Summary
인간과 동물의 치아에 나 멜 탄산의 안정적인 탄소 및 산소 동위 원소 분석은 개별 단과 환경 재건에 대 한 프록시로 사용 되었습니다. 여기, 우리 대 한 자세한 설명을 제공 하 고 대량 순차적 시각적 설명서 치아에 나 멜 샘플링으로 고고학과 고생물학 샘플의 전처리.
Abstract
인간과 동물의 치아에 나 멜 탄산의 안정적인 탄소 및 산소 동위 원소 분석 적용 되었습니다 paleodietary, paleoecological, 및 paleoenvironmental 연구에서 최근 역사적인 기간에서 10 백만 년 전를 다시. 대량 접근 치아 내의 순차 견본이이 기간 동안 식이 환경 변화를 추적할 수 있습니다 하는 동안 사기 질 강화 작용의 기간에 대 한 대표 하는 샘플을 제공 합니다. 없음 명시적 지침 필요한 실험실 장비의 선택에 도움을 철저 하 게 상세한 실험실 샘플링을 설명 되었습니다 동안 이러한 방법론 널리 적용 되었고 고고학, 생태학, 고생물학에 설명, 그리고 프로토콜입니다. 이 문서에서는, 우리가 문서 함수와 및 시각, 전처리 및 diagenetic 심사 방법론 더 널리 사용할 수 있도록 다양 한 실험실 설정에서에서 응용 프로그램을 고려 하는 연구를 통해 샘플링에서 전체 과정.
Introduction
치아에 나 멜 탄산의 안정적인 탄소 및 산소 동위 원소 분석은 인간의 식이 섭취, 이유, 이동성, 뿐 아니라 및 faunal 의존 식물, 동물 및 가축 foddering의 움직임 과거 공부에 사용 되었습니다. 이러한 응용 프로그램 포괄적으로 논의 되었고 다양 한 지역 건조, 온도, 물 소스, 그리고 식물 작곡1,2, 의 효과 나타내는 환경 조건에 대 한 검토 3,4,,56. 고고학과 고생물학, 잠재적인 응용 프로그램의 다양성 뿐만 아니라 치아에 나 멜 탄산의 좋은 보존 했다 그것은 안정 동위 원소 작업3에 대 한 매력적인 소재를. 샘플링, 전처리, 및 diagenesis 심사의 방법 이전 간행물1,7의 숫자에 간략하게 설명 합니다. 그러나, 철저 한 구두 및 시각적 데모 남아 크게 사용할 수 없게, 특히 사람들이 고고학 과학 실험실 및 연구소 그룹이 기술의 사용에 대 한 관심 증가 제한 된 자금 중 5.
치아에 나 멜은 주로 이루어진 hydroxyapatite (bioapatite) 정자8 그 뼈, 사후 diagenetic 이온 대체 및 오염3을 더 저항 하에 보다 큰. 현대 연구는 faunal 치아의 안정적인 탄소 동위 원소 (δ13C) 측정에 나 멜을 안정적으로 레코드 동물 다이어트 및 동작9,10설명 했다. 치아에 나 멜의 안정 되어 있는 산소 동위 원소 (δ18O) 값 섭취 물, 물에 다양 한 환경에 미치는 영향 뿐만 아니라 식물 및 동물성 식품, 식 수, 호흡, 물 포함의 산소 동위 원소 구성에 의해 결정 됩니다. 또한 동위 원소 분별 법으로 이어질 수 있는 (예., 건조, 온도, 고도, 강우량 금액, 대륙 위치)11. 이 식이 환경 재건에 대 한 인기 있는 방법을에서 했다 paleoecological, 고고학, 고생물학 연구.
치아에 나 멜 형성 기간 (년)을 상대적으로 짧은 이며 샘플링 되 고 치아에 따라 다릅니다. 인간을 위한 첫 번째 어 금 니에 나 멜 mineralizes 출생에서 3 세 사이, 구치 형성 1.5 ~ 7 세 사이, 두 번째 어 금 니 2.5와 8 세의 형성 및 세 번째 어 금 니12 7 16 세 사이 청소년 기 동안 형성 . 대형의 그것의 기간 동안 점진적으로 그 치아에 나 멜 형태를 감안할 때, 그것은 전체 성장 축 따라 대량에서 샘플링 하거나 수13 형성 기간 동안 발생 한 규정식 및 환경에서 변경 내용을 조사 하려면 순차적 샘플링 . 특정된 치아 내 식이 변화를 시간순으로 정렬 된 인간과 다른 동물1,14, 간 연례 계절과 규정식 변화에 관한 정보를 제공에 대 한 관찰 이다.
에 나 멜은 보통 diagenesis, 매장 환경에서 발생 하는 동위 원소 수정 가능 하 고15,16, 실험 검사 및 전처리 선택 유용한 만드는 관찰 되었습니다. 푸리에 변환 적외선 분광학 (FTIR), 특히 감쇠 전송 모드에서 빠르고, 저렴 한, 그리고 치아에 나 멜에 taphonomic 변경 평가 대 한 상대적으로 액세스할 수 있는 방법으로 등장 했습니다 동안 그것만 사용할 수 있는 방법, 고생물학 컨텍스트17,18,,1920에 특히. 그러나, 상세한 프로토콜 및 녹음 표준 남아 지구 화학 또는 재료 과학 분야 이외의 많은 사람들이 상대적으로 액세스할 수 없습니다.
