 50 µL של 1% BSA PBST המכיל את הנוגדנים העיקרי, דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה עם טלטול עדין בעזרת מטרף צלחת.
    הערה: אנחנו לא שוטפים בין תוספת חלבון בלוק של נוגדן.
  3. לאחר 24 שעות, לשטוף שלוש פעמים עם x DPBS 1 (ללא Ca2 +/Mg2 +) ולהוסיף הנוגדן משני על ידי שחולק 50 µL של BSA 1% ב- PBST. דגירה h 1 בטמפרטורת החדר בחושך.
  4. לאחר הדגירה נוגדנים משניים, לשטוף 3 פעמים עם 1 x DPBS. להוסיף 50 µL של DPBS עם דאפי (10 µg/mL) דגירה למשך 5 – 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
  5. לבסוף, לשטוף 3 פעמים עם DPBS ולהשאיר µL 100 של 1 x DPBS בבאר. לוחות מוכנים עבור הדמיה.
    הערה: צלחות לאחסנו ב 4 ° C בחושך עד הדמיה.
  6. תמונה את הצלחת באמצעות מערכת הדמיה גבוהה-תוכן, לרכוש מספר שדות על פני הבאר כדי לקבל ייצוג טוב של הבאר. לכמת את הביטוי סמנים שונים ב- HLCs באמצעות תוכנה קולומבוס (High-תוכן הדמיה ניתוח מערכת תוכנה).
    הערה: קולומבוס היא תוכנת ניתוח תוכן גבוהה, אשר מציע תא פילוח ןועברל תא phenotyping. תוצאות דומות יכולה להיות מושגת על ידי שימוש CellProfiler, תוכנה קוד פתוח עבור ניתוח כמותי של תמונות ביולוגי22.

Representative Results

תאית התמיינות בוצעה באמצעות קו בתאי גזע עובריים (H9). הרציף האוטומטי למחצה נעשה שימוש כדי להבדיל ולאפיין את התאים (איור 1 א'). מתקן אוטומטי טיפול בנוזלים שימשה מעיל מטריקס וזרע תאים בודדים. התמיינות היה יזם כאשר התאים הגיעו 40% confluency (יום 0). שינויים מדיה בוצעו באמצעות מערכת פיפטה אוטומטי ערוץ אלקטרוניים ידניים להסרת בינונית, מנפק טיפול בנוזלים עבור תוספת בינונית (איור 1 א'). קיבוע תא, צביעת בוצעו באמצעות מנפק טיפול אוטומטי נוזלי בשילוב עם צלחת אוטומטית למכונת הכביסה. הדמיה של כימות בוצעו על-ידי שימוש של מערכת הדמיה גבוהה-תוכן ותוכנה קולומבוס. פעילות ציטוכרום P450 נמדדה באמצעות assay הוקמה. בעקבות המצע דגירה, supernatants תא נקטפו, והקליט ביולומינסנציה שימוש בקורא כינוייהם microplate (איור 1 א'). בנוסף, שלב קונבנציונאלי ניגודיות מיקרוסקופ שימש כדי למדוד את השינויים במורפולוגיה תאים במהלך התמיינות hepatocyte (איור 1B).

ביום 18, נבדקה מידת ההשתנות במספר התאים בין בארות בעקבות דאפי מכתים (איור 2 א). 7 שדות ראייה נלכדו לכל טוב ואת המספר של גרעינים לכמת (איור 2 א). גילינו אין כל הבדל סטטיסטי בין וולס עם ממוצע של 41,662 ±3, תאים 366 לכל טוב (איור 2B).

ביום 18, HLCs היו קבוע צבעונית לסמני אופייני hepatocyte (איור 3A-G), נבדקו עבור פעילות CYP P450. HLCs הביע סמנים hepatocyte כגון HNF4α (89.2% ± 2 חיובי תאים), ALB (תאים חיוביים 92.8% ±6), AFP (61.8% ± 2 תאים חיוביים). HLCs גם לידי ביטוי חלבונים CYP P450, CYP2D6, CYP3A4 ומוצגים מצולע מראה ייחודי כפי שמוצג על ידי E-קדהרין ביטוי חלבון. פעילות CYP P450 HLCs נמדדה ביום 18. HLCs הציג פעילות CYP1A2 ±45 295,906, 828 RLU/mL/mg של חלבון ו- CYP3A-±177 1,066,112, 416 RLU/mL/mg של חלבון (איור 3 H).

