Summary
ويصف هذا البروتوكول إجراء لاستخراج وإثراء فوسفوبيبتيديس من خطوط خلايا سرطان البروستاتا أو الأنسجة لإجراء تحليل فوسفوبروتيومي عبر البروتيوميات الجماعي القائم على قياس الطيف الكتلي.
Abstract
فوسفوبروتيوميكس تشتمل على دراسة واسعة النطاق للبروتينات فوسفوريلاتيد. الفسفرة البروتين يعد خطوة حاسمة في العديد من ممرات توصيل الإشارات وتنظمه أحكام مؤنزم وفوسفاتاسيس. ولذلك، تميز في فوسفوبروتيومي قد توفر رؤى في تحديد أهداف جديدة والمؤشرات الحيوية لعلاج الأورام. الكتلي يوفر وسيلة لكشف على الصعيد العالمي وتحديد آلاف أحداث الفسفرة فريدة من نوعها. ومع ذلك، فوسفوبيبتيديس وفيرة أقل بكثير من غير فوسفوبيبتيديس، مما يجعل تحليل الكيمياء الحيوية أكثر تحديا. للتغلب على هذا التحديد، أساليب لإثراء فوسفوبيبتيديس قبل تحليل الطيف الكتلي مطلوبة. يمكننا وصف إجراء لاستخراج وهضم البروتينات من الأنسجة تسفر عن الببتيدات، متبوعاً بإثراء فوسفوتيروسيني (pY) والببتيدات فوسفوسيريني/ثريونين (pST) يستند جسم باستخدام ثاني أكسيد التيتانيوم (TiO2)-على أساس أسلوب الإثراء. بعد إعداد العينة والطيف الكتلي، بعد ذلك نحدد وقياس فوسفوبيبتيديس استخدام الكتلي كروماتوغرافيا سائلة وتحليل البرمجيات.
Introduction
حدوث حالات جديدة 165,000 المقدرة ونحو 29,000 الوفيات ستحدث في عام 2018 بسبب سرطان البروستاتا، الذي يمثل أكثر أنواع السرطان شيوعاً، والسبب الرئيسي الثاني للوفاة المتعلقة بالسرطان لدى الرجال في الولايات المتحدة1. المراحل المبكرة من سرطان البروستاتا يتم علاجها ببتر أو الإشعاع العلاج من المرض محصورة في الجهاز، حيث معدل التكرار العشري بين 20% و 40% للمرضى الذين خضعوا لعملية استئصال غدة البروستاتا وبين 30% و 50% للمرضى الذين يتلقون الإشعاع 2من العلاج. نظراً لأن سرطان البروستاتا يعتمد على الاندروجين إشارة للنمو، والعلاجات الاخصاء الجراحي والكيميائي أيضا يعمل للمرضى المعرضة للخطر. لكن يحدث الانتكاس عند السرطان لم يعد يستجيب للعلاج الاندروجين الحرمان كما يتضح من تكرار البيوكيميائية، حيث ترتفع مستضد البروستات المحددة في مصل الدم مرة أخرى. عند هذه النقطة في التقدم، الانبثاث غالباً ما تكتشف كذلك. هذه مرحلة متقدمة، تسمى سرطان البروستاتا المقاوم للخصي المنتشر، يمثل النموذج المميتة من المرض حيث التشخيص وقت متوسط بقاء أقل من سنتين3. تتوفر خيارات العلاج قليلة في أواخر مرحلة المرض، بما في ذلك أنتياندروجينس الجيل الثاني مثل انزالوتاميدي و abiraterone، فضلا عن العلاج الكيميائي على أساس تشن مثل دوسيتاكسيل. وعلى الرغم من العلاجات المتاحة، غالباً ما تقدم المرض. ولذلك، باكتشاف وتطوير أساليب علاج جديدة ضرورية لتحسين الرعاية لمرضى سرطان البروستاتا مرض متقدمة.
الطيف الكتلي (مللي ثانية)-توفر النهج استناداً إلى تحليل عالمي للبروتين من خلال الكشف عن مئات الآلاف من الببتيد تحليلها4. على وجه الخصوص، يمكن أن تسفر عن اكتشاف البروتيوميات، يعرف أيضا باسم البيانات تعتمد على اقتناء (DDA)، تحديد وكوانتيتيشن الآلاف من الببتيدات4،5. يمكن تحديد الاكتشاف المستندة إلى MS البروتيوميات كذلك البروتيوميات من أعلى إلى أسفل، حيث تتميز البروتينات سليمة، والبروتيوميات التصاعدي (يعرف أيضا باسم بندقية)، حيث يتم تحليل الببتيدات تميز البروتينات5. وهكذا، في البروتيوميات بندقية، خطوة proteolysis يأخذ مكان في إعداد العينة السابقة لتحليل مرض التصلب العصبي المتعدد تهزم البروتينات في الببتيدات. في النهاية، يتم تنفيذ بحث قاعدة بيانات لخريطة الببتيدات إلى البروتينات لتحديد الهوية. خالية من التسمية فضلا عن عدة النظائر العلامات [مثلاً، النظائر المستقرة التي وصفها بالأحماض الأمينية في الخلية والثقافة (سيلك)] يمكن استخدام الأساليب الكمية مقارنة الببتيدات بين العينات6،7. بينما وصفها تقنيات النظائر هي معيار الذهب، خالية من تسمية أساليب أثبتت دقة القياس الكمي مشابهة8،9 وميزات وعيوب قابلة للمقارنة بين حساسية وخصوصية10. كوانتيتيشن خالية من تسمية يوفر تغطية أكبر ويسمح مقارنات بين العديد من عينات أكثر، بينما الأساليب المستندة إلى تسمية مقيدة بالتكلفة والقدرات المتنوعة6،،من78.
وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام بندقية MS أيضا باستجواب تعديلات بوستترانسلاشونال (بتمس) مثل الفسفرة11. نظراً لطبيعة المقايسة أقل مقارنة بمجموع الببتيدات فوسفوبيبتيديس، تستخدم عدة أساليب لإثراء فوسفوبيبتيديس، بما في ذلك إيمونوبريسيبيتيشن القائم على الضد من الببتيدات فوسفوتيروسيني (pY)، ثاني أكسيد التيتانيوم (TiO2 )، والمعطل تداولها تقارب معدنية اللوني (ايماك)5،12. لأن الفسفرة البروتين خطوة رئيسية في العديد من الخلايا مما يشير إلى مسارات، بندقية فوسفوبروتيوميكس يسمح للباحثين للتحقيق في الخلية مما يشير إلى تغييرات في سرطانات مختلفة، منها13من الثدي و البروستاتا14و الكلي15، والمبيض،،من1617 لفهم بيولوجيا السرطان وتحديد أهداف جديدة محتملة للعلاج.
وكان هذا الأسلوب فوسفوبروتيوميك بندقية خالية من تسمية بني والمكرر استناداً إلى العمل السابق جربير المجموعة18،،من1920. ويبدأ هذا البروتوكول بوصف استخراج وهضم البروتينات وفوسفوبروتين من الأنسجة إلى الببتيدات. نحن ثم التفصيل إثراء الببتيدات pY استخدام الأجسام المضادة فوسفوتيروسيني محددة و TiO2. كما يصف لنا في إثراء الببتيدات فوسفوسيريني/ثريونين (pST) استخدام القوى الموجبة exchange (SCX) تليها TiO2. ويختتم هذا البروتوكول بتقديم عينات لمرفق لمرض التصلب العصبي المتعدد واستخدام برمجيات تحليل مرض التصلب العصبي المتعدد لتحديد وقياس فوسفوبيبتيديس وعلى فوسفوبروتين المقابلة. تطبيق هذا البروتوكول يمكن أن تمتد إلى ما وراء سرطان البروستاتا في الحقول خارج علم الأورام والسرطانات الأخرى.
Protocol
تجارب باستخدام إكسينوجرافت الأورام كانت وافقت عليه لجنة الاستخدام ورعاية الحيوان المؤسسية جامعة روتجرز كمجموعة المنصوص عليها وفقا للمبادئ التوجيهية "المعاهد الوطنية للصحة".
1-البروتين الاستخراج
- إعداد تحلل المخزن المؤقت (الجدول 1). (الحجم يعتمد على عدد العينات أن تحصد). لعينات الخلايا في المختبر ، انتقل إلى الخطوة 1، 2. لانسجة الورم، انتقل إلى الخطوة 1، 3.
