Summary
. הנה, פשוט, יעיל, בעלת שיטה חסכונית של שיבוט sgRNA מחולקת לרמות.
Abstract
פרוטוקול מחולקת לרמות מתאר שיטות יעיל עבור הדור יעיל וחסכוני של מדריך הקשורים Cas9 RNAs. שתי אסטרטגיות חלופיות עבור מדריך שיבוט RNA (gRNA) מתוארים בהתבסס על השימוש של אנזים הגבלה בסוג IIS BsmBI בשילוב עם קבוצת וקטורים תואם. מחוץ הגישה לשירותי רצף סנגר כדי לאמת את הווקטורים שנוצרה, אין ציוד מיוחד או ריאגנטים נדרשים מלבד אלה הינם סטנדרטיים למעבדות הביולוגיה המולקולרית המודרנית. השיטה מחולקת לרמות זה מיועד בראש ובראשונה שכפול אחד gRNA יחיד או וקטור לבטא gRNA לזווג אחד בכל פעם. פרוצדורה זו אינה סקיילבילית טוב לדור של ספריות המכיל אלפי gRNAs. למטרות אלה, מומלץ מקורות חלופיים של סינתזה oligonucleotide כגון סינתזה oligo-צ'יפס. לבסוף, בעוד פרוטוקול זה מתמקד קבוצת וקטורים יונקים, האסטרטגיה הכללית פלסטיק והוא ישים מכל יצור אם הווקטור המתאים gRNA זמין.
Introduction
חלבונים הקשורים CRISPR 9 (Cas9) הוא endonuclease מונחה RNA אשר מכוונת מטרה גנומית הרצוי כאשר ומורכבת עם מדריך קטן מעוצב כראוי RNA (gRNA)1,2. gRNAs מהווים רצף 20-נוקלאוטיד (protospacer), אשר משלים רצף גנומית היעד. ליד המטרה גנומית רצף הוא 3' protospacer-הקשורים מוטיב (פאם), אשר נדרש עבור איגוד Cas9. במקרה של סטרפטוקוקוס הפישחה ינפל תומימת Cas9 (SpCas9), יש את הרצף הגולה. על איגוד המטרה דנ א, Cas9 cleaves שני גדילי ה-DNA, ובכך מגרה מנגנוני תיקון, שעלולים להיות מנוצלים לרעה כדי לשנות את מיקומה של ריבית. ההפעלה של הנתיב (NHEJ) מועדת לטעויות הלא-הומולוגי הצטרפות-סוף יכול לגרום שיבוש גן המטרה. לחלופין, התיקונים שבוצעו באמצעות רקומבינציה הומולוגית יכול לעורר השילוב יישוב של רצף ה-DNA הרצוי אם תבנית התורם מסופק6. נוקלאז-מת Cas9 (dCas9) משתנים ניתן גם שנוצר3 על ידי מוטציה משקעי בתוך Cas9 החיוניים לפעילות endonucleolytic. dCas9 נשאר המוסמך עבור איגוד ה-DNA, אך לא לחתוך את מטרתה מאוגד. פיוזינג תחומים שונים אפקטור dCas9, מכוון אותו ליד אתר התחלה תעתיק של הגן, dCas9 יכול לשמש עבור אינדוקציה ג'ין סלקטיבית או חלקי הגן להשתיק4,5.
בעוד חזק מאוד, היכולת להשתמש Cas9 כדי להתמקד רצף גנומית של עניין דורש כי משתמש יוצר לראשונה gRNA ייחודי האתר היעד. מגוון שיטות לבניית gRNA ביטוי וקטורים יש כבר בעבר תיאר, רבים של יעילות בדרגות שונות, עולה6,7,8. Amplicons PCR עצמאי יכולה לשמש gRNAs להקרנה מהירה, הולך מן oligonucleotide משלוח. תרביות תאים בתוך מספר שעות; עם זאת, זה דורש Ultramer (מעל 100 bp) oligo סינתזה, שהינו יקר9. . זה גם ניתן לרכוש gBlocks כי הם חסכונית יותר מאשר Ultramers. Cas9 הפך במהירות מרכיב אינטגרלי של ערכת הכלים הביולוגיה המולקולרית המודרנית, שיטה פשוטה, זולה, יעילה במיוחד עבור שכפול gRNA יהיה ברכה לשדה. השיטה המתוארת כאן ננקטה שלנו קבוצה ומעבדות בשיתוף פעולה בשנים האחרונות לייצר gRNAs ייחודי מעל 2,0004.
השיטה מחולקת לרמות מתמקד בטכניקות עבור השיבוט של וקטורים תואם lentiviral המכיל gRNA יחיד או לכל היותר שני gRNAs. עבור הדור של פלסמידים המכיל יותר משני gRNAs, או לשכפל ספריה של gRNAs, גישות אלטרנטיביות מומלצים9,10,11,12.