Figure 1
איור 1: בידול Hepatocyte החל מגירסה בשנת 96 עיצוב טוב. (א). תרשים של הציוד להשתמש למחצה לאוטומטיות התמיינות, קיבוע, מכתים, הדמיה של פעילות פונקציונלית. (B). נציג משתנה ב מורפולוגיה הסלולר במהלך התמיינות סוללות היבריד. בקצרה, מגירסה הם טענתי כלפי האנדודרם סופית, ואחריו hepatoblast מפרט מאופיין על ידי הצגת ריצוף דמוי מורפולוגיה תאים, לפני ההבשלה hepatocyte עם תאים רכישת צורת מצולע. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: הערכת ההשתנות טוב-כדי-טוב HLCs. (א) ייצוג 96. ובכן לוח תצוגה של HLCs צבעונית עם דאפי. סרגל קנה מידה = 1 מ מ. (B) כימות של מספר הטלפון הנייד לכל טוב. ממוצע של מספר הטלפון הנייד לכל בארות בעמודות (למעלה) ושורות (למטה), משדות שבעה של תצוגות לכל טוב, כימות באמצעות תוכנה קולומבוס. מספר הטלפון הנייד הממוצע על פני המשטח הוא 41,662 ± 3,366 SEM תאים לכל טוב. אין הבדלים משמעותיים סטטיסטית נצפו בין בארות. ANOVA One-way עם בדיקות סטטיסטיות של פוסט-הוק של Tukey הועסק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: מדידת פעילות CYP P450 ב HLCs ביום 18 וביטוי של סמן Hepatocyte. (א) האחוז של אלפא גרעיני גורם 4 hepatocyte (HNF4α) ביטוי ± SEM מבוסס על בארות שלושים עם 10 שדות ראייה לכל טוב. (B) האחוז של אלבומין (ALB) ביטוי + /-SEM, מבוסס על 3 בארות נפרד עם 10 שדות ראייה לכל טוב. (ג) אחוזי fetoprotein אלפא (AFP) + /-SEM מבוסס על 3 בארות נפרד עם 10 שדות ראייה לכל טוב. (ד) E-קדהרין מכתים. (ה) CYP2D6 מכתים. (נ) CYP3A4 מכתים. (G)-אימונוגלובולין G (IgG) צביעת שליטה. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (H) CYP P450 1A2 ו- 3A פעילות חילוף החומרים ב- HLCs ב- 18 יום. מייצג הנתונים ביולוגית שישה משכפל + /-פעילות ב- SEM. מצוטט כאומר יחידות קלות יחסית (RLUs) /mL לכל 1 מ ג חלבון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

הליך חצי אוטומטיות שלנו הוא יעיל, אמין, חסכוני, המאפשר הייצור של HLCs בקנה מידה (איור 1). לא היה כל הבדל משמעותי במונחים של מספר תאים בין הבארות בצלחת, שהופך פלטפורמה זו גישה מתאימה להקרנה מבוססת-תא (איור 2). בנוסף, שזרימת העבודה אוטומציה למחצה מאפשר למשתמש לייצר מספר גדול של צלחות בבת אחת, מה שלא היה אפשרי לפני השימוש תהליכים ידניים5,12.

חשוב, בתהליך אוטומציה לא משפיע על התמיינות התשואות, עם רוב התאים לבטא HNF4α (89.2% ± 2) ואת ALB (92.8% ±6) (איור 3). HLCs גם הביע אנזימי CYP P450 CYP2D6, CYP3A4 ומוצגים CYP1A2 CYP3A מטבולית פעילות דומה דווח על ניסויים (איור 3) הקודם5. למרות התקינה של הפרוטוקול, תא confluency לפני הבידול הוא קריטי עבור בידול סוללות היבריד טהור. לכן, להבטיח התפלגות התא טוב על פני הבאר הוא שיקול חשוב (איור 1). זה הוכיח להיות שורת התאים התלויים, לכן אופטימיזציה זריעה וצפיפות תא נדרש עבור כל לפני קו תא הסולם.

