Summary
Bu iletişim kuralı insan pluripotent kök hücreler 96 iyi plaka kartvizitlere hepatosit benzeri hücreleri üretmek için yarı otomatik bir yaklaşımı açıklar. Bu hızlı ve uygun maliyetli, hepatosit benzeri hücreler temel ve uygulamalı insan araştırma için toplu halde üretim kalite güvence sağlayan işlemdir.
Abstract
İnsan pluripotent kök hücreler insan dokusu yenilenebilir kaynağı temsil eder. Bizim araştırma insan embriyonik kök hücreleri (hESCs) insan karaciğer dokusu oluşturma üzerinde odaklanmıştır ve pluripotent kök hücreler (iPSCs) indüklenen. Geçerli farklılaşma yordamlar fetal ve yetişkin özellikleri karışımı görüntüleme insan hepatosit benzeri hücreler (HLCs) oluşturur. Hücre fenotip artırmak için biz tamamen bizim farklılaşma yordam ve hücre niş geliştirilmiş gen ekspresyonu ve işlev görüntüleyen hücre popülasyonlarının üretimi kaynaklanan tanımladınız. Bu çalışmalar ilerleme işareti olsa da, büyük miktarlarda filtreleme için çok iyi plakaların oluşturma yeteneği emek yoğun yordamlar ve toplu toplu için varyasyon tarafından sınırlı olan. Bu sorunu çözmek için yarı otomatik bir platform pluripotent kök hücreler HLCs. kök hücre tohum içine ayırt etmek için geliştirdiğimiz ve farklılaşma gerçekleştirilen sıvı işleme ve otomatik pipetting sistemleri 96-şey plaka biçiminde kullanarak. Farklılaşma hücre fenotip otomatik mikroskobu ve çok iyi luminometer kullanarak analiz edildi.
Introduction
Birincil insan tetkikine (PHHs) temsil eden karaciğer Biyomedikal araştırma ilişkin geçerli standarttır. Onların avantajlara rağmen PHHs kararsız fenotip1olgun tetkikine sınırlı kaynağı temsil eder. İnsan embriyonik kök hücreleri (ESCs) ve insan indüklenmiş pluripotent kök hücreler (IPSC) yenilenebilir bir kaynak karaciğer2,3,4 de dahil olmak üzere insan dokusunun umut verici Biyomedikal araştırmalar için güçlü bir kaynak olarak önerilmiştir . Geçerli hepatosit farklılaşma yordamlar hepatosit işaretleri, genler ve işlevleri PHHs3,4,5,6,7benzer hızlı hücreler üretmek, 8,9,10,11. Daha yakın zamanlarda, tanımlanmış malzeme ve matrisler rekombinant laminins gibi kullanımı gelişmiş hücre fenotip ve deneysel tekrarlanabilirlik5,12,13,14vardır.
Geleneksel hücre kültürü teknikleri el ile pipetting, hem zaman alıcı ve hata eğilimli olan güveniyorsun. Bu tahlil ve bir çalışabilirsiniz plaka biçimi throughput sınırlar. Bugüne kadar emek yoğun doğa ve bu nedenle küçük ölçekli boyutu15,16,17HLCs nesil açıklayan en çalışmaları vardır.
Geçerli sıvı işlemede ilerler ve pipetting sistemleri, otomatik mikroskobu ve laboratuvar Analizörler, insan müdahalesi gereksinimini en aza indirmek işlemleri geliştirmek mümkün yaptık. Biz bu teknolojilerden almış ve yarı otomatik farklılaşma sistemiyle hangi için temel insan karaciğer dokusu büyük miktarlarda üretmek geliştirilen ve Biyomedikal araştırma uygulanan. Bu yaklaşım insan ESC ve IPSC çizgili küçük ayarlamalar hücre kültürünü bağlı olarak gerekli ile gerçekleştirilebilir. Bu sistem yüksek içerik analizi ile birleştirerek, HLC fenotipleme daha az zaman alıcı ve ölçek18,19,20,21gerçekleştirilen olabilir göstermektedir.
Özet olarak, hücre kültürü teknikleri burada açıklanan Otomasyon iyileştirmeler için güvenilirlik, deneysel zaman yönetimi ve tahlil üretilen işi neden olmuştur.
Protocol
1. insan Pluripotent kök hücreler (hPSCs) içine 96 de plakaları için hepatosit farklılaşma tohumlama
Not: Bu protokol için kullanılan ekipman ve reaktifler listelenen Tablo 1' de. Bu deneme için kullanılan ortam steril ve hücre kültürü için oda sıcaklığında olmalıdır. Bu protokol bölümünde açıklanan tüm reaktif/çözüm birimleri Aksi belirtilmediği sürece 96-şey plaka tek bir şey üzerinde temel alır.
-
Hazırlamak laminin 96 iyi plakaları kaplı.
- Rekombinant laminin 521 (100 µg/mL) bir şişe çözülme (LN-521) 4 ° C'de bir gecede 2 h için
- 5 µg/mL solüsyon buz gibi 1 Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz (DPBS) (Ca2 +/Mg ile2 +) x LN-521 sulandrarak hazırlayın.
- Kaset dağıtımı için standart bir tüp dağıtıcısı işleme bir otomatik sıvı iyi 96 iyi plaka başına LN-521 çözümün 50 µL eklemek için kullanın.
Not: Tüm cilt dispenses bir otomatik sıvı işleme dağıtıcı ile aksi belirtilmedikçe kaset dağıtımı standart bir tüp ile gerçekleştirilir. Kaset losyonlu sonuna ulaşana kadar çözüm Başbakan, o zaman dağıtmak için devam edin. Birden fazla 96 iyi tabaklar gerektiği kadar olarak yordamı yineleyerek aynı deneyde hazırlanabilir. - 37 °C/5% CO2 2-4 h için LN521 kaplı plakalar kuluçkaya.
Not: LN521 kaplı plakalar ile 4 ° C'de iki hafta saklanabilir Buharlaşma ve kontaminasyonu önlemek için düz bir yüzeye mühürlü plakalar tutmak.
- Süreyi ön kaplamalı plakalar için 1 h 30 dk 37 ° C'de ısıtın.
- 8-kanal aspirasyon bağdaştırıcı kullanan kaplı yüzey kalan LN-521 çözümü Aspire edin.
Not: Kaplı yüzey kaplama yıkımı önlemek için ile herhangi bir temas önlemek için önemlidir. - 10 µM Rho ilişkili kinaz (ROCK) inhibitörü Y27632 takıma mTeSR1 orta kuyu başına 50 µL eklenir ve plaka da kuluçka makinesine 37 °C/5% CO2' de tohum hücre kadar devam et.
Not: Kuru laminin kaplı wells izin vermez. -
3 x 105 hücre/mL 10 µM ROCK inhibitörü Y27632 takıma mTeSR1 ortamda bir hücre süspansiyon hazırlamak.
Not: Her hücre satırı için tohum yoğunluğu optimizasyonu gerektirir.- Orta Aspire bir petri hPSCs, yaklaşık %75 85 arası farklılaşmamış bir kültür ile gelen LN-521 üzerinde kültürlü confluency daha önce12açıklandığı gibi.
Not: hPSCs LN-521 üzerinde mTSER1 içinde her 24 h değişti ve düzenli olarak hücreleri confluency yukarıda açıklanan12olarak % 80'i ulaştığımızda pasajlı orta ile kültürlü. - Oda sıcaklığında 1 5 mL hücrelerle yıkama x DPBS (olmadan Ca2 +/Mg2 +) ve Aspire edin arabellek.
- 5 mL 1 x nazik hücre ayrılma reaktif de hücrelere ekleme ve hücre ayrılma için 6-8 dk 37 ° C'de kuluçkaya.
Not: tepki durdurmak için mikroskop altında matris hücre dekolmanı inceleyin. Hücreleri plaka kısmen ayrılmış olmalıdır. Eğer değilse, kuluçka ilave bir 1-2 min için genişletmek. - Nazik hücre ayrılma reaktif aspirating tarafından tepki bitirmek ve taze mTeSR1 orta 10 µM ROCK inhibitörü Y27632 hücreleri ile takıma 5 mL ekleyin. Matris ve karıştırmak için birkaç kez bir P1000 ucu kullanarak yukarı ve aşağı pipet hücrelerden kaldırmak için hücre kazıyıcı kullanın.
- Trypan mavi dışlama yöntemi boyama dayalı bir hemasitometre kullanarak canlı hücreleri saymak ve gerekli konsantrasyonları ile hücre süspansiyon hazırlamak.
- Hücreleri istediğiniz sayıyı bir steril 15 mL veya 50 mL santrifüj tüpüne pipette ve spin hücreleri aşağı onları 115 x g oda sıcaklığında 5 min için de centrifuging.
Not: bir 96 için iyi levha, mTeSR1 orta 3 x 105 hücre/mL içeren 5 mL H9 hücre satırı için gereklidir. - Süpernatant Aspire edin ve homojen bir çözüm 10 µM ROCK inhibitörü Y27632 takıma mTeSR1 ortamda 37 ° C'de elde edilir kadar hücre Pelet hafifçe resuspend.
Not: hücre hayatta kalma sonrası yeniden kaplama geliştikçe ROCK inhibitörü kullanılması önerilir.
- Orta Aspire bir petri hPSCs, yaklaşık %75 85 arası farklılaşmamış bir kültür ile gelen LN-521 üzerinde kültürlü confluency daha önce12açıklandığı gibi.
- 50 µL hücre süspansiyon mTeSR1 10 µM ROCK inhibitörü Y27632 ile 50 µL içeren 96 iyi plaka üzerine ekleyin.
- Tohum sonra tabakalar hücre kuluçka hücreleri eklemek izin vermek 24 h 37 °C/5% CO2 dönün.
- Ertesi gün hücreleri incelemek ve hücre-hücre iletişim kurulduktan sonra ROCK inhibitörü tutar. % 40 confluency farklılaşma Orta (Şekil 1B) geçin.
Not: cep confluency % 40 yüksek ise, tabakları HLC farklılaşma H9 hücre satır için uygun değildir.
2. hPSCs rekombinant Laminins 96 de tabak içinde hepatosit benzeri hücrelerine ayırt
-
Farklılaşma orta ve büyüme faktörleri hazırlayın.
- İnsan aktivin A hisse senedi çözüm (100 µg/mL) steril % 0,2 sığır serum albumin (BSA) PBS içinde insan aktivin A toz çözülerek hazırlayın. Aliquot stok ve stok-20 ° C'de 1:1, 000 istifadə edir.
- Fare Wnt3a hisse senedi çözüm (10 µg/mL) fare Wnt3a toz steril % 0,2 BSA içinde çözülerek hazırlayın. Aliquot stok ve stok-20 ° C'de 1: 200 kullanın.
- İnsan Hepatosit büyüme faktörü (HGF) hisse senedi çözüm (10 µg/mL) steril % 0,2 BSA içinde insan HGF toz çözülerek hazırlayın. Aliquot stok ve stok-20 ° C'de 1: 1000 kullanın.
- Oncostatin M (OSM) hisse senedi çözüm (20 µg/mL) steril % 0,2 BSA içinde toz çözülerek hazırlayın. Aliquot stok ve stok-20 ° C'de 1:1, 000 istifadə edir.
- Kesin endoderm: endoderm farklılaşma orta, %2 B27 ek (insülin olmadan 50 x), % 1 penisilin/streptomisin oluşan hazırlamak (son konsantrasyonları: 100 IU/mL ve 100 µg/mL, sırasıyla) eklendi Roswell'e Park Memorial Enstitüsü 1640 () için RPMI 1640) Bazal orta. 4 ° C'de depolayın ve iki hafta içinde kullanın. Orta her değişiminde, gerekli birim aktivin A ve Wnt3a ile 100 ng/mL ve 50 ng/mL, son konsantrasyonu sırasıyla ek.
- Hepatoblast farklılaşma: hepatoblast farklılaşma orta, % 20 nakavt serumu değiştirme (KSR), alternatif ek L-glutamine, % 1 esansiyel olmayan amino asitler (NEAA), 0,1 mM beta-mercaptoethanol, %1 DMSO ve % %1 0.5 oluşan hazırlamak penisilin/streptomisin (100 IU/mL ve 100 µg/mL, son konsantrasyonları sırasıyla) nakavt DMEM (KO-DMEM) eklendi. Vakum altında filtre ve 4 ° C'de depolayın İki hafta içinde kullanın.
- Hepatosit farklılaşma: hepatosit farklılaşma orta, % 1 alternatif ek L-glutamin için 10 µM hidrokortizon 21-hemisuccinate sodyum tuzu (HCC), % 1 penisilin/streptomisin oluşan hazırlamak (100 IU/mL, son konsantrasyonları ve 100 µg/mL, sırasıyla) HepatoZYME orta olarak eklendi. Hisse senedi 4 ° C'de depolayın ve iki hafta içinde kullanın. Her orta değiştirmek için gerekli güç HGF ve OSM ile ek (10 ng/mL ve 20 ng/mL, son konsantrasyonları sırasıyla).
- tohum, 24 saat sonrası dikkatle bir otomatik el elektronik kanallı pipet sistem kullanarak orta kaldırın ve 50 ng/mL Wnt3a ile 100 ng/mL aktivin A takıma taze endoderm-astar orta 100 µL ekleyin.
Not: kesin endoderm orta eklendikten sonra Farklılaşma süreci başlar. Bir kez hücre tohum optimize edilmiştir, hücresel başkalaşım normalde 24 saat içinde başlatılır. Tüm Orta değişiklikler otomatik el elektronik kanallı pipet sistem ile orta kaldırarak ve taze orta bir otomatik sıvı işleme makinesi ile bir standart kullanarak 100 µL dağıtımı yapılmaktadır olmadıkça losyonlu kaset tüp Aksi takdirde belirtilen. Bir otomatik el elektronik kanallı pipet sistem iyi kafa, 300 µL ipuçlarını kullanarak 96 ile kullanıldı. Kısacası, 90 µL de hücreleri ile herhangi bir temas kaçınarak dan Aspire ve hücreleri hücre stresi azaltmak için orta değiştirmek sırasında kuru değil önemlidir. - İnsan embriyonik kök hücreleri için (hESCs), üç gün boyunca endoderm farklılaşma orta her gün değiştirin. Farklılaşma insan indüklenmiş pluripotent kök hücreler (hiPSCs) gerçekleştirilirse, kesin endoderm sahne kullanarak aktivin A sadece 2 gün için genişletmek.
- Sonra kesin endoderm indüksiyon, KSR/DMSO orta hepatoblast belirtimi için geçiş ve Orta 2 günde 5 gün değiştirin.
Not: sonraki orta değiştirmek daha önce hücreleri yıkamak için desteklenen KO-DMEM iyi ekli olmayan hücrelerin sayısı varsa, kullanın. Protokolü (5 gün) ikinci aşaması süresi nedeniyle, 3 orta değişiklikler ile hepatoblast belirtiminin son günü bir son olacak. - Hepatoblast farklılaşma HepatoZYME orta olarak hepatosit olgunlaşma için geçiş. HepatoZYME KSR/DMSO orta çıkardıktan sonra ek olmadan bir kez hücrelerle yıkama ve HepatoZYME olgunlaşma orta 10 ng/mL HGF ve 20 ng/mL OSM ile 100 µL ekleyin.
- Orta her 48 h 7-10 gün için değiştirin. Gün farklılaşma 18, HLCs gen ekspresyonu ve CYP P450 metabolik etkinliğini analiz ederek karakterize.
3. hepatosit benzeri karakterizasyonu Ayrıştırılan üzerinde rekombinant Laminins hücreleri
- Hepatosit özgü işaretleri ve polarizasyon işaretleri immunostaining kullanarak ifade bulmak.
- Hepatosit metabolik fonksiyon CYP P450 deneyleri12' den önce açıklandığı gibi kullanarak sınayın.
- İyi plaka başına başına hücre sayısı sayım plaka varyasyon belirler.
4. yüksek üretilen iş Immunocytochemistry ve resim alma
- Gün 18 farklılaşma, wells üç kez 1 x DPBS ile yıkayın, HLCs % 4 paraformaldehyde (PFA) dağıtım 50 µL tarafından tamir ve için 15-30 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya. Fiksasyon sonra üç kez PBST ile yıkayın (% 0,1 ara) (Ca2 +/Mg2 +) kullanarak bir otomatik kalıp çamaşır makinesi.
Not: Bu bölümdeki tüm yıkama aksi belirtilmedikçe otomatik kalıp çamaşır makinesi kullanılarak gerçekleştirilir. Tüm yıkama aynı iletişim kuralını yapılır. - Membran PBST dağıtım 100 µL (olmadan Ca2 +/Mg2 +) tarafından permeabilize ve oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya. Ardından, protein PBST % 10 BSA losyonlu 100 µL tarafından engelleme gerçekleştirmek ve nazik bir plaka shaker kullanarak sallayarak içinde 1 h için kuluçkaya. Engelleme protein sonra 4 ° C'de gecede nazik sallayarak bir plaka shaker kullanarak kuluçkaya, 50 µL % 1 BSA birincil antikor içeren PBST ekleyin.
Not: protein blok ve antikor ek arasında yıkama yok. - 24 saat sonra (olmadan Ca2 +/Mg2 +) 1 x DPBS üç kez yıkayın ve PBST % 1 BSA losyonlu 50 µL tarafından ikincil antikor ekleyin. Karanlık oda sıcaklığında 1 h kuluçkaya.
- İkincil antikor kuluçka sonra 3 kez 1 x DPBS ile yıkayın. DPBS DAPI ile 50 µL ekleyin (10 µg/mL) ve karanlık oda sıcaklığında 5-10 dk için kuluçkaya.
- Son olarak, 3 kez DPBS ile yıkama ve 1 x DPBS 100 µL kuyuda bırakın. Tabak görüntüleme için hazır.
Not: Tabak karanlıkta 4 ° C'de görüntüleme kadar muhafaza edilmelidir. - Plaka bir yüksek-içerik görüntüleme sistemi kullanılarak görüntü ve iyi iyi bir gösterimini elde etmek için iyi arasında çeşitli alanlarda elde. Ifade HLCs farklı işaretlerinin Columbus yazılım (yüksek-içerik görüntüleme analiz sistemi yazılımı) kullanarak ölçmek.
Not: Columbus hücre segmentasyon analiz için hücre fenotipleme sunuyor bir yüksek içerik analizi yazılımıdır. CellProfiler, bir açık kaynak yazılım biyolojik görüntüleri22Nicel analiz kullanarak benzer sonuçlar elde edilebilir.
Representative Results
Hücre farklılaşması bir embriyonik kök hücre satırı (H9) kullanarak gerçekleştirildi. Yarı otomatik platformu ve dönüşüm (Şekil 1A) hücreleri ayırdetmek için kullanıldı. Bir otomatik sıvı işleme makinesi matris ceket ve tek hücre tohum için kullanıldı. Hücreleri % 40 confluency (gün 0) ulaştığında hücresel başkalaşım başlatıldı. Medya değişikliklerini orta ve orta ek (Şekil 1A) sıvı işleme makinesi kaldırmak için bir otomatik el Elektronik kanal pipet sistemi kullanılarak yapıldı. Hücre fiksasyon ve boyama otomatik sıvı işleme makinesi otomatik kalıp çamaşır makinesi ile birlikte kullanılarak yapıldı. Görüntüleme ve miktar yüksek içerik görüntüleme sistemi ve Columbus yazılım kullanılarak yapıldı. Sitokrom P450 etkinlik kurulan bir tahlil kullanılarak ölçüldü. Substrat kuluçka, hücre supernatants hasat edildi ve bioluminescence multimod Mikroplaka Okuyucu (Şekil 1A) kullanarak kaydedilen. Buna ek olarak, geleneksel faz kontrast mikroskobu hepatosit farklılaşma (Şekil 1B) sırasında hücre morfolojisi değişiklikleri ölçmek için kullanıldı.
Gün 18, cep numarası kuyular arasında değişkenlik (Şekil 2A) boyama DAPI incelenmiştir. Yedi alanları görmek sayısal çekirdeği (Şekil 2A) sayısı başı iyi ele geçirildi. Wells de (Şekil 2B) başına 366 hücre 41,662 ±3, ortalama ile arasında istatistiksel hiçbir farkı tespit ettik.
