Summary
메쉬 전자 프로브는 완벽 하 게 통합 하 고 뇌 내에서 기록 하는 안정, 장기, 단일 신경 수준 제공 합니다. 이 프로토콜 메쉬 전자를 사용 하 여 실험에 대 한 vivo에서 , 바늘, stereotaxic 주입, 입/출력 인터페이스, 녹음 실험, 및 조직의 메쉬를 포함 하는 조직학에 로드 메쉬 제품의 제조와 관련 된 조사 합니다.
Abstract
삽입형 뇌 생리학 프로브는 얕 고 깊은 뇌 영역에서 spatiotemporal 고해상도 신경 활동을 기록 하 신경 그들의 능력 때문에 귀중 한 도구입니다. 그러나 그들의 사용을 방해,, 기계 및 구조 조사와 뇌 사이 불일치에 의해 조직 그 일반적으로 이어질 micromotion 및 결과와 gliosis 신호 만성 기록 실험에서 불안정. 반면, ultraflexible 메쉬 전자의 주입 주사기 주입을 통해 다음 메시 조사 양식 gliosis 원활한는 인터페이스 주위 뇌 조직 적어도 1 년에 개별 뉴런의 안정적인 추적을 가능 하 게 날짜 표시줄입니다. 주사기-주 사용을 사용 하 여 일반적인 마우스 신경 기록 실험의 주요 단계 메쉬 메쉬 전자 제품의 제조를 포함 하 여 표준 사진 평판 기반 프로세스에서 가능한 로드 많은 대학에서 전자,이 프로토콜 세부 정보 전자 표준 모 세관 바늘, stereotaxic 주입 비보, 입/출력 표준 장비 인터페이스, 제 지 또는 녹음 세션, 자유롭게 이동 하 고 뇌의 단면 조직학 메시의 연결 망 전자 메쉬 조직 포함. 대표적인 신경 녹음 및 조직학 데이터 표시 됩니다. 수 사관이이 프로토콜에 잘 알고 그들의 자신의 실험에 메쉬 제품을 통합 하 고 노화 연구 등 장기 안정적인 신경 인터페이스에서 제공 하는 독특한 기회를 활용 하는 데 필요한 지식을 것 이다 프로세스, 두뇌 개발 및 뇌 질환의 병 인
Introduction
단일 신경 해상도 뇌 매핑 수 있는 도구 개발 신경 과학 및 신경과에 중앙 중요성의 이다. Electroencephalography (뇌 파), magnetoencephalography (멕), 기능적 자기 공명 영상 (fMRI) 등 신경 연구에 대 한 비 침범 성 기술을 인간1, 동작 두뇌 활동을 상호 연결에 대 한 귀중 한 증명 2, 하지만 그들은 구조를 공부 하 고 그들의 기본적인 마이크로미터 및 밀리초에 신경 네트워크의 확장, 각각3,4대 한 필요한 spatiotemporal 해상도 부족. 특정 electrocorticography (ECoG) 프로브 및 광학 이미징 방법 전압에 민감한 염료를 사용 하 여 단일 단위 급격히 활동 vivo에서5,6, 기록에 성공 하지만 그들은 일반적으로 근처에 효과가 있는 뇌 표면, 얕은 뇌 영역의 연구에 적용을 제한. 반면, 이식 전기 프로브 자유롭게 형광 라벨에 대 한 필요 없이 거의 모든 두뇌 지역에서 동물을 이동에 단일 신경 생리학을 측정할 수 있도록 필수적인 시스템 수준 신경 과학, 특히 반도체 산업에서 제작 기술을 밀 었 다로 채널 수백 및 수천3,7,,89으로 계산 합니다. 이러한 기능 덕택으로 이식 전기 프로브 많은 중요 한 기여를를 만들었습니다 신경 과학, 신경학, 정보 처리 시각 시스템10, 신경 치료의 근본적인 연구를 포함 하 여 파 킨 슨 병11및 뇌-기계 인터페이스 (BMIs) 고급 보 철12,13의 데모 등 장애.
그럼에도 불구 하 고, 스파이크 진폭 및 개월14,15 주 날짜 표시줄에 불안정 한 신호 감소로 각 성 하는 장기적인 불안정 삽입형 프로브 상대적으로 단기간의 연구에의 적용을 제한 했다 현상, 뇌 노화 및 개발 크게 답이 같은 질문을 떠난다. 장기적인 불안정 한계는 기존의 프로브 및 크기, 역학, 그리고 토폴로지14,15,,1617,18에 뇌 조직 사이 불일치의 결과. 크기, 측면에서 신경 시 냅 스 및 somata 약 수십 나노미터 직경19, 마이크로미터에 각각, 전통적인 프로브는 종종 실리콘 microelectrode 배열 경우 상당히 큰 > 4 번 하나의 신경 세포 체7,8의 크기입니다. 이러한 프로브의 비교적 큰 크기 자연 구조 및 조밀한 신경 조직, 따라서 만성 면역 반응에 기여 하 고 perturbing 공부 되 고 신경 회로의 연결 중단 될 수 있습니다. 기계적 특성 측면에서 전통적인 프로브는 크게 있는 그들은 이식 되; 매우 부드러운 신경 조직 보다 엄격한 심지어 "유연한" 프로브 폴의 10-20 µ m 두꺼운 시트에서 만든 적어도 100000 번 뇌 조직20,21보다 엄격한 있습니다. 굽 힘 강성이이 불일치 하면 신뢰할 수 없는 단일-단위 확장된 녹음 하는 동안 추적 하 고 이식 사이트에서 만성 gliosis 유도로 이어지는 프로브 및 뇌 조직 사이 상대 기울이기 모션. 마지막으로, 기존의 뇌 프로브 토폴로지 구조 반드시 조직의 단단한 볼륨을 제외합니다. 토폴로지 같은 불일치 신경 회로의 연결을 방해, 신경, 폐해 셀 및 뇌 조직22, 내 혈관의 자연 3 차원 (3D) interpenetrated 배포 하는 걸로 고의 3D 전송 방해 신호 분자23. 함께, 기존의 프로브의 이러한 단점 단일 신경 수준에서 경도 신경 과학 연구 및 임상 응용 프로그램 모색 장기 호환성 부족 그들을 만들었습니다.
이러한 단점을 극복 하기 위해 우리는 "조직 같은" 신경 프로브 나 메쉬 전자16,,2124의 새로운 패러다임을 개발 하 여 신경 및 전자 시스템 사이의 라인을 흐리게 하고자 결정 했다. 메쉬 전자 신경 조직, 마이크로미터 크기 규모 같은 나노미터의 뇌 조직, 그리고 (3) 3D의 그들과 유사 하 (2) 기계적 성질 (1) 구조 기능을 통합 하 여 크기, 역학, 그리고 토폴로지에 위의 일치 문제를 해결 macroporous 토폴로지 > 90% 공간 열고 따라서 신경 세포와 extracellular 환경을 통해 분자의 확산에 의해 상호를 수용 한다. 메쉬 전자 프로브는 주사기와 바늘, 깊은 두뇌 지역21,25에 이식 하는 동안 최소한의 심각한 피해를 일으키는 통해 특정 뇌 영역에 정확 하 게 전달 수 있습니다. 신경 소마와 축 삭을 보여왔다 주 후 사출, 전자 기록 및 주변 뇌 조직21 사이의 원활한 gliosis 무료 인터페이스 만드는 내 오픈 3D 메쉬 전자 프로브 구조를 상호 침투 , 26 , 27. 이러한 독특한 기능은 안정적으로 적어도 1 년 날짜 표시줄27이상 같은 개별 뉴런에서 급격히 활동을 추적 하는 메쉬 전자 프로브 사용. 또한, 포토 리소 그래피 (PL)에 따라 메쉬 전자 제작 포함 될 수 있습니다, 시연된 채널 조사 간단한 연락처 마스크 리소 그래피를 사용 하 여 조사 당 최대 128 개의 전극을 전극의 수의 높은 확장성을 제공 합니다. 28 그리고29전문된 장비 없이 주변 전자에 빠른 전기 연결을 허용 하는 플러그 앤 플레이 입/출력 (I/O) 디자인.
연구의 광범위 한 범위 측정 프로토콜 메쉬 전자 통합에서 혜택을 받을 수 있습니다. 대부분 intracortical 기록 실험 주사기 주입, 주입, 다음 대폭 감소 된 면역 반응을 통해 메쉬 전자의 최소 침 습 이식 절차에서 혜택을 수 있는 그리고 떠날 수 망에서 전자는 연속적인 조직학 및 각 기록 사이트를 둘러싼 생물 환경의 정확한 분석을 위한 immunostaining 조직. 특히 만성 기록 실험 메쉬 전자의 독특한 능력을 년 달에 대 한 개별 뉴런의 많은 수를 추적 하에서 가치를 파생 것입니다. 이 기능은 단일 신경 해상도 신경 회로의 경도 노화 연구, 조사 개발 두뇌, 및의 병 인에 문의 이전 실용적 되지 않은 연구에 대 한 기회를 만듭니다. encephalopathies16.
이 프로토콜에서 우리는 키 주사기-주 사용 메쉬 전자 ( 그림 1참조)를 사용 하 여 일반적인 마우스 신경 기록 실험에서 단계를 모두 설명 합니다. 설명 된 단계 로드 메쉬 전자 표준 모 세관 바늘, stereotaxic 주입 메쉬 전자에서 vivo에서,의 연결의 많은 대학에서 표준 PL 기반 프로세스 가능한 메쉬 전자 제품의 제조를 포함는 I/O를 표준 계측 인터페이스, 제 지 또는 자유롭게 이동 녹음 세션, 메쉬 전자를 포함 하는 뇌 조직의 조직학 단면 메쉬. 조직학 연구에만 메쉬 전자를 사용 하 여 일부 연구 자들은 전기 인터페이스 하 고 녹음 하 고, 어떤 경우에 그들은 그 단계를 건너뛸 수 있습니다 필요 하지 않을 수 있습니다. 이 프로토콜에 대해 스스로, 후 수 사관 메쉬 전자 그들의 자신의 실험에 사용 하는 데 필요한 모든 지식이 있어야 합니다.
Protocol
척 추가 있는 동물 주제에 수행 하는 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 하버드 대학에 의해 승인 되었다.
1입니다. 메쉬 전자 제품의 제조
참고:이 섹션에 설명 된 절차는 센터에 대 한 나노 스케일 시스템 (CNS) 하버드 대학에서 같은 표준 대학 클린 룸 시설 내 사용에 대 한 것입니다. 이 시설 뿐만 아니라 유사한 시설 예의 국가 나노기술 인프라 네트워크 (NNIN) 국립 과학 재단 (NSF)에 의해 지원 일환으로 미국의 주위에 외부 사용자가 액세스할 수 있습니다. 이러한 시설에 많은 도구, 장비, 및이 섹션에서 설명 하는 자료의 클린 룸 시설을 제공 하 고 별도 구매 필요로 하지 것 이다.
주의: 메쉬 전자 제품의 제조에 사용 되는 화학 물질의 대부분은 위험한, 저항, 등 CD-26, 리무버 PG, 수 8 개발자, Ni 솔루션을 에칭. 사용 하기 전에 이러한 화학 물질에 대 한 재료 안전 데이터 시트 (MSDS)를 참조 하십시오 및 구현 하 고 항상 적절 한 안전 조치를 따르십시오.
- 열 증발 100 깨끗 한 Si 웨이퍼에 Ni의 nm.
참고: 일반적인 증 착 매개 변수는 5 x 10-7 T의 기본 압력 및 1-2 Å/s의 속도. Ni 박막 웨이퍼에서 메쉬 전자 출시 해산 나중 것 이다 희생 계층 역할을 합니다. - 첫 번째 PL 마스크 (PL 마스크-1)를 사용 하 여 하단의 레이어 메쉬 전자 수-8 부정적인 감광 (그림 2A)의 청 정의.
참고: PL (UV) 자외선 감광 기판 위에 개최 마스크에 닦지는 표준 제작 기술입니다. 빛 하나 게 불용 성 (부정적인 저항) 또는 성 (긍정적인 저항) 기판에 노출 된 지역. 마스크는 컴퓨터 원조 설계 (CAD) 소프트웨어에서 그려지고 일반적으로 공급 업체 로부터 주문. 마스크 aligner 마스크를 기판에 기존 패턴을 정렬 하 고 자외선에 노출 하는 데 사용 됩니다. 메쉬 전자 제품의 제조는 4 개의 다른 마스크를 (마스크-4 PL PL 마스크-1) 필요합니다. 우리의 마스크 디자인 요청 또는 리소스 사이트에서 사용할 수 있습니다 meshelectronics.org.- 스핀 코트 수 8 2000.5 부정적인 감광 제 4000 rpm 400-500 nm의 대략적인 수 8 두께 웨이퍼에.
- 부드러운 빵 95 ° c.에 1 분 뒤에 65 ° C에서 1 분 열판에 웨이퍼
- PL 마스크-1 해당 하단 메쉬 수-8 레이어 하 수-8 노출 마스크 aligner에 웨이퍼를 로드 합니다. 100 mJ/cm2의 i 선 (365 nm 파장) 복용량에 노출.
- 게시물 65 ° c에서 95 ° c.에 1 분 뒤 1 분 열판에 웨이퍼를 구워
- 수-8 개발자의 쟁반에 웨이퍼를 담가. 부드럽게 교 반 하십시오 2 분에 대 한 솔루션 수-8에서 메쉬 패턴은 완전히 개발 되었습니다 때까지. 1 분 및 타격 건조 이소프로필 알코올의 쟁반에 린스.
- 열심히 구워 1 시간 동안 180 ° C에서 열판에 웨이퍼.
참고: 수-8 구은 150 ° C와 개발에 따라 250 ° C 사이 일반적으로 하드는. 하드 빵 anneals 기계적 안정성을 보장 하기 위해 수 8 개발 및 추가 crosslinks 형성 수 있습니다 어떤 표면 균열. 수-8 레이어 및 상단에 대 한 190 ° C 180 ° C에서 열심히 베이킹 수-8 레이어 메쉬 전자에 대 한 좋은 결과 생성합니다.
- PL 사용 하 여 마스크 2 금속 정의 인터커넥트 및 I/O 패드 (그림 2B).
- 300의 대략적인 간격에 대 한 4000 rpm에서 웨이퍼에 스핀 코트 LOR3A nm.
참고: LOR3A polydimethylglutarimide 기반 저항 후속 금속 절차 동안 undercutting는 속도 이다. - 5 분 동안 180 ° C에서 열판에 웨이퍼를 구워.
- 500의 대략적인 간격에 대 한 4000 rpm 스핀 코트 S1805 긍정적인 감광 nm.
- 1 분 동안 115 ° C에서 열판에 웨이퍼를 구워.
- 폭로 PL 마스크-2에 해당 하는 금속 S1805 인터커넥트 및 I/O 패드 마스크 aligner에 웨이퍼를 로드 합니다. 40 mJ/cm2의 h-라인 (405 nm 파장) 복용량에 노출.
- CD-26 감광 개발자의 쟁반에 웨이퍼를 담가. 부드럽게 교 반 하십시오 솔루션 금속 패턴을 상호 연결 될 때까지 1 분 되어 완전히 개발. 이온된 수 (DI)의 쟁반에 1 분 및 타격 건조 린스.
- 3 열 증발 Cr의 nm 뒤 80 nm Au의.
참고: 최대 5 x 10-7 T의 기본 압력 및 1 Å/s의 증 착 속도 일반적으로 최고의 영화 품질 양보. - 금속은 완전히 약화 원하는 인터커넥트 및 메쉬 전자의 I/O 패드 영역에만 금속을 떠날 때까지 약 3 h 리무버 PG의 평면 비 커에 웨이퍼를 담가. 이소프로필 알코올에 타격 건조 린스.
- 300의 대략적인 간격에 대 한 4000 rpm에서 웨이퍼에 스핀 코트 LOR3A nm.
- PL 마스크-3를 사용 하 여 정의 Pt 전극 (그림 2C).
- 1.3.1 1.3.4 통해 단계를 반복 합니다.
- 웨이퍼는 S1805 PL 마스크-3 Pt 전극에 해당 노출 마스크 aligner 로드. 40 mJ/cm2의 h 라인 복용량에 노출.
- CD-26 감광 개발자의 쟁반에 웨이퍼를 담가. 부드럽게 교 반 하십시오 1 분 솔루션 Pt 전극 패턴을 완벽 하 게 개발 되었습니다 때까지. 1 분 및 타격 건조 디의 쟁반에 린스.
- 보증금 3 전자 빔 증발을 사용 하 여 Cr의 nm 뒤 50 nm의 Pt.
참고: 일반적인 증 착 매개 변수는 5 x 10-7 T의 기본 압력 및 속도 2 Å / s. - 금속은 완전히 약화 메쉬 전자의 원하는 전극 사이트에만 Pt를 떠날 때까지 약 3 h 리무버 PG의 평면 비 커에 웨이퍼를 담가. 이소프로필 알코올에 타격 건조 린스.
- PL 마스크-4를 사용 하 여 상위 계층 메쉬 전자 수-8 부정적인 감광 (그림 2D)의 청 정의.
- 1.2.5, 통해 1.2.1 PL 마스크-4 수 8의 상단 청 메쉬 레이어를 해당 노출 제외 하 고 단계 반복 합니다.
- 열심히 구워 190 ° C 1 h에서 열판에 웨이퍼.
참고:이 온도 10 ° C 이상 수-8 (단계 1.2.6) 아래쪽의 하드 빵에 대 한. 이 온도 약간 아래쪽 수-8, 최고 수-8 레이어와 병합 하 고 따라서 단일, 연속 수 8 구조를 형성 하 리플로우됩니다.
- 메쉬 전자는 이제 완전 한 (그림 2E 및 그림 3); Ni 희생 층을 용 해 하 여 Si 웨이퍼에서 그들을 해제.
- 50 W 1 분에 산소 플라즈마와 웨이퍼를 처리 합니다. 이 산화 수-8 표면을, 그것은 친수성 고 메시 수성 솔루션에 쉽게 중단 될 수 있도록 한다.
- 평면 비 커에 결합 하 여 염 산, 염화 제 2 철, 그리고 디 1: 1의 부피 비에: 20, 각각, Ni etchant의 솔루션.
- 메쉬 전자 완전히 Si 웨이퍼에서 릴리스 되었습니다 때까지 약 3 h에 대 한 Ni 현상 솔루션의 평면 비 커에 웨이퍼를 담가.
- 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 Ni 현상에서 디의 100 mL 비 커 전자 프로브 출시 된 메쉬를 전송. 전송 망 전자 디의 신선한 비 커를 3 번 이상 rinsing 되도록.
- 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 살 균, 70% / 30% 에탄올/물 솔루션을 메쉬 전자 전송 다음 rinsing에 대 한 살 균 물 망 전자 전송 피펫으로 사용.
참고: 살 균, 후 메쉬 전자 기능화에 대 한 다른 솔루션을 전송할 수 있습니다. 예를 들어 세포 접착 증진, 메쉬 전자 폴 리-D-lysine (1 mg/mL) 24 h의 수성 해결책을 전송할 수 있습니다. - 메쉬 전자 전송 파스퇴르 피 펫 멸 균 1 x 인산 100 mL 비 커에 프로브를 사용 하 여 주입 비보전에 식 염 수 (PBS)를 버퍼링 합니다.
2. 바늘에 메쉬 전자 로드
- 으로 구입한 피 펫 홀더 양쪽 끝에 흐름에 열려 있다. 주사 (그림 4A) 동안 누설 이므로 에폭시, 원형 나사 패스너 반대 끝 인감. 계속 하기 전에 강화 에폭시를 하자.
- 유리 모 세관 바늘 피 펫 홀더에 삽입 합니다. 원형 강화 나사와 콘 세탁기 (그림 4B)를 사용 하 여 장소에 그것을 고정. 400 µ m 내부 직경 (650 µ m 외부 직경) 유리 모 세관 바늘이이 프로토콜에 대 한 사용 되었다. 다른 모 세관 바늘 재료 (예., 금속)와 직경 사용 될 수 있지만 injectability 되도록 메쉬 제품의 디자인을 변경 해야 할 수도 있습니다.
참고: 모 세관 바늘 150 µ m에서 1.17 m m 내경 (1.5 m m 외부 직경 250 µ m)에 이르기까지 우리의 실험실에서 사용 되었습니다. 작은 바늘을 통해 주입 가로 및 세로 수 8 메쉬 요소 간에 더 심각한 교회법의 각, 수 8 메쉬 요소의 폭 감소, 얇은 스-8를 사용 하 여 만들고는 낮은 사용 하 여 추진 될 수 있습니다 (즉,., 큰 단위 셀) 메쉬 구조. 작은 모 세관 바늘 요청 또는 리소스 사이트에서 사용할 수 있습니다 설계 된 메시에 대 한 포토 meshelectronics.org. 400 µ m의 내경 및 외경 550 µ m의 유리 모 세관 바늘 상업적으로 사용할 수 있습니다. 이러한 400 µ m 내부 직경을 필요로 메쉬과 호환성을 유지 하지만 그들은 여기에서 설명 하는 연구를 위해 사용 되지 않은 동안 주입으로 인 한 심각한 조직 손상을 줄일. - 1 mL 주사기 모 세관 튜브의 2-4 cm 길이 사용 하 여 피 펫 소유자의 쪽 콘센트에 연결 합니다.
- 메쉬 전자를 포함 하는 PBS의 100 mL 비 커에 유리 모 세관 바늘을 삽입 합니다. 전자 프로브 및 수동으로 메쉬 전자 프로브 (그림 5 및 보조 비디오 1) 바늘으로 그리는 주사기를 철회 메시의 I/O 패드 근처 바늘의 끝을 놓습니다.
참고: I/O 패드 줄기 상호 연결 지역, 있으며 메쉬 장치 지역 육안으로 쉽게 식별할 수 때 메시 전자 프로브 솔루션에서 중단 된다. 올바른 방향으로 바늘에 메쉬 전자의 명확한 로딩 수 있습니다. - 푸시/당겨 바늘 내 메쉬 전자의 위치를 조정 하려면 주사기 플런저 여전히 식 염 수에 몰입 하는 동안.
참고: 가능한 바늘의 끝 가까이 ultraflexible 메쉬 장치 지역으로 이상적인 위치. 이 구성은 보장 장치 지역 먼저 주입 하 고 I/O 패드는 동안 두뇌에 마지막 주입 될 것입니다 액체의 볼륨을 최소화 합니다. - 조심 스럽게 피 펫 소유자의 측 출구에서 모 세관 튜브를 분리 합니다. 바늘 이내 메쉬 전자의 위치를 변경할 수 있는 흡입 힘을 만드는 피하기 위해 천천히 그것을 분리 합니다.
3. 살아있는 쥐의 뇌에 메쉬 전자 stereotaxic 주입
참고: 마우스 했다 75 mg/kg 케 타 민 1 mg/kg dexdomitor의 혼합물으로 복 주입으로 마 취 마 취의 정도 수술 전에 발가락 핀치 방법으로 확인 했습니다. 마 취에서 37 ° C homeothermic 담요 위에 마우스를 배치 하 여 체온 유지 되었다. 적절 한 무 균 기술은 포함 압력가 마로 소독 하 되이 국한 되지 않음 사용 전에 h 1에 대 한 모든 금속 수술 기구, 멸 균된 장갑을 사용 하 여, 수술, 불 임 분야의 유지 보수를 통해 뜨거운 비드 소독 기를 사용 하 여 수술에 대 한 구현 수술 사이트, 70% 에탄올, 플라스틱 악기의 소독 및 depilated 두 피 주위 피부 절 개 전에 iodophor 함께 준비 했다. 생존 수술, 수술의 결론 후에 대 한 antiobiotic 연 고는 상처 주위에 적용 했다 그리고 마우스 패드를가 열 하는 37 ° C를 갖춘 케이지를 반환 했다. 마우스 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복 했다 그들이 때까지 무인 남아 있었다. 마우스 최대 72 h는 수술에 대 한 0.05 mg/kg 몸 무게 마다 12 h의 복용량에 복 주입을 통해 무 통 buprenorphine를 부여 했다. 마우스 수술 후 다른 동물에서 분리 했다입니다. 마우스는 pentobarbital 270 mg/kg 몸 무게의 복용량의 복 중 주입 또는 transcardial 관류를 통해 안락사 했다 (단계 6.1 참조). 수 사관이, 외. 을 참조할 수 있습니다. 30, 커비, 외. 31및 게이지, 외 알. 32 설치류 stereotaxic 수술에 대 한 자세한 내용은.
- 마우스를 anesthetize 하 고 stereotaxic 프레임에 그것을 해결.
- 마 취에서 건조를 방지 하기 위해 마우스의 눈에 눈 윤 활 유를 적용 합니다.
- 치과 드릴 및 stereotaxic 프레임 사용 하 여 두개골에 원하는 좌표에서 craniotomy를 엽니다. 스테인레스 스틸 접지 나사 나 와이어의 삽입에 대 한 주사 사이트에서 두 번째 craniotomy를 엽니다.
- 두개골에 클램핑 기판 치과 시멘트로 수정. 절차의 뒷부분에 나오는 접는 단계의 신뢰성을 개선 하기 위해 기판에는 약 1 m m 넓은 간격을 잘라.
참고: 유연한 플랫 케이블 (FFC) 잘라는 "L" 모양 잘 작동 (그림 7A), 있지만 많은 물자 것으로 그들은 32 개 채널에 대 한 정확한 두께의 제로 삽입 강제 (ZIF) 커넥터 (0.18 ± 0.05 m m 두꺼운 케이블에 대 한 설계). - 메쉬 전자 stereotaxic 프레임 (그림 4C 와 그림 6A) 직각 끝 클램프를 사용 하 여 포함 된 바늘으로 피 펫 홀더를 탑재 합니다.
- 5 mL 주사기를 사용 하 여 주사기 펌프 (그림 6D) 고정 피 펫 소유자의 측면 콘센트를 연결할는 약 0.5-1 m 모 세관 튜브의 길이.
참고: 피 펫 소유자에 게 그것을 연결 하기 전에 모 세관 배관에 있는 아무 거품을 확인 합니다. 거품이 흐름 주입을 중단 하 고 메쉬 전자의 매끄러운, 통제 배달 되지 않도록 수 있습니다. - Stereotaxic 프레임을 사용 하 여 뇌 내에서 원하는 시작 위치에서 바늘의 팁의 위치.
참고: 여기에 사용 된 메쉬 전자 감지기는 기록 전극의 ca. 길이 걸쳐 설계 되었습니다 2 m m 및 첫 번째 전극 위치. 메쉬 전자 ( 그림 3A에서맨 왼쪽 가장자리)의 시작 가장자리에서 0.5 m m. 이러한 이유로, 시작 위치는 깊은 관심의 두뇌 지역 보다 0.5 m m 되도록 stereotaxic 좌표를 선택 합니다. 확산 및 메쉬 전자 내 기록 전극의 위치 마스크 디자인 과정에서 자유롭게 선택할 수 있습니다 하 고 그래서 그들은 그들의 stereotaxic 따라 주입으로 기록 전극 관심의 두뇌 지구에 걸쳐 선정 한다 궤적입니다. - 카메라 (그림 6B) 유리 바늘 내 메쉬 전자 프로브 상단의 표시를 배치 합니다. 일부 소프트웨어를 사용 하면 메시 전자의 원래 위치를 표시 하는 화면에 선을 그릴 수 있습니다.
- 주사기 펌프는 낮은 속도를 설정 하 고 시작을 누르면 여는 흐름을 시작 합니다. 10 mL/h 400 µ m 내부 직경 모 세관 바늘에 대 한 일반적인 시작 흐름 속도입니다. 메쉬 전자 프로브 바늘에 내에서 이동 하지 않으면 천천히 흐름 속도를 높입니다.
참고:이 주사 사이트 주변 조직에 손상을 수 뇌에 주입 하는 액체의 볼륨을 최소화 하기 위해 중요 하다. 최상의 결과 얻을 수 있습니다 사출 볼륨 미만 25 µ L의 주입된 메쉬 길이 1 mm 당. 이상적인 값은 절반이 볼륨; 우리의 실험실에서 우리는 일반적으로 10-50 µ L 4mm 주입 메쉬 길이 당 주사. - 메쉬 전자 프로브 바늘 내 이동 시작, stereotaxic 프레임을 사용 하 여 철회는 메쉬 전자 프로브는 주입 되 고, 가이드로 메쉬 전자의 표시 된 원래 위치를 사용 하 여 동일한 비율로 바늘.
참고: 시야 (FoV) 주입 방법25, 불린다이 절차 crumpling 나 탈 구 없이 하는 타겟된 두뇌 지역에 메쉬 전자의 정확한 배달에 대 한 수 있습니다. 종종 메쉬 전자 프로브 바늘에 내에서 이동 시작 되 면 흐름 속도 줄일 수 있습니다. 우리의 실험실에서 20-30 mL/h의 유량 종종 메쉬 및 모 세관 바늘 벽 사이의 정적 마찰을 극복 하는 데 필요한 있지만 속도 수 있습니다 다음 줄어들 10 mL/h 주입 과정이 시작 되 면. 흐름 속도 주입 볼륨 작은 직경 모 세관 바늘에 대 한 일반적으로 작은 수 있습니다. - 계속 흐르는 식 염 수 및 바늘 두개골 종료 때까지 바늘을 축소 합니다. 주사기 펌프에서 흐름을 중지 합니다.
4. 입/출력 인터페이스
참고:이 시점에서, 메쉬 전자 프로브는 되었습니다 주입 선택한 궤적을 따라 뇌 내에서 원하는 시작 지점에서. 바늘 철회 되 고는 바로 위에 전자 인터커넥트 메쉬 craniotomy 스패닝 두뇌에서 바늘을 I/O (그림 7B) 바늘 안에 아직도 패드. 이 섹션에서는 사용 하 여 인쇄 회로 기판 (PCB; 그림 7, 그림 8) 메쉬 전자 프로브를 인터페이스를. PCB 신경 기록 실험 머리 단 되는 절연 기판 통해 32 채널 표준 앰프 커넥터에 ZIF 커넥터를 연결 합니다. PCB는 다양 한 머리 무대 구성에 맞게 customizable 이다. 우리의 디자인 파일 요청에 의해 또는 리소스 웹사이트, meshelectronics.org, 그리고 수에서 사용할 수 있는 Pcb를 PCB 제조 및 어셈블리 서비스의 공급 업체에서 저렴 하 게 구입 하는 데 사용할.
- Stereotaxic 프레임을 사용 하 여 신중 하 게 바늘 FFC 기판 클램핑에 안내 하 고, 격차에 걸쳐 메쉬 전자에 여유를 생성 하기 위해 주사기 펌프 솔루션을 흐르는 (그림 ℃)을 상호 연결.
- 일단 바늘은 클램핑 기판 위 간격에 걸쳐, 메쉬 전자 클램핑 기판 (그림 7D)에 I/O 패드를 꺼낼 빠른 속도로 흐름을 다시 시작 합니다.
- Using 족집게와 디의 피 펫, I/O 패드 가능한 첫 번째 I/O 패드 가까운 ca. 90 ° 각으로 구 부.
참고: 굽 힘은 후속 단계에서 기판에 ZIF 커넥터에 삽입 하려면 패드를 허용 해야 합니다. ZIF 커넥터 메쉬 전자 프로브의 32 I/O 패드는 불완전 한 90 ° 굴곡, 또는 하지 발생 하는 첫 번째 I/O 패드 앞 굽이 발생 I/O 패드 ( 그림 7E의 가장 왼쪽 패드)를 차단 하는 데에 정확 하 게 동일한 폭입니다. - I/O 패드 정렬 됩니다 일단 펼친, 그리고 드라이 메쉬 줄기에 90 ° 각도로 부드럽게 흐르는 장소에 압축 공기.
참고: 메쉬 전자 미만 32 채널 프로브 수 수 인터페이싱에 동일한 32 채널 인터페이스 보드와 함께. 예를 들어 우리의 실험실 일반적으로 32 채널 PCBs와 16-채널 메쉬 전자 프로브를 사용 합니다. ZIF 커넥터, 인터페이스는 쉽게 내 여분의 공간을 제공 하는이 고 추가 uncontacted 채널 임피던스 세션을 녹음 하는 동안 테스트를 통해 오픈 회로로 쉽게 식별 됩니다. - 직선 가장자리 약 0.5-1 mm에서 I/O 패드의 가장자리에 클램핑 기판 절단. 또한 PCB 실장 32 채널 ZIF 커넥터 (그림 7 층)에 삽입을 방해 죄 기판의 외부 부분을 잘라.
- 기판에 ZIF 커넥터에 I/O 패드를 삽입 하 고 (그림 7G) 래치를 닫습니다. 채널과 성공적인 확인 접지 나사 사이의 임피던스를 측정 하기 위해 사용 측정 전자 인터페이스. 임피던스 값이 너무 높은, ZIF 커넥터를 분리, 삽입, 조정 하 고 연결 확인 될 때까지 다시 테스트.
- ZIF 커넥터를 커버 하 고 보호를 위해 치과 시멘트로 노출된 메쉬 전자 인터커넥트. PCB 기판에 간격에 대칭 이동 하 고 마우스 두개골 (그림 7 H)에 시멘트와 PCB를 수정.
주: 격차에 FFC를 절곡 때로는 전자 상호 연결 망을 벗어날 수 있는 기계적인 긴장을 감소 시킨다. - 허용을 강화, 시멘트 견고 하 고 컴팩트한 헤드-무대 기록 세션 (그림 7I) 인터페이스에 대 한 PCB를 선회.
5. 신경 기록 실험
- tailveiner 또는 다른 restrainer33에 마우스를 놓습니다. 표준 앰프 커넥터 머리 단계 PCB에 프리 앰프 PCB를 삽입 합니다. 별도 케이블을 사용 하 여 접지 참조 나사.
- 절제 된 레코딩에 대 한 마우스는 restrainer 둡니다. (그림 8A) 원하는 시간 동안 데이터 수집 시스템을 사용 하 여 데이터를 기록 합니다.
- 자유롭게 이동 하는 녹음, 프리 앰프 PCB를 삽입 하 고 접지 참조 나사 후는 restrainer에서 마우스를 놓습니다. 시간 마우스 자유롭게 작동 하는 동안 데이터 수집 시스템을 사용 하 여 (그림 8B)의 원하는 길이 대 한 레코드입니다.
- 기록 세션의 끝에, 마우스 다시 넣어 restrainer, 필요한 경우. 접지 와이어 및 프리 앰프, 제거 다음 그것의 감 금에 다시 마우스를 해제 하 고 녹음 세션 때까지 동물 시설에 반환.
6. 조직학 단면, 얼룩, 및 이미징
- 원하는 시간 후 주입 될 때까지 기다립니다, 그리고 다음 마우스를 anesthetize 및 transcardially 포름알데히드와 perfuse. 제거, 동결, 그리고 cryosection 10 µ m 두꺼운 조각으로 두뇌. Immunohistochemistry 및 설치류 뇌 조직의 cryosectioning 자세한 프로토콜 Evilsizor에서 찾을 수 있습니다 외. 34.
참고: 메쉬 전자를 포함 하는 뇌 조직 고정 및 모니터링 전자 안으로 남아 있다 하더라도 일반적으로 구분 될 수 있습니다. 이것은 구분 하기 전에 제거 해야 합니다 및 따라서 수정 하거나 수 있습니다 조직 어렵게 프로브-조직 인터페이스를 분석 하는 기존의 신경 프로브에 비해 독특한 기능 이다. - 1 x PBS에 3 번 고정된 뇌 조직 섹션 린스.
- 0.3% 트라이 톤 X-100 및 5% 염소 혈 청의 1 x PBS에 솔루션에서 섹션을 차단 합니다. 실 온에서 1 시간 동안 앉아 보자.
- 1 차 항 체의 솔루션 섹션을 품 어. 여기에 사용 되는 기본 항 체 솔루션 토끼 안티-NeuN (1: 200 희석), 마우스 방지 Neurofilament (1:400 희석), 및 쥐 안티-GFAP (1: 500 희석) 0.3% 트라이 톤 X-100 3% 염소 혈 청을 했다. 4 ° c.에서 밤새 품 어
- 1 x PBS 가진 40 분의 총에 대 한 9 번 섹션 린스.
- 이차 항 체의 솔루션 뇌 섹션을 품 어. 여기에 사용 되는 이차 항 체 솔루션 되었고 알 렉 사 Fluor 488 염소 안티 토끼 (1: 200 희석), 알 렉 사 Fluor 568 염소 반대로 마우스 (1: 200 희석), 알 렉 사 Fluor 647 염소 반대로 쥐 (희석 1: 200). 실 온에서 1 h에 대 한 섹션을 품 어.
- 1 x PBS와 함께 30 분의 총에 대 한 9 번 섹션 린스.
- Coverslips antifade mountant 사용으로 유리 슬라이드에 섹션을 탑재 합니다. 이미징 하기 전에 적어도 24 h에 대 한 어둠 속에서 슬라이드를 둡니다.
- Confocal 현미경 488를 사용 하 여 슬라이드 이미지, 561 nm, 그리고 알 렉 사 Fluor 488 위한 여기 소스로 633 nm 레이저, 알 렉 사 Fluor 568, 및 알 렉 사 Fluor 647, 각각. 메쉬 전자 이미지를 차동 간섭 콘트라스트 (DIC)을 사용 하 여 이미지 및 분석의 후속 오버레이 대 한 동일한 현미경에.
Representative Results
결과 연구 대상된 뇌 영역, 주입 이후 경과 시간, 주입, 그리고 I/O 인터페이스 절차, 다른 요인 중에서 성공 하는 동안 급성 피해 금액에 동물 종에 따라 달라 집니다. 단일 단위 급격히 활동 1 주 후 주입 및 스파이크 진폭 최대 4-6 주 동안 다를 수 있습니다 (150 µ m 내부 직경 바늘)의 경우 1 일 때까지 표시 되지 않을 수 있습니다. 그림 9 는 해 마와 성인 남성 C57BL/6J 마우스의 기본 somatosensory 피 질에 주입 하는 32-채널 메쉬 전자 프로브에서 대표적인 electrophysiological 데이터를 보여줍니다. 약 300 µ V 진폭 로컬 필드 전위 (LFPs) 모든 32 채널에 기록 되었다 고 단일 단위 급격히 활동 26 채널에 기록 했다. LFPs 및 격리 된 스파이크 사이 2, 4 개월,이 확장 된 시간 동안 녹음 전자와 뉴런 간의 매우 안정적인 인터페이스 제안 유사한 남아 있었다. 그림 10 조직학 단면 대표 결과 뇌 조직의 메쉬 전자 주입 후 1 년을 포함 하는 immunostaining를 보여 줍니다. 얼룩 NeuN, 신경 somata, neurofilament, 신경 축 삭에 대 한 표식에 대 한 표식에 대 한 암시 하는 메쉬 전자와 뇌 조직 간의 원활한 인터페이스 주사 사이트에서 조직 밀도의 손실을 거의 보여준다. GFAP (이다에 대 한 표식)에 대 한 추가 얼룩 입지 약간 만성 면역 응답을 elicits 나타내는 메쉬 전자 주위 이다의 근처-배경 수준을 보여준다.
그림 1: 주 사용 주사기의에서 단계 메쉬 전자 실험. 이 프로토콜 메쉬 전자를 사용 하 여 일반적인 설치류 신경 기록 실험의 모든 주요 단계를 설명 합니다. 실험 보통 수반, 구현, 메쉬 전자 제품의 제조 (1), (2) 모 세관 바늘에 메쉬 전자 로드의 순서에서 (3) stereotaxic 주입 메쉬 전자 두뇌, 메쉬를 인터페이스 (4) 전기 I/O 전자, (5) 구속 또는 자유롭게 이동 녹음, 그리고 (6) 메쉬/조직 단면 및 조직학에 대 한 얼룩. 일부 연구에서 조직학 데이터만 수 있습니다 수 원하는, 단계 (4) 및 (5) 어떤 경우에 생략 될 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 회로도 ultraflexible 장치 지역 (맨 윗줄)에서 플러그 앤 플레이 메쉬 전자 제조 절차를 묘사, 줄기 인터커넥트 (중간 행), 영역과 I/O 영역 (아래쪽 행). (A) 수-8 부정적인 감광 (레드) PL 마스크-1 청 각 플러그 앤 플레이 메쉬 전자 프로브의 레이어 아래 정의를 모방. PL 마스크 2, 열 증발 및 금속 이륙 (B) 패턴 정의 Au 인터커넥트 및 I/O 패드 (금). (C) PL 마스크-3, 전자 빔 증발, 및 금속 이륙 패턴화 Pt 전극 (블루) 정의 합니다. (D) 수-8 부정적인 감광 (레드) PL 마스크-4 최고의 청 레이어를 정의 하 꽃무늬. 수-8에서 구멍 각 Pt 전극 및 I/O 패드에 남아 있습니다. (E) A 완료 점선 박스 상단, 중간, 아래쪽 행에 확대 하는 위치를 나타내는 전자 프로브 메쉬. 포토 마스크 디자인 파일 요청 저자 또는 리소스 사이트에서 사용할 수 있는 meshelectronics.org. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 사진 및 플러그 앤 플레이의 광학 현미경 이미지 망 전자. (A) 플러그 앤 플레이 I/O와 주사기-주 사용 메쉬 전자 프로브의 광학 현미경 이미지를 바둑판식으로 배열. 제작 완료 단계 그림 2 에서 그러나 Ni 코팅 기판에서 릴리스 이전 후 몇 군데는 조사 했다. 점선된 상자 왼쪽에서 오른쪽 ultraflexible 장치, 줄기, 영역과 I/O 영역 각각 C, D, 및 E, 확대의 섹션에 해당 합니다. 눈금 막대 = 1 m m. (B) 20 완료를 포함 하는 3 인치 Si 웨이퍼의 사진 메쉬 전자 프로브. 눈금 막대 = 20 m m. (C) ultraflexible 장치 지역에서 20 µ m 직경 Pt 기록 전극의 광학 현미경 이미지. 눈금 막대 = 100 µ m. (D) 고밀도 Au의 광학 현미경 이미지 줄기 지역에서 상호 연결. 각 Au 상호 전기적으로 절연 이며 단일 I/O 패드에 연결 하는 단일 Pt 전극. 눈금 막대 = 100 µ m. (E) 광학 현미경 이미지 I/O 패드의. 축소 가능한 메쉬 지역 및 줄기에 있는 지속적인 박막 지역 각 패드에 의하여 이루어져 있다. 수-8 리본 비 실시 정렬을 유지 수 있도록 함께 패드의 메쉬 부분을 연결 합니다. 눈금 막대 = 200 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 주입 중 모 세관 바늘을 들고 대의 조립. 기구의 구성 요소 (A) 사진. 구성 요소 (1) 유리 모 세관 바늘, 피 펫 홀더 (2), (3) 원형 나사 패스너 피펫은 홀더, 및 (4) 피 펫 홀더에 대 한 원뿔 와셔 포함. 항목 (2) (4) 피 펫 소지자의 구입에 포함 되어 있습니다. 화살표는 에폭시와 붙어 있이 필요가 있는 피 펫 소유자의 콘센트를 표시 합니다. (B) 피 펫 홀더 어셈블리 및 유리 모 세관 바늘의 삽입 후의 사진. 추가 에폭시 (화살표로 표시) 피 펫 소유자의 최고 콘센트에서 표시 이며 (표시 되지 않음) 주사기에 피펫으로 홀더를 연결 하는 모 세관 배관. (C) 피 펫 보유자와 직각 끝 클램프와 stereotaxic 프레임에 부착 후 모 세관 바늘의 사진. 스케일 바는 1 cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 유리 바늘에 메쉬 전자 로드. (A) 플러그 앤 플레이 메쉬 전자 선적 절차의 개요 그림. 솔루션에서 정지 하는 동안 유리 바늘 메쉬 전자 프로브의 I/O 끝 가까이 배치 됩니다. 다음 주사기 플런저 메쉬 전자 프로브를 수동으로 제거 됩니다. 이상적인 위치는 바늘의 끝 안쪽 ultraflexible 장치 지역 이다. (B) 사진 (a) 해당 유리 바늘에 메쉬 전자 프로브. 스케일 바 = 2 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: stereotaxic 수술 역의 도식. 연결 된 피 펫 소유자와 동력된 stereotaxic 프레임 (A)는 원하는 두뇌 지역에 바늘을 위치 하는 데 사용 됩니다. 바늘과 로드 메쉬 전자의 위치 목표 렌즈 모니터링 카메라 (B)를 연결 하 고 컴퓨터 (C)에 표시 됩니다. 주사기 펌프 (D) 원하는 두뇌 지역에 메쉬 전자의 정확 하 고, 제어 주입 수 바늘을 통해 식 염 수의 정확한 볼륨을 흐른다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: 플러그 앤 플레이 I/O 인터페이스 절차. (A)는 FFC 기판 클램핑 치과 시멘트는 craniotomy에 인접 한 확보. (B) 플러그 앤 플레이 메쉬 전자는 stereotaxically FoV 메서드를 사용 하 여 원하는 뇌 영역에 주입. (C)는 메시의 I/O 패드와 바늘 전자 여전히 내부 조사, FFC 기판 클램핑에 위치. (D) 흐름 FFC 기판 클램핑에 I/O 패드를 꺼낼 바늘을 통해 재개 됩니다. (E) I/O 패드는 줄기, 전도 면 펼쳐 졌 하 고 장소에서 건조 기준으로 구부러진된 90 °. (F)는 FFC 기판 I/O 패드의 가장자리에서 직선 ca. 0.5 m m가 위로 잘립니다. 초과 기판 절단 떨어져 32 채널 ZIF 커넥터에 삽입을 허용 하도록. (G)는 I/O 패드는 사용자 정의 PCB에 장착 된 32 채널 ZIF 커넥터에 삽입 됩니다. ZIF 커넥터 수 있도록 폐쇄 래치는 I/O 패드와 접촉. (H) 래치 이루어 PCB는 두개골에 대칭 이동 하 고는, 그리고 PCB 치과 시멘트와 장소에 고정 되어. (나)는 PCB 세션을 녹음 하는 동안 쉽게 인터페이스 표준 앰프 커넥터와 함께 소형 headstage를 형성 한다. 스케일 바 = 1 cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8: 자제하 고 자유롭게 이동 녹음. 기록 세션 동안 restrainer에서 남성 C57BL/6J 마우스의 (A) 사진. 32 개 채널 프리 앰프 PCB 표준 앰프 커넥터에 삽입 되었습니다. (B)는 자유롭게 이동 기록 실험 중 32 채널 프리 앰프 PCB와 같은 마우스의 사진. 스케일 바 = 1 cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 9: 대표 신경 녹음 결과. (A) 대표 LFP 32 개 채널에서 열 지도 메쉬 전자 프로브 마우스 해 마와 피 somatosensory 질에 주입. 데이터는 마우스 자유롭게 2 개월 (위)와 4 개월 (아래) 후 주입에서 그것의 감 금 소를 탐험 하는 동안 기록 되었다. LFP 진폭은 오른쪽에 있는 색상 막대에 따라 색으로 구분. 하이 패스 필터링 된 추적 (블랙) 스파이크 활동을 보여주는 32 개 채널의 각는 스펙트로그램에 중첩 됩니다. (B) 스파이크 (A)에 그릴 데이터를 정렬 한 후 절연. 단일 단위 급격히 활동 32 개 채널 모두 2 개월 후 주입 (위)와 4 개월 후 주입 (아래)의 26에 발견 되었다. 스파이크의 각 클러스터 위에 숫자 (A)에 채널 번호에 해당합니다. 이 그림에서 Fu는, 외. 수정 되었습니다. 28. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 10: 대표 조직학 결과. 메쉬 전자 수평 (중간 패널) 내에서 방향을 설명 하는 (A) 회로도 및 화살 (하단 패널) 뇌 조각. (B) 형광 현미경 이미지 10 µ m 두꺼운 피 질 뇌 조각 16-채널 메쉬 전자 probe의 주사 후 1 년의. 조각은 NeuN (녹색)에 대 한 immunostained 되었습니다. (C) 같은 뇌 조각 neurofilament (빨간색)에 대 한 immunostained. (D) 같은 뇌 조각 immunostained GFAP (시안)에 대 한. (E) A 합성 이미지 (B)의 (D)를 통해 보여주는 메시 전자/조직 레이블이 NeuN neurofilament (빨간색), GFAP (녹청), (녹색), 인터페이스 그리고 전자 (파란색)을 메쉬. 바 규모 = 100 µ m. 이 그림에서 푸 외 수정 되었습니다. 27. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 비디오 1: 로드 및 솔루션으로 메쉬 전자의 주입을 반복. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
제조 및 메쉬 제품의 사용에서 모든 단계는 중요 하다, 하지만 몇 가지 특히 중요 하다. 그들의 웨이퍼에서 메쉬 전자를 방출 하기 전에 쉽게 수성 해결책 (단계 1.6.1)에 정지 하는 메시를 만들기 위해 표면 산화에 필수적 이다. 큰 볼륨을 요구 하는 경우이 단계를 생략, 메시 일반적으로 물, 바늘에 로드 하기 어렵게 그들의 표면에 부동 만약 그들이 로드할 수 있습니다, 그들은 종종 유리 바늘의 측면에 충실, (> 100 µ L) 주입을 위해. 릴리스, 그러므로, 일반적으로 의미는 메시를 사용할 수 없습니다 하기 전에 표면 산화를 실패 하 고 제조는 처음부터 다시 수행 해야 합니다. 또 다른 중요 한 단계는 구 부리는 메쉬 전자 "줄기" (단계 4.3) 인터페이스 I/O 동안 ~ 90 °. 각도가 90 ° 보다 작은 경우 다음 모든 32 I/O 패드 맞지 않습니다 ZIF 커넥터; 일부 삽입, 연결 된 전극의 수를 줄일 수 있도록 끝을 잘라 수 있을 것 이다. 프로세스 속보에서 줄기를 방지 하기 위해 부드럽게 또한 수행 합니다.
메쉬 기기 설계는 포토를 수정 하 고 그림 2에 설명 된 동일한 제조 절차를 사용 하 여 다양 한 응용 프로그램에 대 한 사용자 지정할 수 수 있습니다. 예를 들어 그림 9 에 데이터를 기록 하는 데 사용 하는 메쉬 전자 프로브 32 기록 전극을 마우스 해 마 및 기본 somatosensory 피 질 해야 하도록 설계 되었습니다, ultraflexible 메시 내에서 전극 배치 될 수 있습니다. 거의 모든 두뇌 지구를 대상으로 선택 또는 자극에 대 한 더 큰 전극 통합된27일 수 있다. 동일한 기본 메쉬 구조 및 제작 절차를 유지 하지만 전극 배치 및 디자인 연구의 요구에 맞게 조정 됩니다. 그러나 수 사관 주의 한다,, 그리고 항상 테스트 수정된 디자인 의도 바늘을 통해 쉽게 주입 수는. 메쉬 전자의 벤딩 기계에 작은 변화는 injectability에 상당한 효과 가질 수 있습니다. 1 개의 그런 보기는 가로 및 세로 수-8 리본 사이의 45 ° 각도 손 쉽 세 주입 수 메쉬 전자 프로브를 하지만 90 ° 각도 crumples 바늘21를 나 막 신을 한 결과입니다.
기록 전극의 임피던스를 측정 하는 것은 문제 해결에 유용 합니다. 20 µ m 직경 원형 Pt 전극 근처 PBS29x 1에서 또는 vivo에서 1 kHz의 주파수에서 1 m ω 임피던스 크기가 있어야 합니다. 이것 보다 훨씬 더 큰 임피던스 전극 노출 되지, 감광 제 잔여물과 오염 된 경우 발생할 수 있습니다 또는 하지 전기적 연결을 의미 합니다. 후자의 경우, 예를 들어 먼지 사진 마스크에 Au에서 분리에 결과 인터커넥트, PL 동안 또는 메쉬 I/O 패드 중 I/O 인터페이스 중 ZIF 커넥터 핀 접촉 하지는 발생할 수 있습니다. 임피던스 크기 절반 예상 값 채널 서로 병렬로 두 전극 임피던스의 회로 만드는 인접 한 누전 될 수 있습니다 제안 합니다. 측정 된 임피던스 값 가이드로 문제 해결; 하는 동안 동작 메쉬 전자 프로브 광학 현미경과 결합, 문제의 원인을 수 있습니다 일반적으로 식별 및 적절 하 게 수정 다음 제조 실행 또는 I/O 인터페이스 시도.