Protocol
הערה: הפרוטוקול הבא מתאר כיצד לבצע עיצוב gRNA באמצעות כלים מקוונים (צעדים 1.1-1.4), אשר הינן נפוצות כדי כל שיטות הבנייה פלסמיד gRNA מפורט בכתב היד. ברגע ניתן לזהות את gRNAs הרצויה, השלבים עבור הזמנת את הצורך oligonucleotides מתוארים יחד עם מספר שיטות שונות ידביקו את oligonucleotides ביטוי וקטורים (למשל, pSB700). הציגו הם 2 שיטות שיבוט יחיד וקטורים לבטא-מדריך על בסיס גם מצדו לתוך וקטור ביטוי predigested (שלבים 2-7.3) או שער הזהב שיבוט (שלבים 8-8.4). המתוארים בהמשך היא אסטרטגיה עבור שכפול לזווג לבטא-מדריך וקטורים באמצעות תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) ואחריו שער הזהב שיבוט (שלבים 11-16). לבסוף, שיטות נפוצות לביצוע שינוי כימי של e. coli (שלבים 9-9.6) ואימות של הביטוי וקטור רצף (שלבים 10 כדי 10.2.3) מתוארים גם.
- עיצוב oligonucleotides gRNA באמצעות כלים מקוונים כפי שמוצג להלן.
- GRNAs עיצוב באמצעות כלים מקוונים כמו כלי מקוון (https://crispr.med.harvard.edu/sgRNAScorerV2/) ה sgRNA מלך השערים 2.013 או תחליפים כלי העיצוב sgRNA רחבה (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/ sgrna-design)14 ועוד מספר15.
- להשתמש את ג'ין שם, סמל או raw רצפי היעד דנ א כדי ליצור רצפים gRNA פוטנציאליים.
הערה: נוצר קובץ גיליון אלקטרוני (.csv/.xls) עם כל gRNAs פוטנציאליים נגד את הגן או את רצף שסופקו. איכות gRNAs פוטנציאליים ידווחו ציון אם נעשה שימוש בכלי מקוון sgRNA מלך השערים 2.0 או % ביעד יעילות אם נעשה שימוש בכלי העיצוב sgRNA רחבה. בשני אמצעים נגזרים על בסיס הפעילות חיתוך ביעד. - שקול את-יעד פעילות בבחירה gRNA כאשר הדירוג של gRNAs.
הערה: מדריכים אופטימליים הם אלה עם היעילות על המטרה הגדולה ביותר ואת הפעילות לפחות את המטרה. לצורך הפעלה (CRISPRa), gRNAs נועדו לכוון את האזור מ- 1-200 bp במעלה הזרם של התחלה גנים ברמת השעתוק באתר (TSS)4,15. עבור עיכוב (CRISPRi), gRNAs נועדו לכוון את האזור מ-50 bp במעלה הזרם של TSS עד 300 bp במורד הזרם של TSS5. כדי לבטל את הגן באמצעות חיתוך Cas9, gRNAs נועדו למטרה % 10-50 הראשונים של רצף קידוד במורד הזרם של ייזום codon (כפי gRNAs מיקוד 3' בסוף הגן הוכחו להיות פחות יעילה)13. - להבטיח אין אתרי BsmBI פנימי קיימים אם oligonucleotides משמשות עבור השיבוט שער הזהב, כפי לכך oligonucleotides annealed מתעכל13.
- בחר את רצפי גנומית היעד ולהסיר את 3' הגולה פאם (להשאיר רק את רצף protospacer) עבור השינוי רצף oligonucleotide gRNA יחיד (למשל, מתחיל רצף: CGCGTGCTCTCCCTCATCCATGG).
הערה: אם בעזרת גיליון אלקטרוני, הנוסחה הבאה יסיר 3' הגולה: =LEFT(A2,LEN(A2)-3), איפה A2 התא המכיל את רצף המטרה ופאם.- הוסף CACCG 5' סוף oligo.
הערה: בעת מצדו לשדרת pSB700, רצף זה תכלול 3' סוף האמרגן U6 נהיגה שעתוק של gRNA. הרצף "CACC" מבטיח oligo תואם המסוכך של וקטור pSB700 BsmBI-מעוכלים. האות ג' דרישה של פולימראז השלישי היזמים ומבטיחה אתחול יעיל של שעתוק של gRNA. להשתמש בנוסחה הבאה בתוך גיליון אלקטרוני כדי לבצע משימה זו: =CONCATENATE("CACCG",(B2)), איפה B2 התא המכיל את רצף protospacer [למשל, הוספת 5' CACCG רצף כדי protospacer: CACCGCGCGTGCTCTCCCTCATCCA (זה נמצא oligo קדימה הסופי שמסודר)]. - צור מהווה השלמה הפוכה (rc) של הרצף protospacer.
הערה: לדוגמה, המשלים הפוכה של protospacer הנ ל הוא TGGATGAGGGAGAGCACGCG. - צרף AAAC 5' בסוף protospacer rc. צרף C נוספים של 3' בסוף protospacer rc (oligo הפוכה).
הערה: הרצף "AAAC" מבטיח oligo תואם עבור שכפול לתוך וקטור pSB700 BsmBI-מעוכלים. נוספים C על קצה 3' יש צורך anneal את רצף ייזום "G" הוסיף את oligo קדימה. השתמש בנוסחה הבאה בתוך גיליון אלקטרוני כדי לבצע את המשימות =CONCATENATE("AAAC",(C2),"C"), איפה C2 התא המכיל את הרצף המשלים הפוכה [למשל, AAACTGGATGAGGGAGAGCACGCGC (זהו oligo הפוכה סופית זה הורה)].