Gün 18, HLCs sabit ve tipik hepatosit işaretleri (Şekil 3A-G) lekeli ve CYP P450 etkinlik için test. HLCs ifade HNF4α gibi hepatosit işaretleri (%89.2 ±2 pozitif hücrelerinin), ALB (%92.8 ±6 pozitif hücrelerinin), AFP (%61,8 ±2 pozitif hücrelerinin). HLCs da CYP P450 proteinler, CYP2D6 ve CYP3A4 ifade ve E-Cadherin protein ifade tarafından gösterildiği gibi poligonal görünümün faklı bir görünümü görüntülenir. HLCs CYP P450 etkinlik günü 18 ölçüldü. HLCs 295,906 ±45, 828 RLU/mL/mg protein ve CYP3A 1,066,112 ±177, 416 RLU/mL/mg protein (Şekil 3 H), CYP1A2 faaliyet sergiledi.
Şekil 1: 96 yılında hepatosit farklılaşma PSC'ler üzerinden de biçimlendirmek. (A). Diyagram araç yarı otomatikleştirmek, hücresel başkalaşım, fiksasyon, boyama, görüntüleme ve fonksiyonel etkinlik için kullandık. (B). temsilcisi HLC farklılaşma sırasında hücresel morfoloji değiştirir. Kısaca, PSC'ler kesin endoderm, Arnavut kaldırımı benzeri morfoloji gösteren hücreleri tarafından ve hepatosit olgunlaşma önce şekli poligonal edinme hücreleri ile karakterize hepatoblast belirtimi ardından doğru astarlanmalıdır. Ölçek çubuğu 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: HLCs iyi şey değişkenlik değerlendirilmesi. (A) 96 gösterimi de plaka DAPI ile lekeli HLCs görünümünü. Ölçek çubuğu 1 mm. (B) = miktar iyi başına hücre sayısı. Cep numarası sütunlar (üst) ve satırlar (alt), yedi alanların sayısı başı iyi quantified Columbus yazılımını kullanarak wells başına ortalama. 41,662 ± 3,366 SEM hücreleri de başına ortalama hücre sayıdır plaka arasında. Kuyular arasında istatistiksel olarak anlamlı fark tespit edildi. One-way ANOVA Tukey'nın post-hoc istatistiksel testler ile istihdam edildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: hepatosit marker ifade ve HLCs CYP P450 etkinlik ölçümü, gün 18. Hepatosit nükleer faktör 4 Alfa yüzdesi (A) (HNF4α) ifade ± SEM on alanları bakış iyi başına otuz kuyu temel alınır. (B) albümin (ALB) ifade + /-SEM, yüzde on alanları bakış iyi ücret 3 ayrı wells üzerinde dayanır. (C) 3 ayrı wells de başına on alanları bakış ile alfa fetoprotein (AFP) SEM +/-yüzdesi dayanmaktadır. (D) E-cadherin boyama. (E) CYP2D6 boyama. (F) CYP3A4 boyama. (G). immünglobulin denetim boyama G (IgG). Ölçek çubuğu 50 µm. (H) CYP P450 1A2 ve 3A metabolik aktivite HLCs gün 18 =. Altı biyolojik SEM etkinlik çoğaltır veri temsil başına 1 mg protein göreli ışık birimleri (RLUs) /mL olarak alıntı yaptı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
Bizim yarı otomatik verimli, güvenilir ve ekonomik, HLCs üretimi (Şekil 1) ölçekte sağlayan işlemdir. Hücre tabanlı filtreleme (Şekil 2) için uygun bir yaklaşım bu platform yapma plaka, kuyular arasında hücre sayısı açısından herhangi bir anlamlı bir fark yoktu. Ayrıca, yarı Otomasyon iş akışı kullanıcının hangi manuel süreçleri5,12kullanmadan önce mümkün değildi tabak bir kerede çok sayıda üretmek sağlar.
