Summary
יציב הפחמן והחמצן איזוטופ ניתוח של קרבונט אמייל השן האדם ושל בעלי החיים שימש כמדד עבור דיאטה בודדים ושיחזור הסביבה. כאן, אנו מספקים תיאור מפורט, תיעוד חזותי של בכמות גדולה ורציפה השן אמאייל דגימה, כמו גם רעלני של דגימות כפליאונטולוג הממצאים הארכיאולוגיים.
Abstract
יציב הפחמן והחמצן איזוטופ ניתוח של קרבונט אמייל השן האדם ושל בעלי החיים הוחל paleodietary, paleoecological, ומחקר paleoenvironmental מתקופות היסטוריות האחרונות לחזור לפני 10 מליון שנה. גישות בצובר מספקים מדגם מייצג עבור התקופה של מינרליזציה אמייל, בעוד דוגמאות רציפים בתוך שן ניתן לעקוב אחר שינויים תזונתיים וסביבתיים בתקופה זו. בעוד מתודולוגיות אלה יש כבר נרחב שהוחל, שמתואר לארכיאולוגיה, אקולוגיה, פלאונטולוגיה, היו הנחיות מפורשות אין כדי לסייע בבחירה של ציוד מעבדה הכרחי וכדי לתאר ביסודיות מעבדה מפורט דגימה ו פרוטוקולים. במאמר זה, ואנחנו מתעדים וככתבה, באופן חזותי, התהליך כולו מן הדגימה דרך ההקרנה pretreatment ומהירות diagenetic כדי לבצע את המתודולוגיה זמינים באופן נרחב יותר חוקרים בהתחשב היישום שלה במגוון של הגדרות מעבדה.
Introduction
יציב הפחמן והחמצן איזוטופ ניתוחים של קרבונט אמייל השן שימש ללמוד אחרי צריכת התזונה האנושית, הגמילה, ניידות, וכן רוצפה הסתמכות על צמחייה, התנועה של בעלי חיים, חיות משק foddering. יישומים אלה יש כבר באופן מקיף דנו ונבדקים למגוון רחב של תנאים סביבתיים המציין את השפעת כאילוסטרציה מקומיים, טמפרטורה, מקורות מים, צמחייה יצירות1,2, 3,-4,-5,-6. המגוון של יישומים אפשריים בארכיאולוגיה והיסטוריה פלאונטולוגיה, כמו גם שימור טובה קרבונט אמייל השן, הפכה אותו חומר אטרקטיבי של איזוטופ יציב עבודה3. שיטות דגימה, רעלני ו ההקרנה diagenesis מתוארות בקצרה במספר פרסומים קודמים1,7. עם זאת, הפגנות מילולית וחזותית יסודית להישאר זמין במידה רבה, במיוחד לאנשים מחוץ ארכאולוגיה מעבדות ובקרב קבוצות מעבדה עם מוגבלת למימון שבו האינטרס השימוש בטכניקה זו גוברת 5.
אמייל השן בעיקר מורכב היידרוקסיאפטיט (bioapatite) וגידולו8 גדולים יותר מאלה של העצם, שהופך אותו עמידים יותר בפני החלפות יוניים diagenetic פוסט-מורטם וזיהום3. מחקרים מודרניים הראו כי המידות איזוטופ (אלפא13ג) פחמן יציב של השן רוצפה אמייל הרשומה באופן אמין בעל חיים תזונה והתנהגות9,10. הערך איזוטופ (אלפא18O) חמצן יציב של זגוגית השן נקבעת על-ידי הרכב איזוטרופי חמצן של בלע מים, הכוללת מים צמח, מזונות בעלי חיים, מי שתייה, נשימה, כמו גם השפעות סביבתיות שונות על המים אשר יכול להוביל בהמשך איזוטרופי fractionation (למשל., חופיים, טמפרטורה, גובה, כמות המשקעים, מיקום הקונטיננטלי)11. זו הפכה אותו שיטה פופולארית עבור שחזור תזונתיים וסביבתיים במחקר הארכיאולוגי, paleoecological, פליאונטולוגיה.
תקופת היווצרות אמייל השן קצרים יחסית (שנים), משתנה בהתאם השן להיות שנדגמו. על בני אדם, זגוגית שן טוחנת ראשונה mineralizes מלידתם ועד לגיל 3 שנים וטוחנות mineralize בין 1.5 ו-7 שנים של גיל, השן הטוחנת השנייה mineralize בגילאי 2.5 ו- 8, השן הטוחנת השלישית mineralize במהלך גיל ההתבגרות, בין 7 ל 16 שנים12 . נתון המהווה אמייל השן באופן מצטבר מעל בתקופה של היווצרות, שניתן יהיה לטעום בצובר לאורך ציר הגידול כולו או נדגמים ברצף כדי לחקור את השינויים בדיאטה וסביבה שהתרחשו במהלך תקופת היווצרות13 . מסודר בסדר כרונולוגי שינוי תזונה בתוך השן נתון זה נצפות לבני אדם ולבעלי אחרים חיות1,14, מתן מידע לגבי הבין-השנתי וריאציה עונתיות ותזונתיות.
בעוד אמייל עמיד בדרך כלל diagenesis, איזוטרופי שינויים הנובעים הסביבה קבורה אפשרי, נצפו15,16, הפיכת בדיקות ניסויית והבחירות pretreatment שימושי. אמנם זה לא השיטה זמין רק, ספקטרוסקופיית פורייה (FTIR), במיוחד במצב שידור הקלוש, התפתחה בתור מהיר, זול, נגיש יחסית שיטה להערכת שינוי taphonomic אמייל השן. בפרט בהקשרים כפליאונטולוג17,18,19,20. עם זאת, נתונים היסטוריים פרוטוקולים וסטנדרטים הקלטה נותרים יחסית נגיש לאנשים רבים מחוץ לתחומי המדע גאוכימיה או חומר.
זמני התגובה וכימיקלים המועסקים על ידי חוקרים רעלני של זגוגית השן גם משתנים באופן משמעותי בספרות, לעתים קרובות תוך התחשבות מוגבל לגבי מה ההשתנות לעשות פחמן יציב והערכים איזוטופ החמצן של המדגם21 ,22. . הנה, מדווחים גישה שימושים לדלל חומצה אצטית (0.1 M) עבור רעלני דוגמאות אבקת האמייל. עם זאת, בהתחשב בכך ההבדלים במדידות איזוטרופי הנובע רעלני הם קלים יחסית על זגוגית השן, זה הכי טוב עבור החוקרים לעקוב אחר הפרוטוקולים עבור datasets שבה הם רוצים להשוות את הנתונים שלהם ל-11. יתר על כן, שבו נלקחים דגימות רציפים קטנים, במיוחד על דגימות Holocene, אין רעלני עשוי להיבחר (בעקבות בדיקות diagenetic פיילוט) כדי למנוע בזבוז הדגימה.
למרות השיטות שאנחנו מדווחים כאן בהחלט לא חדש, הידע שלנו, זו הפעם הראשונה בה תיעוד הכתוב יסודית של תפזורת, דיגום רציף, בחירות pretreatment שיטות הסימון diagenetic (בדמות FTIR) השן אמייל נעשו נרחב זמין לקהל אקדמיים מגוונים. בעוד אנו מקווים המאמצים שלנו יגרום גישה זו יותר נגישים למספר רחב יותר של אנשים פרטיים, מעבדות, חוקרים שרוצים להחיל ולפרסם טכניקה זו חייב להיות מודע מינימום תקן, שיקולים diagenetic, דיווח, מצגת דרישות overviewed במקום20, וכן המורכבויות המפרש פוטנציאל להיות ייחודי לאזור המחקר שלהם, taxa ניתח, ולאחר זמן מחזור5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
להלן כללי התנהגות עוקב אחר הקווים המנחים של המעבדה ספקטרומטר מסה של איזוטופ אור במכון מקס פלאנק על המדע של ההיסטוריה האנושית. אתיקה המתאים הרשאות מוועדות לאומיות ובינלאומיות יש לחפש על ניתוחים המערבים בסכנת הכחדה דגימות רוצפה מודרני או היסטורית ועל השימוש וחומר הארכיאולוגי רוצפה עניין בפני בעלי עניין עכשווי . בנייר זה, הדגימות השתמשו היו דגימות הארכיאולוגי של מאובנים. . בני אדם לא חיים השתמשו במחקר זה, מלא אתית, מוסדי, ממשלתי והרשאות הרווחנו דבר עבור כל ניתוח הרסני.
1. נפח דגימה
הערה: לבני אדם ולבעלי חיים, השיטה הבסיסית של צובר השן אמאייל הדגימה הוא היישום של תרגיל לקצה buccal של השן.
- לנקות את המשטח החיצוני של השן (~0.1 מ"מ) באמצעות אלומיניום ירה blaster, או על ידי שחיקה עדין באמצעות הגדרת את התרגיל. השתמש תרגיל ידניים עם מקדח יהלום נקי שקצהו נשך (ראה להלן), צורה אפילו, המחוברים באמצעות צ'אק שיבנו התרגיל. להבטיח שחיקה אפילו ועדין מתבצע כמו חריץ מקביל לציר הצמיחה כולה (איור 1 , איור 2).
- ניסיון, במידת האפשר להחיל את שיטת באותו חלק השן עבור כל אדם או חיה שנדגמו.
הערה: במחקר paleodietary אדם, השן הטוחנת השלישית הם בדרך כלל העדיף בתור נציג של המנוח לנוער/מבוגר דיאטה בזמן השן הטוחנת הראשונה הם נמנעו בגלל הגמילה אפקטים23. השן המועדפת עבור כל טקסון, ואת תקופת החיים מיוצג, תשתנה בהתאם השאלה שנבחנה ודוגמאות זמינים. - תרגיל בחדר מאוורר היטב בעת לבישת מסיכה כדי למנוע שאיפת אבקת אמייל השן. ללבוש משקפי מגן כדי להגן על העיניים. שימו לב כי כמות האבקה מדגם קדח משתנה בהתאם הציוד המשמש עבור ניתוח, פרוטוקול pretreatment וגודל של השן. תרגיל במהירות נמוכה על מנת למנוע חימום הדגימה.
הערה: כ, 4-8 מ ג של אבקת הדגימה היא יעד המתאים עבור ניתוחים מרובים באמצעות מערכת גז באינטרנט הקדמה והכנה איזוטופ יחס ספקטרומטר מסה ולבדיקה diagenetic. להיות מודע כי המהירות שבחרת התרגיל יהיה תלוי השבריריות של המדגם, דורש רמה מסוימת של ניסוי וטעייה. באופן כללי, על תרגיל ידניים, שתיים מתוך חמש ברים של כוח הן מספקות. לקדוח את אבקת שיניים בגלל חתיכת נייר אלומיניום נקי או שקילה נייר. - לאסוף את אבקת האמייל וכתוצאה מכך ולהעביר אותו לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה 1.5 mL זה יש כבר tared על איזון מדויק כראוי לפני הקידוח. תווית כל שפופרת עם הכינוי מדגם (איור 3). להקליט את המשקל של מספרים, אמייל מדגם מחברת מעבדה, כמו גם מסד נתונים אלקטרוניים.
- לפני קידוח כל שן חדשה, נקה את סיביות קודח שימוש קודם באמצעות 0.5 M HCl על רקמה חזקים. לאחר מכן לשטוף את המקדחה עם הממס האורגני (כמו אצטון, מתנול או אתנול) באמצעות רקמה חזקים.
- בעקבות של קידוח יושב, לנקות את סביבת העבודה ביסודיות באמצעות ייעודי שואב אבק, או יעה עם מברשת. נגב את החלל הדגימה עם מתנול. ואקום או בקלילות לרסס את התרגיל עם אוויר דחוס כדי להסיר אבקה ואבק לדוגמה בין דגימות.
2. רציפים דגימה
הערה: דיגום רציף ניתן לצפות במגוון של צורות, יהיה תלוי טקסון להיות שנדגמו, בגודל של השן, כמו גם את הרזולוציה הזמנית הרצויה.
- לנקות את השטח של השן להיות שנדגם על-ידי הסרת מאוד דק (~0.1 מ"מ) שכבה של זגוגית השן החיצוניים.
- תרגיל הדגימות על פני buccal בניצב לציר צמיחה של השן, פועל מצומת שורש אמייל לחלק העליון של הכתר. לקדוח בניצב לציר צמיחה, פסים אופקיים עם כל מדגם וכתוצאה מכך חריץ רחב 1-2 מ מ לאורך השכבה אמייל (איור 1 , איור 4). לטפל כדי למנוע קודחים דרך האמאיל לתוך dentine כפי זה לזהם את המדגם, וכתוצאה מכך המדידה.
הערה: מספר דגימות שנלקחו ישתנו בהתאם לרזולוציה הרצויה אך ג 10 מייצג יעד המתאים ללמוד שינויים עונתיים אלפא13C וערכי18O אלפא עבור hypsodont בגודל של ביות הבקר. - לבחור את המקדחה המתאימה עבור כל דגימה, כמו מרוחב הקו דגימה נקבעת לפי הקוטר של המקדחה.
- השתמש מלכודת מעטה עדין יותר שיניים הדורשים מספר רב יותר של דוגמאות מצטבר (איור 2) (למשל., שיניים אנושיות), כמו גם עבור קידוח יציב יותר. להגדיר את הדוכן המתקן שמחזיק את התרגיל בצורה מאובטחת, עם המקדחה מצביע כלפי מטה.
הערה: בעוד הארבעה ניתן להשיג בקלות שן טוחנת האנושי קבוע שימוש בגודל כף יד גישה24, דגימה מעודנת יותר דורש מעטה או CO2 לייזר אבלציה הגישה כי לא דנו כאן14. גישה נפוצה אחרת היא שימוש של חצי אוטומטיות microsampling25. - להחזיק את השן או להצמיד מלחציים. הקש את זגוגית השן נגד המקדחה והפעילו לחץ. דוגמאות הן קדח בהדרגה על פני buccal מהקודקוד (השיניים. הטוחנות) לבסיס של הכתר במיקום של הצומת אמייל-root (ERJ). שכפל באותה דגימת זרע קידוח אסטרטגיה מספר פעמים קידוח במקביל קו רצוף כל השורה לדוגמה הקודמת. השתמש מקדחה קטנות דיאמונד גלילי השיניים עדינים, כגון כבשים הטוחנות, בקוטר של 1 מ מ (איור 1C).
- למדוד את המרחק של כל שורה דגימה מן ERJ באמצעות מחוגה ולהקליט במרחק הזה להשוואה.
- בצע את השלבים 1.3-1.6 לעיל.
הערה: אם שיניים קטנות, עדינות נבחנים, שיטות הסימון pretreatment ומהירות diagenetic לא החלת דגימות קטן כמו 1-4 מ"ג יפיק תוצאות אמינות על הגדרת הקדמה והכנה גז ופשוט לניתוח קרבונט. מערכות אוטומטיות-ציוד היקפי השינוי יכול להקל על השימוש של משקולות מדגם אפילו נמוכה יותר, אך באופן בלתי נמנע מוגבלים על ידי היחס קרבונט26,למדה אמייל (4-5% wt)27. חוקרים כדאי להתייעץ עם המעבדה איפה דגימות הולכים ניתן למדוד כדי לקבוע את כמות הדגימה הדרושה.
3. פורייה להפוך אינפרא-אדום מסות/Attenuated הכולל השתקפות שיטה
- עבור פעולת השירות השתקפות הכולל הקלוש, להקים רקע קאמרית מדגם, או תחת ואקום או בתנאים אטמוספרי רגיל.
- מניחים כ- 1 מ ג של זגוגית השן מעל הקריסטל יהלום בבית הבליעה מדגם בעזרת מרית. להוריד ולאבטח את ההודעה לדוגמה עד שיש חיבור המשרד בין ה-post, הדגימה את הצלחת יהלום. סגור את תא הדגימה, עם או בלי ואקום בהקמה, בהתאם הקמה או זמינות.
- למדוד את ספקטרום FTIR המדגם 64 פעמים עבור מספר גל הנע בין 400 ל 4,000 ס מ-1. המספר הרצוי של משכפל ישתנו בהתבסס על מטרות המחקר, על פי הניתוח של משכפל שלוש, אידיאלי עם aliquots שונים להיות נלקח וחזרתי כדי הצינור microcentrifuge דיור המדגם, יבטיח תוצאות חזקות.
- לנקות את המרית עם מתנול בין כל aliquot לבין כל דגימה.
- לבצע תיקון בסיסית בעזרת התוכנה זמינה. התוכנה מפחית אוטומטית את הרקע קאמרית מדגם מהפרופיל FTIR וכתוצאה מכך. כדי להבטיח הפארמצבטית טוב יותר, רק אמייל ספקטרה עם ספיגת המינימלי של 0.06 ללהקה פוספט הגבוה ביותר ב- ~ס מ 1035-1 צריכים להילקח בחשבון.
- לפקח על הנוכחות של קלציט קרבונט מזהם משני נפוץ כל הדגימות על-ידי בדיקה לשיא-711 ס מ-1.
- לאחר הניתוח, בזהירות לחזור הדגימות שלהם צינורות microcentrifuge שימוש בהתקן מרית או יניקה ולקחת אל השלב הבא של רעלני או ניתוח.
- לייצא את הנתונים הגולמיים של הגל והעוצמה כקובץ csv (או דומה) ולהשתמש כדי לחשב את מדדי עניין (מדדים נפוצים כוללים אינדקס אתר פוספט, B-אתר אינדקס פוספט, פוספט Crystallinity אינדקס, מים-אמיד במדד פוספט, ו CO-3-/PO-4 אינדקס17,18,19) (טבלה 1).
- השווה FTIR נובעת הדגימות מאובנים או ארכיאולוגי גדל datasets של זגוגית השן רוצפה מודרני עכשיו זמין19,הספרות20 כדי לקבוע את האופי וההיקף של שינוי diagenetic אמייל שנדגמו.
4. פשוט חומצה אצטית (0.1 M) רעלני
- שוקלים את אבקת האמייל עבור כל מדגם צינור microcentrifuge באמצעות איזון לפי הצורך. תווית הצינור בהתאם. אבקת האמייל חייב להיות הקרקע במידה שווה, עם חלקיקים בגודל דומה.
הערה: חוקרים רבים לנצל את סוכן חמצון, כגון אקונומיקה שתדללו (NaClO) או 30% חמצן (H2O2) כדי להסיר אורגניקס מדגם וזה אמור להתווסף בשלב זה. עם זאת, ייתכן ריאגנטים אלה לשנות את הפחמן יציב ואת הערכים איזוטופ החמצן של מדגם אלא ספקטרום של עצם דגימות קולגן בכל מערכת גז ופשוט הקדמה והכנה להדגים כי החומצה הזרחנית 100% מנוצל קרבונט מדידה אינו מגיב עם דגימות אורגניות (איור 5), רומז כי השלב זה לא הכרחי. - להוסיף 0.1 מ"ל של 0.1 M חומצה אצטית (לכל 1 מ ג של האמייל) כל דגימה באמצעות פיפטה. להימנע מלגעת הדגימות עם פיפטה. אם הדגימה של פיפטה באים במגע, להשתמש פיפטה חדש עבור הדוגמה הבאה כדי למנוע זיהום לחצות.
- להתסיס, או באמצעות טלטול או תועמלן אלקטרונית (איור 3), ועוזבים את הדגימות לשבת במשך 10 דקות אבקת האמייל לא אמורים להישאר בחומצה אצטית לתקופה ממושכת של זמן (> 4 שעות).
- מקם את הדגימות microcentrifuge למשך 2 דקות ב 13,700 x g.
הערה: חלופה בעלות נמוכה היא השימוש צנטריפוגה מיני במשך 4 דקות ב- g x 3,500, אשר מחזיקה פחות דגימות, אבל הוא פחות זמן רב בהתמודדות עם ערכות מדגם גדולים. - כאשר התוכנית microcentrifuge עוצר, החלף 2 מיליליטר מים הנדסה גנטית באמצעות פיפטה נקי, ואז microcentrifuge את הדגימות למשך 2 דקות ב g 13,700 x לחומצה אצטית.
- להחליף את המים הנדסה גנטית פעמיים נוספות, כמו קודם, ובדוק על נייטרליות. הסר את הנוזלים הנותרים בעזרת פיפטה (מבלי להפריע את תגובת שיקוע).
הערה: בסך הכל שלושה שוטף עם מים הנדסה גנטית היא הליך רגיל כדי להגיע נייטרליות. צריך לרחוץ את הדגימה עד נייטרליות. - לחתוך יריעות מצלמות-מיקרוסקופים (1 ס"מ × 1 ס מ) ומניחים מעל כל שפופרת microcentrifuge. תעשה חור קטן במרכז באמצעות חפץ חד כך המדגם מתייבש כראוי.
- מקום הצינורות להקפיא יבש כדי להסיר את כל הנוזלים הנותרים.
הערה: אם להקפיא יבש אינו זמין, עדין תנור ייבוש (40 ° C) גם אפשרות, לא צריך שום תופעות לוואי על פחמן יציב ונתונים איזוטופ החמצן. - פעם יבש, להסיר את מצלמות-מיקרוסקופים ולסגור את המכסים microcentrifuge. ודא כי צינור תיוג נכון לכתוב מחדש במידת הצורך.
הערה: זהו השלב האחרון לפני אחסון עבור שוקל, אשר במעבדות עם קרנות מוגבל עשוי להיות השלב האחרון לפני חלוקת הדגימות לניתוח במקום אחר.
5. שקילה ומדידת דוגמאות ותקנים
- בעזרת מרית, שוקלים לצאת כ 2 מ ג של אבקת האמייל לדיסק פח על איזון רגיש 0.001 מ ג (איור 6). ואז בזהירות להעביר את הדגימה לתוך בקבוקון זכוכית בורוסיליקט עמידי חומצה זרחתית. כמות זו של האמייל נדרש להניב תוצאות אמינות בשל היחס קטן יחסית קרבונט ב אמייל השן.
- לנקות את המרית בין דוגמאות שימוש מתנול להשתמש בדיסק טרי, נקי או שקילה קיבול עבור כל דגימה.
- שוקלים לצאת 0.2 מ ג ברמה בינלאומית כגון NBS18 הבינלאומית לאנרגיה אטומית, 603 הבינלאומית לאנרגיה אטומית, CO8 הבינלאומית לאנרגיה אטומית או מרק קאקו3. תקן ללא צורך במיקור חוץ מסיבים על אמייל homogenized של שן גדול יכול לשמש היטב20. לריצה מלא של דגימות 76, תקנים, שימוש בדגימות 61 ותקני 15, אשר צריך להיות מופץ באופן שווה כל הפעלה. מספר מחקרים דיווחו על המספרים המתאימים סטנדרטים ופרטים המחקר הארכיאולוגי20,28.
הערה: רעלני חוזרות וניתוח אמייל בתקן הבית, על פני מספר הרצפים של דגימות הארכיאולוגי, היא גם עשויה לספק מדד המתאים של דיוק הדגימות נחקר20. - הדק שתוכננה עפעפיו, נגיש המחט עד מחצה חזק אבל לא נשאב לתוך הבקבוקון. לא על הדק המכסה הלחץ על מחצה יקבל חזקה מדי, עלולה לגרום בסופו של דבר במחט שבורה במהלך ניתוח. מקם את הבקבוקונים סדר המפורטים בתוך בלוק חימום-70 מעלות צלזיוס. חייב להיות אמין עבור הערך לתוך התוכנה המחשב הקליט את ההזמנה ואת משקולות של דגימות.
- למדוד את הדגימות לפי שלושה שלבים: 1) מיושרות למלא את הדגימות עם הליום טהור, 2) להוסיף חומצה זרחתית, 3) למדוד את הדגימה.
- לרוקן את הדגימות עם הליום טהור (כיתה 5.0) עם קיבולת של 100 מ ל/דקה במשך 5 דקות כדי לשטוף הסביבתית.
- להוסיף 4-5 טיפות של חומצה זרחתית (99%, צפיפות 1.85 g/mL) לדגימת המכילות קרבונט. התגובה בין מדגם H3פו4 מתחיל. במהלך התגובה, CO2 משוחרר אשר נושאת את הערך איזוטרופי של יונים קרבונט CO32 - המדגם.
- חכה h 1 עבור דגימה עד equilibration של CO2 . לאחר 1 h, יש למדוד את הדוגמאות כדי להשיג תוצאות אמינות. במהלך הרכישה, תערובת של דגימת דלק הוא עובר על המכשיר. שלב הייבוש מסיר מים הדגימה תערובת.
- למדוד את הדגימה על-ידי הפעלת שלוש פסגות של CO2 הפניה גז עם הרכב איזוטרופי ידוע. שיא עוצמת צריך להיות mV 4000 כדי להתאים את עוצמת הפסגות מדגם (בין 4000 עד 8000 mV). הפסגות גז התייחסות שלוש צריך להיות 20 s ארוכה ו-30 s בנפרד. בצע עם הגדרת מרווח הזמן מדידה של המדגם. למדוד את הדגימה 10 פעמים עבור 5 s כל ו- 55 s בנפרד. ודא כי שיא גובה פוחתת לאורך זמן המציינת תחבורה נאותה של תערובת מדגם/הליום (איור 5).
הערה: במהלך המדידה, התוכנה מחשבת את ההרכב איזוטרופי המדגם על-ידי השוואת הערך איזוטרופי ידוע, את שיא הגובה, ואת אזור הפסגה של הגז הפניה עם שיא הגובה ואזור של הפסגות של הדגימות. Raw 13C /12C ו- 18O /16O ההרכב של המדגם מחושב.
- לנרמל את הדגימות לאחר מדידה.
הערה: זה חשוב כי הגז ההפניה אינו עובר אותו נתיב כימיים ופיזיים כמו הגז לדוגמה כאשר ספקטרומטר מסה. לכן חיוני כי הדגימות מכוילים בנוסף לסטנדרטים בינלאומיים (שלב 5.3) עוברים אותו הפיסיקליות והכימיות הטיפול תוך ריצה כמו הדגימה עצמה20. סטנדרטים בינלאומיים קרבונט אלה מאפשרות הכיול לשתי נקודות של דוגמאות על קנה המידה דלתא בינלאומיים והערכה של דיוק, הדיר במהלך תקופה נתונה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות ההליך דגימה שהוצגו לעיל, אמייל מצטבר bioapatite דגימות הוכנו. הניתוח של bioapatite ב אמייל תלוי הדיוק של דגימה, בין אם בתפזורת או מצטבר. במקרה זה, בחרנו להציג את התוצאות של דגימות הארכיאולוגי (שני כבשים) של אזורי אקלים שונים. דוגמאות מצטבר היו מנותח של השן הטוחנת השנייה כבשים ו מתויג החל ERJ (איור 4). מיקומי הדגימה מצטבר מוספרו ולאחר כל מיקום נמדדה כמו המרחק שלו במ מ ERJ (איור 7).
מגוונות הפחמן והחמצן איזוטופ יציב נובע הכבשים שני לאשר כי הם חיו בסביבות שונות, זה במקרה גראסלאנד טרופי (א) ו גראסלאנד יבש-סטפ ממוזג (B), בהתאמה. אלפא מצטבר18O ערכים עבור הכבשים תוכנית לטווח קצר בין 3.3 כדי 5.1‰, רומז הבליעה של מקורות המים עם ערכי איזוטרופי דומים וחוסר חזקה העונתי במאזן משקעים (איור 8). לעומת זאת, אלפא18O ערכים עבור הכבשים B יש של משרעת גבוהה של וריאציה, החל ─5.2 וכלה ─13.1‰, המציינת וריאציה עונתיים חזק בכמות המשקעים. ערכים איזוטופ הפחמן יציב מראים הבדלים חריפים בלע צמחיה בין דגימות, עם כבשים שיש דיאטה המורכבת בעיקר C4 צמחים, ואילו כבשים B בלע בעיקר C3 צמחיה. כבשים אלה נבחרו במיוחד כדי להדגים ניכר מצטבר חמצן, פחמן איזוטופ יציב תוצאות איכות הסביבה וריאציה.
שיניים אנושיות באופן דומה לטעום מן ERJ לכתר לאורך ציר הגידול. אלפא מצטבר18O וערכי13C אלפא עבור שן של בן אדם מסביבת יערות הגשם הם מאוד מוגבל, בטווח 2‰. הדבר מצביע על חוסר וריאציה אסטרטגיות הרעיה במשך התקופה של מינרליזציה אמייל (איור 9).
איור 1: קידוח שן. (א) צילום של שן להיות קדח על המתקן להגדיר. (ב) צילום של אבקת האמייל להיות שליקט בנייר והניח לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה 1.5 mL (עם תווית נכונה). (ג) תמונה של מקדחים שונים זמינים עבור הדגימה מצטבר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: האסדה להגדיר האם תמונה של המתקן לשדך את התרגיל במקום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: לטעום הכנה- לטעום להיות להציב לתוך שפופרת צנטרפוגה מיקרו, נסער על מערבולת לאחר כימיקלים נוספו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: מצטבר שנדגמו כבשים שיניים. כבשים שיניים (A ו- B) היו באופן מצטבר שנדגמו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: Chromatogram של gasbench לרוץ. תמונה של chromatogram אחד מדגם הצגת האינטנסיביות של הפניה גז פסגות ושל פסגות לדוגמה לאורך זמן. ההמונים שזוהו הם 44, 45, 46. שלושת הפסגות הן CO2 הפניה גז פסגות עם הרכב איזוטרופי ידוע. פסגות עשר שאחריו הם פסגות דגימת הפחתה בעוצמת. פסגות תמיד צריכה להיות מופרדת באמצעות מספר שניות כדי להבטיח של אפליה קפדנית בין הפסגות ומכאן שילוב שיא נקי. מספרים על גבי כל מצב שיא הזמן (s) של זיהוי שיא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6: שקילה קרבונט דגימה. תמונה של המדגם להיות משוקלל לתוך מבחנות זכוכית בעזרת מרית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7: דגימות מצטבר על שן כבשים. דוגמאות מצטבר לאורך ציר הגידול של השן מ ERJ לחלק העליון של הכתר להתוות לצד הפחמן והחמצן איזוטופ יציב ערכים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 8: כבשים אמייל קרבונט איזוטופ תוצאות. יציב ערכים האיזוטופ חמצן ופחמן לשיניים שני כבשים מצטבר שנדגמו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 9: אמייל האנושי קרבונט איזוטופ תוצאות. יציב חמצן ופחמן איזוטופ ערכים עבור שן אנושית מצטבר שנדגמו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| PCI (מדד Crystallinity פוספט) |  |
Sponheimer ו- Lee-Thorp, 1999b |
| שמות אחרים: | ||
| CIIR (Crystallinity אינדקס אינפרא-אדום) | שמש, 1990 | |
| IRSF (פיצול גורם אינפרא-אדום) | ויינר, בר-יוסף, 1990 | |
| BPI (B-קרבונט במדד פוספט) |  |
LeGeros, 1991 |
| API (A-קרבונט במדד פוספט) |  |
Sponheimer ו- Lee-Thorp, 1999b |
| באי (יחסית כמות של B-A-האתר קרבונט) |  |
Sponheimer, 1999; Sponheimer ו- Lee-Thorp, 1999b |
| WAMPI (מים-אמיד במדד פוספט) |  |
רוש. et al., 2010 |
טבלה 1: מדדים אמפיריים המאפיינות את המאפיינים קריסטל-כימי של אמייל bioapatite. אנו ממליצים על שימוש של מדדים אמפיריים של Sponheimer (1999), Sponheimer ו- Lee-Thorp (1999), רוש. et al. (2010) כדי לאפיין את המאפיינים קריסטל-כימי של bioapatite אמייל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
האתגרים של מוצלחת דגימה (בתפזורת, מצטבר) של שיניים מתבסס על הגישה לידע לגבי טכניקות קידוח ולטעום הכנה, לצד ההשקעה בציוד זול יחסית. האתגרים הללו הם surmountable בקלות כאשר ברור ההוראות זמינים בנוגע גישות pretreatment מדגם. במאמר זה, אנו מקווים יש המופץ אלה בצורה ברורה, תמציתי לחוקרים החדשה לשיטות אלו. מלומדים יישום שיטות אלה בפעם הראשונה צריך להתאמן על החי והצומח מודרני נגיש לפני ניתוח של דגימה של דגימות כפליאונטולוג ארכיאולוגיים יקרי ערך.
הדוגמאות של קרבונט אמייל השן האדם ושל בעלי החיים לניתוח איזוטופ יציב הוא הליך פשוט זה התחייבה במעבדות מרובים. עם זאת, יש נטייה טכניקות והטכנולוגיה הקשורים קידוח של שיניים כדי להשתנות על ידי מעבדה להיכלל ברשימה רחבה יותר של ידע טכני פנימי שאינו משותף בגלוי. דגימה מצטבר יש יתרונות חשובים, מאפשר זיהוי מפורט אינטרה-וריאציה צריכת התזונה, הבליעה של מים. זה מומחש באמצעות משכנעת את ההבדלים שנמצאו בין אנשים מאזורים שונים כמו תזונה, מידע על איכות הסביבה נשמרת ב- bioapatite אמייל השן. בנתוני הנציגה שלנו, וריאציה איזוטרופי משמעותי ניכרת בין הכבשים מן המרעה טרופיים בהשוואה את הכבשים מן יבש-סטפ ממוזג גראסלאנדס (איור 8).
שלבים קריטיים בתוך הפרוטוקול קשורים את דיוק קידוח, שימור אמייל השן וטכניקות pretreatment. אי דיוקים קטנים קידוח, לדוגמה, דרך האמאיל לתוך dentine השן, עלולה לגרום עצומה משתנה האיזוטופ המידות29. השימור של זגוגית השן ניתן לבדוק באמצעות מגוון רחב של שיטות, כולל שיעור מוערך קרבונט מדגם נתון הנמדד, כמו גם את קביעת FTIR שנדונו כאן. החוקרים גם ליידע את המעבדות של הסביבה קבורה, במיוחד אם למערכת מים או בקרקעות חומצי, אשר יכולים להשפיע על שימור מבניים אמייל השן מאובנים. הקשיות של זגוגית השן להתייחס כמחוון הראשונית של שימור, אשר רק עשוי להיות ניכרת במהלך קידוח. אמייל רך וניתן בקלות קדח מרמז כי סריג הגביש bioapatite ייתכן השפלת, יש לבדוק עם FTIR או אמצעים אחרים דיווחו בספרות30. השוני מדגם רעלני נראה את התוצאה מוגבל וריאציה איזוטרופי השן אמאייל21,22. לכן, אנו ממליצים על השימוש הפרוטוקולים פשוטים (למשל., 0.1 M חומצה אצטית במשך פחות מ 4 שעות ולאחר מכן לשטוף עם מים מזוקקים).
ישנן מספר מגבלות על הטכניקה, הקשורים עם פרשנות ועיצוב הדגימה. קידוח דגימות סדרתית היא מיומנות זה לוקח קצת זמן להתמחות. הבנה ברורה של taxa, השן כדי להיות מנותח חיוני בתהליך גיבוש של הדגימה עיצוב2,25. יתרה מזאת, קידוח של דגימות יכול לקחת כמות ניכרת של זמן להשלים. עם זאת, הפחמן וכתוצאה מכך והערכים חמצן איזוטופ יציב עבור שיניים ברצף שנדגמו לאפשר לחוקרים לעקוב אחר שינויים תזונתיים וסביבתיים. שינויים אלה קשורים טבעי שינויים עונתיים, לעיתים קרובות בתקופות עתיקות, שלחוקרים מתחשב הן contextualized מתוך הבנה של וריאציה הפניה איזוטרופי ערכות הם חלק בלתי נפרד זה מחקר6.
במאמר, אנו הדגימו דגימה מצטבר, לרשימת תפוצה דגימה של האדם והן כבשים שיניים. עוד יותר, אנו מורים החוקרים על שיטות pretreatment שתי קבוצות המדגם. שיטת דגימה מצטבר ניתן להחיל בהצלחה על החי והצומח עתיקה ומודרנית עם מינרליזציה וצמיחה אמייל דומה (למשל., בקר וסוסים). ניתן להשתמש רעלני של bioapatite אמייל כפי שמוצג במאמר על דגימות חתך של שרידים עתיקים. הלקח החשוב ביותר שלנו הליך הדגימה היא גורפת דגימה מצטבר של שיניים, אשר לא מוסבר בקלות במסמך. הפגנות נוספות יכול להנהיג בנו דמוקרטיה איזוטופ הארכיאולוגי דגימה וגישות טיפוליות מראש אחרים (למשל., עצם עקירות קולגן או הדוגמאות של קדרות הארכיאולוגי למדידות איזוטופ יציב של חומצות שומן) שיפור התפשטות ידע וטכנולוגיה בתחום זה. דמוקרטיזציה כזה אסור, עם זאת, ניתן לראות כתחליף מלאה עבור ייעוץ עם המומחים, או בספרות זמין, כדי לקבוע את הסטנדרטים של מדידה ופרשנות20,28בהקשר נתון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים ללא ניגוד אינטרסים.
Acknowledgments
ברצוננו להודות חברת מקס פלנק מימון המחקר הזה, כמו גם את ההגדרה האחרונה למעלה של מעבדת איזוטופ יציב-החוג לארכיאולוגיה, מכון מקס פלנק על המדע של ההיסטוריה האנושית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dremel Micro | Dremel | https://www.dremel.com/en_US/products/-/show-product/tools/8050-micro | |
| Diamond-tipped drill bit | Dremel | https://www.dremel.com/en_US/products/-/show-product/accessories/7122-diamond-wheel-point | |
| 1.5 mL micro-centrifuge tube | Sigma Aldrich | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t2422?lang=de®ion=DE&gclid=EAIaIQ obChMI7pHRpauW2QIV77ftCh1p1 wjhEAAYASAAEgKzkvD_BwE |
|
| Methanol | Linear Formula: CH3OH | ||
| Acetic Acid | Linear Formula: CH3CO2H | ||
| Dremel rig set-up (workstation) | Dremel | https://www.dremel.com/en_US/products/-/show-product/tools/220-01-workstation | |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/75002401 | |
| Mini-centrifuge | Sprout | http://www.heathrowscientific.com/sprout-mini-centrifuge-4 | |
| Freeze drier | Zirbus Technology | http://www.zirbus.com |
References
- Balasse, M. Reconstructing dietary and environmental history from enamel isotopic analysis: time resolution of intra-tooth sequential sampling. International Journal of Osteoarchaeology. 12 (3), 155-165 (2002).
- Balasse, M. Potential biases in sampling design and interpretation of intra-tooth isotope analysis. International Journal of Osteoarchaeology. 13 (1-2), 3-10 (2003).
- Lee-Thorp, J. A. On isotopes and old bones. Archaeometry. 50 (6), 925-950 (2008).
- Clementz, M. T. New insight from old bones: stable isotope analysis of fossil mammals. Journal of Mammalogy. 93 (2), 368-380 (2012).
- Loftus, E., Roberts, P., Lee-Thorp, J. A. An isotopic generation: four decades of stable isotope analysis in African archaeology. Azania: Archaeological Research in Africa. 51 (1), 88-114 (2016).
- Ventresca Miller, A. R., Makarewicz, C. Isotopic approaches to pastoralism in prehistory: Diet, mobility, and isotopic reference sets. Isotopic Investigations of Pastoralism in Prehistory. , 1-14 (2018).
- Hollund, H. I., Ariese, F., Fernandes, R., Jans, M. M. E., Kars, H. Testing an alternative high-throughput tool for investigating bone diagenesis: FTIR in attenuated total reflection (ATR) mode. Archaeometry. 55 (3), 507-532 (2013).
- LeGeros, R. Z. Calcium phosphates in oral biology and medicine. Monographs in oral sciences. 15, 109-111 (1991).
- Lee-Thorp, J. L., Van Der Merwe, N. J. Carbon isotope analysis of fossil bone apatite. South African Journal of Science. 83 (11), 712-715 (1987).
- Cerling, T. E., Harris, J. M. Carbon isotope fractionation between diet and bioapatite in ungulate mammals and implications for ecological and paleoecological studies. Oecologia. 120 (3), 347-363 (1999).
- Koch, P. L. Isotopic study of the biology of modern and fossil vertebrates. Stable Isotopes in Ecology and Environmental Science. , 99-154 (2007).
- Nelson, S. J. Wheeler's Dental Anatomy, Physiology and Occlusion-E-Book. , Elsevier Health Sciences. (2014).
- Tsutaya, T., et al. From cradle to grave: multi-isotopic investigations on the life history of a higher-status female from Edo-period Japan. Anthropological Science. 124 (3), 185-197 (2016).
- Sponheimer, M., Passey, B. H., De Ruiter, D. J., Guatelli-Steinberg, D., Cerling, T. E., Lee-Thorp, J. A. Isotopic evidence for dietary variability in the early hominin Paranthropus robustus. Science. 314 (5801), 980-982 (2006).
- Lee-Thorp, J., Sponheimer, M. Three case studies used to reassess the reliability of fossil bone and enamel isotope signals for paleodietary studies. Journal of Anthropological Archaeology. 22 (3), 208-216 (2003).
- Zazzo, A. Bone and enamel carbonate diagenesis: a radiocarbon prospective. Palaeogeography, Palaeoclimatology, Palaeoecology. 416, 168-178 (2014).
- Sponheimer, M. Isotopic paleoecology of the Makapansgat Limeworks fauna (Australopithecus africanus, South Africa). , (1999).
- Sponheimer, M., Lee-Thorp, J. A. Alteration of enamel carbonate environments during fossilization. Journal of Archaeological Science. 26 (2), 143-150 (1999).
- Roche, D., Ségalen, L., Balan, E., Delattre, S. Preservation assessment of Miocene-Pliocene tooth enamel from Tugen Hills (Kenyan Rift Valley) through FTIR, chemical and stable-isotope analyses. Journal of Archaeological Science. 37 (7), 1690-1699 (2010).
- Roberts, P., et al. Calling all archaeologists: guidelines for terminology, methodology, data handling, and reporting when undertaking and reviewing stable isotope applications in archaeology. Rapid Communications in Mass Spectrometry. , (2018).
- Snoeck, C., Pellegrini, M. Comparing bioapatite carbonate pre-treatments for isotopic measurements: Part 1-Impact on structure and chemical composition. Chemical Geology. 417, 394-403 (2015).
- Pellegrini, M., Snoeck, C. Comparing bioapatite carbonate pre-treatments for isotopic measurements: Part 2-Impact on carbon and oxygen isotope compositions. Chemical Geology. 420, 88-96 (2016).
- Wright, L. E., Schwarcz, H. P. Stable carbon and oxygen isotopes in human tooth enamel: identifying breastfeeding and weaning in prehistory. American Journal of physical anthropology. 106 (1), 1-18 (1998).
- Roberts, P., et al. Fruits of the forest: Human stable isotope ecology and rainforest adaptations in Late Pleistocene and Holocene (∼ 36 to 3 ka) Sri Lanka. Journal of human evolution. 106, 102-118 (2017).
- Zazzo, A., Balasse, M., Patterson, W. P. High-resolution δ13C intratooth profiles in bovine enamel: Implications for mineralization pattern and isotopic attenuation. Geochimica et Cosmochimica Acta. 69 (14), 3631-3642 (2005).
- Sydney-Zax, M., Mayer, I., Deutsch, D. Carbonate content in developing human and bovine enamel. Journal of dental research. 70 (5), 913-916 (1991).
- Rink, W. J., Schwarcz, H. P. Tests for diagenesis in tooth enamel: ESR dating signals and carbonate contents. Journal of Archaeological Science. 22 (2), 251-255 (1995).
- Szpak, P., Metcalfe, J. Z., Macdonald, R. A. Best practices for calibrating and reporting stable isotope measurements in archaeology. Journal of Archaeological Science: Reports. 13, 609-616 (2017).
- Wright, L. E., Schwarcz, H. P. Correspondence between stable carbon, oxygen and nitrogen isotopes in human tooth enamel and dentine: infant diets at Kaminaljuyu. Journal of Archaeological Science. 26 (9), 1159-1170 (1999).
- Schoeninger, M. J., Hallin, K., Reeser, H., Valley, J. W., Fournelle, J. Isotopic alteration of mammalian tooth enamel. International Journal of Osteoarchaeology. 13 (1-2), 11-19 (2003).