- הוסף CACCG 5' סוף oligo.
- להזמין את oligonucleotides, עם אין שינויים נוספים על oligonucleotides.
- סדר כמות מינימלית של oligo הנדרשים, כפי סכומים רק קטנים מאוד יש צורך התגובות שיבוט.
- לדלל תחל lyophilized כדי ריכוז סופי של 100 μM 1 x מאגר TE (10 מ מ טריס-Cl, pH 7.5 עם 1 מ מ EDTA).
- Aliquot 1:1 ואחורה oligonucleotides (למשל, 10 μL כל) לתוך רצועת-קאפ המבחנות.
הערה: זה יאפשר שכפול מהיר של gRNAs רבים בכל פעם באמצעות פיפטה רב-ערוצי.- המערבולת ו ספין למטה את תערובות oligo (100 x g עבור 15 s). דגירה התגובה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות לפני שתגדיר את מצדו.
הערה: אין צורך לחמם, ואז צנני את תערובות oligo להקל חישול שלהם. ראוי לציין כי 3-4 זוגות של gRNA oligonucleotides עשוי להיות איחדו, annealed בתגובה אחת (למשל, לערבב 3 μL של העבר, μL 3 של הפוך oligonucleotides יחד של עד 4 זוגות oligo gRNA, נותן הנפח הכולל של 24 μL). ייתכן ניתן לכוונן את עוצמת הקול של oligonucleotides המשמש את חישול כדי להכיל את הצרכים של המשתמש.
הערה: השלבים 6-7.3 מתארים את predigestion של pSB700. עבור שיטה חלופית, ראה שלב 8, המתאר מצדו הגבלה BsmBI צעד אחר צעד.
- המערבולת ו ספין למטה את תערובות oligo (100 x g עבור 15 s). דגירה התגובה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות לפני שתגדיר את מצדו.
- לעכל 1-5 μg של וקטור הביטוי מדריך pSB700 שנבחר עם BsmBI (0.5 μL לכל 1 μg) עבור h 1 בגיל 55 ° C15. לנהל את העיכול של הווקטור הביטוי pSB700 gRNA הנפח הכולל של 40 μL (טבלה 1).
- להפעיל את המוצרים עיכול על 1.5% (wt/כרך) התכה נמוכה agarose ג'ל.
- לגזור הלהקה המרכזי (backbone) וקטור מתעכל המתאים שבר של ~ 9 kb גודל ולמקם את הפרוסה ג'ל בצינור microcentrifuge 1.5 mL (איור 1).
- להשתמש ערכת טיהור ג'ל מסחרית כדי לחלץ את ה-DNA של הג'ל agarose על פי הוראות היצרן.
- Elute ה-DNA אל תוך 10-15 μL מאגר TE (10 מ מ טריס, pH 7.5; 10 מ מ טריס, pH 8.0) כדי לקבל eluate מרוכז.
- מאתרים ומפסיקים את oligonucleotides annealed gRNA משלב 4 לתוך הווקטור הביטוי מדריך pSB700 BsmBI-מעוכלים בתגובה 20 μL (טבלה 2) עבור השיבוט של oligonucleotides gRNA לתוך הווקטור ביטוי pSB700 מראש מעוכל.
- ראשית, להוסיף מים, מאגר, ו DNA, ואז מערבולת התערובת ולהוסיף האנזים, מערבולת 1 בפעם האחרונה לאחר הוספת האנזים ו ספין למטה הפתרון (100 x g עבור 15 s). דגירה התגובות בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
- לכלול תגובה הוספה ללא שליטה שלילי יש וקטור מתעכל BsmBI לבד, בלי מוסף oligo annealed gRNA. 1 μL של מים עשוי לשמש במקום μL 1 של gRNA oligonucleotides עבור הפקד שלילי ללא הוספה.
- להמשיך השינוי (שלב 9).
הערה: שלב 8 היא שיטה חלופית predigestion של pSB700 כפי שמתואר שלבים 6-7.3.
- להציג oligonucleotides gRNA (שתואר בשלבים 1-5.1) לתוך וקטור pSB700 באמצעות שער הזהב שיבוט עבור מצדו הגבלה BsmBI צעד אחר צעד.
- להרכיב את תערובת הבסיס (1 x) – אם gRNAs מרובים הם משובטת, להכין את תערובת הבסיס ללא oligonucleotides הוספה הוסיף (טבלה 3). Aliquot הבסיס מערבבים לתוך המבחנות ולהשתמש פיפטה רב-ערוצי להוסיף את oligonucleotides gRNA של שלב 4.2. כוללות פקד לא הוספה באמצעות 1 μL של מים.
- מאת כולל האנזים BsmBI ו- T4 DNA ליגאז בתוך אותה התגובה, מושגות עיכול הגבלה בו זמנית, מצדו (כלומר, שער הזהב שיבוט). שימוש בפרוטוקול שער פשוטים הבאים כדי לעכל את הווקטור מאתרים ומפסיקים את הכיסויים בתגובה 1: שמור את התגובה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים, ב 50 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ב- 65 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ב 80 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ולבסוף , תחזיק על 4 מעלות צלזיוס.