Önemlisi, Otomasyon işlemi HNF4α ifade hücreleri çoğunluğu ile farklılaşma verimleri üzerinde etkisi olmadı (%89.2 ±2) ve ALB (%92.8 ±6) (Şekil 3). HLCs da CYP P450 enzimleri CYP2D6 ve CYP3A4 ifade ve metabolik aktivite önceki bildirilen deneyler (Şekil 3)5' e benzer CYP1A2 ve CYP3A görüntülenir. Protokol standardizasyon rağmen hücre confluency farklılaşma önce saf HLC farklılaşma için önemlidir. Bu nedenle, bir iyi hücre dağılımı arasında iyi sağlanması önemli bir göz (Şekil 1). Bu hücre kültürünü bağımlı olduğu kanıtlanmıştır, bu nedenle hücre tohum ve yoğunluk optimizasyonu her hücre satırı rahip için ölçek-up gereklidir.
Şu anki haliyle bu platform HLCs klinik uygulamalar için büyük miktarlarda üretmek uygun değildir ve bu büyük olasılıkla hücre fabrikaları ve Biyoreaktörler aracılığıyla gerçekleştirilecektir. Ancak, geliştirilen metodolojisi hastalığı modelleme, uyuşturucu tarama ve/veya uyuşturucu çalışmalar repurposing için insan karaciğer hücrelerinin oluşturmada hızlı izin vermez. Ayrıca, tahlil multiparametric veri kümeleri nesil mekanik analiz için izin çoğullama için mükellef olduğunu. İleriye, aynı zamanda bu teknoloji daha karmaşık vitro sistemlerine 3D farklılaşma gibi veya HLC fenotip vitrogeliştirmek için bir platform olarak uygulanan olabilir inanıyoruz.
Sonuç olarak, basit ve yarı otomatik sistemimiz deneysel iş çıkarma yeteneğini artırmak ve deneysel varyasyon, azaltmak böylece biyolojik veri kümeleri ve onların ekstrapolasyon insan fizyolojisi doğru kalitesini artırma inanıyoruz.
Disclosures
Prof. David C. Hay bir eş-kurucusu ve Stemnovate sınırlı direktörüdür.
Prof. David C. Hay HigherSteaks Limited direktörüdür.
Acknowledgments
Bu eser ödül şef bilim adamının Office (TCS/16/37) ve bir MRC Doktora Bursu ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 405 LS Washer | Biotek | ||
| B27 supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
| beta-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| DPBS with Calcium and Magnesium | ThermoFisher | 14040133 | |
| Gentle cell dissociation reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050 | |
| GripTips for VIAFLO 96 | Integra | 6434 | |
| HepatoZYME-SFM | Life Technologies | 17705021 | |
| Human Activin A | Peprotech | 120-14E | |
| Human Hepatocyte Growth Factor | Peprotech | 100-39 | |
| Human Oncostatin M | Peprotech | 300-10 | |
| Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LN521-02 | |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma-Aldrich | H4881 | |
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829 | |
| Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828 | |
| mTeSR1 medium | STEMCELL Technologies | 5850 | |
| MultidropCombi Reagent Dispenser | ThermoFisher | 5840300 | |
| Non-essential amino acids | Life Technologies | 11140 | |
| Operetta High-Content Imaging System | PerkinElmer | HH12000000 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
| Recombinant mouse Wnt3a | R&D Systems | 1324-WN-500/CF | |
| Rho-associated kinase (ROCK)inhibitor Y27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 21875 | |
| Standard tube dispensing cassette | ThermoFisher | 24072670 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| VIAFLO 96 Electronic 96-channel pipette | Integra | 6001 | |
| PBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190250 | |
| Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 | Sigma-Aldrich | 1.00496 EMD MILLIPORE | |
| P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System | Promega | V8801 | |
| P450-Glo CYP1A2 Assay and Screening System | Promega | V8771 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Antibodies | |||
| Albumin | Sigma-Aldrich | A6684 | 1:200 (mouse) |
| Alpha-fetoprotein | Abcam | ab3980 | 1:500 (mouse) |
| CYP2D6 | University of Dundee | University of Dundee | 1:200 (sheep) |
| CYP3A4 | University of Dundee | University of Dundee | 1:200 (sheep) |
| HNF-4α | Santa Cruz | sc-8987 | 1:400 (rabbit) |
| E-cadherin | Abcam | ab76055 | 1:200 (mouse) |
| IgG | DAKO | 1:400 | |
| Anti-Mouse 488 (secondary antibody) | Life technologies | A-11001 | 1:400 |
| Anti-sheep 488 (secondary antibody) | Life technologies | A-11015 | 1:400 |
| Anti-rabbit 488 (secondary antibody) | Life technologies | A-11008 | 1:400 |
References
- Forbes, S. J., Gupta, S., Dhawan, A. Cell therapy for liver disease: From liver transplantation to cell factory. J Hepatol. 62 (1, Supplement), S157-S169 (2015).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 170-182 (2016).