-
حصاد الخلايا
- جمع الخلايا في أنبوب 50 مل مخروطية وتدور لهم على 700 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية وإبقاء بيليه على الجليد. كرر هذه الخطوة لكل الأطباق جمع الخلايا إلى بيليه واحد. (عادة، هناك حاجة إلى حوالي 5 أطباق 15 سم تقريبا المتلاقية للخلايا ل 5 ملغ بروتين، ولكن هذا قد يكون معتمداً على خط الخلية واحتياجات تحددها كل محقق تجريبيا.)
- أغسل بيليه مع 30 مل من المحلول الملحي مبردة معزولة الفوسفات (PBS) وتدور في 700 x ز لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية قبل يسفط في برنامج تلفزيوني. إضافة 1.5 مل من المخزن المؤقت لتحلل كل 5 ملغ بروتين يستخدم لبيليه الخلية. بيبيت صعودا وهبوطاً عدة مرات. انتقل إلى الخطوة 1، 4.
-
حصاد الأنسجة
- وزن الورم وإضافة 2 مل من تحلل المثلج المخزن المؤقت لكل 100 مغ من الأنسجة في أنبوب اختبار ثقافة. (عادة، 50 إلى 150 ملغ وزن الرطب أنسجة مطلوب.)
- مجانسة ليساتي استخدام اليد أو benchtop الخالطون (نبض x 2 ل 15 ق.) تنظيف الخالطون قبل العينة الأولى وبين العينات باستخدام التبييض 10% إيثانول 70% والمياه في الخلافة.
- لتقليل والكيلات، وتسخين العينات المتجانس في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. ثم تبرد لهم على الجليد لمدة 15 دقيقة. على الجليد، sonicate x 3 ليساتي (أي، نبضة لمدة 30 ثانية مع 60 s مؤقتاً بين النبضات). وينبغي العينة لا لزج أو كلومبي عند هذه النقطة. الحرارة في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق21.
- جمع المادة طافية أنبوب في سونيكيشن نفس استخدام دوار دلو سوينغ في س 3,500 ز عند 15 درجة مئوية عن 15 دقيقة للطرد المركزي وتجاهل بيليه.
- تحديد تركيز البروتين عن طريق إجراء مقايسة برادفورد22. إذا لزم الأمر، تمييع إلى 5 ملغ/مل مع تحلل المخزن مؤقت. تخزينها في-20 درجة مئوية.
ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً التجربة هنا. تجميد العينات في-80 درجة مئوية، ويستمر في وقت لاحق.
2-الهضم
- تمييع العينة 12-fold باستخدام 100 ملم تريس (pH = 8.5) لتقليل الكمية جوانيدينيوم. تمييع جميع العينات على نفس وحدة التخزين تقليل تأثيرات الهضم غير متكافئة. حفظ 12.5 ميكروغرام عسر الهضم للتأكد من أنه الملطخة بأخذ جل23.
- لإضافة 10 ميكروغرام من ليسيل Endopeptidase (Lys-ج) 5 ملغ بروتين، واحتضان في درجة حرارة الغرفة حاء – 5-6 ضبط الأس الهيدروجيني إلى 8.0 بإضافة 1 م أونتيتراتيد تريس (الرقم الهيدروجيني ~ 11).
- إعداد 1 ملغ/مل للأم-1-توسيلاميدو-2-فينيليثيل ثاني ميثيل كيتون (تبكك)-معاملة التربسين 1 مم HCl (مع 20 مم كاكل2). إضافة التربسين بنسبة بروتين التربسين: 1: 100 واحتضان أنه عند 37 درجة مئوية ح 3.
- قم بإضافة نفس الكمية من التربسين الطازجة كما هو الحال في الخطوة 2، 3. احتضان عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- حفظ 12.5 ميكروغرام لهضمها للتأكد من هضم كاملة على الملطخة بأخذ جل23.
3-عكس مرحلة الاستخراج
- سجل حجم ليستي. تصفية في النموذج باستخدام عامل تصفية استقطاع كاتشين 15 مل 10. الطرد المركزي العينة في 3,500 س ز استخدام الدوار دلو سوينغ (أو 3,500 ز س في دوار زاوية ثابتة) في 15 درجة مئوية حتى يصبح حجم ريتينتاتي أقل من 250 ميليلتر (وهذا يأخذ حوالي 45-60 دقيقة). جمع-التدفق عبر وتجاهل في ريتينتاتي.
ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً التجربة هنا. تجميد العينات في-80 درجة مئوية، ويستمر في وقت لاحق. - أسيديفي العينة، بإضافة حوالي 20 ميليلتر من 5% حامض trifluoroacetic (تفا) كل مل من ليستي. خلطهما جيدا وقياس درجة الحموضة العينة باستخدام شرائح الأس الهيدروجيني. ضبط الأس الهيدروجيني 2.5 استخدام 5% تفا.
- قم بتوصيل الطرف أقصر من عمود C-18 المتشعبة فراغ. تعيين الفراغ بين 17 و 34 من الجيش الشعبي الكوري (أو وفقا لإرشادات الشركة المصنعة). استخدام الماصات الزجاجية ، الرطب العمود مع 3 مل من 100% الاسيتو الانيتريل (ACN). لا تدع العمود الجاف.
- استخدام الماصات الزجاجية ، حجته العمود مع 6 مل من 0.1% تفا تطبيقها مل 2 × 3. تحميل العينة المحمضة في العمود. لا تقم بإضافة أكثر من 3 مل في وقت واحد. ضبط فراغ لاستهداف حوالي 1 إلى 2 قطرات في الثانية الواحدة.
- استخدام الماصات الزجاجية ، أغسل العمود مع 9 مل من 0.1% تفا تطبيقها مل 3 × 3. الوت العمود مع 2 مل من 40% تزاول، 0.1% تفا. جمع اثنين 2 مل الكسور في أنابيب زجاجية الثقافة. تجاهل العمود.
- تغطي هذه الأنابيب النذرة مع بارافيلم ولكمه ثقوب 3-5 على غلاف باستخدام إبرة 20 غ. تجميد النذرة في الثلج الجاف لمدة 30 دقيقة على الأقل حتى يتم صلبة تماما.
- ليوفيليزي الكسور بين عشية وضحاها. اليوم التالي، تأكد من العينات جافة تماما قبل التوقف في ليوفيليزير. تخزين الأنابيب في أنبوب 50 مل مخروطية مع مناديل حساسة في-80 درجة مئوية.
ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً التجربة هنا.
4-إيمونوبريسيبيتيشن وإثراء pY الببتيدات24
- ريسوسبيند مسحوق المجففة بالتبريد مع 0.5 مل من المخزن المؤقت ملزم إيمونوبريسيبيتيشن المثلج (IP) في كل جزء. تجمع الكسور بنقل وحدة التخزين استثارة 0.5 مل من الكسر الثاني للكسر الأول وحفظ طرف ماصة. قوة دوامة (بدلاً من بيبيتينج صعودا وهبوطاً) للتأكد من حل العينة تماما قبل نقلها إلى كريوتوبي ملولبة 3.6 مل.
- كما هو الحال في الخطوة 4، 1.، شطف أنابيب ليوفيليزيشن مع آخر مل 0.5 من المخزن المؤقت لربط IP (الجدول 1) في كل أنبوبة. نقل الحل إلى أنبوب ملولبة 3.6 مل استخدام تلميح ماصة نفسه إلى أدنى حد من أي خسارة في العينة. تكرار شطف 1 x أكثر، مما يجعل حجم استثارة النهائية 2 مل (ل 5 ملغ بروتين). قياس درجة الحموضة عينة للتأكد من أنها حوالي 7.4. إذا كانت حمضية جداً، تكراري إضافة 10 ميليلتر من 1 م تريس (أونتيتراتيد، الرقم الهيدروجيني ~ 11). إذا كان من الأساسي جداً، تكراري إضافة 10 ميليلتر من HCl مخفف (01:25 أو 1: 100).
-
قبل تغسل الخرز pY (على 5 ملغ من بدء ليساتي)
- هناك حاجة إلى 25 ميكروغرام من جسم 10 4 و 12.5 ميكروغرام من جسم 27B10.4 كل عينة. بعد استخدام p200 "الماصة؛" مع تلميح قص لنقل الأجسام المضادة في أنابيب ميكروسينتريفوجي منفصلة، وتغسل الأجسام المضادة مع 450 ميليلتر من المخزن المؤقت لربط IP المثلج 2 x. الطرد المركزي لهم في ز 100 x لمدة 1 دقيقة على 4 درجة مئوية و aspirate من المادة طافية.
- ريسوسبيند الخرز إلى تركز أسهم 0.5 ملغ/مل باستخدام المخزن المؤقت لربط IP. (لا لا دوامة الخرز). بعد اليقوتينج ملاط اللازمة (50 ميليلتر من الملاط جسم 10 4 و 25 ميليلتر 27B10.4 جسم ملاط كل عينة) في أنبوب واحد، تدور إلى أسفل الأنابيب المخزون أجهزة الطرد المركزي في ز 200 x لمدة 1 دقيقة في 4 درجات مئوية. أغسل سيديوالس مع المادة طافية قبل العودة الخرز للتخزين في الثلاجة.
- إضافة الخرز قبل غسلها بأي حل حراكه عينة في كريوتوبيس ملولبة. احتضان لهم عند 4 درجة مئوية في المدورة نهاية أكثر بين عشية وضحاها.
- ضع كريوتوبيس ملولبة في أنبوب الطرد مركزي 50 مل اصطف مع مسح دقيق. تدور أسفل الخرز في 100 غرام x للحد الأدنى 1 حفظ المادة طافية، التي ستستخدم لإثراء الببتيدات الباسيفيكي. (الإثراء لتوقيت المحيط الهادي يبدأ في الخطوة 7، ويمكن تنفيذها بالتوازي مع معالجة الببتيد pY).
- ريسوسبيند الخرز مع 300 ميليلتر من المخزن المؤقت لربط IP. نقلها إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 2 مل وتدور عليهم إلى أسفل في 100 غ س ل 1 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- شطف الحضانة أنبوب x 3 مع 200 ميليلتر من المخزن المؤقت لربط IP. نقل المحتويات إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي نفسه في كل مرة. ثم تدور عليهم إلى أسفل.
- أغسل حبات في ميكروسينتريفوجي أنبوب x 3 مع 500 ميليلتر من المخزن المؤقت لربط IP وتدور لهم أسفل في 100 غ س ل 1 دقيقة. ثم تغسل الخرز 4 x مع 450 ميليلتر من 25 مم NH4HCO3ودرجة الحموضة 7.5، وتدور عليهم في ز 100 x للحل 1 دقيقة استخدام طازجة 25 مم NH4HCO3 من مسحوق كل الوقت.
- الطرد المركزي الخرز في 1,500 س ز 1 دقيقة استخدام تلميح تحميل لجل إزالة المادة طافية تماما بغمس غيض غيض تحميل جل قليلاً تحت سطح الخرز.
- إضافة 4 × حجم حبة 0.1% تفا الخرز (أيإضافة 300 ميليلتر من 0.1% تفا على 75 ميكروغرام من الملاط حبة pY). خلطهما جيدا واحتضان الخليط في ثيرموميكسير 1,000 لفة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- نقل استثارة لعامل تصفية تدور 0.2 ميكرون. وسرعان ما تدور أسفل أنبوب شطف نقل وحدة التخزين المتبقية إلى تدور نفس عامل التصفية باستخدام بيبيت P10. نقل تدور إلى أسفل تصفية تدور في 850 x ز 1 كحد أدنى في شطف لأنبوب ميكروسينتريفوجي ملزمة البروتين المنخفض . الفراغ تركز النذرة إلى جفاف بين عشية وضحاها عند 40 درجة مئوية، ومع وقت حرارة من 300 دقيقة.
ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً التجربة هنا. تجميد العينات في-80 درجة مئوية، ويستمر في وقت لاحق.
5-ثاني أكسيد التيتانيوم تخصيب25 من الببتيدات pY
- ريسوسبيند المجففة في أسفل فوسفوبيبتيديس في 200 ميليلتر من 50% تزاول، 0.1% تفا. دوامة والطرد المركزي لهم في س 10,000 ز لتكرار س. 30 هذا س 1 إلى ريسوسبيند عليها جيدا.
- إعداد الخرز2 TiO الواردة في النصائح التي لها قدرة 200 ميليلتر عينات.
- اضغط برفق على جانب نصيحة صغيرة من تلميح لنقل المواد لهذا الغرض. شطف الحافة بإضافة 200 ميليلتر من 100% تزاول، تليها عكس التلميح والتحريك نهاية الصغيرة لنقل السائل نحو عملية النداءات الموحدة.
- باستخدام شفرة حلاقة، قطع صغيرة غيض من غيض ووضعه على أنبوب ملزمة البروتين المنخفض. (تجنب استخدام أنابيب البوليسترين TiO2 ستلتزم بجانبي الأنبوب). إزالة الغطاء وقم بإدراج ميكروبيبيتي يغرق بها تزاول المتبقية. تكرار الغسيل مع 200 ميليلتر من 100% تزاول. وتقع الآن الخرز TiO2 في أنبوب ملزمة البروتين المنخفض للخطوات التالية.
- مسبق TiO2 مع 500 ميليلتر من تزاول 100% 2 x. بيبيت إلى مزيج الخرز مع المذيب. الطرد المركزي لهم في 100 غ س ل 1 دقيقة.
- شرط TiO2 مع 500 ميليلتر من 0.2 M فوسفات الصوديوم العازلة (الرقم الهيدروجيني ~ 7) 2 x. أغسل حبات مع 300 ميليلتر من الموازنة المخزن المؤقت 3 x. نظراً لأن TiO2 كثيفة جداً، وسوف تستقر الخرز بسرعة.
- إضافة 400 ميليلتر من 50% تزاول، 0.1% تفا في أنبوب ملزمة البروتين المنخفض، تليها إضافة ميليلتر 84 من حمض اللبن. نقل فوسفوبيبتيديس ريسوسبينديد في أنبوب ملزمة البروتين المنخفض واحتضانها لهم ح 1 في درجة حرارة الغرفة المدورة نهاية أكثر استخدام.
- الطرد المركزي الخرز في 100 غ س ل 1 دقيقة بيليه لهم. أغسل لهم مع 300 ميليلتر من المخزن المؤقت للموازنة (الجدول 1) 2 x وتدور عليهم إلى أسفل في 100 غ س ل 1 دقيقة.
- شطف الخرز مع 300 ميليلتر من الشطف المخزن المؤقت 2 x. نقلها إلى عامل تصفية تدور 0.2 ميكرون. تدور لهم في 1,500 س ز لمدة 1 دقيقة.
- نقل وحدة التصفية إلى أنبوب نظيفة 1.5 مل ملزمة بروتين منخفضة. الوت محتويات 2 x مع 200 ميليلتر من 0.9% NH3 ح2O. قياس درجة الحموضة مع شرائح الأس الهيدروجيني، التي ينبغي أن تكون بين 10 و 11. وتركز فراغ النذرة إلى جفاف بين عشية وضحاها تتبخر الأمونيا.
6-الملحي الببتيدات pY لتحليلات مرض التصلب العصبي المتعدد
- إعادة تشكيل فوسفوبيبتيديس مع 15 ميليلتر من 0.1% تفا فورتيكسينج وسينتريفوجينج لهم في 10,000 ز x 30 s ريسوسبيند لهم. كرر هذا س 1 إلى ريسوسبيند عليها جيدا. لا "الماصة؛" صعودا وهبوطاً.
- تنظيف العينة باستخدام تلميح C-18 مع قدرة ملزمة من 5 ميكروغرام واتبع البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
- جاف تماما حجم شطف بتركيز الفراغ. حاء – 1-2 وهذا يأخذ ريسوسبيند فوسفوبيبتيديس المجفف في 12.5 ميليلتر من حل الطيف الكتلي (انظر الجدول 1) (أو كما أوصت مرض التصلب العصبي المتعدد الباحث الأساسية البروتيوميات منشأة). دوامة وتدور بإيجاز الحل إلى أسفل في 10,000 س ز لتكرار س. 30 هذا x 2 ريسوسبيند لهم أيضا. العينات على استعداد لتقديمها إلى مرفق الكتلي (الخطوة 11).
ملاحظة: الخطوات التالية أدناه تتعلق بتوقيت المحيط الهادي الببتيد التخصيب فقط.
7-عكس مرحلة الاستخراج من الببتيدات الباسيفيكي
- قياس تركيز المادة طافية المكتسبة من الخطوة 4، 6 عن طريق إجراء مقايسة ببتيد من الببتيد. كمية كافية لتوقيت المحيط الهادي الطيف الكتلي 2.5 ملغ.
- ضبط الأس الهيدروجيني إلى 3.5 مع 5% تفا.
- قم بتوصيل الطرف أقصر من عمود C-18 المتشعبة فراغ. تعيين الفراغ بين 17 و 34 من الجيش الشعبي الكوري (أو وفقا لإرشادات الشركة المصنعة). ويت العمود مع 3 مل من 100% تزاول. لا تدع العمود الجاف.
- حجته العمود مع 6 مل من 0.1% تفا تطبيقها مل 2 × 3. تحميل العينة المحمضة في العمود. لا تقم بإضافة أكثر من 3 مل في وقت واحد. ضبط فراغ لاستهداف حوالي 1-2 قطرات في الثانية الواحدة.
- أغسل العمود مع 9 مل من 0.1% تفا تطبيقها مل 3 × 3. الوت العمود مع 2 مل من 40% تزاول، 0.1% تفا. جمع اثنين 2 مل الكسور في أنابيب زجاجية الثقافة. تجاهل العمود.
- تغطي هذه الأنابيب النذرة مع بارافيلم ولكمه ثقوب 3-5 على غلاف باستخدام إبرة 20 غ. تجميد النذرة في الثلج الجاف لمدة 30 دقيقة على الأقل حتى يتم صلبة تماما.
- ليوفيليزي الكسور المحدد بين عشية وضحاها. اليوم التالي، تأكد من العينات جافة تماما قبل التوقف في ليوفيليزير. تخزين الأنابيب في أنبوب 50 مل مخروطية مع مناديل حساسة في-80 درجة مئوية.
ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً التجربة هنا.
8-القوى تبادل الأيونات الموجبة (SCX) من الببتيدات الباسيفيكي
- ريسوسبيند الببتيدات المجففة بالتبريد في 2 مل من المخزن المؤقت A (الجدول 1). تجمع الكسور لكل عينة. (الحل سيكون غائم).
- إعداد المتشعبة فراغ. قم بتوصيل عمود SCX حقنه 3 مل مع المكبس إزالتها. تعيين الفراغ بين 17 و 34 من الجيش الشعبي الكوري (أو وفقا لإرشادات الشركة المصنعة).
- شرط العمود SCX مع 4 مل تزاول، تليها 4 مل من المخزن المؤقت أ
- تحميل 2 مل العينة من الخطوة 8.1 وجمع النذرة فورا. تحميل 3 مل من المخزن المؤقت A:B (80.9:19.1) وجمع النذرة. تجمع الواتس من كل عينة والكوة لهم في 2 مل منخفضة البروتين-ربط الأنابيب.
- الفراغ تركز جميع العينات حتى يبقى حوالي 30% الحجم. (هذه الخطوة تستغرق حوالي 2-4 ح). تجمع في مختبرين في أنبوب ملزمة البروتين المنخفض 1 لكل عينة.
- قم بتوصيل الطرف أقصر من عمود C-18 المتشعبة فراغ. تعيين الفراغ بين 17 و 34 من الجيش الشعبي الكوري (أو وفقا لإرشادات الشركة المصنعة). ويت العمود مع 3 مل من 100% تزاول 2 x. هل عدم السماح العمود الجاف.
- حجته العمود مع 3 مل من 0.1% تفا 2 x. تحميل العينة في العمود. لا تقم بإضافة أكثر من 3 مل في وقت واحد. ضبط فراغ لاستهداف حوالي 1-2 قطرات في الثانية الواحدة.
- أغسل العمود مع 3 مل من 0.1% تفا 2 x. الوت العمود مع 4 مل من 50% تزاول، 0.1% تفا.
9-ثاني أكسيد التيتانيوم إثراء الببتيدات الباسيفيكي
-
إعداد الخرز2 TiO الواردة في النصائح التي لها قدرة 200 ميليلتر عينات
- اضغط برفق على الجانب نصيحة صغيرة من تلميح لتحريك الخرز تحقيقا لهذه الغاية. إزالة الغطاء وصب الخرز في أنبوب مخروطي البوليبروبيلين 15 مل.
- شطف الحافة بإضافة 200 ميليلتر من 100% تزاول، عكس التلميح بضع مرات، والتحريك نهاية الصغيرة لنقل السائل نحو عملية النداءات الموحدة. باستخدام شفرة حلاقة، قطع صغيرة غيض من غيض ووضعه على أنبوب مخروطي البوليبروبيلين 15 مل. إزالة الغطاء وقم بإدراج ميكروبيبيتي يغرق بها تزاول المتبقية. تكرار الغسيل مع 200 ميليلتر من 100% تزاول. الخرز2 TiO تقع الآن في أنبوب مخروطي 15 مل للخطوات التالية.
- مسبق TiO2 مع 500 ميليلتر من تزاول 100% 2 x. بيبيت إلى مزيج الخرز مع المذيب. الطرد المركزي لهم في 100 غ س ل 1 دقيقة.
- شرط TiO2 مع 500 ميليلتر من 0.2 M فوسفات الصوديوم العازلة (الرقم الهيدروجيني ~ 7) مرتين. أغسل حبات مع 300 ميليلتر من الموازنة المخزن المؤقت 3 x.
- نقل فوسفوبيبتيديس التيد في أنبوب مخروطي البوليبروبيلين 15 مل. إضافة ميليلتر 560 من حمض اللبن واحتضان من أجل ح 1 في درجة حرارة الغرفة المدورة نهاية أكثر استخدام.
- الطرد المركزي المخلوط في 100 غ س ل 1 دقيقة بيليه الخرز. أغسل لهم مع 300 ميليلتر من المخزن المؤقت للموازنة (الجدول 1) 3 x. تدور عليهم إلى أسفل في 100 غ س ل 1 دقيقة.
- شطف الخرز مع 300 ميليلتر من الشطف المخزن المؤقت 2 x. نقلها إلى عامل تصفية تدور 0.2 ميكرون. تدور عليهم إلى أسفل في 1,500 س ز لمدة 1 دقيقة.
- نقل وحدة التصفية إلى أنبوب نظيفة 1.5 مل ملزمة بروتين منخفضة. الوت محتويات 2 x مع 200 ميليلتر من 0.9% NH3 ح2o. واسمحوا الحل الجلوس على فوسفوبيبتيديس لمدة 2 دقيقة قبل التينج لهم. قياس درجة الحموضة، التي ينبغي أن تكون بين 10 و 11.
- وتركز فراغ النذرة إلى جفاف بين عشية وضحاها تتبخر الأمونيا.
10-الملحي الببتيدات الباسيفيكي لتحليلات مرض التصلب العصبي المتعدد
- اضغط برفق على جانب نصيحة صغيرة من تلميح لنقل المواد لهذا الغرض. شطف الحافة بإضافة 200 ميليلتر من 100% تزاول، تليها عكس التلميح والتحريك نهاية الصغيرة لنقل السائل نحو عملية النداءات الموحدة.
- باستخدام شفرة حلاقة، قطع صغيرة غيض من غيض ووضعه على أنبوب مخروطي البوليبروبيلين 15 مل. إزالة الغطاء وقم بإدراج ميكروبيبيتي يغرق بها تزاول المتبقية. تكرار الغسيل مع 200 ميليلتر من 100% تزاول. وتقع الآن الخرز TiO2 في الأنبوب البولي بروبلين 15 مل المخروطية للخطوات التالية.
- تنظيف العينة باستخدام تلميح C-18 مع قدرة ملزمة من 100 ميكروغرام. (اتبع تعليمات الشركة المصنعة).
- جاف تماما حجم شطف بتركيز الفراغ. وهذا يأخذ ح 1-2.
- ريسوسبيند فوسفوبيبتيديس المجفف في 12.5 ميليلتر من حل الطيف الكتلي (أو كما أوصت مرض التصلب العصبي المتعدد البروتيوميات الأساسية مرفق الباحث). دوامة والطرد المركزي لهم في 10,000 ز x 30 س. كرر x 2 ريسوسبيند عليها جيدا. (لا "الماصة؛" صعودا وهبوطاً.)
11-تحليل الكتلي
- إرسال عينات إلى مرفق الأساسية البروتيوميات MS لأداء السائل اللوني-جنبا إلى جنب MS (LC-MS/MS) استخدام الإعدادات الموصى بها. إعدادات المثال كما يلي (انظر الجدول 2 للملخص):
- تحميل 5 ميليلتر من العينات على عمود فخ (2 سم × 75 ميكرون القطر منذ فترة طويلة) وغسلها مع 0.1% تفا لمدة 5 دقائق مع معدل تدفق 5 ميليلتر/دقيقة.
- إحضار في فخ تمشيا مع عمود نانو تحليلية (20 سم × 75 ميكرون) مع معدل تدفق 300 nL/دقيقة.
- التدرجات الخطية مجزأة (نسبة مئوية من حمض الفورميك 0.16%، 80% تزاول في حمض الفورميك 0.2 ٪) مختلفة بين عينات pY والباسيفيكي:
- للعينات pY، الوت لهم استخدام تدرج من 4-15 في المائة في 5 دقائق، 15-50% في 40 دقيقة ومن 50-90% في 5 دقائق.
- لعينات الباسيفيكي، الوت لهم استخدام تدرج من 15-25% في 40 دقيقة، 25-50% في 44 دقيقة، 4-15% في 30 دقيقة و 50-90% في 11 دقيقة.
- الحصول على بيانات MS في اقتناء البيانات تعتمد على الوضع مع سلسلة دورية لفحص كامل مع قرار 120 ألف تليها MS/MS (مشاريع التنمية البشرية، طاقة الاصطدام النسبية من 27 في المائة) من 20 الأيونات الأكثر كثافة ودينامية استبعاد مدة 20 ثانية.
- بعد مرض التصلب العصبي المتعدد تشغيل الإكمال، استيراد ملفات raw مرض التصلب العصبي المتعدد في برنامج MS برمجيات تحليل لتحديد وقياس فوسفوبيبتيديس. (ماكسكوانت البرمجيات8،،من2627 استخدمت في هذه التجربة. ما لم يحدد في الجدول 3، استخدام الإعدادات الافتراضية.)
Representative Results
ويصف هذا البروتوكول بالتفصيل طريقة لاستخراج البروتين وهضم متبوعاً بتخصيب فوسفوبيبتيدي والتحليل مرض التصلب العصبي المتعدد لاحقة (الشكل 1). التراكيب كافة المخازن المؤقتة والحلول التي يتم استخدامها في هذا البروتوكول المذكورة في الجدول 1. ويوفر استخدام متسلسلة Lys-C والتربسين كفاءة هضم. ملطخة بأخذ جل لما قبل هضمها ليستي يؤكد وجود البروتينات، بينما تلطيخ من هضمها بعد ليستي يؤكد الهضم الكامل (الشكل 2A). لهضم كامل، يجب أن تظهر لا عصابات أعلاه كاتشين 15، ما عدا كاتشين 30 وعصابات كاتشين 23.3 ج Lys والتربسين، على التوالي. إضافة Lys-ج يقلل أيضا من عدد الانشقاقات الضائعة (الشكل 2). الببتيدات pY تمثل 2% فقط من فوسفوبروتيومي28، إيمونوبريسيبيتيشن الببتيدات pY استخدام جسم الخاصة بالسنة التحضيرية هو الخطوة الأولى لتخصيب الببتيد pY. المادة طافية الناتج يصبح مدخلاً لإثراء الببتيد الباسيفيكي. إيمونوبريسيبيتيشن بأي فعالية يفصل الببتيدات pY من الببتيدات الباسيفيكي فيها في المتوسط 85% فوسفوبيبتيديس تم التعرف عليها من إعداد pY pY (الشكل 3A) وأكثر من 99% فوسفوبيبتيديس تم التعرف عليها من إعداد الباسيفيكي الباسيفيكي (الشكل 3B). ويستخدم ثاني أكسيد التيتانيوم لإثراء فوسفوبيبتيديس في كل الأعمال التحضيرية. النسبة المئوية المتوقعة من الببتيدات في إعداد MS الجاهزة التي يتم فوسفوريلاتيد ما بين 30-50% (الشكل 4 أ). قد يكون التغير في نسبة تخصيب فوسفوبيبتيدي أكبر في إعداد بأي نتيجة لوجود العديد من الببتيدات pY أقل من الببتيدات الباسيفيكي. فيما يتعلق بالأنواع فوسفوبيبتيدي، يكون أغلبية فوسفوبيبتيديس الكشف عن مجموعة فوسفوريل مفرد أو مزدوج (الشكل 4 باء).
بعد أداء الكتلي، يتم تحميل ملفات raw مرض التصلب العصبي المتعدد في برنامج تحليل مرض التصلب العصبي المتعدد. إعدادات المعلمات المستخدمة في التجربة مذكورة في الجدول 3 ولكن سوف تختلف من برنامج إلى برنامج وقد تختلف من إصدار ل. المعلمات التي لم يتم سردها تركت كافتراضي، بما في ذلك فرانكلين روزفلت استقطاع 1% لمطابقة الطيف الببتيد (PSM) مع نقاط أندروميدا الحد أدنى من 40 للتعرف على الببتيدات المعدلة27. الإعداد تعريب احتمال قطع أكبر من 0.75 بتصفية حوالي 5% الببتيدات pY و 15% و 34% من pS و pT الببتيدات، على التوالي (الشكل 5A). بعد تطبيق عوامل التصفية هذه، هو العدد المتوقع من تعريفات فوسفوبيبتيدي في نهاية التحليل MS حوالي 300 الببتيدات pY (على 5 ملغ البروتين الانطلاق) وحوالي 7,500 pS الببتيدات والببتيدات 640 pT (عن 2.5 ملغ الببتيد بدء والمبلغ) من الأعمال التحضيرية تخصيب كل منهما (الشكل 5 (ب)). ويحدد عدد replicates وتباين كثافة إشارة فوسفوبيبتيدي توفير الطاقة الكافية لإجراء المقارنات الإحصائية. في أربع تجارب منفصلة مع المجموعات التي تحتوي على التكرارات البيولوجية أو تريبليكاتيس، حسبت معاملات النسبة المئوية للتغير (% السيرة الذاتية) للكشف عن فوسفوبيبتيديس. توزيعات تقلب الدنيا (مثلاً، مجموعات الباسيفيكي 1-5 في الشكل 5) تشير إلى أن جمع العينات، وإعداد، ويدير الكتلي متسقة. من ناحية أخرى، يشير توزيعات تقلب أعلى (مثلاً، مجموعة الباسيفيكي 6 في الشكل 5) ضجيج البيانات التي تتطلب تغييرات حظيرة أكبر للكشف عن وجود اختلافات كبيرة في التحليلات التفاضلية المتلقين للمعلومات.