במתכונתה הנוכחית, פלטפורמה זו אינה מתאימה כדי לייצר כמויות גדולות של HLCs עבור יישומים קליניים, זה קרוב לוודאי תושג באמצעות תא מפעלים, ריאקטורים. עם זאת, המתודולוגיה פיתח לאפשר לדור מהירה של תאי הכבד האנושי מחלה דוגמנות, והתרופות הקרנה או סמים שינוי מחקרים. יתר על כן, וזמינותו היא לבצע ריבוב, המתיר את הדור של multiparametric datasets לניתוח מכניסטית. הולך קדימה, אנו גם מאמינים כי טכנולוגיה זו יכול להיות מיושם יותר במבחנה מערכות מורכבות כגון תלת-ממד בידול או כפלטפורמה כדי לשפר את סוללות היבריד פנוטיפ במבחנה.

לסיכום, אנו מאמינים כי המערכת שלנו פשוטים ואוטומטיים למחצה להגדיל את התפוקה ניסיוני, להפחית וריאציה ניסיוני, ובכך שיפור איכות datasets ביולוגי, אקסטרפולציה שלהם כלפי פיזיולוגיה אנושית.

Disclosures

פרופסור דוד ג חציר הוא מייסד, מנכ ל Stemnovate מוגבלת.

פרופסור דוד ג חציר הוא במאי של HigherSteaks מוגבלת.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה פרסים מ של המדען הראשי במשרד (TCS 16 37), מלגת MRC PhD.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
405 LS Washer Biotek
B27 supplement Life Technologies 12587-010
beta-mercaptoethanol Life Technologies 31350
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A2058
DMSO Sigma-Aldrich D5879
DPBS with Calcium and Magnesium ThermoFisher 14040133
Gentle cell dissociation reagent STEMCELL Technologies 7174
GlutaMax Life Technologies 35050
GripTips for VIAFLO 96 Integra 6434
HepatoZYME-SFM Life Technologies   17705021
Human Activin A Peprotech 120-14E
Human Hepatocyte Growth Factor Peprotech 100-39
Human Oncostatin M Peprotech 300-10
Human Recombinant Laminin 521 BioLamina LN521-02
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt Sigma-Aldrich H4881
Knockout DMEM Life Technologies 10829
Knockout Serum Replacement Life Technologies 10828
mTeSR1 medium STEMCELL Technologies 5850
MultidropCombi Reagent Dispenser ThermoFisher 5840300
Non-essential amino acids Life Technologies 11140
Operetta High-Content Imaging System PerkinElmer HH12000000
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Life Technologies 15140122
Recombinant mouse Wnt3a R&D Systems 1324-WN-500/CF
Rho-associated kinase (ROCK)inhibitor Y27632 Sigma-Aldrich Y0503-1MG
RPMI 1640 Life Technologies 21875
Standard tube dispensing cassette ThermoFisher 24072670
TWEEN 20 Sigma-Aldrich P9416 
VIAFLO 96 Electronic 96-channel pipette Integra 6001
PBS, no calcium, no magnesium ThermoFisher 14190250
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 Sigma-Aldrich 1.00496 EMD MILLIPORE
P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System Promega V8801
P450-Glo CYP1A2 Assay and Screening System Promega V8771
DAPI Invitrogen D1306
Antibodies
Albumin Sigma-Aldrich A6684 1:200 (mouse)
Alpha-fetoprotein Abcam ab3980 1:500 (mouse)
CYP2D6 University of Dundee University of Dundee 1:200 (sheep)
CYP3A4 University of Dundee University of Dundee 1:200 (sheep)
HNF-4α Santa Cruz sc-8987 1:400 (rabbit)
E-cadherin Abcam ab76055 1:200 (mouse)
IgG DAKO 1:400
Anti-Mouse 488 (secondary antibody) Life technologies A-11001 1:400
Anti-sheep 488 (secondary antibody) Life technologies A-11015 1:400
Anti-rabbit 488 (secondary antibody) Life technologies A-11008 1:400