- Szkolnicka, D., Lucendo-Villarin, B., Moore, J. K., Simpson, K. J., Forbes, S. J., Hay, D. C. Reducing Hepatocyte Injury and Necrosis in Response to Paracetamol Using Noncoding RNAs. Stem Cells Transl Med. 5 (6), 764-772 (2016).
- Choudhury, Y., et al. Patient-specific hepatocyte-like cells derived from induced pluripotent stem cells model pazopanib-mediated hepatotoxicity. Sci Rep. 7, 41238 (2017).
- Cameron, K., et al. Recombinant Laminins Drive the Differentiation and Self-Organization of hESC-Derived Hepatocytes. Stem Cell Rep. 5 (6), 1250-1262 (2015).
- Cayo, M. A., et al. A Drug Screen using Human iPSC-Derived Hepatocyte-like Cells Reveals Cardiac Glycosides as a Potential Treatment for Hypercholesterolemia. Cell Stem Cell. 20 (4), 478-489 (2017).
- Takayama, K., et al. Prediction of interindividual differences in hepatic functions and drug sensitivity by using human iPS-derived hepatocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (47), 16772-16777 (2014).
- Takayama, K., et al. 3D spheroid culture of hESC/hiPSC-derived hepatocyte-like cells for drug toxicity testing. Biomaterials. 34 (7), 1781-1789 (2013).
- Hay, D. C., et al. Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo. Stem Cells Dayt Ohio. 26 (4), 894-902 (2008).
- Iii, R. L. G., et al. Maturation of Induced Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocytes by 3D-Culture. PLOS ONE. 9 (1), e86372 (2014).
- Chen, Y. -F., Tseng, C. -Y., Wang, H. -W., Kuo, H. -C., Yang, V. W., Lee, O. K. Rapid generation of mature hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells by an efficient three-step protocol. Hepatol Baltim Md. 55 (4), 1193-1203 (2012).
- Wang, Y., et al. Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells. JoVE J Vis Exp. (121), e55355 (2017).
- Takayama, K., et al. Long-Term Self-Renewal of Human ES/iPS-Derived Hepatoblast-like Cells on Human Laminin 111-Coated Dishes. Stem Cell Rep. 1 (4), 322-335 (2013).
- Kanninen, L. K., et al. Laminin-511 and laminin-521-based matrices for efficient hepatic specification of human pluripotent stem cells. Biomaterials. , 86-100 (2016).
- Szkolnicka, D., et al. Accurate prediction of drug-induced liver injury using stem cell-derived populations. Stem Cells Transl Med. 3 (2), 141-148 (2014).
- Kim, D. E., et al. Prediction of drug-induced immune-mediated hepatotoxicity using hepatocyte-like cells derived from human embryonic stem cells. Toxicology. 387 (Supplement C), 1-9 (2017).
- Rashid, S. T., et al. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest. 120 (9), 3127-3136 (2010).
- Grimm, F. A., Iwata, Y., Sirenko, O., Bittner, M., Rusyn, I. High-Content Assay Multiplexing for Toxicity Screening in Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes and Hepatocytes. Assay Drug Dev Technol. 13 (9), 529-546 (2015).
- Bray, M. -A., et al. A dataset of images and morphological profiles of 30,000 small-molecule treatments using the Cell Painting assay. GigaScience. , (2017).
- Pradip, A., et al. High Content Analysis of Human Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocytes Reveals Drug Induced Steatosis and Phospholipidosis. Stem Cells Int. 2016, 2475631 (2016).
- Donato, M. T., Gómez-Lechón, M. J., Tolosa, L. Using high-content screening technology for studying drug-induced hepatotoxicity in preclinical studies. Expert Opin Drug Discov. 12 (2), 201-211 (2017).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, R100 (2006).