- ראוי לציין, ודא כי oligonucleotides אינם מכילים אתרי BsmBI לפני השימוש בשיטה זו. אם gRNAs כי הם משובטת מכילים באתרים מגבלת BsmBI, הם ניתנות לעיכול על התוספת של BsmBI. זה ימנע את המשתמש קבלת כל transformants.
- לאחר התגובה הראשונית פשוטה שער, להוסיף את μL 0.5 נוספים של האנזים BsmBI כל התגובה ולמקם אותם בחזרה ב 55 ° C עבור 1 h. לאחר העיכול, להחזיק את התגובה ב 4 ° C או. תקפיא את זה עד מוכן להפוך. את הסיבוב השני של אנזים הגבלה דגירה מסיר כל מעוכל או pSB700 פראי-סוג religated וקטור עמוד השדרה מעירוב התגובה כך וקטורים היחיד אשר קיבלו את הכיסויים oligo נותרו ללא פגע, תניב transformants.
- להמשיך השינוי (שלב 9).
- להפוך μL 0.5 של תערובת התגובה μL 8 של המוסמכים e. coli [למשל, נב DH5a (1-3 x 109 cfu/µg של ה-DNA pUC19) או נאב יציב 1 - 3 x 109 cfu/µg של ה-DNA pUC19). עבור פלסמידים lentiviral, תאים יציב נב תספק התשואות פלסמיד עקבית יותר.
- להסיר e. coli אחסון ב- 80 ° C, להפשיר את זה על קרח למשך 5-10 דקות.
- להוסיף 0.5 μL של המיקס תגובה ל- 8 μL של המוסמכים e. coli ולשמור את התערובת על קרח למשך 30 דקות.
- חום לזעזע את התערובת ב 42 מעלות צלזיוס במשך 45 s.
- . הנח את זה על קרח למשך 2 דקות.
- לשחזר את התרבות על מטרף רוטרי ב 250 μL של SOC מדיה עבור 1 h ב- 37 ° C עבור DH5a נב וב -30 ° C עבור אורוות נב.
- צלחת 80 μL של התרבות על עמידות לאנטיביוטיקה המתאים צלחת מרק Lysogeny (LB), דגירה אותו בן לילה ב- 37 ° C עבור DH5a נב וב -30 ° C עבור אורוות נב [למשל, pSB700 מצופה ב- LB אמפיצילין (100 μg/mL) לוחות] (איור 3).
- לאמת את רצף gRNA ביטוי פלסמיד: לאמת את רצף כל המושבה על ידי סנגר רצף באמצעות פריימר 5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC-3' אילו ראשוניים-U6 האמרגן במעלה הזרם של oligo gRNA הכנס.
- לבחור 2-3 מושבות לכל תגובה עבור קביעת רצף (טבלה 4).
הערה: מספר ספקי רצף עכשיו הצעה לשירותי ניתן לבצע סנגר רצף ישירות ממושבות חיידקים, אשר מקטינה באופן משמעותי את הזמן ואת עלויות על-ידי ביטול הצורך לטהר את פלסמידים לפני רצף. לחלופין, ניתן להשתמש ערכת בידוד פלסמיד להתאושש הדנ א פלסמיד חיידקי מהעותקים בודדים. פלסמידים מטוהרים ואז ניתן להגיש על רצף. אם תגובת מצדו במאגר מבוצע, השתמש בטבלה 4 כמדריך עבור מספר מושבות זה צריך להיות נבחר ולא נשלח על רצף. - בעקבות אישור רצף, לבודד את פלסמידים ביטוי gRNA.
- השתמש טיפ פיפטה סטרילי כדי לחסן את המושבה הרצוי לתוך תרבות מ ל LB בינוני המכיל 100 μg/mL של אמפיצילין בשביל pSB700 ביטוי וקטורים.
- לגדל תאי חממה רוטרי ב 100 סל"ד ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה (30 ° C אם נב אורוות משמשות).
- לבודד את פלסמיד ה-DNA של תרבויות באמצעות ערכת ההכנה של פלסמיד, ע פ הפרוטוקול של היצרן.
הערה: בזמן השיטות שהוזכרו לעיל לאפשר למשתמשים ליצור וקטורים יחיד המכיל gRNA, פרוטוקול זה יאפשר למשתמשים ליצור וקטורים המכילים gRNAs 2, אחד מונע על ידי יזם השלישי שלהם RNA פולימראז.
- לבחור 2-3 מושבות לכל תגובה עבור קביעת רצף (טבלה 4).
- עבור עיצוב gRNA לזווג, השתמש בקובץ הפלט של כלי עיצוב של sgRNA שפורטו לעיל (שלבים 1.1-1.4) ובחר 2 מדריכים מעניינים.
- הפעלה או דיכוי, לבחור זוגות של עזר הניתנים לפחות 30 nt לגזרים.
- GRNAs המשמש לחיתוך, בחר מדריכים כי היעד 2 exons שונים בתוך הגן.
- על ההוראות שלהלן, לייעד את gRNA הראשון במערך gRNA-A, את gRNA השני של מערך gRNA-B, כדי ליצור שינוי רצף oligonucleotide gRNA לזווג.
הערה: oligo המשמש ליצירת gRNA-A ייקרא פא, oligo הפוך נוהג להציג gRNA-B יכונו בשם rB. שיטת השיבוט מתחת יצרף באופן אוטומטי משחק ייזום בקצה 5' של כל אחד gRNAs.- צור את הפא המתאים oligo כדלקמן.
הערה: נוקלאוטידים 20 הכוללת את gRNA מיקוד רצף עבור gRNA-א מהווים את רצף פא הראשוני שעליו השלבים הבאים תוכלו לבנות (למשל, protospacer - aggggctacaccactcattg).- הוסף TTTTCGTCTCTCACCG 5' סוף פא (למשל, של רצף TTTTCGTCTCTCACCGaggggctacaccactcattg).
- הוסף GTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCA 3' סוף פא (למשל, של רצף TTTTCGTCTCTCACCGaggggctacaccactcattgGTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCA). זה הגרסה הסופית של oligo הפא להזמין.
- צור את הצורך oligo rB כדלקמן.
הערה: נוקלאוטידים 20 הכוללת את רצף מיקוד gRNA עבור gRNA-B תהווה את רצף rB הראשוני שעליו השלבים הבאים תוכלו לבנות (למשל, של gtcccctccaccccacagtg מתחיל רצף).- לקחת את המשלים הפוכה של rB = (revcom) rB (למשל, cactgtggggtggaggggac).
- צרף TTTTCGTCTCTAAAC לסוף 5' (revcom) rB (למשל., TTTTCGTCTCTAAACcactgtggggtggaggggac).
- צרף CGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG לסוף 3' (revcom) rB (למשל, TTTTCGTCTCTAAACcactgtggggtggaggggacCGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG). זה הגרסה הסופית של oligo rB להזמין.
הערה: הנוסחאות הבאות עשוי לשמש עם תוכנת גיליון אלקטרוני נפוצות כדי לערוך באופן אוטומטי את רצפי oligo: = CONCATENATE("TTTTCGTCTCTCACCG",(A2), "GTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCA"), איפה A2 התא המכיל את רצף ה-fA, ואת = CONCATENATE("TTTTCGTCTCTAAAC",(B2),"CGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG"), איפה B2 התא המכיל את רצף rB (revcom).
- צור את הפא המתאים oligo כדלקמן.
- להזמין את oligonucleotides מיצרן סינתזה של בחירה. אין לערוך שינויים נוספים נדרשים.
- להשתמש את פלסמיד מוכן דנ א כדי לבצע PCR עם תחל פא והן rB. זה לצרף שני פארווערטס ולאפשר gRNAs הפוכה למקטע PCR המופקים הזה פלסמיד ורצון אחד לבוא לידי ביטוי של יזם משלו (היזמים U6 ו 7SK — היזמים השונים נמצאים בשימוש זה עיצוב כדי למנוע רקומבינציה ויראלי).
- להשתמש בפרוטוקול ה-PCR Phusion מיוחד GC כדי ליצור השבר הדרושים: לשמור את התערובת ב 98 ° C עבור 1 דקות (מחזור 1), ב 98 ° C 15 s, ב 53 ° C 15 s, 65 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, ובבית 72 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות (30 מחזורים) , ולאחר מכן החזק את זה ב 4 ° C (טבלה 5).
- להפעיל את המוצר PCR על 1% agarose ג'ל ולוודא את הלהקה 1 נתפסת 490 ~ bp (איור 2).
- לחתוך ולחלץ את מוצר ה-PCR זה באמצעות ערכת חילוץ ג'ל של בחירה. Elute ה-DNA לתוך μL 15 טה מאגר (10 מ"מ טריס, pH 7.5; 10 מ מ. טריס, pH 8.0), או מים מזוקקים.
- למדוד את הריכוז של המוצר שחולצו יחד עם זה של וקטור pSB700 עם ספקטרופוטומטרים לחישוב molarity דנ א. לנרמל את המוצר PCR והן את וקטור ריכוז של 40 femtomoles/μL.
הערה: מספר אתרי אינטרנט זמינים לסייע עם חישוב molarity של פתרון ה-DNA נתון המבוססת על האורך של ה-DNA, הריכוז שלו בפתרון (למשל, Promega: http://www.promega.com/a/apps/biomath/index.html?calc=ugpmols). המחשבון משתמשת בנוסחה:
כאן, N הוא האורך של נוקלאוטיד ברצף.
- להגדיר מגבלה סימולטני לעיכול, מצדו תגובה באמצעות פרוטוקול שתואר בשלבים 8-8.4 לשבט את מקטע ה-PCR לתוך וקטור pSB700.
- במקום הוספת 1 μL של פתרון תחל התגובה, להוסיף 1 μL של 40 fmole μL של מוצר ה-PCR. בנוסף, משתמשים μL 1 של וקטור pSB700-ריכוז של 40 fmole/μL.
הערה: שוויון יחסי טוחנת להוביל תוצאות עקביות, למרות אפילו במקרים שבהם היחס המדויק לא משמשים, ניתן להשיג מושבות.
- במקום הוספת 1 μL של פתרון תחל התגובה, להוסיף 1 μL של 40 fmole μL של מוצר ה-PCR. בנוסף, משתמשים μL 1 של וקטור pSB700-ריכוז של 40 fmole/μL.
- לאחר סיום תהליך התגובה שער הזהב (שלבים 8-8.4), להמשיך השינוי ואת הרצף האימות (שלבים 9 - 10.2.3).
Representative Results
השיטות המתוארות ב פרוטוקול זה הן עבור היצירה של וקטורים ביטוי גם gRNA יחיד או מזווג. GRNA יחיד להביע וקטורים יכולים להיווצר על-ידי predigesting עמוד השדרה וקטור (איור 1) ואחריו נבדק זה בסדרה של oligonucleotides קצר או באמצעות שער הזהב שיבוט בו-זמנית לעכל את עמוד השדרה של וקטור, מאתרים ומפסיקים את זה פנימה סדרת oligonucleotides קצר בתגובה אחת. סיפק גם הוא שיטה לייצר וקטורים המכילים 2 gRNAs, אחד מונע על ידי יזם עצמאי משלו, על-ידי שיבוט קטע PCR מותאם אישית (איור 2).
שיבוט מוצלח עבור כל הפרוטוקולים מחולקת לרמות יגרום המראה של מושבות יותר באופן משמעותי עבור המרות עם ה-DNA הוספה המתאים יותר בצלחת הבקרה הוספה לא (איור 3).
איור 1: העיכול של וקטור הביטוי gRNA pSB700. .1% ג'ל agarose משמש. ליין 1: pSB700 נימולים. ליין 2: pSB700 לחתוך עם BsmBI.
איור 2: מזווג gRNA PCR. .1% ג'ל agarose משמש. ליין 1: מדריך לזווג PCR שבר של ~ 490 bp.
איור 3: מוצלח שיבוט של טרנספורמציה של פלסמיד gRNA. החלונית השמאלית מציגה ליברות והפך אמפיצילין צלחת עם בהצלחה מושבות. החלונית ' נכון ' מציגה צלחת הבקרה הוספה לא מציג שום מושבות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| pSB700 מדריך ביטוי וקטור | 1-5 μg |
| נב מאגר 3.1 | 4 ΜL |
| BsmBI | 1 ΜL |
| מים מזוקקים | μL עד 40 |
| הנפח הכולל | 40 ΜL |
טבלה 1: עיכול הגבלה של הווקטור הביטוי gRNA pSB700 עם BsmBI.
| Oligos annealed gRNA (בודדת או במאגר התגובה) | 1 ΜL |
| PSB700 BsmBI-מעוכלים מדריך ביטוי וקטור | 1 μL (~ 100-250 ng) |
| 10 x T4 DNA ליגאז התגובה מאגר | 2 μL (1 x ריכוז סופי) |
| T4 DNA ליגאז | 1 μL (120 יחידות) |
| מים מזוקקים | 15 ΜL |
| הנפח הכולל | 20 μl |
טבלה 2: מצדו תגובה של gRNA oligonucleotides אל predigested pSB700 gRNA ביטוי וקטור.
| מגיב | נפח (1 x) |
| H2O | 6 ΜL |
| ליגאז T4 | 0.5 ΜL |
| ATP | 1 ΜL |
| BsmBI | 0.5 ΜL |
| נב מאגר 3.1 | 1 ΜL |
| וקטור (למשל, pSB700) (40 fmol) | 1 μlL |
| הוסף - קדימה ולהפוך oligos או ה-PCR מקטע כפול מדריך (40fmol) | 1 μL (0.5 μL לפנים ולא לאחור 0.5 μL) |
טבלה 3: צעד אחר צעד BsmBI ההגבלה, gRNA מצדו תגובה שילוב.
| מדריך 1 | רצף 3 מושבות |
| עבור 2 מדריכים | רצף מושבות 5-10 |
| עבור 3 מדריכים | רצף מושבות 10-15 |
| עבור 4 מדריכים | רצף מושבות 15-20 |
טבלה 4: המספר המומלץ של מושבות רצף עבור gRNA במאגר שיבוט תגובות.
| רכיב ה-PCR | תגובה 50 µL |
| פריימר לפנים 10 מיקרומטר | 2.5 ΜL |
| פריימר הפוכה 10 מיקרומטר | 2.5 ΜL |
| 5 x Phusion HF או המאגר GC | 10 ΜL |
| dNTPs 10 מ מ | 1 ΜL |
| תבנית ה-DNA | 100 ng |
| Phusion DNA פולימראז | 0.5 ΜL |
| נוקלאז ללא מים | µL עד 50 |
טבלה 5: תערובת PCR gRNA לזווג.
Discussion
נעשו מספר שינויים, עלות-לחיסכון בזמן לבניית וקטור ביטוי gRNA. פרוטוקול ההגבלה, מצדו צעד בודד המותווה כמו גם שיטה של gRNA לזווג ביטוי וקטור הבנייה. הביטוי gRNA לזווג מושגת באמצעות הגברה PCR באמצעות oligonucleotides המכיל רצף המטרה gRNA קדמי (n20) והן המשלים הפוכה של מטרה אחרת (n20). זה ואז מציג מקדם מכירות RNA Pol III המשני (7SK) כמו גם זנב sgRNA לתוך כמקובל לבטא gRNA יחיד ביטוי פלסמידים.
עיצוב oligonucleotide זהיר יבטיח PCR מוצלחת של הבנייה gRNA לזווג, כמו גם מצדו של-סופך. בעקבות צעד אחר צעד הגבלת ותגובה מצדו, התוספת של עוד יותר BsmBI יבטיח שכל כיווני ביטוי שלא שונתה בעקבות התגובות נחתכים. פעולה זו תקטין באופן משמעותי את הרקע על השינוי. באמצעות נב יציב המוסמכת e. coli וגידול ב 30 ° C יהיה להגדיל את התשואה של שינוי מוצלח.
היתרונות שטכניקה זו יש על פני שיטות נפוצות כוללים של פישוט של התהליך של oligonucleotide, חישול, מגבלה צעד אחר צעד של הווקטור ביטוי gRNA ולא את מצדו של oligonucleotides, ואת היכולת לנצל קונבנציונלי וקטורים ביטוי gRNA יחיד עבור הביטוי של מדריכים לזווג. בעוד הפרוטוקול המתוארים כאן מתמקדת על קבוצת וקטורים יונקים, האסטרטגיה הכללית פלסטיק והוא החלים על כל אורגניזם, בתנאי הווקטור המתאים gRNA זמין. בסך הכל, הפרוטוקול המתואר חוסך זמן ועלויות.
עם זאת, יצוין כי ההליך מחולקת לרמות של רכישת oligonucleotides בודדים אינה סקיילבילית טוב לדור של ספריות המכיל אלפי gRNAs. למטרות אלה, מומלץ מקורות חלופיים של סינתזה oligonucleotide כגון oligo שבב סינתזה.
. זה מועיל לכלול פקד לא הוספה בעת שכפול gRNAs. התגובה הזו ניתן בקלות להגדיר במקביל עם התגובות של עניין והוא יכול לשמש כדי לקבוע אם עיכול לא שלם של וקטור המוצא תרמה המושבות ציין בסוף ההליך. יתר על כן, אם אחד מהפרוטוקולים שיבוט לעיל נכשל עקב וקטור שהיישום מתעכל עמוד השדרה או יעילות מצדו המסכן, אנו מציעים מנסה החלופה שכפול השיטה שאנחנו המחולקות.
בעת שימוש שער הזהב שיבוט בו-זמנית לעכל את הווקטור, מאתרים ומפסיקים ב oligonucleotides קטן בתוך תגובה אחת, חשוב לבדוק כי gRNA כי הם להיות משובטים לתוך וקטור אין אתר BsmBI בתוכו, כפי שזה יוביל t הוא gRNA שהוא נחתך, היעדרות של מושבות אחרי הטרנספורמציה.
GRNA שיבוט אסטרטגיה שאנחנו המחולקות מאפשר דור מהירה וחסכונית של gRNAs ~ 10 דולר ארה ב כל מדריך, עם עיקר העלויות מגיעה הסינתזה oligonucleotide ואימות רצף. בעוד השיטה מחולקת לרמות מיועד לאפשר למשתמשים ליצור gRNAs לשימוש עם SpCas9, הפרוטוקול בקלות ניתן להתאים לשימוש עם Cas9 orthologues או אחרים מונחה RNA endonucleases כגון Cpf1 או C2C2, עם שינויים קלים עמוד השדרה וקטור ו oligonucleotide הסככה רצף16,17.
פרוטוקול שפורטו לעיל יספקו gRNA תבדוק-רצף הביטוי פלסמידים ד' 3 (החל עם oligonucleotides המעוצבים בהתאם), וזה מהר יותר באופן משמעותי מאשר שיטות הנוכחי. זה כולל את העיצוב gRNA של 1 h (שלבים 1-2.3), דילול aliquot של oligonucleotides של 10 דקות (שלבים 3-5.1), עיכול, טיהור של וקטור הביטוי gRNA pSB700 של 2 h (שלבים 6-6.4), השיבוט של oligonucleotides gRNA אל predi gested pSB700 gRNA ביטוי וקטור בין לילה בטמפרטורת החדר (שלבים 7-7.3), מצדו הגבלה BsmBI צעד אחר צעד של 3 שעות ו- 40 דקות (שלבים 8-8.4), הטרנספורמציה של 16 h (שלבים 9-9.6), ואת האימות של הרצף של פלסמיד ביטוי gRNA של 24 שעות (עם משך הזמן בהתאם סנגר רצף זמינות ומהירות בעקבות הגשת של המושבה חיידקי; שלב 10). העיצוב gRNA לזווג את השינוי רצף לוקח 1 h (שלבים 11-13). GRNA לזווג ה-PCR לוקח 3.5 h (שלבים 14-14.4). השיבוט של השבר PCR לתוך וקטור pSB700 לוקח 3 שעות ו- 40 דקות (שלב 15-16).