رقم 1: رسم تخطيطي لسير العمل. بروتينات من العينات المستخرجة وهضمها. يتم استخراج الببتيدات باستخراج المرحلة الصلبة (SPE)، والببتيدات فوسفوتيروسيني (pY) إيمونوبريسيبيتاتيد. في موازاة ذلك، يتم إثراء الببتيدات فوسفوسيريني/ثريونين (pST) من المادة طافية في الخطوة إيمونوبريسيبيتيشن بأي. يتم تنفيذ تبادل الأيونات الموجبة قوية (SCX) على المادة طافية لإزالة الببتيدات مشحونة للحد من قمع أيون12. كل الاستعدادات الخضوع لتخصيب فوسفوبيبتيدي عن طريق أكسيد التيتانيوم (TiO2). بعد تنظيف العينة، يتم تنفيذ السائل اللوني-جنبا إلى جنب الكتلي (LC-MS/MS) لقياس وفرة فوسفوبيبتيدي. ثم يتم تحميل البيانات الخام إلى برنامج تحليل مرض التصلب العصبي المتعدد لتحديد فوسفوبيبتيديس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: تقييم الهضم. (أ) ثلاث عينات مع 12.5 ميكروغرام ليساتي الهضم قبل الهضم، وليس بعد-C، وتظهر التربسين بعد الهضم. اختبار وصمة عار جل أخذ يظهر هضم نظيفة بعد استخدام متسلسلة ج Lys والتربسين. علامات الحجم الوزن الجزيئي (ميغاواط) في كيلودالتونس (كاتشين). (ب) أ لوحظ الحد في الانقسامات غاب بعد ليز-ج أضيفت إلى البروتوكول. فوسفوبيبتيديس دون انقسامات غاب ارتفعت النسبة من 48% إلى 64% ومن 60 في المائة إلى 84 في المائة في المتوسط للأعمال التحضيرية تخصيب pY والباسيفيكي، على التوالي. الرسوم البيانية تلخيص البيانات المستقاة من تجربتين أداؤها دون Lys-ج وخمس تجارب يؤديها مع ليز-C. أشرطة الخطأ هي الانحرافات المعيارية تمثل 38 pY و 38 pST عينات من تجارب منفصلة 2 (بدون Lys-ج) و 62 pY و 60 الباسيفيكي عينات من 5 تجارب منفصلة (مع ليز-ج). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: إثراء فوسفوبيبتيديس pY وتوقيت المحيط الهادي. هذه اللوحات تظهر النسب المئوية بسطي فوسفوبيبتيديس من أما (أ) pY أو (ب) الأعمال التحضيرية تخصيب الباسيفيكي. وأسفرت الإثراء بأي بأي إيمونوبريسيبيتيشن وثاني أكسيد التيتانيوم يجري فوسفوبيبتيديس 85% للسنة التحضيرية الببتيدات، بينما هي 0.1 في المائة فقط من فوسفوبيبتيديس في إثراء الباسيفيكي pY. واستمدت هذه القيم من دراسة والرمات (الملف STY)Sites.txt من تجربة تمثيلية واحدة بعد تصفية الملوثات وتسلسل عكسي، وفوسفوبيبتيديس مع التعريب الاحتمالات أقل من 0.75. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: فوسفوبيبتيدي التخصيب بثاني أكسيد التيتانيوم. (أ) يبين النسبة المئوية للكشف عن فوسفوبيبتيديس (نسبة إلى مجموع الببتيدات) من العينات في أربع تجارب منفصلة. (ب) هذا الفريق يوضح تكوين متوسط مونو مزدوجة، وفوسفوريلاتيد متعدد الببتيدات في أربع تجارب منفصلة. مجالات الخطأ في الفريق A هي الانحرافات المعيارية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: يتوقع تعريفات فوسفوريسيدوي. (أ) هذا الفريق يظهر احتمالات التعريب الفسفرة معرفات من الإثراء بأي (إلى اليسار) وإثراء الباسيفيكي (يمين). متوسط النسبة المئوية للمعرفات التي تفي بقطع احتمال > 0.75 هو 93%، 75%، ونسبة 52 في المائة للسنة التحضيرية، pS، وحزب العمال، على التوالي. (ب) المتوسط عدد معرفات مع > 0.75 التعريب الاحتمال هو 300 للسنة التحضيرية و 7,500 لملاحظة 640 لحزب العمال. (ج) هذا الفريق يظهر مؤامرات كمان معامل الاختلاف (% CV) من فوسفوبيبتيديس المئة. وأجرى تقييم % السيرة الذاتية إلا إذا تم الكشف عن قيمة كثافة إشارة في كل تكرار البيولوجية أو مجموعة ثلاث. تم أخذ البيانات من أربع تجارب منفصلة. مجالات الخطأ في لوحات A و B هي الانحرافات المعيارية من 34 pY وعينات الباسيفيكي 34 من 4 تجارب منفصلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| المخزن المؤقت | وحدة التخزين | تكوين | |
| المخزن المؤقت لتحلل كلوريد جوانيدينيوم م 6 | 50 مل | كلوريد جوانيدينيوم م 6، 100 ملم تريس pH 8.5، الفوسفين تريس (2-كاربوكسيثيل) 10 مم، 40 مم تشلورواسيتاميدي، أورثوفاناداتي الصوديوم 2 مم، بيروفوسفات صوديوم 2.5 ملم، 1 مم β-جليسيروفوسفاتي، 500 ملغ n-أوكتيل-غليكوزيد، نقية جداً المياه إلى وحدة التخزين | |
| بيروفوسفات صوديوم 100 مم | 50 مل | ز 2.23 ديكاهيدراتي بيروفوسفات الصوديوم، مياه نقية فائقة لوحدة التخزين | |
| م 1 β-جليسيروفوسفاتي | 50 مل | ز 15.31 β-جليسيروفوسفاتي، مياه نقية فائقة لوحدة التخزين | |
| حامض trifluoroacetic 5% | 20 مل | أضف 1 مل حامض trifluoroacetic 100% إلى 19 مل مياه نقية جداً | |
| 0.1 حامض trifluoroacetic % | 250 مل | إضافة 5 مل حامض trifluoroacetic 5% على مياه نقية فائقة مل 245 | |
| المخزن المؤقت شطف pY | 250 مل | 0.1% trifluoroacetic الحمضية، 40% الاسيتو الانيتريل، مياه نقية فائقة لوحدة التخزين | |
| المخزن المؤقت شطف الباسيفيكي | 250 مل | 0.1% trifluoroacetic الحمضية، 50% الاسيتو الانيتريل، مياه نقية فائقة لوحدة التخزين | |
| المخزن المؤقت لربط IP | 200 مل | 50 مم تريس الأس الهيدروجيني 7.4، كلوريد الصوديوم 50 مم، مياه نقية فائقة لوحدة التخزين | |
| بيكربونات الأمونيوم 25 مم، الرقم الهيدروجيني 7.5 | 10 مل | يذوب مغ 19.7 في 10 مل المياه النقية فائقة العقيمة، درجة الحموضة إلى 7.5 مع حمض الهيدروكلوريك ن 1 (~ 10-15 حل مل ميليلتر/10)، جعل جديدة | |
| المخزن المؤقت للفوسفات م 1، الرقم الهيدروجيني 7 | مل 1,000 | 423 مل م 1 فوسفات هيدروجين الصوديوم، وفوسفات هيدروجين الصوديوم م 1 مل 577 | |
| المخزن المؤقت للموازنة | 14 مل | الاسيتو الانيتريل 6.3 مل، 280 حامض trifluoroacetic 5% ميليلتر، حمض الالكتيك ميليلتر 1740، مياه نقية فائقة مل 5.68 | |
| المخزن المؤقت الشطف | 20 مل | الاسيتو الانيتريل مل 9، 400 حامض trifluoroacetic 5% ميليلتر، 10.6 مل مياه نقية جداً | |
| حل الطيف الكتلي | 10 مل | 500 ميليلتر الاسيتو الانيتريل، 200 ميليلتر 5% حامض trifluoroacetic، 9.3 مل مياه نقية جداً | |
| المخزن المؤقت A | 250 مل | 5 مم مونوبوتاسيوم فوسفات (pH 2.65)، الاسيتو الانيتريل 30% وكلوريد البوتاسيوم 5 مم والمياه نقية جداً لوحدة التخزين | |
| المخزن المؤقت ب | 250 مل | 5 مم مونوبوتاسيوم فوسفات (pH 2.65)، 30% الاسيتو الانيتريل، كلوريد البوتاسيوم 350 مم، والمياه النقية فائقة لوحدة التخزين | |
| 0.9 هيدروكسيد الأمونيوم % | 10 مل | ميكروليتر 300 29.42% هيدروكسيد الأمونيوم، مياه نقية فائقة مل 9.7 | |
الجدول 1: المخازن المؤقتة والحلول- يظهر هذا الجدول في التراكيب المخازن المؤقتة والحلول المستخدمة في هذا البروتوكول.
| إعدادات LC-MS/MS | ||
| المعلمة | pY الإعداد | pST الإعداد |
| عينة تحميل (ميليلتر) | 5 | |
| تحميل معدل التدفق (ميليلتر/دقيقة) | 5 | |
| معدل تدفق التدرج (nL/دقيقة) | 300 | |
| التدرج الخطي (نسبة 0.16% حمض الفورميك، 80% تزاول في حمض الفورميك 0.2%) | 4-15% لمدة 5 دقائق | 4-15% لمدة 30 دقيقة |
| 15-50% لمدة 40 دقيقة | 15-25% لمدة 40 دقيقة | |
| 50-90% لمدة 5 دقائق | 25-50% لمدة 44 دقيقة | |
| 50-90% لمدة 11 دقيقة | ||
| دقة المسح الضوئي الكامل | 120,000 | |
| عدد الأكثر كثافة الأيونات مختارة | 20 | |
| الطاقة الاصطدام النسبية (%) (HCD) | 27 | |
| دينامية الاستبعاد (s) | 20 | |
الجدول 2: إعدادات LC-MS. وهذا مثال على إعدادات LC-ماجستير في تجربة فوسفوبروتيوميك بندقية نموذجية. تم تحميل العينات إلى عمود فخ. أحضر في الفخ في سطر مع عمود تحليلية. هذه الإعدادات هي الأمثل لاستخدام نظام LC MS المدرجة في الجدول للمواد والمواد الكاشفة. هذه الإعدادات ستحتاج إلى تعديل أخرى لنظم LC-مرض التصلب العصبي المتعدد.
| إعدادات المعلمة ماكسكوانت | ||
| الإعداد | عمل | |
| المعلمات الخاصة بالمجموعة | ||
| نوع | نوع | حدد قياسي |
| تعدد | تعيين إلى 1 | |
| وضع الهضم | إنزيم | حدد التربسين/ف |
| ماكس. غاب عن الانقسامات | تعيين إلى 2 | |
| التعديلات | التعديلات متغير | إضافة الفوسفات (قذر) |
| خالية من تسمية التحديد الكمي | خالية من تسمية التحديد الكمي | حدد لفق |
| لفق أدنى نسبة العد | تعيين إلى 1 | |
| لفق سريع | تحقق من | |
| المتنوعة | إعادة تحديد | تحقق من |
| معلمات العمومية | ||
| تسلسل | ملفات فاستا | فاستا حدد ملف تم تحميله من أونيبروت |
| التعديلات ثابت | إضافة Carbamidomethyl (C) | |
| تحديد ظ. | تطابق بين تشغيل | تحقق من |
| نافذة وقت المباراة | تعيين لمدة 5 دقائق | |
| النافذة الزمنية المحاذاة | تعيين إلى 20 دقيقة | |
| تتطابق مع ملامح مجهولة | تحقق من | |
| تقدير البروتين | حساب نسبة الحد الأدنى | تعيين إلى 1 |
| مواقع المجلدات | وبناء على ذلك تعديل | |
الجدول 3: إعدادات البرامج تحليل MS. في ماكسكوانت، تم تحديد المعلمات الخاصة بالمجموعة والعالمية في هذا الجدول أو تعديلها. كافة المعلمات الأخرى ما زالت في الافتراضي. وقد أجريت هذه التجارب باستخدام الإصدار 1.5.3.30. قد تختلف المعلمات من إصدار لآخر ومن البرمجيات للبرمجيات.
Discussion
قبل استخدام هذا البروتوكول لإثراء فوسفوبيبتيديس، دراسة متأنية للتصميم التجريبي أمر بالغ الأهمية. استخدام replicates البيولوجي استخدام أكثر فعالية من حيث تكلفة لموارد الطيف الكتلي من replicates التقنية. عدد replicates اللازمة سيتوقف في جزء منه على مدى تغير البيانات. أظهرت دراسة أجريت مؤخرا، في حين أن زيادة عدد replicates يتجاوز الثلاثة إلا بشكل هامشي يزيد عدد الجثث، يتطابق عدد الجثث كبيرة بين المجموعات زيادات بالمزيد10.
نظراً لوفرة أقل من فوسفوبروتين في الخلية، كميات بروتين كافية انطلاق ضرورية للحصول فوسفوبروتيومي عالمية من عينات سرطان البروستاتا في وضع الاكتشاف. واستخدمت في هذه التجارب، 5 ملغ بروتين. حوالي خمسة صحون 15 سم تقريبا المتلاقية الخلايا توفر ما يكفي من البروتين كمدخلات في هذا البروتوكول، على الرغم من أن هذا سوف تكون الخلية تعتمد على الخط. أما بالنسبة لانسجة الورم، وهو العائد المتوقع من البروتين حوالي 6-8% وزن الأنسجة. في الإعداد في المختبر ، هو عينة مراقبة إيجابية للنظر في إضافة vanadate 1 ملم لمدة 30 دقيقة قبل الحصاد في الخلايا. بانديت، مثبط الفوسفاتيز فوسفوتيروسيل بروتين تنافسية، سيحافظ الفسفرة تيروزين، مما يزيد من عدد pY الببتيد تعريفات29.
الهضم نظيفة خطوة أساسية تحقيق أقصى قدر من تحديد فوسفوبيبتيدي. بالإضافة إلى أخذ الاختبار وصمة عار، ويمكن استخدامها في المئة من الانشقاقات ضياع في البيانات لتقييم كفاءة الهضم (الشكل 2). تتوفر برامج مراقبة الجودة التي يحلل الانشقاقات الضائعة ومقاييس أخرى لتقييم نوعية البيانات MS30. بينما التربسين البروتياز البديلة الأكثر شيوعاً، وتتوفر5 لمعالجة تغطية الفجوات في البروتين حيث لا يمكن أن يكون الأمثل الببتيدات تريبتيك ولدت31. إعدادات البرنامج تحليل مرض التصلب العصبي المتعدد ثم سيحتاج إلى تعديل وفقا لذلك بالتكيف للتغيرات في البروتياز.
يستخدم البروتوكول إيمونوبريسيبيتيشن (لتخصيب pY) فضلا عن ثاني أكسيد التيتانيوم (TiO2) إثراء فوسفوبيبتيديس. وتشمل النهج البديلة لإثراء الببتيدات تقارب معدنية المعطل تداولها اللوني (ايماك)، أكاسيد معدنية أخرى لأكسيد المعدن التقارب اللوني (وزارة الزراعة والتعاونيات) مثل هيدروكسيد الألومنيوم، والاستيلاء على تقارب أيون معدني المستندة إلى البوليمر (بوليماك) 5،12. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن أساليب الإثراء المختلفة إثراء لمختلف قطاعات السكان من فوسفوبيبتيديس32. على سبيل المثال، يثري ايماك أكثر فوسفوريلاتيد متعدد الببتيدات بينما يفضل أن يثري وزارة الزراعة والتعاونيات الببتيدات فوسفوريلاتيد مونو33. وتعكس النتائج ممثلة لهذا البروتوكول هذه الملاحظة (الشكل 4 باء). منشور صدر مؤخرا أظهرت أن الجمع بين ايماك ووزارة الزراعة والتعاونيات باستخدام مادة هجين يمكن أن يحتمل أن توفر تغطية أكبر من الأنواع فوسفوبيبتيدي34. وهكذا، يمكن تعديل هذا البروتوكول استخدام أساليب تخصيب أخرى بالتوازي مع السماح لإجراء تحاليل فوسفوبروتيوميك حتى أكثر شمولاً.
ماكسكوانت26 برمجيات تستخدم لتحليل البيانات MS في هذا البروتوكول، ولكن التطبيقات التجارية35 متاحة أيضا لتحديد فوسفوبيبتيدي. لتحديد فوسفوبيبتيدي، يتم تطبيق تعريب احتمال الانقطاع. يتم تنفيذ عامل التصفية هذا لتحديد فوسفوبيبتيديس بثقة عالية (أي، أكبر من 0.75) في فوسفوريسيدوي تحديد10،28. وبعبارة أخرى، احتمال summed لجميع المخلفات الأخرى التي يحتمل أن تكون قد تحتوي على والرمات-المجموعة أقل من 0.25. ويمكن جمع قطع هذا زيادة التشدد اختيار فوسفوبيبتيدي. فيما يتعلق بعدد التعريفات، العدد المتوقع من الببتيدات pY بالمئات، بينما العدد المتوقع من الببتيدات الباسيفيكي بالآلاف عالية. وتعكس هذه القيم فوسفوبروتيومي التي لوحظت من قبل توزيع حوالي 2%، 12%، و 86% من فوسفوسيتيس فيها pY، وحزب العمال، وملاحظة، على التوالي28.
إذا كان يتم تنفيذ الخطوات تخصيب pY والباسيفيكي بالتوازي، يمكن إكمال خطوات إعداد عينة في البروتوكول في غضون ستة أيام. بالاقتران مع أداة قوية لمرض التصلب العصبي المتعدد، توفر البروتوكولات تخصيب فوسفوبيبتيدي مثل هذا نهج عالمي للعلماء لجمع البيانات لتحليل فوسفوبروتيومي في مجال البحوث الخاصة بكل منها.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونشكر أعضاء المختبر دريك لتقديم المشورة والمدخلات على المخطوطة. كما نشكر أعضاء البيولوجية الكتلة قياس الطيف الكتلي مرفق لروبرت الخشب جونسون الطبية المدرسية وروتجرز، "ولاية جامعة نيو جيرسي"، لتقديم المشورة وإجراء الكتلي على عينات لدينا. تشنغ جيم لاري معتمد من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة "المعاهد الوطنية للصحة" تحت رقم جائزة T32 GM008339. توماس ج. جربير معتمد من قبل لجنة التحقيق الوطنية/المعاهد الوطنية للصحة (بوغ في سرطان البروستاتا P50 CA092131؛ P01 CA168585)، وجائزة باحث بحث مجتمع أمريكية لمكافحة سرطان (RSG-12-257-01-TBE). جوستين م. دريك معتمد من قبل جائزة المحقق الشاب مؤسسة سرطان البروستاتا ومؤسسة الصحة في ولاية نيو جيرسي، إدارة للدفاع البروستات سرطان البحث برنامج W81XWH-15-1-0236 والدقة الطب مبادرة رائدة جائزة من روتجرز معهد السرطان في نيو جيرسي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultra-Low Temperature Freezer | Panasonic | MDF-U76V | |
| Freezer -20 °C | VWR | scpmf-2020 | |
| Swing rotor bucket | ThermoFisher Scientific | 75004377 | |
| Vacuum manifold | Restek | 26080 | |
| Lyophilizer | Labconco | 7420020 | |
| CentriVap Benchtop Vacuum Concentrator | Labconco | 7810010 | |
| End-over-end rotator | ThermoFisher Scientific | 415110Q | |
| Razor blade | Fisher Scientific | 620177 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Millipore Sigma | UFC901024 | |
| Glass culture tubes | Fisher Scientific | 14-961-26 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| 20G needle | BD | B305175 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Screw cap cryotube | ThermoFisher Scientific | 379189 | |
| Nunc 15 mL conical tubes | ThermoFisher Scientific | 12-565-268 | |
| Gel loading tips | Fisher Scientific | 02-707-181 | |
| Millipore 0.2 µm spin filter | Millipore Sigma | UFC30GVNB | |
| Low protein-binding Eppendorf tubes | Eppendorf | 22431081 | |
| anti-Phosphotyrosine, Agarose, Clone: 4G10 | Millipore Sigma | 16101 | |
| 27B10.4 antibody | Cytoskeleton | APY03-beads | |
| Peptide assay kit | Thermo Scientific | 23275 | Step 7 |
| TopTip | PolyLC Inc | TT200TIO.96 | Steps 5 and 9 |
| SCX columns (PolySULFOETHYL A) | PolyLC Inc | SPESE1203 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | |
| Trifluoracetic Acid (TFA) | Fisher Scientific | PI-28904 | |
| Acetonitrile (ACN) | Fisher Scientific | A21-1 | |
| Lactic acid | Sigma-Aldrich | 69785-250ML | |
| Ammonium Hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Scientific | BP510-500 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Trypsin, TPCK Treated | Worthington Biochemicals | LS003740 | |
| Lysyl Endopeptidase | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 125-05061 | |
| MonoTip | PolyLC Inc | TT200TIO.96 | Step 10 |
| ZipTip | MilliporeSigma | ZTC18S096 | Step 6 |
| nanoEase, MZ peptide BEH C18, 130A, 1.7 μm, 75 μm x 20 cm | Waters | 186008794 | Step 11: analytical column |
| Acclaim PepMap 100 C18 LC Columns | ThermoFisher Scientific | 164535 | Step 11: trap column |
| Ultimate 3000 RLSCnano System | Dionex | ULTIM3000RSLCNANO | Step 11 |
| Q Exactive HF | ThermoFisher Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBFZ | Step 11 |
| MilliQ water | deionized water used to prepare all solutions and bufferes | ||
| Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB-120 | sonicator |
| Polytron System PT | Kinematica AG | PT 10-35 GT | homogenizer |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
- Paller, C. J., Antonarakis, E. S. Management of biochemically recurrent prostate cancer after local therapy: evolving standards of care and new directions. Clinical Advances in Hematology & Oncology. 11 (1), 14-23 (2013).
- Lowrance, W. T., Roth, B. J., Kirkby, E., Murad, M. H., Cookson, M. S. Castration-resistant prostate cancer: AUA guideline amendment 2015. The Journal of Urology. 195 (5), 1444-1452 (2016).
- Domon, B., Aebersold, R. Options and considerations when selecting a quantitative proteomics strategy. Nature Biotechnology. 28 (7), 710-721 (2010).
- Zhang, Y. Y., Fonslow, B. R., Shan, B., Baek, M. C., Yates, J. R. Protein analysis by shotgun/bottom-up proteomics. Chemical Reviews. 113 (4), 2343-2394 (2013).
- Bantscheff, M., Schirle, M., Sweetman, G., Rick, J., Kuster, B. Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389 (4), 1017-1031 (2007).
- Bantscheff, M., Lemeer, S., Savitski, M. M., Kuster, B. Quantitative mass spectrometry in proteomics: critical review update from 2007 to the present. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 404 (4), 939-965 (2012).
- Cox, J., et al. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
- Rubbi, L., et al. Global phosphoproteomics reveals crosstalk between Bcr-Abl and negative feedback mechanisms controlling Src signaling. Science Signaling. 4 (166), ra18 (2011).
- Hogrebe, A., et al. Benchmarking common quantification strategies for large-scale phosphoproteomics. Nature Communications. 9 (1), 1045 (2018).
- Rush, J., et al. Immunoaffinity profiling of tyrosine phosphorylation in cancer cells. Nature Biotechnology. 23 (1), 94-101 (2005).
- Fila, J., Honys, D. Enrichment techniques employed in phosphoproteomics. Amino Acids. 43 (3), 1025-1047 (2012).
- Mertins, P., et al. Proteogenomics connects somatic mutations to signalling in breast cancer. Nature. 534 (7605), 55-62 (2016).
- Drake, J. M., et al. Phosphoproteome integration reveals patient-specific networks in prostate cancer. Cell. 166 (4), 1041-1054 (2016).
- Lue, H. W., et al. Metabolic reprogramming ensures cancer cell survival despite oncogenic signaling blockade. Genes & Development. 31 (20), 2067-2084 (2017).
- Francavilla, C., et al. Phosphoproteomics of primary cells reveals druggable kinase signatures in ovarian cancer. Cell Reports. 18 (13), 3242-3256 (2017).
- Zhang, H., et al. Integrated proteogenomic characterization of human high-grade serous ovarian cancer. Cell. 166 (3), 755-765 (2016).
- Skaggs, B. J., et al. Phosphorylation of the ATP-binding loop directs oncogenicity of drug-resistant BCR-ABL mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (51), 19466-19471 (2006).
- Zimman, A., et al. Activation of aortic endothelial cells by oxidized phospholipids: a phosphoproteomic analysis. Journal of Proteome Research. 9 (6), 2812-2824 (2010).
- Zimman, A., Berliner, J. A., Graeber, T. G. Phosphoproteomic analysis of aortic endothelial cells activated by oxidized phospholipids. Methods in Molecular Biology. , 53-69 (2013).
- Humphrey, S. J., Azimifar, S. B., Mann, M. High-throughput phosphoproteomics reveals in vivo insulin signaling dynamics. Nature Biotechnology. 33 (9), 990-995 (2015).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Meyer, T. S., Lamberts, B. L. Use of coomassie brilliant blue R250 for the electrophoresis of microgram quantities of parotid saliva proteins on acrylamide-gel strips. Biochimica el Biophysica Acta. 107 (1), 144-145 (1965).
- Bergstrom Lind, S., et al. Immunoaffinity enrichments followed by mass spectrometric detection for studying global protein tyrosine phosphorylation. Journal of Proteome Research. 7 (7), 2897-2910 (2008).
- Pinkse, M. W., Uitto, P. M., Hilhorst, M. J., Ooms, B., Heck, A. J. Selective isolation at the femtomole level of phosphopeptides from proteolytic digests using 2D-NanoLC-ESI-MS/MS and titanium oxide precolumns. Analytical Chemistry. 76 (14), 3935-3943 (2004).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Cox, J., et al. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).
- Olsen, J. V., et al. Global, in vivo, and site-specific phosphorylation dynamics in signaling networks. Cell. 127 (3), 635-648 (2006).
- Huyer, G., et al. Mechanism of inhibition of protein-tyrosine phosphatases by vanadate and pervanadate. The Journal of Biological Chemistry. 272 (2), 843-851 (1997).
- Bielow, C., Mastrobuoni, G., Kempa, S. Proteomics quality control: quality control software for MaxQuant results. Journal of Proteome Research. 15 (3), 777-787 (2016).
- Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. Value of using multiple proteases for large-scale mass spectrometry-based proteomics. Journal of Proteome Research. 9 (3), 1323-1329 (2010).
- Bodenmiller, B., Mueller, L. N., Mueller, M., Domon, B., Aebersold, R. Reproducible isolation of distinct, overlapping segments of the phosphoproteome. Nature Methods. 4 (3), 231-237 (2007).
- Leitner, A., Sturm, M., Lindner, W. Tools for analyzing the phosphoproteome and other phosphorylated biomolecules: a review. Analytica Chimica Acta. 703 (1), 19-30 (2011).
- Yang, D. S., et al. Design and synthesis of an immobilized metal affinity chromatography and metal oxide affinity chromatography hybrid material for improved phosphopeptide enrichment. Journal of Chromatography A. 1505, 56-62 (2017).
- Al Shweiki, M. R., et al. Assessment of label-free quantification in discovery proteomics and impact of technological factors and natural variability of protein abundance. Journal of Proteome Research. 16 (4), 1410-1424 (2017).