급성 연구 주사기-주 사용 메쉬 전자를 사용 하 여 제한 됩니다 단일 단위 급격히 활동 일반적으로 하지 1 주 포스트 주입27까지 관찰에 비록 최근 작품 (미 발표)이이 문제는 쉽게 극복 하기 보여줍니다. 메쉬는 급상승 활동 보고 하는 데 필요한 시간의 주요 결정 요인 디자인,이 기간 동안 조직 손상의 정도 영향을 미칠 메쉬 전자, 함께 두뇌와 주입, 사용 하는 바늘의 직경에 주입 액체의 볼륨 있는 주입 하 고 치유의 속도입니다. 대형 주입 볼륨 메시 전자 방출 이전에 Ni 현상;에서 산소 플라즈마로 처리 되지 않습니다 경우 필요할 수 있습니다. 메쉬 친수성 인 경우 즉, 그것은 유리 바늘을 준수 수 있습니다. 때때로, 메시 어려울 삽입 하는 기계를 절곡 이어질 결함이 있다. 메쉬 전자 로드 하는 동안 그것은 그 메쉬는 쉽고 원활 하 게 내에서 이동 바늘 ( 보충 비디오 1에서 같이) 확인 하는 것이 중요. 그렇지 않으면, 다른 메쉬 전자 프로브를 사용 해야 합니다. 원활한 신경 인터페이스에 대 한 최상의 결과 주입된 메쉬 길이 4 m m 당 10-50 µ L의 이상적인 주입 볼륨 달성 될 것입니다. 최근 결과 미세한 메쉬 전자 프로브를 주입 또는 주입 (급성 측정) 후 급상승 하는 단일 단위에서 관찰 될 수 있다 작은 직경 모 세관 바늘 (150 µ m 내부 직경, 250 µ m 외부 직경 작은) 표시 통해 더 긴 시간. 마스크 디자인 파일 이러한 미세한 메쉬 구조에 대 한 요청에 의해 또는 리소스 웹 사이트에서 사용할 수 있는 meshelectronics.org. 우리가 우리의 vivo에서 메쉬 주입 절차의 수익률은 150 µ m 내부 직경 (250 µ m 외부 직경 더 최근 작업에 대 한 80-90%에 가까운 약 70%, 수 400 µ m 내부 직경 (650 µ m 외부 직경) 바늘을 사용 하 여 전체 수익률 추정 ) 바늘. 실패에 대 한 가장 일반적인 이유는 (1) 메시 부드럽게, 주사 하지 않는다 두뇌, 필요한 수동 조작 하는 동안 (2) 메쉬 파손에 예기치 않게 큰 주입 볼륨에서 뇌 부 종 인 i/o 인터페이스 절차, 그리고 (3) 주입 하는 동안 손상 된 혈관에서 출혈이. 주입 하는 동안 혈관을 손상 하는 것은 드문 (실패의 10% 미만 원인) 감소 될 수 있는 이미지 유도 수술을 사용 하 여 추가. 우리는 또한 혈관의 손상 transfection 바이러스 성 입자의 주입, 딱딱한 뇌 프로브, 주입 및 메쉬 전자의 주입을 포함 하 여 뇌 조직의 침투를 포함 하는 모든 절차의 일반적인 한계는 참고.
메쉬 전자 프로브 에서처럼 그림 9 와 그림 10, 각각 수 안정적으로에서 기록 추적 같은 개별 뉴런에 적어도 개월 1 년 계획을 하 고 거의 만성 면역 반응을 보여주고 있습니다. 이 대회 깊이 전극, 일반적으로 스파이크 진폭, 불안정 한 신호, 및 만성 염증을 감소 하는 장기 실험14, 기록의 과정에서 고통에 비해 상당한 우위를 나타냅니다. 15. 또한, 메쉬 전자 그들은 남아 있을 수 있습니다 조직에서 조직학 단면 중 얼룩, 이미징, 기존의 프로브, 달리는 너무 경직 된 장점 있고 따라서 조직학 전에 제거 해야 합니다 분석입니다. 따라서, 메쉬 전자 immunohistochemical 분석을 사용 하 여 정확 하 게 각 녹음 사이트를 둘러싼 세포 환경 공부를 독특한 능력에 대 한 수 있습니다.
제시 하는 프로토콜 여기 열립니다-최대 신경 과학에서 새로운 기회를 흥미로운. 최소한 침략 적 전달 방법 및 메쉬 전자 뇌 조직으로의 완벽 한 통합 신경 회로 중단을 최소화 고 대부분 만성 신경 기록 실험의 종류 혜택을 수 있는 만성 면역 응답을 피 한다. 기록 하 고 오랜 기간 특히 노화, 같은 달-1 년 동안 프로세스에 연관 밀리초 규모 급격히 활동 하고자 하는 수 사관에 게 관심이 될 것입니다 동일한 단일 뉴런을 추적할 메쉬 전자의 능력은 뇌 질환, 또는 두뇌 개발16,18의 병 인. 또한, 거기 존재 확장 단계로 PCB 머리-디지털 멀티플렉싱8,35, 같은 기능을 구현 하도록 활성 전자를 추가 하는 등이 프로토콜을 사용자 지정 하는 상당한 기회 무선 통신35,,3637, 그리고 신호 처리35, 공동 조직 재생18,38에서 원조 하기 위하여 메쉬 전자와 줄기 세포 또는 폴리머 주입 39, 그리고 통합 나노와이어 field-effect 트랜지스터 (NW-Fet)로 전자를 위한 메쉬 매우 지역화 및 다기능 뇌 프로브24,29,40,41 ,42.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
C.M.L. 지원 공군 사무실의 과학적 연구 (FA9550-14-1-0136), 하버드 대학 물리 과학 및 엔지니어링 가속기 상을, 그리고 국립 연구소의 건강 감독의 개척자 상 (가이 작품의 인정 1DP1EB025835-01). T.G.S. 국가 방위 과학 & 공학 대학원 친교 (NDSEG) 프로그램을 통해 국방부 (국방부)에 의해 지원 인정. G.H. 노화 국립 보건원의 국립 연구소에서 독립 상 (부모 K99/R00) 미국 심장 협회 (16POST27250219) 및 통로에서 친목 지원을 인정합니다. 이 작업 수행 되었다 일부 하버드 대학 센터에 대 한 나노 시스템 (CNS), 구성원의는 국가 나노기술 조정 인프라 네트워크 (NNCI), NSF ECCS 보너스 번호 아래 국립 과학 재단에 의해 지원 되는 1541959입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Motorized stereotaxic frame | World Precision Instruments | MTM-3 | For mouse stereotaxic surgery |
| 512-channel recording controller | Intan Technologies | C3004 | A component of the neural recording system |
| RHD2132 amplifier board | Intan Technologies | C3314 | A component of the neural recording system |
| RHD2000 3 feet ultra thin SPI interface cable | Intan Technologies | C3213 | A component of the neural recording system |
| Mouse restrainer | Braintree Scientific | TV-150 STD | Standard 1.25 inch inner diameter; used to restrain the mouse during restrained recording sessions. |
| Si wafers | Nova Electronic Materials | 3" P <100> .001-.005 ohm-cm 356-406 μm Thick Prime Grade SSP Si wafers w/2 Semi-Std. Flats & 6,000 A°±5% Wet Thermal Oxide on both sides. |
|
| Photomasks (chrome on soda lime glass) | Advance Reproductions | Advance Reproductions and other vendors manufacture photomasks from provided design files. Our photomask design files are available by request or from the resource website, meshelectronics.org. Alternatively, some university clean rooms have mask writers for making photomasks on site. | |
| AutoCAD software | Autodesk Inc. | Design software for drawing photomasks. A free alternative is LayoutEditor. Our photomask design files are available by request or from the resource website, meshelectronics.org. | |
| Thermal evaporator | Sharon Vacuum | Used to evaporate Ni, Cr, and Au onto mesh electronics during fabrication. Many university clean rooms have this or a similar tool. | |
| SU-8 2000.5 negative photoresist | MicroChem Corp. | Negative photoresist used to define the bottom and top passivating layers of mesh electronics. | |
| MA6 mask aligner | Karl Suss Microtec AG | Used to align each photomask to the pattern on the wafer and expose the wafer to UV light. Most university clean rooms have this or a similar tool. | |
| SU-8 developer | MicroChem Corp. | Used to develop SU-8 negative photoresist following exposure to UV light. | |
| LOR3A lift-off resist | MicroChem Corp. | Used with Shipley 1805 photoresist to promote undercutting during metal lift-off processes | |
| Shipley 1805 positive photoresist | Microposit, The Dow Chemical Company | Positive photoresist used to define metal interconnects and Pt electrodes in mesh electronics | |
| MF-CD-26 positive photoresist developer | Microposit, The Dow Chemical Company | To develop S1805 positive photoresist after exposure in a mask aligner. Many university clean rooms stock this chemical. | |
| Spin coater | Reynolds Tech | For coating wafers with positive and negative resists. Most university clean rooms have spin coaters. | |
| PJ plasma surface treatment system | AST Products, Inc. | Used to oxidize the surface of mesh electronics prior to release into aqueous solution. Most university clean rooms have this or a similar tool. | |
| Electron beam evaporator | Denton Vacuum | For evaporating Cr and Pt during fabrication of mesh electronics. Many university clean rooms have this or a similar tool. | |
| Remover PG | MicroChem Corp. | Used to dissolve LOR3A and Shipley S1805 resists during metal lift-off | |
| Ferric chloride solution | MG Chemicals | 415-1L | A component of Ni etching solution |
| 36% hydrochloric acid solution | Kanto Corp. | A component of Ni etching solution | |
| Glass capillary needles | Drummond Scientific Co. | Inner diameter 0.40 mm, outer diameter 0.65 mm. Other diameters are available. | |
| Micropipette holder U-type | Molecular Devices, LLC | 1-HL-U | Used to hold the glass capillary needles during stereotaxic injection |
| 1 mL syringe | NORM-JECT®, Henke Sass Wolf | Used for manual loading of mesh electronics into capillary needles | |
| Polyethylene intrademic catheter tubing | Becton Dickinson and Company | Inner diameter 1.19 mm, outer diameter 1.70 mm | |
| 5 mL syringe | Becton Dickinson and Company | Used in the syringe pump for injection of mesh electronics in vivo | |
| Eyepiece camera | Thorlabs Inc. | DCC1240C | Used to view mesh electronics within capillary needles during injection |
| ThorCam uc480 image acquisition software for USB cameras | Thorlabs Inc. | Used to view mesh electronics within capillary needles during injection | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | Used to flow precise volumes of solution through capillary needles during injection of mesh electronics |
| EXL-M40 dental drill | Osada | 3144-830 | For drilling the craniotomy |
| 0.9 mm drill burr | Fine Science Tools | 19007-09 | For drilling the craniotomy |
| Hot bead sterilizer 14 cm | Fine Science Tools | 18000-50 | Used to sterlize surgical instruments |
| CM1950 cryosectioning instrument | Leica Microsystems | Used to slice frozen tissue into sections. Many universities have this or a similar tool available in a shared facility. | |
| 0.3% Triton x-100 | Life Technologies | Used for histology | |
| 5% goat serum | Life Technologies | Used for histology | |
| 3% goat serum | Life Technologies | Used for histology | |
| Rabbit anti-NeuN | Abcam | ab177487 | Used for histology |
| Mouse anti-Neurofilament | Abcam | ab8135 | Used for histology |
| Rat anti-GFAP | Thermo Fisher Scientific Inc. | PA516291 | Used for histology |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific Inc. | P36930 | Used for histology |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich Corp. | P6407-5MG | Molecular weight = 70-150 kDA |
| Right-angle end clamp | Thorlabs Inc. | RA180/M | Used to attach the pipette holder to the stereotaxic frame |
| Printed circuit board (PCB) | Advanced Circuits | Used to interface between mesh electronics and peripheral measurement electronics such as the Intan recording system. Advanced Circuits and other vendors manufacture and assemble PCBs based on provided design files. Our PCB design files are available by request or at the resource site meshelectronics.org | |
| 32-channel standard amplifier connector | Omnetics Connector Corp. | A79024-001 | Component assembled onto the PCB |
| 32-channel flat flexible cable (FFC) | Molex, LLC | 152660339 | Used as a clamping substrate when interfacing to mesh electronics I/O pads with the PCB-mounted ZIF connector |
| 32-channel zero insertion force (ZIF) connector | Hirose Electric Co., LTD | FH12A-32S-0.5SH(55) | Component assembled onto the PCB |
References
- Lopes da Silva, F. EEG and MEG: relevance to neuroscience. Neuron. 80 (5), 1112-1128 (2013).
- Logothetis, N. K. What we can do and what we cannot do with fMRI. Nature. 453 (7197), 869-878 (2008).
- Seymour, J. P., Wu, F., Wise, K. D., Yoon, E. State-of-the-art MEMS and microsystem tools for brain research. Microsystems & Nanoengineering. 3, 16066 (2017).
- Buzsaki, G. Rhythms of the Brain. , Oxford University Press. (2006).
- Khodagholy, D., et al. NeuroGrid: recording action potentials from the surface of the brain. Nature Neuroscience. , (2014).
- Hamel, E. J., Grewe, B. F., Parker, J. G., Schnitzer, M. J. Cellular level brain imaging in behaving mammals: an engineering approach. Neuron. 86 (1), 140-159 (2015).
- Jun, J. J., et al. Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature. 551 (7679), 232-236 (2017).
- Berenyi, A., et al. Large-scale, high-density (up to 512 channels) recording of local circuits in behaving animals. Journal of Neurophysiology. 111 (5), 1132-1149 (2014).
- Scholvin, J., et al. Close-Packed Silicon Microelectrodes for Scalable Spatially Oversampled Neural Recording. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 63 (1), 120-130 (2016).
- Schiller, P. H. The Central Visual System. Vision Research. 26 (9), 1351-1386 (1986).
- Benabid, A. L., Chabardes, S., Mitrofanis, J., Pollak, P. Deep brain stimulation of the subthalamic nucleus for the treatment of Parkinson's disease. The Lancet Neurology. 8 (1), 67-81 (2009).
- Hochberg, L. R., et al. Reach and grasp by people with tetraplegia using a neurally controlled robotic arm. Nature. 485 (7398), 372-375 (2012).
- Lebedev, M. A., Nicolelis, M. A. Brain-Machine Interfaces: From Basic Science to Neuroprostheses and Neurorehabilitation. Physiological Reviews. 97 (2), 767-837 (2017).
- Polikov, V. S., Tresco, P. A., Reichert, W. M. Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 148 (1), 1-18 (2005).
- Perge, J. A., et al. Intra-day signal instabilities affect decoding performance in an intracortical neural interface system. Journal of Neural Engineering. 10 (3), 036004 (2013).
- Hong, G., Yang, X., Zhou, T., Lieber, C. M. Mesh electronics: a new paradigm for tissue-like brain probes. Current Opinion in Neurobiology. 50, 33-41 (2017).
- Dai, X., Hong, G., Gao, T., Lieber, C. M. Mesh Nanoelectronics: Seamless Integration of Electronics with Tissues. Accounts of Chemical Research. 51 (2), 309-318 (2018).
- Feiner, R., Dvir, T. Tissue-electronics interfaces: from implantable devices to engineered tissues. Nature Reviews Materials. 3 (1), 17076 (2017).
- Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M., Siegelbaum, S. A., Hudspeth, A. J. Principles of Neural Science. , McFraw-Hill. (2013).
- Rousche, P. J., et al. Flexible polyimide-based intracortical electrode arrays with bioactive capability. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 48 (3), 361-371 (2001).
- Liu, J., et al. Syringe-injectable electronics. Nature Nanotechnology. 10 (7), 629-636 (2015).
- Kasthuri, N., et al. Saturated Reconstruction of a Volume of Neocortex. Cell. 162 (3), 648-661 (2015).
- Saxena, T., Bellamkonda, R. V. A sensor web for neurons. Nature Materials. 14, 1190-1191 (2015).
- Xie, C., et al. Three-dimensional macroporous nanoelectronic networks as minimally invasive brain probes. Nature Materials. 14 (12), 1286-1292 (2015).
- Hong, G., et al. Syringe Injectable Electronics: Precise Targeted Delivery with Quantitative Input/Output Connectivity. Nano Letters. 15 (10), 6979-6984 (2015).
- Zhou, T., et al. Syringe-injectable mesh electronics integrate seamlessly with minimal chronic immune response in the brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (23), 5894-5899 (2017).
- Fu, T. M., et al. Stable long-term chronic brain mapping at the single-neuron level. Nature Methods. 13 (10), 875-882 (2016).
- Fu, T. M., Hong, G., Viveros, R. D., Zhou, T., Lieber, C. M. Highly scalable multichannel mesh electronics for stable chronic brain electrophysiology. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (47), E10046-E10055 (2017).
- Schuhmann, T. G. Jr, Yao, J., Hong, G., Fu, T. M., Lieber, C. M. Syringe-Injectable Electronics with a Plug-and-Play Input/Output Interface. Nano Letters. 17 (9), 5836-5842 (2017).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
- Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. Stereotaxic surgery for excitotoxic lesion of specific brain areas in the adult rat. Journal of Visualized Experiments. (65), e4079 (2012).
- Gage, G. J., et al. Surgical implantation of chronic neural electrodes for recording single unit activity and electrocorticographic signals. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Rodent Handling and Restraint Techniques. , Journal of Visualized Experiments. Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/10221/rodent-handling-and-restraint-techniques (2018).
- Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons. Journal of Visualized Experiments. 10 (99), e52293 (2015).
- Sodagar, A. M., Perlin, G. E., Yao, Y., Najafi, K., Wise, K. D. An Implantable 64-Channel Wireless Microsystem for Single-Unit Neural Recording. IEEE Journal of Solid-State Circuits. 44 (9), 2591-2604 (2009).
- Wentz, C. T., et al. A wirelessly powered and controlled device for optical neural control of freely-behaving animals. Journal of Neural Engineering. 8 (4), 046021 (2011).
- Harrison, R. R., et al. Wireless neural recording with single low-power integrated circuit. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 17 (4), 322-329 (2009).
- Landa, N., et al. Effect of injectable alginate implant on cardiac remodeling and function after recent and old infarcts in rat. Circulation. 117 (11), 1388-1396 (2008).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Zhang, A., Lieber, C. M. Nano-Bioelectronics. Chemical Reviews. 116 (1), 215-257 (2016).
- Zhou, W., Dai, X., Lieber, C. M. Advances in nanowire bioelectronics. Reports on Progress in Physics. 80 (1), 016701 (2017).
- Dai, X., Zhou, W., Gao, T., Liu, J., Lieber, C. M. Three-dimensional mapping and regulation of action potential propagation in nanoelectronics-innervated tissues. Nature Nanotechnology. 11 (9), 776-782 (2016).