הנושאים הכי סביר עשוי להיות מתמודד עם פרוטוקול זה מתייחסים חוסר היעילות הרכבה שער הזהב, טרנספורמציה. כוללות פקד לא הוספה במהלך ההרכבה שער הזהב כדי להמחיש את היעילות של ההרכבה. במהלך השינוי, הפקד חיובי puc19 תספק פקד יעילות טרנספורמציה. נב יציב e. coli אמור לשמש פלסמידים תואם lentiviral, לעתים קרובות דורשת עד > 16 h ב- 30 מעלות צלזיוס להניב מושבות גלוי.
Disclosures
. ג'ורג ' מ הכנסייה יש הון עצמי Editas, קאריבו החיים, אשר שואפים למסחרי הגנום CRISPR-Cas9 עריכה טכנולוגיה (לקבלת רשימה מלאה של גילוי, עיין http://arep.med.harvard.edu/gmc/tech.html).
Acknowledgments
Sathiji Nageshwaran נתמך על-ידי פרידרייך מחקר ברית אטקסיית (07340305 - 01) נבחרת אטקסיה קרן מלגות ומענקים (7355538-01). אלחנדרו צ'אבז מומן על ידי המכון הלאומי לסרטן גרנט 5T32CA009216-34 ופרס בורוז Wellcome קרן הקריירה עבור מדענים רפואיים. . ג'ורג ' מ הכנסייה נתמך על ידי ארה ב במכון הלאומי של בריאות (NIH) לאומי מחקר הגנום האנושי גרנט RM1 HG008525, המכון Wyss ביולוגית בהשראת הנדסה. ג'יימס ג'יי קולינס מאשר תמיכה של המענק סוכנות צמצום ההגנה איום HDTRA1-14-1-0006 הקבוצה גבולות פול אלן ג'י. אלחנדרו צ'אבז פיתח שיטת השיבוט כפול-מדריך. Sathiji Nageshwaran, אלחנדרו צ'אבז, נאן שר Yeo כתב היד עם קלט מן כל המחברים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BsmBI | New England Biolabs | R0580L | |
| T4 DNA ligase | Enzymatic/New England Biolabs | L6030-LC-L/M0202S | |
| Buffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) | New England Biolabs | P0756S | |
| QIAprep spin miniprep kit | Qiagen | 27104 | |
| Chemically competent E. coli | New England Biolabs | C3019l, C2987l, or C3040H | |
| Standard microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| Axygen 8-Strip PCR tubes | Fischer Scientific | 14-222-250 | |
| Thermocycler with programmable temperature-stepping control | BioRad, | 1851148 | |
| UV spectrophotometer (NanoDrop 2000c) | Thermo Scientific | ||
| pSB700 plasmid | Addgene | #64046 | |
| NEB Stable Competent E. coli (High Efficiency) | New England Biolabs | c3040 | |
| Lysogeny broth (LB) | |||
| Ampicillin | |||
| TE buffer (1 mM EDTA, 10 mM Tris-Cl, pH 7.5) | |||
| pSN007 plasmid | Addgene | 102440 |
References
- Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), E2579-E2586 (2012).
- Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J., Charpentier, E. A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Shalem, O., Sanjana, N., Zhang, F. High-throughput functional genomics using CRISPR-Cas9. Nature Reviews Genetics. 16 (5), 299-311 (2015).
- Chavez, A., et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).
- Gilbert, L., et al. CRISPR-Mediated Modular RNA-Guided Regulation of Transcription in Eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
- Yang, L., Yang, J., Byrne, S., Pan, J., Church, G. CRISPR/Cas9-Directed Genome Editing of Cultured Cells. Current Protocols in Molecular Biology. , 31.1.1-31.1.17 (2014).
- Yang, L., Mali, P., Kim-Kiselak, C., Church, G. CRISPR-Cas-Mediated Targeted Genome Editing in Human Cells. Methods in Molecular Biology. 1114, 245-267 (2014).
- Vidigal, J., Ventura, A. Rapid and efficient one-step generation of paired gRNA CRISPR-Cas9 libraries. Nature Communications. 6, 8083 (2015).
- Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nature Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).
- Kabadi, A., Ousterout, D., Hilton, I., Gersbach, C. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector. Nucleic Acids Research. 42 (19), e147 (2014).
- Sakuma, T., Nishikawa, A., Kume, S., Chayama, K., Yamamoto, T. Multiplex genome engineering in human cells using all-in-one CRISPR/Cas9 vector system. Scientific Reports. 4 (1), (2014).
- Chari, R., Yeo, N., Chavez, A., Church, G. sgRNA Scorer 2.0: A Species-Independent Model To Predict CRISPR/Cas9 Activity. ACS Synthetic Biology. 6 (5), 902-904 (2017).
- Doench, J., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
- Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2014).
- The CRISPR Software Matchmaker: A New Tool for Choosing the Best CRISPR Software for Your Needs. , Available from: http://blog.addgene.org/the-crispr-software-matchmaker-a-new-tool-for-choosing-the-best-crispr-software-for-your-needs (2015).
- Engler, C., Marillonnet, S. Golden Gate Cloning. DNA Cloning and Assembly Methods. Valla, S., Lale, R. , Humana Press. New York, NY. 119-131 (2013).
- Zetsche, B., et al. Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
- Abudayyeh, O., et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science. 353 (6299), (2016).