반응 시간과 치아에 나 멜의 전처리에 연구원에 의해 고용 하는 화학 물질도 상당히 다이 다양성 안정적인 탄소 및 산소 동위 원소 값 샘플21의 무엇을 할 수 있습니다로 제한 고려 종종 문학에서 ,22. 여기, 우리는 나 멜 파우더 샘플의 전처리에 대 한 접근을 사용 하 여 희석 초 산 (0.1 m M)를 보고 합니다. 그러나, 그에 주어진 동위 원소 측정 전처리에서 결과에 차이 상대적으로 경미한 치아에 나 멜에 대 한, 연구자는 그들은11에 그들의 데이터를 비교 하고자 하는 데이터 집합에 대 한 프로토콜에 따라에 대 한 최상 이다. 또한, 홀로세 샘플에 특히 작은 순차적 샘플 촬영은 어디 아무 전처리 선택할 수 있습니다 (다음 파일럿 diagenetic 테스트) 샘플 낭비를 피하기 위해.
우리가 여기에 보고 하는 방법을 우리의 지식에 새로운 수단으로 있지만, 이것은 처음으로 대량 및 순차 샘플링, 전처리 선택, 그리고 치아에 대 한 diagenetic 확인 방법 (FTIR의 형태로)의 철저 한 서 면 및 비주얼 문서에 나 멜 되었습니다 널리 사용할 수 있는 다양 한 학술 관객 들에 게. 우리는 우리의 노력 하 게 될이 이렇게 더 쉽게 개인 및 실험실의 넓은 수를 희망 하는 동안 적용 하 고이 기술을 게시 하 고 싶은 연구자 최소 기준, diagenetic 고려 사항, 보고 알고 있어야 하 고 프레 젠 테이 션 요구 overviewed 다른 잠재적인 해석 복잡성을 그들의 연구 영역, 분석, taxa에 고유 기간5시간으로20일.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
다음 프로토콜 인류 역사의 과학에 대 한 최대 플랑크 연구소에서 빛 동위 원소 질량 분석 실험실의 지침을 따릅니다. 멸종 위기에 놓인된 현대 또는 역사 faunal 견본를 포함 분석 그리고 현대 이해 관계자 관심의 고고학과 faunal 물자의 사용에 대 한 국내 및 국제 위원회에서 적절 한 윤리 권한은 찾았던 되어야 합니다. . 이 문서에서 사용 하는 샘플 고고학과 화석 표본 이었다. 아니 살아있는 인간이이 연구에 사용 되었다 하 고 파괴적인 분석에 대 한 전체 윤리, 기관, 및 정부 권한을 갖게 되었습니다.
1. 대량 샘플링
참고: 인간과 동물, 대량의 기본적인 방법은 치아에 나 멜 샘플링은 치아의 볼 가장자리에 드릴의 응용 이다.
- 드릴 설정을 사용 하 여 부드러운 마모 또는 알루미늄 샷 블래스터를 사용 하 여 치아 (~0.1 m m)의 외부 표면을 청소. 깨끗 한 다이아몬드 밀고 드릴 비트 (아래 참조), 심지어 모양, 드릴 설정에 한 척을 통해 연결 된 휴대용 드릴을 사용 합니다. 온화 하 고 심지어 마모 홈 전체 성장 축에 평행으로 수행 확인 (그림 1 및 그림 2).
- 시도, 가능한 경우, 각 인간 같은 치아 부분 또는 동물 샘플링에 메서드를 적용 합니다.
참고: 인간 paleodietary 연구에서 셋째 어 금 니는 일반적으로 선호 하는 대표 늦게 청소년/성인 다이어트로 동안 첫 번째 어 금 니 효과23이유 때문에 피할 수 있습니다. 각 taxon, 표현, 생활의 기간에 대 한 선호 치아는 사용할 수 있는 샘플 및 연구 질문으로 달라 집니다. - 치아에 나 멜 분말의 흡입을 피하기 위해 마스크를 착용 하는 동안 통풍이 잘되는 방에 드릴. 눈을 보호 하기 위해 고글을 착용. 교 련된 샘플 파우더의 양을 분석, 전처리 프로토콜 및 치아의 크기에 사용 되는 장비에 따라 달라 집니다 것을 유의 하십시오. 샘플이 열을 방지 하기 위해 낮은 속도로 드릴.
참고: 약, 4-8 mg 샘플 파우더의 동위 원소 비율 질량 분석 및 diagenetic 테스트 온라인 가스 준비 및 도입 시스템을 사용 하 여 여러 분석에 대 한 적절 한 목표 이다. 선택한 드릴 속도 샘플의 취약성에 따라 달라 집니다와 시행 착오의 몇 가지 수준을 요구할 것 이다 다는 것을 유의 하십시오. 일반적으로, 소형 드릴에 힘의 2/5 바는 충분. 깨끗 한 알루미늄 호 일의 조각을 통해 치아 분말을 드릴 또는 종이 무게. - 결과 나 멜 파우더를 수집 하 고 드릴링 전에 적절 하 게 정확한 균형에 tared 되었습니다 1.5 mL 마이크로 원심 튜브로 전송. 라벨 샘플 지정 (그림 3)과 각 관. 샘플 번호 및에 나 멜 무게 실험실 노트북 전자 데이터베이스에 기록 합니다.
- 각 새로운 치아를 시추 하기 전에 먼저 0.5 M HCl을 사용 하 여 강력한 조직에 사용된 드릴 비트를 청소. 다음 씻어 드릴 비트는 유기 용 제 (아세톤, 메탄올, 에탄올 등)와 함께 사용 하 여 강력한 조직.
- 철저 하 게 전용 사용 하 여 작업 영역을 청소 드릴링, 다음 진공 청소기, 또는 쓰와 브러시. 메탄올과 샘플링 공간을 닦아 주십시오. 진공 또는 훈련 압축 공기 제거 샘플 사이의 먼지와 샘플 파우더를 가볍게 스프레이 합니다.
2. 순차 샘플링
참고: 순차 샘플링 및 다양 한 형태에에서 접근 될 수 있다 taxon 샘플링 되는 치아 뿐만 아니라 원하는 시간적 해상도의 크기에 따라 달라 집니다.
- 매우 얇은 제거 하 여 샘플링 되는 치아의 표면을 청소 외부 치아에 나 멜 층 (~0.1 m m).
- 크라운의 정상에에 나 멜 루트 분기점에서 실행 되는 치아의 성장 축에 수직인 볼 표면 샘플을 드릴. 수평 밴드 성장 축에 수직인 각 샘플에 나 멜 층에 걸쳐 1-2 밀리미터 넓은 홈에 결과 드릴 (그림 1 및 그림 4). 그것은 샘플 및 결과 측정을 오염 시킬 것으로 dentine에에 나 멜을 드릴 하지 않도록 주의 하십시오.
참고: 샘플 수 원하는 해상도 따라 달라 집니다 하지만 c. 10 δ13C에 길 들 여 진된 소의 크기는 hypsodont에 대 한 δ18O 값 계절 변화를 공부 하는 적절 한 목표를 나타냅니다. - 샘플링 라인의 폭은 드릴 비트의 직경에 의해 결정으로 각 샘플에 대 한 적절 한 드릴 비트를 선택 합니다.
- 장비 설정을 사용 하 여 증분 샘플 (그림 2)의 더 많은 수를 요구 하는 더 섬세 한 치아 (예., 인간의 치아), 뿐만 아니라 더 안정적인 드릴링에 대. 아래쪽을 가리키는 드릴 비트와 함께 안전 하 게, 드릴을 보유 하 고 있는 장비 스탠드를 설정 합니다.
참고: 4 개의 샘플은 쉽게 휴대용 접근24를 사용 하 여 영구 인간의 모 랄에서 얻어질 수 있다, 하는 동안 더 세련 된 샘플링 rig 또는 CO2 레이저 절제 접근 되지 것입니다 그 논의 여기14. 또 다른 일반적인 방법은 사용 하는 반자동된 microsampling25입니다. - 치아를 보유 하거나 클램프를 연결 합니다. 치아에 나 멜 드릴 비트에 대 한 누르고 압력을 적용 합니다. 샘플은 뚫고 증분 볼 표면 꼭대기 (occlusal 표면)에서 나 멜-루트 분기점 (ERJ)의 위치에서 크라운의 기지에. 동일한 샘플 전략 여러 번 이전 샘플 줄에 각 연속 선 병렬 드릴링 드릴링을 복제 합니다. 작은 원통형 다이아몬드 드릴 비트를 사용 하 여 양 어 금 니, 직경 1 mm (그림 1C)와 같은 섬세 한 치아에 대 한.
- ERJ 캘리퍼스를 사용 하 여에서 각 샘플링 라인의 거리를 측정 하 고 비교에 대 한이 거리를 기록 합니다.
- 단계 1.3-1.6 위의 따릅니다.
참고: 작은, 섬세 한이 분석 되 고 전처리 및 diagenetic 검사 방법을 적용 되지 않습니다, 만약 샘플 1-4 밀리 그램 작은 탄산 분석의 온라인 가스 준비 및 설정에 신뢰할 수 있는 결과 생산할 예정 이다. 수정 된 자동화 주변 기기 시스템의 더 낮은 샘플 무게, 사용을 촉진할 수 있다 하지만 공부에 나 멜 (4 ~ 5 wt %)26,27에 탄산의 비율에 의해 필연적으로 제한 됩니다. 연구팀은 샘플은 필요한 샘플의 크기를 결정 측정 하려고 하는 연구소와 상담 해야 한다.
3. 푸리에 변환 적외선 분 광 분석/Attenuated 총 반사율 메서드
- 약하게 한 총 반사율 메서드에 대 한 샘플 챔버 배경, 진공에서 또는 정상적인 대기의 상태를 설정 합니다.
- 치아에 나 멜의 약 1 밀리 그램 다이아몬드 크리스탈 주걱을 사용 하 여 샘플 챔버에 배치. 낮은 및 샘플, 게시물과 다이아몬드 격판덮개 사이 회사 연결 될 때까지 샘플 게시물 보안. 시료 챔버와 함께 또는 없이 설립 되 고 진공, 설정 또는 가용성에 따라서를 닫습니다.
- 400과 4000 cm-1사이 배열 하는 wavenumber에 대 한 64 번 샘플의 FTIR 스펙트럼을 측정 합니다. 복제의 원하는 수 따라 달라 집니다, 연구의 목표에 불구 하 고 다음 주택 샘플, microcentrifuge 튜브에 반환 되 고 다른 aliquots와 이상적으로 3 복제의 분석 강력한 결과 보장 한다.
- 각 약 수 사이 고 각 샘플 사이의 메탄올과 주걱을 청소.
- 사용 가능한 소프트웨어를 사용 하 여 기본 보정을 수행 합니다. 소프트웨어는 자동으로 샘플 챔버 배경을 결과 연결 프로필에서 뺍니다. 더 나은 재현성을 보장 하기 위해, ~1035 c m-1 에서 가장 높은 인산 염 밴드에 0.06의 최소 흡 광도와 나 멜 스펙트럼만 계정에 취해야 한다.
- 711 c m-1에서 피크를 확인 하 여 모든 샘플에서 일반적인 보조 오염 탄산 방해석의 존재를 모니터링 합니다.
- 분석에 따라 신중 하 게 주걱 또는 흡입 장치를 사용 하 여 그들의 microcentrifuge 관에 샘플을 반환 하 고 전처리 또는 분석의 다음 단계에 걸릴.
- 원시 파장 및 강도 데이터를.csv 파일로 (또는 유사한) 내보내고 관심의 인덱스를 계산에 사용 (일반적으로 사용 되는 인덱스는 A 사이트 인산 인덱스, B 사이트 인산 인덱스, 인산 염 결정 지, 인산 인덱스에 물 아 미드 및 공동3/PO4 17,,1819색인) (표 1).
- 비교는 FTIR 화석 또는 고고학 견본에서 결과 지금 성장 하 고 현대 faunal 치아에 나 멜의 데이터 집합 문학19,20 에서 사용할 수 있는 자연과 diagenetic 변경의 범위를 결정 하는 에 나 멜 샘플링입니다.
4. 간단한 초 산 (0.1 M) 전처리
- 각 샘플에 대 한에 나 멜 파우더 적절 한 균형을 사용 하 여 microcentrifuge 튜브에 무게. 튜브를 따라 레이블을 지정 합니다. 에 나 멜 파우더 비슷한 크기의 입자와 같은 정도로 접지 해야 합니다.
참고: 많은 연구자 활용 희석 표 백제 (NaClO) 같은 산화 대리인, 또는 30% 과산화 수소 (H2O2) 샘플 및 이것에서 생명체를 제거 하는 시점에서 추가 되어야 합니다. 그러나, 뿐만 아니라 이러한 시 약 변경 안정적인 탄소 및 산소 동위 원소 값은 샘플의 수 있지만 온라인 가스 준비 및 도입 시스템에서 뼈 콜라겐 샘플의 스펙트럼 보여 100% 인산 탄산에 활용 측정 유기 샘플 (그림 5),이 단계가 필요 하지 않습니다 제안 반작용 하지 않는다. - 피 펫을 사용 하 여 각 샘플을 0.1 m M 초 산 (에 나 멜의 1 밀리 그램) 당 0.1 mL를 추가 합니다. 피펫으로와 샘플을 만지지 마십시오. 샘플 및 피 펫 접촉으로와 서, 다음 샘플에 대 한 새로운 피 펫을 사용 하 여 교차 오염을 방지.
- 선동, 떨고 또는 전자 교 반기 (그림 3)를 통해 고 다음 앉아 10 분에 나 멜 파우더 하지 맡겨야 한다 아세트산에 시간의 연장된 기간에 대 한 대 한 샘플 (> 4 h).
- 13,700 x g에서 2 분 동안 microcentrifuge에서 샘플을 놓습니다.
참고: 값이 싼 대안 3500 x g는 적은 샘플을 보유 하 고 있지만 큰 샘플 세트를 다룰 때 시간이 덜 소모 되는에서 4 분에 대 한 미니 원심 분리기의 사용 이다. - Microcentrifuge 프로그램 중지, 초 산 2 mL의 초순 13,700 x g 2 분에 대 한 예제는 깨끗 한 피 펫, 다음 microcentrifuge을 사용 하 여 바꿉니다.
- 두 번 더 전에, 초순 수를 변경 하 고 중립성에 대 한 테스트. (방해는 상쾌한) 없이 피 펫을 사용 하 여 나머지 액체를 제거 합니다.
참고: 초순와 3 개의 세척 총 중립성을 표준 절차입니다. 중립성에이 때까지 샘플을 세척 한다. - 시트 Parafilm (1 cm × 1 cm)의 고 각 microcentrifuge 튜브 위에 놓습니다. 샘플을 적절 하 게 건조 되도록 날카로운 개체를 사용 하 여 중앙에 작은 구멍을 확인 합니다.
- 어떤 남아 있는 액체를 제거 하는 건조 기 동결에 튜브를 놓습니다.
참고: 동결 건조 기, 부드러운 오븐 없으면 건조 (40 ° C) 또한 가능성 이며 안정적인 탄소 및 산소 동위 원소 데이터에 어떤 악영향을 하지 말았어야. - 일단 건조, 제거는 Parafilm 고 microcentrifuge 뚜껑을 닫습니다. 튜브 라벨 인지 정확한 확인 및 필요한 경우 다시 쓰기.
참고: 이것은 밖으로, 제한 된 자금으로 실험실에서 다른 분석에 대 한 샘플 배포 전에 마지막 무대 될 수 무게에 대 한 스토리지 이전 마지막 단계.
5. 계량 및 측정 샘플 및 표준
- 0.001 mg (그림 6)에 민감한 균형에 주석 디스크에에 나 멜 가루 약 2 m g으로 무게는 주걱을 사용 하 여. 인산의 산 성-붕 규 산 유리 약 병에 샘플을 신중 하 게 전송 다음. 에 나 멜의이 금액은 치아에 나 멜에 탄산의 상대적으로 작은 비율 때문에 신뢰할 수 있는 결과 얻을 하는 데 필요한.
- 메탄올을 사용 하 여 샘플 사이 주걱을 깨끗 한 신선한, 깨끗 한 디스크를 사용 하 여 또는 선박 각 샘플에 대 한 무게.
- IAEA NBS18, IAEA 603, IAEA CO8, 또는 머 CaCO3등 국제 표준의 0.2 밀리 그램을 무게. 사내 표준 큰 치아의 무 균된에 나 멜에서 만든 잘20으로 사용할 수 있습니다. 76 샘플 및, 사용 61 샘플 및 15 표준의 전체 실행에 대 한이 균등 하 게 배포 해야 전부에 실행. 여러 연구 결과 적절 한 수의 표준 및 고고학 연구20,28세부 사항을 보고 했다.
참고: 반복된 전처리 및 집 표준, 고고학 샘플의 실행의 수에에서에 나 멜의 분석은 정확도의 적절 한 측정을 제공 하는 공부 되 고 샘플에 대 한 것도20. - 심장은 아니지만 꽉 빨려는 유리병까지 바늘을 액세스할 수 있는 특수 설계 된 뚜껑을 조입니다. 할 하지 통해 조여 뚜껑 심장에 압력 너무 강한 얻을 것 이다 하 고 궁극적으로 부러진된 바늘 분석 하는 동안 발생할 수 있습니다. 70 ° c.에가 열 블록 내에 나열 된 순서로 튜브를 배치 컴퓨터 소프트웨어에 순서와 샘플의 무게를 안정적으로 기록 합니다.
- 3 단계에 따라 샘플을 측정: 1) 플러시 순수한 헬륨으로 샘플을 작성, 2) 추가 인산 3) 샘플 측정.
- 순수한 헬륨 (학년 5.0) 주변 공기를 밖으로 플러시를 5 분 동안 100 mL/min의 흐름으로 샘플을 플러시.
- 인산의 4-5 방울을 추가 (99%, 밀도가 1.85 g/mL) 탄산이 포함 된 샘플을. 샘플 H3포4 사이의 반응을 시작합니다. 반응, 동안 CO2 는 동위 원소는 탄산염 이온 CO32- 샘플의 값을 운반 해제.
- CO2 의 평형에 도달할 때까지 샘플 당 1 시간을 기다립니다. 1 시간 후 신뢰할 수 있는 결과 얻으려면 샘플을 측정 한다. 동안에 수집, 샘플 가스와 장치에 그 패스의 혼합물. 건조 단계 샘플 가스 혼합물에서 물을 제거합니다.
- 알려진된 동위 원소 성분과 CO2 참조 가스의 세 봉우리로 시작 하 여 샘플을 측정 합니다. 피크 강도 4000 mV (사이 4000 8000 mV) 샘플 봉우리의 강도 일치 하도록 해야 합니다. 3 참조 가스 봉우리 20 s 길고 30 s 떨어져 해야 합니다. 샘플의 측정 간격을 정의로 따라. 10 회 5 대 한 샘플 측정 각 s와 55 s 떨어져. 피크 높이 나타내는 샘플/헬륨 혼합물 (그림 5)의 적절 한 전송 시간이 지남에 감소를 확인 합니다.
참고: 측정, 동안 소프트웨어 계산 샘플의 동위 원소 구성 알려진된 동위 원소 값, 피크 높이 및 피크 높이 참조 가스의 피크의 면적 및 샘플의 봉우리의 면적을 비교 하 여 합니다. 원시 13C /12C와 18O /16O 구성 샘플의 계산 됩니다.
- 측정 후 샘플을 정상화.
참고: 이것은 중요 참조 가스 샘플 가스 질량 분석기에 도입 하는 경우와 동일한 화학 및 물리적 경로 받아야 하지 않는다 하기 때문에. 따라서, 샘플 또한 국제 표준 (단계 5.3)는 동일한 육체 및 화학 치료를 받을 실행 내에서 자체 샘플으로20에 보정은 필수적 이다. 이러한 국제 탄산 표준 국제 델타 측정 비율에 샘플 2-포인트 캘리브레이션 및 정밀도와 반복성을 실행에 걸쳐 평가 활성화합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
위의 샘플 프로시저를 사용 하 여 증분에 나 멜 bioapatite 샘플 준비 되었다. 에 나 멜에서 bioapatite의 분석은 샘플링, 대량 또는 증분의 정확도에 따라 달라 집니다. 이 경우에, 다른 기후 지역에서 고 고 학적 샘플 (2 개 양)의 결과를 선택 했습니다. 증분 샘플 양 두 번째 어 금 니에서 분석 및 ERJ (그림 4)에서 시작을 표시 했다. 증분 샘플 위치 번호가 있었다, 그리고 각 위치 ERJ (그림 7)에서 m m의 거리로 측정 되었다.
다양 한 탄소와 산소 두 양 안정 동위 원소 결과 그들은이 다른 환경에서 살 았 확인 경우 열 대 초원 (A) 및 온화한 건조 스텝 초원 (B), 각각. 양 쇼 3.3 5.1‰, 제안 유사한 동위 원소 값으로 물 소스의 섭취와 강수량 (그림 8)에서 강한 계절 교대의 부족 사이 좁은 범위에 대 한 증분 δ18O 값입니다. 반면, 양 B에 대 한 δ18O 값 ─5.2에서 ─13.1‰, 강 수에 강한 계절 변화를 나타내는 이르기까지 변화의 높은 진폭을 있다. 안정적인 탄소 동위 원소 값 제안 양 B 양 주로 C3 식물을 섭취 하는 동안 C4 식물의 주로 구성 된 다이어트는 데 샘플 사이 섭취 한 식물에 강한 차이. 이러한 양 특히 증분 산소와 탄소 안정 동위 원소 결과에 분명 환경 변화를 설명 하기 위해 선택 되었다.
인간의 치아 성장 축 왕관에는 ERJ에서 유사 하 게 샘플링 됩니다. 증분 δ18O 및 열대우림 환경에서 인간의 치아에 대 한 δ13C 값은 매우 제한, 2‰ 범위 내에서. 이 사기 질 강화 작용 (그림 9)의 기간 동안 채집 전략에 변화의 부족을 건의 한다.
그림 1: 드릴링 치아. (A) 설정 장비에 교 련된 되 고 치아의 사진. (B)에 나 멜 파우더 깡통 호 일에 수집 되 고 (와 함께 적절 한 레이블) 1.5 mL 마이크로 원심 관에 배치의 사진. (C) 다른 드릴 비트 증분 샘플링에 사용할 수 있는 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 장비 설정 최대 사진 장비 자리에 드릴으로 설정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 샘플 준비. 마이크로 원심 관으로 배치 하 고 화학 물질 추가 된 후 소용돌이에 동요 되 고 샘플. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 증분 양 치아 샘플. 양 치아 (A와 B) 샘플링 증분 된. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: gasbench 실행의 크로마. 시간이 지남에 참고 가스 봉우리와 샘플 봉우리의 강도 표시 한 샘플의 크로마의 사진. 검색 된 대 중 44, 45 및 46 있습니다. 처음 세 개의 봉우리는 CO2 참조 가스 봉우리 알려진된 동위 원소 구성. 그 다음 10 개의 봉우리는 샘플 봉우리 강도 감소. 봉우리 봉우리 사이의 엄격한 차별 되도록 몇 초 항상 구분 합니다 및 따라서 깨끗 한 피크 통합. 피크 탐지의 각 피크 상태 시간 (들) 위에 번호. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 샘플 탄산염 무게. 주걱을 사용 하 여 유리 튜브에가 중 되 고 샘플 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: 양 치아에 증분 샘플. 크라운의 상단에는 ERJ에서 치아의 성장 축 따라 증분 샘플 탄소와 산소 안정 동위 원소 값 플롯. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8: 양에 나 멜 동위 원소 결과 탄산염. 두 개의 증분 샘플된 양 치아에 대 한 산소와 탄소 동위 원소 값 안정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 9: 인간에 나 멜 동위 원소 결과 탄산염. 안정적인 산소와 탄소 동위 원소 값 증분 샘플링된 인간의 치아에 대 한. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| PCI (인산 염 결정 지) |  |
Sponheimer와 리-소프, 1999b |
| 다른 이름: | ||
| CIIR (화도 인덱스 적외선) | Shemesh, 1990 | |
| IRSF (적외선 요소 분할) | 이너와 바-요세프, 1990 | |
| BPI (인산 인덱스 B-탄산) |  |
LeGeros, 1991 |
| API (인산 색인에서 A-탄산) |  |
Sponheimer와 리-소프, 1999b |
| 바이 (B-A 사이트 탄산의 상대적인 양) |  |
Sponheimer, 1999; Sponheimer와 리-소프, 1999b |
| WAMPI (인산 인덱스에 물-아 미드) |  |
로슈 외., 2010 |
표 1: bioapatite에 나 멜의 크리스탈 화학 속성 특징 경험적 인덱스. Sponheimer (1999 년), Sponheimer 리-소프 (1999 년), 로슈 외 에서 경험적 인덱스를 사용 하는 것이 좋습니다. (2010 년) bioapatite에 나 멜의 크리스탈 화학 속성 특성.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
(대량과 증분) 성공의 전에 치열의 지식에 대 한 액세스에 의존 드릴링 기술 및 샘플 준비, 상대적으로 저렴 한 장비에 대 한 투자와 함께. 이러한 문제는 쉽게 넘을 때 명확한 지침에 관한 샘플링 및 전처리 방법 사용할 수 있습니다. 이 문서에서는 이러한 방법에 새로운 연구에 대 한 명확 하 고 간결한 방식에서를 전파 하겠습니다. 처음으로 이러한 방법을 적용 하는 학자 분석 및 귀중 한 고고학과 고생물학 샘플의 샘플링 하기 전에 액세스할 수 현대 동물에 연습 해야 합니다.
인간과 동물의 치아에 나 멜 탄산 안정 동위 원소 분석을 위한 샘플링은 여러 실험실에서 시행 된 간단한 절차입니다. 그러나, 기술 연구소에 의해 변화 하 고 공개적으로 공유 되지 않은 내부 기술 지식의 광범위 한 집합에 포함 되어야 하는 치열의 시추와 관련 된 기술에 대 한 경향이 있다. 증분 샘플링 식이 섭취에 상세한 내부 개별 변이의 식별 및 물 섭취를 허용 하는 주요 이점이 있다. 이 강력한 식이로 다른 지역에서 개인 간의 차이점은 표시 하 고 환경 정보 치아에 나 멜 bioapatite에서 유지 됩니다. 우리의 대표적인 데이터에서 중요 한 동위 원소 변이 온화한 건조 스텝 초원 (그림 8)에서 양에 비해 열 대 초원에서 양 사이 분명 하다.
프로토콜 내에서 중요 한 단계는 시추에서 정확도, 치아에 나 멜, 그리고 전처리 기법의 보존 관련이 있습니다. 드릴링, 작은 부정확 등 치아 dentine에 나 멜을 통해 될 수 있습니다 매우 변수 동위 원소 측정29. 치아에 나 멜의 보존 방법 설명한 연결 설정 뿐 아니라, 주어진된 샘플의 예상된 탄산 비율을 포함 하 여 다양 한 통해 확인할 수 있습니다. 연구원은 특히 여부 물 로그 또는 산 성 토양, 화석 치아에 나 멜의 구조 보존에 영향을 미칠 수 있는 매장 환경 실험실에 게 또한 한다. 치아에 나 멜의 경도 시추 하는 동안 분명 하 게 될만 수 보존의 초기 지표로 서 간주 되어야 합니다. 에 나 멜은 부드럽고 쉽게 드릴 bioapatite 결정 격자 성능이 저하 될 수 있습니다 및 FTIR와 검사 되어야 한다 또는 다른 수단 문학30에서 보고 나왔다. 샘플 전처리에 변화는 치아에 나 멜21,22에 제한 된 동위 원소 변이 귀 착될 것으로 보인다. 따라서, 우리 간단한 프로토콜의 사용을 제안 (예., 0.1 m M 미만 4 h 증류수로 세척 하 여 다음에 대 한 초 산).
샘플링 설계와 해석 기술, 몇 가지 제한이 있습니다. 연속 샘플을 시추 하는 것은 마스터에 시간이 좀 걸립니다 기술 이다. Taxa 및 분석 하기 위해 치아의 명확한 이해를 공식화 하는 샘플링 디자인2,25에 필수적 이다. 또한, 샘플의 드릴링 상당한 완료 하는 데 시간이 걸릴 수 있습니다. 그러나, 결과 탄소 및 산소 안정 동위 원소 값 순차적 샘플링된 치열에 대 한 식이 및 환경 변화를 추적 하는 연구원을 수 있습니다. 이러한 변화는 고 대 기간에 종종 자연 계절 변화, 관련 동위 원소 참조 세트에 변화의 이해 내 contextualized 사려깊은 해석이 연구6필수 있습니다.
문서에서 우리 증분 샘플링 증명 하 고 인간 및 양 치열의 샘플링을 대량. 또한, 우리 연구원 두 샘플 집합에 대 한 전처리 방법에 지시합니다. 증분 샘플링 방법을 성공적으로 비슷한에 나 멜 성장 및 강화 된 고 대와 현대 동물에 적용할 수 있습니다 (예., 가축 및 말). 전처리는 문서와 같이 나 멜 bioapatite의 고 대 유적의 횡단면에서 샘플에 사용할 수 있습니다. 우리의 샘플링 절차에서 가장 중요 한 교훈을 대량 이며 쉽게 문서에 설명 되지 않습니다 치열의 증분 샘플링. 다른 고고학 동위 원소 샘플링 및 전처리 방법 추가 데모 민주화 수 (예., 콜라겐 추출 또는 지방산의 안정 동위 원소 측정에 대 한 고고학 도자기의 샘플링 뼈) 강화는 지식과 기술이이 분야에서의 확산입니다. 그러나 이러한 민주화 해서는 안 된다,, 상담 전문가, 또는 사용할 수 있는 문학, 측정 및 주어진된 컨텍스트20,28해석의 기준을 확립에 대 한 완전 한 교체로 볼 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 충돌의 관심을 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 자금에 대 한 최근 설정으로이 연구를 학과 고고학, 막스 플랑크 연구소에서 안정 동위 원소 실험실의 인류 역사의 과학에 대 한 최대 플랑크 사회를 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dremel Micro | Dremel | https://www.dremel.com/en_US/products/-/show-product/tools/8050-micro | |
| Diamond-tipped drill bit | Dremel | https://www.dremel.com/en_US/products/-/show-product/accessories/7122-diamond-wheel-point | |
| 1.5 mL micro-centrifuge tube | Sigma Aldrich | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t2422?lang=de®ion=DE&gclid=EAIaIQ obChMI7pHRpauW2QIV77ftCh1p1 wjhEAAYASAAEgKzkvD_BwE |
|
| Methanol | Linear Formula: CH3OH | ||
| Acetic Acid | Linear Formula: CH3CO2H | ||
| Dremel rig set-up (workstation) | Dremel | https://www.dremel.com/en_US/products/-/show-product/tools/220-01-workstation | |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/75002401 | |
| Mini-centrifuge | Sprout | http://www.heathrowscientific.com/sprout-mini-centrifuge-4 | |
| Freeze drier | Zirbus Technology | http://www.zirbus.com |
References
- Balasse, M. Reconstructing dietary and environmental history from enamel isotopic analysis: time resolution of intra-tooth sequential sampling. International Journal of Osteoarchaeology. 12 (3), 155-165 (2002).
- Balasse, M. Potential biases in sampling design and interpretation of intra-tooth isotope analysis. International Journal of Osteoarchaeology. 13 (1-2), 3-10 (2003).
- Lee-Thorp, J. A. On isotopes and old bones. Archaeometry. 50 (6), 925-950 (2008).
- Clementz, M. T. New insight from old bones: stable isotope analysis of fossil mammals. Journal of Mammalogy. 93 (2), 368-380 (2012).
- Loftus, E., Roberts, P., Lee-Thorp, J. A. An isotopic generation: four decades of stable isotope analysis in African archaeology. Azania: Archaeological Research in Africa. 51 (1), 88-114 (2016).
- Ventresca Miller, A. R., Makarewicz, C. Isotopic approaches to pastoralism in prehistory: Diet, mobility, and isotopic reference sets. Isotopic Investigations of Pastoralism in Prehistory. , 1-14 (2018).
- Hollund, H. I., Ariese, F., Fernandes, R., Jans, M. M. E., Kars, H. Testing an alternative high-throughput tool for investigating bone diagenesis: FTIR in attenuated total reflection (ATR) mode. Archaeometry. 55 (3), 507-532 (2013).
- LeGeros, R. Z. Calcium phosphates in oral biology and medicine. Monographs in oral sciences. 15, 109-111 (1991).
- Lee-Thorp, J. L., Van Der Merwe, N. J. Carbon isotope analysis of fossil bone apatite. South African Journal of Science. 83 (11), 712-715 (1987).
- Cerling, T. E., Harris, J. M. Carbon isotope fractionation between diet and bioapatite in ungulate mammals and implications for ecological and paleoecological studies. Oecologia. 120 (3), 347-363 (1999).
- Koch, P. L. Isotopic study of the biology of modern and fossil vertebrates. Stable Isotopes in Ecology and Environmental Science. , 99-154 (2007).
- Nelson, S. J. Wheeler's Dental Anatomy, Physiology and Occlusion-E-Book. , Elsevier Health Sciences. (2014).
- Tsutaya, T., et al. From cradle to grave: multi-isotopic investigations on the life history of a higher-status female from Edo-period Japan. Anthropological Science. 124 (3), 185-197 (2016).
- Sponheimer, M., Passey, B. H., De Ruiter, D. J., Guatelli-Steinberg, D., Cerling, T. E., Lee-Thorp, J. A. Isotopic evidence for dietary variability in the early hominin Paranthropus robustus. Science. 314 (5801), 980-982 (2006).
- Lee-Thorp, J., Sponheimer, M. Three case studies used to reassess the reliability of fossil bone and enamel isotope signals for paleodietary studies. Journal of Anthropological Archaeology. 22 (3), 208-216 (2003).
- Zazzo, A. Bone and enamel carbonate diagenesis: a radiocarbon prospective. Palaeogeography, Palaeoclimatology, Palaeoecology. 416, 168-178 (2014).
- Sponheimer, M. Isotopic paleoecology of the Makapansgat Limeworks fauna (Australopithecus africanus, South Africa). , (1999).
- Sponheimer, M., Lee-Thorp, J. A. Alteration of enamel carbonate environments during fossilization. Journal of Archaeological Science. 26 (2), 143-150 (1999).
- Roche, D., Ségalen, L., Balan, E., Delattre, S. Preservation assessment of Miocene-Pliocene tooth enamel from Tugen Hills (Kenyan Rift Valley) through FTIR, chemical and stable-isotope analyses. Journal of Archaeological Science. 37 (7), 1690-1699 (2010).
- Roberts, P., et al. Calling all archaeologists: guidelines for terminology, methodology, data handling, and reporting when undertaking and reviewing stable isotope applications in archaeology. Rapid Communications in Mass Spectrometry. , (2018).
- Snoeck, C., Pellegrini, M. Comparing bioapatite carbonate pre-treatments for isotopic measurements: Part 1-Impact on structure and chemical composition. Chemical Geology. 417, 394-403 (2015).
- Pellegrini, M., Snoeck, C. Comparing bioapatite carbonate pre-treatments for isotopic measurements: Part 2-Impact on carbon and oxygen isotope compositions. Chemical Geology. 420, 88-96 (2016).
- Wright, L. E., Schwarcz, H. P. Stable carbon and oxygen isotopes in human tooth enamel: identifying breastfeeding and weaning in prehistory. American Journal of physical anthropology. 106 (1), 1-18 (1998).
- Roberts, P., et al. Fruits of the forest: Human stable isotope ecology and rainforest adaptations in Late Pleistocene and Holocene (∼ 36 to 3 ka) Sri Lanka. Journal of human evolution. 106, 102-118 (2017).
- Zazzo, A., Balasse, M., Patterson, W. P. High-resolution δ13C intratooth profiles in bovine enamel: Implications for mineralization pattern and isotopic attenuation. Geochimica et Cosmochimica Acta. 69 (14), 3631-3642 (2005).
- Sydney-Zax, M., Mayer, I., Deutsch, D. Carbonate content in developing human and bovine enamel. Journal of dental research. 70 (5), 913-916 (1991).
- Rink, W. J., Schwarcz, H. P. Tests for diagenesis in tooth enamel: ESR dating signals and carbonate contents. Journal of Archaeological Science. 22 (2), 251-255 (1995).
- Szpak, P., Metcalfe, J. Z., Macdonald, R. A. Best practices for calibrating and reporting stable isotope measurements in archaeology. Journal of Archaeological Science: Reports. 13, 609-616 (2017).
- Wright, L. E., Schwarcz, H. P. Correspondence between stable carbon, oxygen and nitrogen isotopes in human tooth enamel and dentine: infant diets at Kaminaljuyu. Journal of Archaeological Science. 26 (9), 1159-1170 (1999).
- Schoeninger, M. J., Hallin, K., Reeser, H., Valley, J. W., Fournelle, J. Isotopic alteration of mammalian tooth enamel. International Journal of Osteoarchaeology. 13 (1-2), 11-19 (2003).