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Forbes, S. J., Gupta, S., Dhawan, A. Cell therapy for liver disease: From liver transplantation to cell factory. J Hepatol. 62 (1, Supplement), S157-S169 (2015).
  2. Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 170-182 (2016).
  3. Szkolnicka, D., Lucendo-Villarin, B., Moore, J. K., Simpson, K. J., Forbes, S. J., Hay, D. C. Reducing Hepatocyte Injury and Necrosis in Response to Paracetamol Using Noncoding RNAs. Stem Cells Transl Med. 5 (6), 764-772 (2016).
  4. Choudhury, Y., et al. Patient-specific hepatocyte-like cells derived from induced pluripotent stem cells model pazopanib-mediated hepatotoxicity. Sci Rep. 7, 41238 (2017).
  5. Cameron, K., et al. Recombinant Laminins Drive the Differentiation and Self-Organization of hESC-Derived Hepatocytes. Stem Cell Rep. 5 (6), 1250-1262 (2015).
  6. Cayo, M. A., et al. A Drug Screen using Human iPSC-Derived Hepatocyte-like Cells Reveals Cardiac Glycosides as a Potential Treatment for Hypercholesterolemia. Cell Stem Cell. 20 (4), 478-489 (2017).
  7. Takayama, K., et al. Prediction of interindividual differences in hepatic functions and drug sensitivity by using human iPS-derived hepatocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (47), 16772-16777 (2014).
  8. Takayama, K., et al. 3D spheroid culture of hESC/hiPSC-derived hepatocyte-like cells for drug toxicity testing. Biomaterials. 34 (7), 1781-1789 (2013).
  9. Hay, D. C., et al. Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo. Stem Cells Dayt Ohio. 26 (4), 894-902 (2008).
  10. Iii, R. L. G., et al. Maturation of Induced Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocytes by 3D-Culture. PLOS ONE. 9 (1), e86372 (2014).
  11. Chen, Y. -F., Tseng, C. -Y., Wang, H. -W., Kuo, H. -C., Yang, V. W., Lee, O. K. Rapid generation of mature hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells by an efficient three-step protocol. Hepatol Baltim Md. 55 (4), 1193-1203 (2012).
  12. Wang, Y., et al. Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells. JoVE J Vis Exp. (121), e55355 (2017).
  13. Takayama, K., et al. Long-Term Self-Renewal of Human ES/iPS-Derived Hepatoblast-like Cells on Human Laminin 111-Coated Dishes. Stem Cell Rep. 1 (4), 322-335 (2013).
  14. Kanninen, L. K., et al. Laminin-511 and laminin-521-based matrices for efficient hepatic specification of human pluripotent stem cells. Biomaterials. , 86-100 (2016).
  15. Szkolnicka, D., et al. Accurate prediction of drug-induced liver injury using stem cell-derived populations. Stem Cells Transl Med. 3 (2), 141-148 (2014).
  16. Kim, D. E., et al. Prediction of drug-induced immune-mediated hepatotoxicity using hepatocyte-like cells derived from human embryonic stem cells. Toxicology. 387 (Supplement C), 1-9 (2017).
  17. Rashid, S. T., et al. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest. 120 (9), 3127-3136 (2010).
  18. Grimm, F. A., Iwata, Y., Sirenko, O., Bittner, M., Rusyn, I. High-Content Assay Multiplexing for Toxicity Screening in Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes and Hepatocytes. Assay Drug Dev Technol. 13 (9), 529-546 (2015).
  19. Bray, M. -A., et al. A dataset of images and morphological profiles of 30,000 small-molecule treatments using the Cell Painting assay. GigaScience. , (2017).
  20. Pradip, A., et al. High Content Analysis of Human Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocytes Reveals Drug Induced Steatosis and Phospholipidosis. Stem Cells Int. 2016, 2475631 (2016).
  21. Donato, M. T., Gómez-Lechón, M. J., Tolosa, L. Using high-content screening technology for studying drug-induced hepatotoxicity in preclinical studies. Expert Opin Drug Discov. 12 (2), 201-211 (2017).
  22. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, R100 (2006).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 137 Pluripotent גזע תאים התאים כמו hepatocyte אוטומציה למחצה הסולם הדמיה תוכן גבוהה ביולוגיה התפתחותית
יצור אוטומטי למחצה של Hepatocyte כמו תאים מתאי גזע Pluripotent
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Meseguer-Ripolles, J.,… More

Meseguer-Ripolles, J., Lucendo-Villarin, B., Wang, Y., Hay, D. C. Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (137), e57995, doi:10.3791/57995 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter