Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Sprøjte-injicerbar Mesh elektronik til stabil kronisk gnaver Elektrofysiologi

Published: July 21, 2018 doi: 10.3791/58003
Automatic Translation
1, 2, 2, 2,3, 2, 3, 1,2
1John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences, Harvard University, 2Department of Chemistry and Chemical Biology, Harvard University, 3Department of Physics, Korea University

Summary

Mesh elektronik sonder problemfrit integrere og sikre stabile, langsigtede, single-neuron optagelse i hjernen. Denne protokol bruger mesh elektronik til i vivo eksperimenter, der involverer fabrikation af mesh elektronik, ilægning i nåle, stereotaxisk injektion, input/output interfacing, optagelse eksperimenter og histologi væv indeholdende mesh sonder.

Abstract

Implantable hjernen Elektrofysiologi sonder er værdifulde værktøjer i neurovidenskab på grund af deres evne til at optage neurale aktivitet med høj spatiotemporelle opløsning fra overfladisk og dyb hjerneregioner. Deres anvendelse har været forhindret, men af mekaniske og strukturelle misforholdet mellem sonder og hjernen væv, ofte føre til micromotion og gliosis med deraf følgende signal ustabilitet i kronisk optagelse eksperimenter. I kontrast, efter implantation af ultraflexible mesh elektronik via sprøjte indsprøjtning, sonder trådnet form en problemfri, gliosis-fri interface med de omkringliggende hjernevæv, der giver mulighed for stabile sporing af individuelle neuroner på mindst et år tidsskalaen. Denne protokol detaljer de vigtigste skridt i en typisk mus neurale optagelse eksperiment ved hjælp af sprøjte-injicerbar mesh elektronik, herunder fabrikation af mesh elektronik i en standard fotolitografi-baseret proces muligt på mange universiteter, lastning mesh elektronik i standard kapillær nåle, stereotaxisk injektion in vivo, tilslutning af den trådnet input/output til standard instrumentering grænseflader, tilbageholdende eller frit flytte indspilningerne, og histologisk skæring af hjernen væv indeholdende mesh elektronik. Repræsentative neurale optagelser og histologi data præsenteres. Efterforskere fortrolig med denne protokol vil have den nødvendige viden til at indarbejde mesh elektronik i deres egne eksperimenter og drage fordel af de unikke muligheder af langsigtede stabile neurale interfacing, såsom undersøgelser af befolkningens aldring processer, hjernens udvikling og patogenesen af hjernesygdom.

Introduction

Udvikling af værktøjer i stand til at kortlægge hjernen med single-neuron opløsning er af central betydning for neurovidenskab og neurologi. Noninvasiv teknologier til neurale undersøgelser såsom electroencefalografi (EEG), magnetoencephalography (MEG) og funktionel magnetisk resonans imaging (fMRI) har vist sig værdifuld for korrelerede hjerneaktivitet med adfærd i mennesker1, 2, men de mangler den spatiotemporelle opløsning nødvendige for at undersøge strukturen og dynamikken i neurale netværk på deres grundlæggende mikrometer og millisekund skalaer, henholdsvis3,4. Visse electrocorticography (ECoG) sonder og optisk Billeddannende metoder ved hjælp af spænding-følsomme farvestoffer lykkedes optagelse single-Enhed spiking aktivitet i vivo5,6, men de er generelt effektivt kun nær den hjernen overflade, begrænse anvendelighed til undersøgelser af lavvandede hjerneregioner. Derimod implantable elektriske sonder kan måle single-neuron Elektrofysiologi i frit at flytte dyr fra næsten ethvert område af hjernen uden brug af fluorescerende mærkning, hvilket gør dem uundværlige til systemer-niveau neurovidenskab, især som microfabrication teknikker fra halvlederindustrien har skubbet tæller kanal i hundreder og tusinder3,7,8,9. I kraft af disse kapaciteter, har implantable elektriske sonder gjort mange vigtige bidrag til neurovidenskab og neurologi, herunder grundlæggende studier af edb i den visuelle system10, behandling af neurologiske sygdomme som Parkinsons sygdom11og demonstration af hjerne-maskine-grænseflader (BMIs) for avancerede proteser12,13.

Ikke desto mindre har langsigtet ustabilitet manifesteret som faldende spike amplituder og ustabile signaler på tidsskalaer af uger til måneder14,15 begrænset anvendelighed af implantabelt sonder til studiet af relativt kortsigtede fænomener, forlader spørgsmål såsom hjernens ældning og udvikling i høj grad ubesvarede. Begrænsninger i langsigtet ustabilitet er en følge af en uoverensstemmelse mellem konventionelle sonder og hjernevæv i størrelse, mekanik og topologi14,15,16,17,18. Med hensyn til størrelse, mens neuronal synapser og somata er ca snese nanometer til snesevis af mikrometer i diameter19, henholdsvis, traditionelle sonder er ofte betydeligt større, for silicium mikroelektrode arrays > 4 gange størrelsen af en enkelt neuron cellen kroppen7,8. Den relativt store størrelse af disse sonder kan forstyrre den naturlige struktur og tilslutning af tætte neurale væv, dermed bidrage til kronisk immunrespons og prøvningen af neurale kredsløb undersøges. Mekaniske egenskaber er traditionelle sonder drastisk stivere end de meget bløde neurale væv implanteres; selv "fleksible" sonder fra 10 – 20 µm tykke plader af polyimid er mindst 100.000 gange stivere end hjernen væv20,21. Denne uoverensstemmelse i bøjning stivhed forårsager relative shear bevægelse mellem sonde og hjernen væv, fører til upålidelige single-enhed sporing under udvidede optagelser og overtalelse kronisk gliosis på webstedet implantation. Endelig, den topologisk struktur af konventionelle hjernen sonder nødvendigvis udelukker en solid volumen af vævet. Sådanne uoverensstemmelse i topologi forstyrrer forbindelsen af neurale kredsløb, er til hinder for den naturlige tredimensionale (3D) interpenetrated distribution af neuroner og gliaceller blodkar i hjernen væv22og hindrer 3D transport af signalering molekyler23. Sammen, har disse mangler af konventionelle sonder gjort dem ikke opfylder de langsigtede kompatibilitet søges til kliniske applikationer og langsgående neurovidenskab undersøgelser på single-neuron niveau.

For at overvinde disse mangler har søgt vi at sløre grænsen mellem de neurale og elektroniske systemer ved at udvikle et nyt paradigme for "væv-lignende" neurale sonder kaldes mesh elektronik16,21,24. Mesh elektronik løser de ovenfor tilsvarende problemer i størrelse, mekanik og topologi af indlemmede (1) strukturelle egenskaber af den samme nanometer til mikrometer størrelse skala af neurale væv, (2) mekaniske egenskaber ligner dem af hjernevæv, og (3) en 3D kombineret makroporøs topologi, der er > 90% åben plads og kan dermed rumme interpenetration af neuroner og diffusion af molekyler gennem det ekstracellulære miljø. Mesh elektronik sonder kan leveres netop til specifikke hjerneregioner gennem en sprøjte og en nål, forårsager minimal akutte skader mens implanterer selv i dyb hjernen regioner21,25. Neuronal soma og axoner har vist sig at infiltreret åbne 3D-maske elektronik sonde struktur inden for uger efter injektion, hvorved der skabes en problemfri, gliosis-fri grænseflade mellem optagelse elektronik og omgiver hjernen væv21 , 26 , 27. disse unikke funktioner har aktiveret mesh elektronik sonder til stabilt spore spiking aktivitet fra de samme individuelle neuroner over mindst et år tidsskalaen27. Derudover giver fabrikation af den trådnet elektronik baseret på fotolitografi (PL) høj skalerbarhed af antallet af elektroder, der kan blive indarbejdet, med demonstreret kanal tæller op til 128 elektroder pr. sonden ved hjælp af simpel kontakt maske litografi 28 og en plug-and-play input/output (I/O) design, der giver mulighed for hurtig elektrisk forbindelse til perifere elektronik uden specialudstyr29.

En bred vifte af undersøgelser kan drage fordel af at indarbejde mesh elektronik i måling protokoller. De fleste intracortical optagelse forsøg kunne drage fordel af mesh electronics' minimalt invasiv implantation procedure via sprøjte indsprøjtning, drastisk nedsat immunrespons efter implantation, og evnen til at forlade mesh elektronik i den væv under efterfølgende histologi og immunfarvning for præcise analyse af det biologiske miljø omkring hver optagelse site. Kronisk optagelse forsøg vil navnlig udlede værdien fra mesh elektronik unikke evne til at spore stort antal individuelle neuroner i måneder til år. Denne evne skaber muligheder for studier med single-neuron beslutning, der var tidligere upraktisk, såsom langsgående ældning undersøgelser af neurale kredsløb, undersøgelser for at udvikle hjernen, og undersøgelser af patogenesen af encephalopatier16.

I denne protokol beskriver vi alle nøglen skridt i en typisk mus neurale optagelse eksperiment ved hjælp af sprøjte-injicerbar mesh elektronik (Se figur 1). Trinene beskrevet omfatter fabrikation af mesh elektronik i en standard PL-baseret proces mulig på mange universiteter, indlæse mesh elektronik i standard kapillær nåle, stereotaxisk injektion af mesh elektronik i vivo, tilslutning af den mesh I/O til standard instrumentering grænseflader, tilbageholdende eller frit bevægelige indspilningerne og histologiske skæring af hjernevæv indeholdende mesh elektronik. Nogle forskere bruger mesh elektronik kun for histologi undersøgelser kan ikke kræve elektrisk grænseflade og optagelse, hvorefter de kan springe disse trin. Efter sætte sig med denne protokol, skal efterforskerne har al den viden, der er nødvendige for at bruge mesh elektronik i deres egne eksperimenter.

Protocol

Alle procedurer udføres på hvirveldyr animalske emner blev godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) af Harvard University.

1. fabrikation af Mesh elektronik

Bemærk: Den procedure, der er beskrevet i dette afsnit er beregnet til brug inde i en standard Universitet renrums facilitet, som Center for nanoskala systemer (CNS) ved Harvard University. Denne facilitet samt lignende faciliteter er tilgængelige for eksterne brugere rundt omkring i USA, for eksempel, som en del af den nationale nanoteknologi infrastruktur netværk (NNIN) understøttes af National Science Foundation (NSF). I disse faciliteter, mange af de redskaber, udstyr og materialer, der er beskrevet i dette afsnit er leveres sammen med adgang til funktionen renrums og ville ikke kræve separate køb.

Forsigtig: Mange af kemikalier, der anvendes i fremstilling af mesh elektronik er farlige, herunder modstår, CD-26, remover PG, SU-8 udvikleren og Ni ætsning løsning. Konsultere materialer sikkerhedsdatabladene (MSDS) for disse kemikalier før brug og gennemføre og følge relevante sikkerhedsforanstaltninger på alle tidspunkter.

  1. Termisk fordampe 100 nm af Ni på en ren Si-wafer.
    Bemærk: Typisk deposition parametre er base Tryk på 5 x 10-7 T og sats på 1-2 Å/s. Det tynde lag af Ni fungerer som en blote lag, der vil senere blive opløst for at frigive mesh elektronik fra wafer.
  2. Brug den første PL maske (PL maske-1) til at definere bunden passiverende lag mesh elektronik med SU-8 negative photoresist (figur 2A).
    Bemærk: PL er en standard microfabrication teknik som ultraviolet (UV) lys skinnede ind på en maske afholdt over en lysfølsom substrat. Lys enten gør uopløselige (negative modstår) eller opløselig (positiv modstår) de udsatte områder på underlaget. Maskerne er udarbejdet i computer aided design (CAD) programmel og derefter typisk bestilt hos en leverandør. En maske aligner bruges til at justere masker til eksisterende mønstre på et substrat og udsætte dem for UV-lys. Fabrikation af mesh elektronik kræver fire forskellige masker (PL maske-1 gennem PL maske-4). Vores maske designs er tilgængelige ved anmodning eller fra den ressource site, meshelectronics.org.
    1. Spin-coat SU-8 2000.5 negative photoresist på wafer ved 4000 rpm for en omtrentlig SU-8 tykkelse 400 – 500 nm.
    2. Blød bages wafer på en kogeplade i 1 min. ved 65 ° C efterfulgt af 1 min. ved 95 ° C.
    3. Indlæse wafer i en maske aligner at eksponere SU-8 med PL maske-1 svarende til mesh SU-8 bundlag. Udsætte på en i-linje (365 nm bølgelængde) dosis af 100 mJ/cm2.
    4. Post bage wafer på en kogeplade i 1 min. ved 65 ° C efterfulgt af 1 min. ved 95 ° C.
    5. Fordyb wafer i en bakke med SU-8 udvikleren. Forsigtigt agitere løsning for 2 min indtil trådnet mønsteret i SU-8 er fuldt udviklet. Skyl i en bakke med isopropylalkohol for 1 min og blæse tør.
    6. Hårdt bage wafer på en kogeplade ved 180 ° C i 1 time.
      Bemærk: SU-8 er normalt hårdt bagt mellem 150 og 250 ° C efter udvikling. Den hårde bage anneals enhver overflade revner, som kan danne under udvikling og yderligere krydsbindinger SU-8 for at sikre mekanisk stabilitet. Hårdt bagning ved 180 ° C for SU-8 bundlag og 190 ° C til toppen SU-8 lag giver gode resultater for mesh elektronik.
  3. Brug PL maske-2 til at definere metal forbinder og I/O pads (figur 2B).
    1. Spin-coat LOR3A på wafer ved 4000 rpm for en omtrentlig tykkelse på 300 nm.
      Bemærk: LOR3A er en polydimethylglutarimide-baseret modstå hvilke hastigheder underbud i den efterfølgende metallization procedure.
    2. Bage wafer på en kogeplade ved 180 ° C i 5 min.
    3. Spin-coat S1805 positive photoresist ved 4000 rpm for en omtrentlig tykkelse på 500 nm.
    4. Bage wafer på en kogeplade ved 115 ° C i 1 min.
    5. Indlæse wafer i en maske aligner at eksponere S1805 med PL maske-2 svarende til metal forbinder og I/O puder. Udsætte i en h-line (405 nm bølgelængde) dosis på 40 mJ/cm2.
    6. Fordyb wafer i en bakke i CD-26 photoresist udvikler. Forsigtigt agitere løsningen for 1 min indtil metal forbinder mønster har været fuldt udviklet. Skyl i en bakke med deioniseret vand (DI) for 1 min og blæse tør.
    7. Termisk fordampe 3 nm af Cr efterfulgt af 80 nm af Au.
      Bemærk: En base pres på højst 5 x 10-7 T og deposition af 1 Å/s typisk give den bedste film kvalitet.
    8. Fordybe wafer i en flad bægerglas af remover PG i ca 3 timer, indtil metallet har fuldt underbyde, forlader metal kun i den ønskede interconnect og I/O pad regioner af mesh elektronik. Skyl i isopropylalkohol og blæse tør.
  4. Bruge PL maske-3 til at definere Pt elektroder (figur 2 c).
    1. Gentag trin 1.3.1 gennem 1.3.4.
    2. Indlæse wafer i maske aligner at afsløre S1805 med PL maske-3 svarer til Pt elektroder. Udsætte i en h-line dosis på 40 mJ/cm2.
    3. Fordyb wafer i en bakke i CD-26 photoresist udvikler. Forsigtigt agitere løsning for 1 min, indtil Pt elektroder mønster har udviklet fuldt ud. Skyl i en bakke af DI til 1 min og blæse tør.
    4. Bruge en elektron beam fordamper til depositum 3 nm af Cr efterfulgt af 50 nm af Pt.
      Bemærk: Typisk deposition parametre er en base Tryk på 5 x 10-7 T og sats af 2 Å / s.
    5. Fordybe wafer i en flad bægerglas af remover PG i ca 3 timer, indtil metallet har fuldt underbyde, forlader Pt kun på de ønskede elektrode websteder af mesh elektronik. Skyl i isopropylalkohol og blæse tør.
  5. Bruge PL maske-4 til at definere toppen passiverende lag mesh elektronik med SU-8 negative photoresist (figur 2D).
    1. Gentag trin 1.2.1 gennem 1.2.5, undtagen udsætter med PL maske-4 svarer til den øverste passiverende mesh lag af SU-8.
    2. Hårdt bage wafer på en kogeplade ved 190 ° C i 1 time.
      Bemærk: Denne temperatur er 10 ° C højere end for den hårde bages af bunden SU-8 (trin 1.2.6). Denne forhøjede temperatur ombrydes lidt bunden SU-8, får det til at fusionere med den øverste SU-8 lag og dermed danne en enkelt, kontinuerlig SU-8 struktur.
  6. Mesh elektronik er nu komplet (figur 2E og figur 3); frigøre dem fra Si-wafer ved at opløse det Ni blote lag.
    1. Behandle wafer med ilt plasma på 50 W i 1 minut. Dette oxiderer SU-8 overflade, hvilket gør den hydrofile og at lade masken for at være let suspenderet i vandig opløsning.
    2. I en flad bægerglas, kombinere saltsyre, ferrichloridopløsning og DI på en volumetrisk forholdet 1:1:20, henholdsvis at gøre en løsning af Ni TIPkan.
    3. Fordybe wafer i en flad bægerglas af Ni TIPkan løsning i ca 3 timer, indtil trådnet elektronikken er helt blevet frigivet fra Si-wafer.
    4. Bruge en Pasteur pipette til at overføre den frigivne mesh elektronik sonder fra Ni TIPkan til et 100 mL bægerglas af DI. Overføre trådnet elektronikken til en frisk bægerglas af DI mindst 3 gange for at sikre skylning.
    5. Bruge en Pasteur pipette til at overføre trådnet elektronikken til en 70/30% ethanol/vand løsning til desinfektion, så brug pipetten til at overføre trådnet elektronikken til sterilt vand til skylning.
      Bemærk: Efter sterilisation, trådnet elektronikken kan overføres til andre løsninger for functionalization. For eksempel, for at fremme cellulære vedhæftning, kan trådnet elektronikken overføres til en vandig opløsning af poly-D-lysin (1 mg/mL) i 24 timer.
    6. Brug en Pasteur pipette til at overføre trådnet elektronikken sonder til et 100 mL bægerglas af sterile 1 x phosphat bufferet saltvand (PBS) før injektion in vivo.

2. Ilægning af Mesh elektronik i nåle

  1. Pipette indehaveren som købt er åbne for strømme i begge ender. Seal ende overfor cirkulære skrue fasteneren med epoxy, så der er ingen lækage under injektion (figur 4A). Lad epoxyen hærde, før du fortsætter.
  2. Indsæt et glas kapillær nål i pipette holderen. Fastgør det på plads ved hjælp af cirkulære stramning skrue og kegle Skive (figur 4B). En 400 µm indre diameter (650 µm ydre diameter) glas kapillær nålen blev brugt til denne protokol. Andre kapillær nål materialer (fx., metal) og diametre kan anvendes men kan kræve ændringer af designet af mesh elektronik sikre injektionsydelse.
    Bemærk: Kapillar nåle spænder fra 150 µm til 1,17 mm indre diameter (250 µm til 1,5 mm ydre diameter) har været brugt i vores laboratorium. Injektion gennem mindre nåle kan fremmes ved at gøre vinkel på skæringspunktet mellem de tværgående og langsgående SU-8 mesh elementer mere akut, faldende bredden af SU-8 mesh elementer, ved hjælp af tyndere SU-8, og ved hjælp af en grovere (dvs., større enhed celle) mesh struktur. Komponeneter for masker designet for mindre kapillær nåle er tilgængelige ved anmodning eller fra den ressource site, meshelectronics.org. Glas kapillær nåle med en indre diameter på 400 µm og ydre diameter på 550 µm findes også kommercielt. Disse reducere den akutte vævsskader forårsaget af injektion, mens opretholde kompatibilitet med masker, der kræver en indre diameter på 400 µm, men de blev ikke brugt til de undersøgelser, der er beskrevet her.
  3. Tillægge side outlet pipette indehaverens ved hjælp af en 2-4 cm længde af kapillar slangen en 1 mL sprøjte.
  4. Indsæt glas kapillær nålen i 100 mL bægerglas PBS, som indeholder trådnet elektronikken. Anbring enden af nålen nær I/O puder af en mesh elektronik sonde og manuelt trække sprøjten for at tegne en mesh elektronik sonde ind nål (figur 5 og supplerende Video 1).
    Bemærk: I/O puder, stilken interconnect region, og mesh enhed region let kan identificeres af blotte øje når trådnet elektronik sonderne er suspenderet i løsning. Dette giver mulighed for entydig lastning af mesh elektronik i nåle med den korrekte orientering.
  5. Push/pull sprøjte stemplet mens stadig nedsænkes i saltvand for at justere placeringen af mesh elektronik inden for nålen.
    Bemærk: Ideelle placering er med regionen ultraflexible mesh enhed som tæt på slutningen af nålen som muligt. Denne konfiguration minimerer mængden af væske, der vil blive injiceret i hjernen samtidig garantere regionen enhed sprøjtes først og I/O puder sidst.
  6. Forsigtigt frigøre kapillær slangen fra side outlet af indehaveren pipette. Fjern det langsomt for at undgå at skabe en suge kraft, der kan ændre placeringen af trådnet elektronikken inden for nålen.

3. stereotaxisk injektion af Mesh elektronik i levende mus hjernen

Bemærk: Mus var bedøvede af intraperitoneal injektion med en blanding af 75 mg/kg ketamin og 1 mg/kg dexdomitor. Graden af anæstesi blev bekræftet med metoden tå knivspids forud for begyndelsen kirurgi. Kropstemperatur blev opretholdt ved at placere musen på en 37 ° C varmblodige tæppe under anæstesi. Ordentlig steril teknik blev gennemført for kirurgi, herunder men ikke begrænset til autoklavering alle metal kirurgiske instrumenter for 1 h før brug, ved hjælp af steriliseret handsker, ved hjælp af en varm perle sterilizer hele operationen, opretholdelsen af et sterilt felt omkring operationsstedet, desinficering af plast instrumenter med 70% ethanol og skrabet hovedbunden var hud prepped med iodophor før indsnit. For overlevelse operationer, efter afslutningen af operation, antiobiotic salve blev anvendt omkring såret, og musen var vendt tilbage til et bur, udstyret med et 37 ° C varme pad. Mus blev ikke efterlades uden opsyn, indtil de havde genvundet tilstrækkelig bevidsthed for at opretholde brystbenet recumbency. Musene fik buprenorphin analgesi via intraperitoneal injektion i en dosis på 0,05 mg/kg legemsvægt hver 12 h i op til 72 timer efter operationen. Mus blev isoleret fra andre dyr efter kirurgi. Mus blev aflivet via enten intraperitoneal injektion med pentobarbital ved en dosis på 270 mg/kg legemsvægt eller via transcardial perfusion (Se trin 6.1). Efterforskerne har flere betydninger Geiger, et al. 30, Kirby, et al. 31og Gage, mfl. 32 for detaljer om gnaver stereotaxisk kirurgi.

  1. Bedøver musen og ordne det i et stereotaxisk ramme.
  2. Anvende okulær smøremiddel til musens øjne til at forhindre tørhed under anæstesi.
  3. Bruge en dental boremaskine og stereotaxisk ramme til at åbne en kraniotomi på de ønskede koordinater på kraniet. Åbne en anden kraniotomi fra injektionsstedet til indsættelse af en rustfrit stål grundstødning skrue eller wire.
  4. Lave en fastspænding substrat til kraniet med dental cement. Skære en ca 1 mm bred hul i substrat til at forbedre pålideligheden af de folde trin senere i proceduren.
    Bemærk: En flad fleksibelt kabel (FFC) skåret til et "L" form fungerer godt (figur 7A), selv om mange materialer vil arbejde så længe de er af den rigtige tykkelse for 32-kanals nul insertion force (ZIF) stik (designet til 0,18 ± 0,05 mm tykke kabler).
  5. Mount indehaveren pipette med nålen indeholdende mesh elektronik på stereotaxisk rammen ved hjælp af en retvinklet ende klemme (figur 4 c og figur 6A).
  6. Tillægger en 5 mL sprøjte fastgjort i en sprøjten pumpe (figur 6D) ved hjælp af side outlet pipette indehaveren af en ca 0,5 – 1 m længde af kapillar slangen.
    Bemærk: Sørge for der er ingen bobler i kapillær slangen før tilslutning til indehaveren af pipette. Bobler kan afbryde strømmen under injektion og forhindre en glat, kontrolleret leverance af mesh elektronik.
  7. Brug stereotaxisk rammen til at placere spidsen af nålen på den ønskede igangsætning placering i hjernen.
    Bemærk: De trådnet elektronik sonder anvendes her er designet med optagelse elektroder spredt over en længde af ca. 2 mm og med den første elektrode placeret ca. 0,5 mm fra start kanten af trådnet elektronikken (længst til venstre kant i figur 3A). Af denne grund, skal stereotaxisk koordinaterne vælges således, at den igangsætning placering er 0,5 mm dybere end hjernen region af interesse. Spredning og placering af optagelse elektroder i mesh elektronik kan vælges frit under designprocessen maske og bør vælges, så optagelse elektroder span hjernen region(er) af interesse, som de er injiceres langs deres stereotaxisk bane.
  8. Placere kameraet (fig. 6B) for at vise toppen af mesh elektronik sonden inden for glas nålen. Nogle software tillader brugeren at tegne en linje på skærmen for at markere den oprindelige placering af trådnet elektronikken.
  9. Indlede strømmen ved at sætte sprøjten pumpe til en lav hastighed og trykke på Start. 10 mL/h er en typisk starter strømningshastighed for en 400 µm indre diameter kapillær nål. Øg langsomt flow-hastighed, hvis trådnet elektronik sonden ikke flyttes inden for nålen.
    Bemærk: Det er vigtigt at minimere mængden af væske sprøjtet ind i hjernen, da dette kan beskadige vævet omkring injektionsstedet. Bedste resultater er opnået med injektionsvolumener mindre end 25 µL pr. 1 mm af injicerede mesh længde. Ideelle værdier er mindre end halvdelen af denne mængde; i vores laboratorium injicere vi typisk 10 – 50 µL pr. 4 mm injiceres mesh længde.
  10. Som trådnet elektronik sonden begynder at bevæge sig inden for nålen, bruge stereotaxisk rammen til at trække nål i samme tempo, som er at være injiceres mesh elektronik sonden ved hjælp af den markerede oprindelige holdning af mesh elektronik som en guide.
    Bemærk: Denne procedure, betegnes field of view (FoV) injektion metode25giver mulighed for præcis levering af mesh elektronik til en målrettet hjernen regionen uden crumpling eller dislokation. Flowet kan ofte reduceres, når trådnet elektronik sonden begynder bevæger sig inden for nålen. I vores laboratorium, strømningshastigheder for 20-30 mL/h er ofte nødvendigt at overvinde den statisk friktion mellem mesh og kapillær nål vægge, men satsen kan derefter reduceres til 10 mL/h, når indsprøjtningssystem processen er indledt. Strømningshastigheder og injektionsvolumener er normalt mindre for mindre diameter kapillær nåle.
  11. Fortsat strømmer saltvand og tilbagetrækningskraften nålen indtil nålen har afsluttet kraniet. Stop strømmen fra sprøjten pumpe.

4. input/output Interfacing

Bemærk: på dette tidspunkt trådnet elektronik sonden har været injiceres fra det ønskede startpunkt i hjernen langs den valgte bane. Nålen har været trukket tilbage og lige over kraniotomi med mesh elektronik forbinder spænder fra hjernen til nålen og I/O puder stadig inde i kanylen (figur 7B). Dette afsnit bruger en printplade (PCB; Figur 7, figur 8) at interface til trådnet elektronik sonden. Printet forbinder en ZIF stik til en 32-kanals standard forstærker stik gennem en isolerende underlag, der bliver hoved-scenen for neurale optagelse eksperimenter. Printet kan tilpasses til at rumme forskellige hoved-fase konfigurationer. Vores design-filer er tilgængelige ved anmodning eller fra ressource hjemmeside, meshelectronics.org og kan bruges til at købe PCB billigt fra leverandører af PCB fremstilling og samling tjenester.

  1. Bruge stereotaxisk rammen til at omhyggeligt guide nålen til FFC fastspænding substrat og på tværs af hullet, flyder løsningen med sprøjten pumpe til at generere slæk i trådnet elektronikken forbinder (figur 7C).
  2. Når nålen er ovenfor den klemmer substrat og over kløften, genoptage flow i et hurtigt tempo hen til udsende trådnet elektronikken I/O puder på den klemmer substrat (figur 7 d).
  3. Brug af pincet og pipette af DI, bøje I/O puder til ca. 90° vinkel som tæt på den første I/O pad som muligt.
    Bemærk: Bøjning er nødvendigt at tillade puder til at blive indsat i ZIF stik på en PCB i et efterfølgende skridt. ZIF stik er præcis den samme bredde som de 32 I/O puder af mesh elektronik sonden, så en ufuldkommen 90° bøje eller en bøje ikke forekommer lige før den første I/O pad, vil resultere i skulle afskære I/O pads (længst til venstre puder i tal 7E).
  4. Når I/O pads er justeret, udfoldet, og på en 90° vinkel ud til den trådnet stilk, tør dem på plads med blidt strømmende komprimeret luft.
    Bemærk: Mesh elektronik sonder med færre end 32 kanaler kan interface til med det samme 32-kanal interface bord. Vores laboratorium bruger f.eks almindeligt 16-kanals mesh elektronik sonder med 32-kanals PCB. Dette giver ekstra plads i ZIF stik, hvilket gør interfacing lettere, og de ekstra uncontacted kanaler kan identificeres let som åben kredsløb ved hjælp af impedans test under indspilningerne.
  5. Skære fastspænding underlaget på en lige kant ca 0,5-1 mm fra kanten af I/O puder. Også afskåret uvedkommende dele af den klemmer substrat, der vil hindre indsættelse i Printmonteret 32-kanals ZIF stik (figur 7F).
  6. Sæt I/O puder i ZIF stik på Printene og luk låsen (figur 7 g). Brug måling elektronik til at måle impedans mellem kanalerne og jorden skruen og bekræft vellykket grænseflade. Hvis impedans værdier er for høj, afsikrer ZIF stik, justere indsættelse og retest indtil vellykket forbindelse bekræftes.
  7. Dække ZIF stik og udsatte mesh elektronik forbinder med dental cement til beskyttelse. Flip Printet på hullet i underlaget, og fastsætte Printet med cement på musen kraniet (figur 7 H).
    Bemærk: Bøjning FFC på gap reducerer den mekaniske stamme, der undertiden kan bryde den trådnet elektronik forbinder.
  8. Tillad cement til at hærde, dreje Printet i et robust, kompakt head-scenen for interfacing under efterfølgende indspilningerne (figur 7I).

5. neurale optagelse eksperimenter

  1. Placere musen i en tailveiner eller andre Tilbageholderen33. Sæt forforstærker PCB i standard forstærker stikket på hoved-fase PCB. Bruge et separat kabel til jorden reference skruen.
  2. For tilbageholdende optagelser, bevæger musen i Tilbageholderen. Registrere data, der anvender dataoptegningssystem for den ønskede tidsperiode (figur 8A).
  3. For frit flytte optagelser, slip musen fra Tilbageholderen efter indsættelse forforstærker PCB og grundstødning reference skruen. Rekorden for den ønskede længde af tid ved hjælp af dataoptegningssystem, mens musen opfører sig frit (fig. 8B).
  4. I slutningen af optagelsen session, sætte musen tilbage i Tilbageholderen, hvis nødvendigt. Fjerne grundstødning wire og forforstærker, så slipper musen tilbage til sit bur og returnere det til den Dyrefacilitet indtil den næste optagelse session.

6. histologiske afsnitsinddeling, farvning og billedbehandling

  1. Vent, indtil den ønskede tid efter injektion, derefter bedøver musen og transcardially perfuse med formaldehyd. Fjern, fryse og cryosection hjerne i 10 µm tykke skiver. En detaljeret protokol om Immunhistokemi og cryosectioning af gnaver hjernevæv kan findes i Evilsizor, mfl. 34.
    Bemærk: Hjernevæv indeholdende mesh elektronik kan fastsættes og sectioned normalt, selvom overvågning elektronik er efterladt inde. Dette er en enestående kapacitet i forhold til konventionelle neurale sonder, som skal fjernes før skæring og derfor kan ændre væv eller gøre det vanskeligt at analysere grænsefladen sonde-væv.
  2. Skyl de frosne hjerne væv afsnit 3 gange i 1 x PBS.
  3. Blokere sektioner i en opløsning af 0,3% Triton X-100 og 5% ged serum i 1 x PBS. Lad sidde ved stuetemperatur i 1 h.
  4. Inkuber sektioner med løsningen af primære antistoffer. De primære antistof løsninger anvendes her var kanin anti-NeuN (1:200 fortynding), musen anti-Neurofilament (1: 400 fortynding) og rotte anti-GFAP (1: 500 fortynding) med 0,3% Triton X-100 og 3% ged serum. Der inkuberes natten over ved 4 ° C.
  5. Skyl sektioner 9 gange til et samlet beløb på 40 min. med 1 x PBS.
  6. Inkuber hjernen sektioner med løsningen af sekundære antistoffer. Sekundær antistof løsninger anvendes her var Alexa Fluor 488 ged anti-kanin (1:200 fortynding), Alexa Fluor 568 ged anti-mus (1:200 fortynding) og Alexa Fluor 647 ged anti-rotte (1:200 fortynding). Inkuber sektioner i 1 time ved stuetemperatur.
  7. Skyl sektioner 9 gange i alt i 30 min med 1 x PBS.
  8. Montere sektionerne på glas dias med coverslips ved hjælp af antifade praeparat. Forlade dias i mørke i mindst 24 timer før billeddannelse.
  9. Billede af dias med en Konfokal mikroskop ved hjælp af 488 nm, 561 nm, og 633 nm lasere som excitation kilder for Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568 og Alexa Fluor 647, henholdsvis. Bruge differential interferens kontrast (DIC) til at afbilde trådnet elektronikken på samme mikroskop for efterfølgende overliggende billeder og analyse.

Representative Results

Resultaterne varierer afhængig af dyrearter i undersøgelsen, regionen målrettede hjernen, den forløbne tid siden injektion, mængden af akutte skader påført under injektion, og succesen af I/O interfacing procedure, blandt andre faktorer. Single-Enhed spiking aktivitet kan ikke vises indtil 1 dag (ved 150 µm indre diameter nåle) til 1 uge efter injektion og spike amplituder kan variere op til 4-6 uger. Figur 9 viser repræsentative elektrofysiologiske data fra en 32-kanals mesh elektronik sonde indsprøjtes i hippocampus og primære somatosensoriske cortex af en voksen mand C57BL/6J mus. Ca 300-µV amplitude lokale felt potentialer (LFPs) blev optaget på alle 32 kanaler og single-Enhed spiking aktivitet blev indspillet på 26 kanaler. LFPs og isoleret pigge forblev lignende mellem 2 og 4 måneder, hvilket tyder på en meget stabil grænseflade mellem optagelse elektronik og neuroner i denne udvidede periode. Figur 10 viser repræsentative resultater af histologiske skæring og immunfarvning af hjernevæv indeholdende mesh elektronik 1 år efter injektion. Farvning for NeuN, en markør for neurale somata, og neurofilament, en markør for neurale axoner, afslører lidt eller ingen tab af væv tæthed på injektionsstedet, antyde sømløse sammenknytning mellem trådnet elektronik og hjernen væv. Farvning for GFAP (markør for astrocytter) yderligere afslører nær baggrundsværdier for astrocytter omkring mesh elektronik, der angiver, at dets tilstedeværelse fremkalder lidt kronisk immunrespons.

Figure 1
Figur 1: trin i en sprøjte-injicerbar mesh elektronik eksperiment. Denne protokol beskriver alle vigtige trin i en typisk gnaver neurale optagelse eksperiment ved hjælp af mesh elektronik. Eksperimenter som regel medfører, med henblik på gennemførelsen, (1) fabrikation af mesh elektronik, (2) indlæsning af mesh elektronik ind i kapillære nåle, (3) stereotaxisk injektion af mesh elektronik ind i hjernen, (4) elektriske I/O grænseflade for maskestørrelser elektronik, (5) tilbageholdende eller frit bevægelige optagelser og (6) mesh/væv skæring og farvning for histologi. I nogle undersøgelser, kan kun histologi data ønske, i hvilket tilfælde trin (4) og (5) kan hoppet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: skematisk skildrer fabrikation proceduren til plug-and-play mesh elektronik i regionen ultraflexible enhed (øverste række), stængel forbinder region (midterste række) og I/O region (nederste række). (A) SU-8 negative photoresist (rød) er mønstrede med PL maske-1 til at definere bunden passiverende lag af hver plug-and-play mesh elektronik sonde. (B) mønstre med PL maske-2, termisk fordampning og metal lift-off definere Au forbinder og I/O pads (guld). (C) mønstre med PL maske-3, elektron beam fordampning og metal lift-off definere Pt elektroder (blå). (D) SU-8 negative photoresist (rød) er mønstrede med PL maske-4 til at definere passiverende slidlaget. Åbninger i SU-8 er tilbage på hver Pt elektrode og I/O pad. (E) A afsluttet mesh elektronik sonde med stiplede bokse med angivelse af de steder i toppen, midten og bunden rækker udvidet. Photomask design-filer er tilgængelige ved anmodning fra forfatterne eller fra den ressource site, meshelectronics.org. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: fotografier og optisk mikroskop billeder af plug-and-play mesh elektronik. (A) flise optisk mikroskop billeder af en sprøjte-injicerbar mesh elektronik sonde med plug-and-play I/O. Sonden var afbildet efter afslutningen af fabrikation trin i figur 2 men før frigivelsen fra de Ni-belagt substrat. Stiplede bokse svarer fra venstre mod højre til dele af ultraflexible enhed region, stængel og I/O region forstørret i C, D og E, henholdsvis. Skalalinjen = 1 mm. (B) fotografi af en 3 tommer Si wafer indeholdende 20 afsluttet mesh elektronik sonder. Skalalinjen = 20 mm. (C) optisk mikroskop billede af 20 µm diameter Pt optagelse elektroder i regionen ultraflexible enhed. Skalalinjen = 100 µm. (D) optisk mikroskop billede af high-density Au forbindelser i regionen stilk. Hver Au interconnect er elektrisk isoleret og forbinder en enkelt Pt elektrode til en enkelt I/O pad. Skalalinjen = 100 µm. (E) optisk mikroskop billede af I/O puder. Hver pad består af en sammenklappelig mesh region og en kontinuerlig tynd-hinde region beliggende på stænglen. Non-udførelse af SU-8 bånd forbinde trådnet dele af puder sammen for at hjælpe med at opretholde justering. Skalalinjen = 200 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Fig. 4: montage af apparater til at holde kapillær kanyler under injektionen. (A) fotografi af dele af apparatet. Komponenterne omfatter (1) et glas kapillær nål, (2) en pipette indehaveren, (3) en cirkulær skrue fasteneren for indehaveren pipette, og (4) en kegle skive til indehaveren af pipette. Elementer (2) gennem (4) er inkluderet med køb af en pipette indehaveren. Pil markerer outlet pipette indehaveren, som skal være limet lukket med epoxy. (B) fotografi af pipette indehaveren efter forsamling og indsættelse af et glas kapillær nål. Den ekstra epoxy er synlig på den øverste outlet pipette indehaveren (markeret med pil) og kapillær slanger forbinder pipette indehaveren med en sprøjte (ikke vist). (C) foto af indehaveren pipette og kapillær nålen efter den vedhæftede fil til stereotaxisk rammen med en højre-vinkel slutningen klemme. Skala barer er 1 cm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Ilægning af mesh elektronik i glas nåle. (A) skematisk illustration af proceduren lastning til plug-and-play mesh elektronik. Glas nål er placeret i nærheden af I/O slutningen af en mesh elektronik sonde, mens det er suspenderet i løsning. Sprøjte stemplet er derefter manuelt trukket tilbage for at tegne i mesh elektronik sonde. Ideel placering er med regionen ultraflexible enhed lige inden slutningen af nålen. (B) fotografier svarende til (A) af en mesh elektronik sonde indlæses ikke i et glas nål. Skalere barer = 2 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: skematisk af stereotaxisk kirurgi station. En motoriseret stereotaxisk ramme (A) med vedlagte pipette indehaveren er bruges til at placere nålen ind i ønskede hjernen regionen. Placeringen af nålen og indlæst mesh elektronik overvåges med et mål linse og knyttet kamera (B) og vises på en computer (C). En sprøjten pumpe (D) løber præcise mængder af saltvand gennem nålen, giver mulighed for nøjagtig, kontrolleret injektion af mesh elektronik i regionen ønskede hjernen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Plug-and-play I/O interfacing procedure. (A) en FFC fastspænding substrat er sikret med dental cement støder op til kraniotomi. (B) Plug-and-play mesh elektronik stereotaxically injiceres i den ønskede hjernen regionen ved hjælp af metoden FoV. (C) nålen med I/O puder af trådnet elektronik sonde stadig inde, flyttes over FFC fastspænding substrat. (D) Flow er genoptages gennem nål til at skubbe I/O puder på FFC fastspænding substrat. (E) I/O pads er bøjet 90 ° i forhold til stilken, udfoldede sig med den ledende side opad, og tørrede i stedet. (F) FFC substrat er trimmet med saks til en lineær ca. 0,5 mm fra kanten af I/O puder. Overskydende substrat er skåret væk for at tillade indsættelse i en 32-kanals ZIF stik. (G) I/O pads er indsat i en 32-kanals ZIF stik monteret på en brugerdefineret PCB. ZIF stik er smækket lukkede at gøre kontakt med I/O puder. (H) låsen er cementeret lukket, Printet er vendt på kraniet, og Printet er fast på plads med dental cement. (jeg) The PCB danner en kompakt headstage med en standard forstærker stik til nem interfacing under indspilningerne. Skalere barer = 1 cm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: tilbageholdende og frit bevægelige optagelser. (A) fotografi af en mandlig C57BL/6J mus i en Tilbageholderen under indspilningen. En 32-kanals forforstærker PCB er blevet indsat i standard forstærker stik. (B) fotografi af den samme mus med 32-kanals forforstærker PCB i løbet af en frit bevægende optagelse eksperiment. Skalere barer = 1 cm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9: repræsentative neurale optagelse resultater. (A) repræsentant LFP varme kort fra 32-kanals mesh elektronik sonder injiceres mus hippocampus og somatosensoriske cortex. Data blev registreret mens musen frit udforskede sit bur på 2 måneder (øverst) og 4 måneder (nederst) efter injektion. LFP amplitude er farvekodede ifølge farvelinjen til højre. High-pass filtreret spor (sort) viser spiking aktivitet er overlejret på spektrogram for hver af de 32 kanaler. (B) pigge isoleret efter sortering dataene afbildes i (A). Single-Enhed spiking aktivitet blev opdaget på 26 af de 32 kanaler begge 2 måneder efter injektion (øverst) og 4 måneder efter injektion (nederst). Tal over hver klynge af pigge svarer til kanalnumre i (A). Dette tal er blevet ændret fra Fu, et al. 28. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 10
Figur 10: repræsentative histologi resultater. (A) skematiske illustrerer orienteringen af mesh elektronik inden for vandret (midterste panel) og sagittal (nederste panel) hjerne skiver. (B) Fluorescens mikroskop billede af en 10 µm tykt kortikale hjernen skive et år efter injektion af en 16-kanals mesh elektronik sonde. Skive har været immunostained for NeuN (grøn). (C) den samme hjerne slice immunostained for neurofilament (rød). (D) den samme hjerne slice immunostained for GFAP (cyan). (E) A sammensat billede af (B) til (D) viser trådnet elektronik/væv interface med mærket NeuN (grøn), neurofilament (rød), GFAP (cyan), og mesh elektronik (blå). Skalere barer = 100 µm. Dette tal er blevet ændret fra Fu et al. 27. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende Video 1: gentagne lastning og injektion af mesh elektronik i løsning. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Alle trin i fabrikation og brug af mesh elektronik er vigtige, men et par er især kritisk. Før frigive trådnet elektronikken fra deres wafer, er det vigtigt at oxidere overflade for at gøre masker let suspenderet i vandig opløsning (trin 1.6.1). Hvis dette trin springes over, maskerne normalt flyder på overfladen af vandet, hvilket gør dem svære at indlæse i nåle, og hvis de kan indlæses, de ofte klæbe til siderne af glas nåle, der kræver store mængder (> 100 µL) til injektion. Manglende evne til at oxidere overfladen før udgivelsen, derfor typisk betyder, at maskerne ikke kan benyttes og fremstilling skal re udføres fra begyndelsen. En anden kritisk trin bøjning trådnet elektronikken "stammer" ~ 90 ° under I/O grænseflade (trin 4.3). Hvis vinklen er mindre end 90°, vil så alle 32 I/O puder ikke passe ind i ZIF stik; nogle vil have skal skæres ud i slutningen at tillade indsættelse, reduktion af antallet af tilsluttede elektroder. Processen skal også gøres forsigtigt for at forhindre stammen fra at bryde.

Design af mesh elektronik kan tilpasses til forskellige anvendelser af modificerer komponeneter og bruger den samme fabrikation procedure skitseret i figur 2. For eksempel, mens de trådnet elektronik sonder anvendes til at registrere data i figur 9 var designet til at have 32 optagelse elektroder span mus hippocampus og primære somatosensoriske cortex, kan elektrode placering i masken for ultraflexible være valgt for at målrette næsten enhver hjerne region(er) eller større elektroder til stimulation kan blive indarbejdet27. De samme grundlæggende mesh struktur og fabrikation procedure bevares, men elektrode placering og design er justeret for at opfylde behovene i undersøgelsen. Efterforskere bør være forsigtig, men, og altid test at modificerede design kan injiceres let gennem de tilsigtede nåle. Små ændringer til bøjning mekanik af mesh elektronik kan have væsentlig indvirkning på injektionsydelse. Et eksempel er at en 45° vinkel mellem tværgående og langsgående SU-8 bånd giver en mesh elektronik sonde, der kan sprøjtes facilely men en 90° vinkel resulterer i en crumples og træsko nåle21.

Måling impedans af optagelse elektroder er nyttigt til fejlfinding. En 20 µm diameter cirkulære Pt elektrode bør have en impedans størrelsesorden nær 1 MΩ, naar det maales ved en frekvens på 1 kHz i vivo eller i 1 x PBS29. Impedans betydeligt større end dette indebærer, at elektroden er ikke udsat, som kan ske, hvis det er forurenet med photoresist rester, eller ikke elektrisk forbundet. Sidstnævnte kan opstå hvis for eksempel der er støv på foto maske under PL, der resulterer i en afbryder i Au forbindelser, eller hvis en af trådnet I/O puder ikke er kontaktet af stikbenene ZIF under I/O interfacing. En impedans størrelsesorden omtrent halvdelen den forventede værdi tyder på, at Kanalen kan være kortsluttet til den tilstødende, at skabe et kredsløb af to elektrode impedances parallelt med hinanden. De målte impedans værdier fungere som en vejledning under fejlfinding; kombineret med optisk mikroskopi af mesh elektronik sonder, kilden til problemet kan normalt identificeres og korrigeres i overensstemmelse hermed i den næste fabrikation køre eller I/O interfacing forsøg.

Brugen af sprøjte-injicerbar mesh elektronik til akutte undersøgelser er begrænset, single-Enhed spiking aktivitet ikke er normalt observeret indtil 1 uge post injektion27, selv om de seneste arbejde (upubliceret) viser, at dette problem let overvinde. Vigtige determinanter af tid at se spiking aktivitet er trådnet design, mængden af væske indsprøjtes i hjernen sammen med mesh elektronik og diameteren af nålen anvendes til injektion, da disse påvirker graden af vævsskade i løbet af de injektion og hastigheden af healing. Store injektionsvolumener kan være nødvendig, hvis trådnet elektronikken ikke behandles med ilt plasma før udgivelsen i Ni TIPkan; det vil sige, hvis trådnet ikke er hydrofile, kan det tiltræde glas nålen. Lejlighedsvis, har maskerne defekter, der fører til bøjning mekanik, som gør dem vanskelige at injicere. Under indlæsningen af trådnet elektronikken er det vigtigt at kontrollere, at maskerne bevæger sig let og smidigt inden for nålen (som vist i supplerende Video 1). Hvis ikke, en anden mesh elektroniske sonden bør anvendes. Bedste resultater for problemfri neurale samspil kan opnås med de ideelle injektionsvolumener på 10-50 µL pr. 4 mm af injicerede mesh længde. Nyere resultater med finere mesh elektronik sonder injiceres og/eller mindre diameter kapillær nåle (så små som 150 µm indre diameter, 250 µm ydre diameter) viser, at Enhed spiking kan observeres fra kort efter injektion (akut målinger) gennem længere tid. Maske design filer til disse finere mesh strukturer er tilgængelige ved anmodning eller fra ressource hjemmeside, meshelectronics.org. Vi anslår, at det samlede udbytte af vores i vivo mesh injektion procedurer ved hjælp af 400 µm indre diameter (650 µm ydre diameter) nåle til omkring 70%, selv om udbyttet er tættere på 80-90% for vores nyere arbejde med 150 µm indre diameter (250 µm ydre diameter ) nåle. De mest almindelige årsager til manglende er (1) at trådnet ikke injicere gnidningsløst, der resulterer i hjerneødem fra uventet store injektionsvolumener ind i hjernen, (2) mesh brud under manuel manipulation kræves i I/O interfacing procedure, og (3) blødning fra beskadige et blodkar under injektion. Beskadige et blodkar under injektion er sjældne (årsag til mindre end 10% af fejl) og kan reduceres yderligere ved hjælp af billede-styrede kirurgi. Vi bemærker også, at beskadigelse af blodkar er en fælles begrænsning af alle procedurer, der involverer penetration af hjernevæv, herunder indsprøjtning af virale partikler for Transfektion, implantation af stive hjernen sonder og injektion af trådnet elektronikken.

Mesh elektronik sonder er i stand til stabilt optage fra og spore de samme individuelle neuroner på mindst måneder til år tidsfrister og fremkalder næsten ingen kronisk immunrespons, som vist i figur 9 og figur 10, henholdsvis. Dette repræsenterer en betydelig fordel i forhold til konventionen dybde elektroder, som ofte lider af faldende spike amplituder, ustabile signaler og kronisk betændelse i løbet af langsigtede optagelse eksperimenter14, 15. Derudover trådnet elektronikken har den fordel, at de kan være tilbage i vævet under histologiske skæring, farvning, billedbehandling, i modsætning til konventionelle sonder, som er alt for stive og skal derfor fjernes inden histologi analyser. Derfor, mesh elektronik giver mulighed for den unikke evne til at bruge immunhistokemisk analyse at netop studere de cellulære miljø omkring hver optagelse site.

Protokollen præsenteret her åbner op spændende nye muligheder i neurovidenskab. Minimalt invasive leveringsmetode og problemfri integration af mesh elektronik med hjernevæv minimerer afbrydelser til neurale kredsløb og undgår kronisk immunrespons, som kunne gavne de fleste former for kroniske neurale optagelse eksperimenter. Evne til mesh elektronik til at registrere og spore de samme enkelt neuroner for lange perioder vil især være af interesse for efterforskere forsøger at korrelere millisekund-skala spiking aktivitet med måned-år lange processer såsom aldring, den patogenesen af hjernesygdom eller hjerne udvikling16,18. Derudover findes der betydelige muligheder for at udvide og tilpasse denne protokol, såsom at tilføje aktive elektronik til PCB hoved-scenen for at gennemføre funktionalitet som digital multiplexing8,35, trådløs meddelelse35,36,37, og signalbehandling35, co injektion af stamceller eller polymerer med trådnet elektronikken til støtte i væv revitalisering18,38, 39, og indarbejde Nanotråd felt - effekten transistorer (NW-FETs) i mesh elektronik for stærkt lokaliseret og multifunktionelle hjernen sonder24,29,40,41 ,42.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

C.M.L. anerkender støtte dette arbejde ved Air Force Office for videnskabelig forskning (FA9550-14-1-0136), en Harvard University Physical Sciences og Engineering Accelerator award og en nationale institutter for Health direktørs Pioneer Award ( 1DP1EB025835-01). T.G.S. anerkender støtte af Department of Defense (DoD) gennem de nationale forsvar Science & Engineering Graduate stipendium (NDSEG) program. G.H. anerkender fellowship støtte fra American Heart Association (16POST27250219) og vejen til uafhængighed Award (Parent K99/R00) fra National Institute on Aging af National Institutes of Health. Dette arbejde blev udført dels ved Harvard University Center for nanoskala systemer (CNS), medlem af den nationale nanoteknologi koordineret infrastruktur netværk (NNCI), som støttes af National Science Foundation under NSF ECCS Award nr. 1541959.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Motorized stereotaxic frame World Precision Instruments MTM-3 For mouse stereotaxic surgery
512-channel recording controller Intan Technologies C3004 A component of the neural recording system
RHD2132 amplifier board Intan Technologies C3314 A component of the neural recording system
RHD2000 3 feet ultra thin SPI interface cable Intan Technologies C3213 A component of the neural recording system
Mouse restrainer Braintree Scientific TV-150 STD Standard 1.25 inch inner diameter; used to restrain the mouse during restrained recording sessions.
Si wafers Nova Electronic Materials 3" P <100> .001-.005 ohm-cm 356-406 μm Thick
Prime Grade SSP Si wafers w/2 Semi-Std. Flats &
6,000 A°±5% Wet Thermal Oxide on both sides.
Photomasks (chrome on soda lime glass) Advance Reproductions Advance Reproductions and other vendors manufacture photomasks from provided design files. Our photomask design files are available by request or from the resource website, meshelectronics.org. Alternatively, some university clean rooms have mask writers for making photomasks on site.
AutoCAD software Autodesk Inc. Design software for drawing photomasks. A free alternative is LayoutEditor. Our photomask design files are available by request or from the resource website, meshelectronics.org.
Thermal evaporator Sharon Vacuum Used to evaporate Ni, Cr, and Au onto mesh electronics during fabrication. Many university clean rooms have this or a similar tool.
SU-8 2000.5 negative photoresist MicroChem Corp. Negative photoresist used to define the bottom and top passivating layers of mesh electronics.
MA6 mask aligner Karl Suss Microtec AG Used to align each photomask to the pattern on the wafer and expose the wafer to UV light. Most university clean rooms have this or a similar tool.
SU-8 developer MicroChem Corp. Used to develop SU-8 negative photoresist following exposure to UV light.
LOR3A lift-off resist MicroChem Corp. Used with Shipley 1805 photoresist to promote undercutting during metal lift-off processes
Shipley 1805 positive photoresist Microposit, The Dow Chemical Company Positive photoresist used to define metal interconnects and Pt electrodes in mesh electronics
MF-CD-26 positive photoresist developer Microposit, The Dow Chemical Company To develop S1805 positive photoresist after exposure in a mask aligner. Many university clean rooms stock this chemical.
Spin coater Reynolds Tech For coating wafers with positive and negative resists. Most university clean rooms have spin coaters.
PJ plasma surface treatment system AST Products, Inc. Used to oxidize the surface of mesh electronics prior to release into aqueous solution. Most university clean rooms have this or a similar tool.
Electron beam evaporator Denton Vacuum For evaporating Cr and Pt during fabrication of mesh electronics. Many university clean rooms have this or a similar tool.
Remover PG MicroChem Corp. Used to dissolve LOR3A and Shipley S1805 resists during metal lift-off
Ferric chloride solution MG Chemicals 415-1L A component of Ni etching solution
36% hydrochloric acid solution Kanto Corp. A component of Ni etching solution
Glass capillary needles Drummond Scientific Co. Inner diameter 0.40 mm, outer diameter 0.65 mm. Other diameters are available.
Micropipette holder U-type Molecular Devices, LLC 1-HL-U Used to hold the glass capillary needles during stereotaxic injection
1 mL syringe NORM-JECT®, Henke Sass Wolf Used for manual loading of mesh electronics into capillary needles
Polyethylene intrademic catheter tubing Becton Dickinson and Company Inner diameter 1.19 mm, outer diameter 1.70 mm
5 mL syringe Becton Dickinson and Company Used in the syringe pump for injection of mesh electronics in vivo
Eyepiece camera Thorlabs Inc. DCC1240C Used to view mesh electronics within capillary needles during injection
ThorCam uc480 image acquisition software for USB cameras Thorlabs Inc. Used to view mesh electronics within capillary needles during injection
Syringe pump Harvard Apparatus PHD 2000 Used to flow precise volumes of solution through capillary needles during injection of mesh electronics
EXL-M40 dental drill Osada 3144-830 For drilling the craniotomy
0.9 mm drill burr Fine Science Tools 19007-09 For drilling the craniotomy
Hot bead sterilizer 14 cm Fine Science Tools 18000-50 Used to sterlize surgical instruments
CM1950 cryosectioning instrument Leica Microsystems Used to slice frozen tissue into sections. Many universities have this or a similar tool available in a shared facility.
0.3% Triton x-100 Life Technologies Used for histology
5% goat serum Life Technologies Used for histology
3% goat serum Life Technologies Used for histology
Rabbit anti-NeuN Abcam ab177487 Used for histology
Mouse anti-Neurofilament Abcam ab8135 Used for histology
Rat anti-GFAP Thermo Fisher Scientific Inc. PA516291 Used for histology
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific Inc. P36930 Used for histology
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich Corp. P6407-5MG Molecular weight = 70-150 kDA
Right-angle end clamp Thorlabs Inc. RA180/M Used to attach the pipette holder to the stereotaxic frame
Printed circuit board (PCB) Advanced Circuits Used to interface between mesh electronics and peripheral measurement electronics such as the Intan recording system. Advanced Circuits and other vendors manufacture and assemble PCBs based on provided design files. Our PCB design files are available by request or at the resource site meshelectronics.org
32-channel standard amplifier connector Omnetics Connector Corp. A79024-001 Component assembled onto the PCB
32-channel flat flexible cable (FFC) Molex, LLC 152660339 Used as a clamping substrate when interfacing to mesh electronics I/O pads with the PCB-mounted ZIF connector
32-channel zero insertion force (ZIF) connector Hirose Electric Co., LTD FH12A-32S-0.5SH(55) Component assembled onto the PCB

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lopes da Silva, F. EEG and MEG: relevance to neuroscience. Neuron. 80 (5), 1112-1128 (2013).
  2. Logothetis, N. K. What we can do and what we cannot do with fMRI. Nature. 453 (7197), 869-878 (2008).
  3. Seymour, J. P., Wu, F., Wise, K. D., Yoon, E. State-of-the-art MEMS and microsystem tools for brain research. Microsystems & Nanoengineering. 3, 16066 (2017).
  4. Buzsaki, G. Rhythms of the Brain. , Oxford University Press. (2006).
  5. Khodagholy, D., et al. NeuroGrid: recording action potentials from the surface of the brain. Nature Neuroscience. , (2014).
  6. Hamel, E. J., Grewe, B. F., Parker, J. G., Schnitzer, M. J. Cellular level brain imaging in behaving mammals: an engineering approach. Neuron. 86 (1), 140-159 (2015).
  7. Jun, J. J., et al. Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature. 551 (7679), 232-236 (2017).
  8. Berenyi, A., et al. Large-scale, high-density (up to 512 channels) recording of local circuits in behaving animals. Journal of Neurophysiology. 111 (5), 1132-1149 (2014).
  9. Scholvin, J., et al. Close-Packed Silicon Microelectrodes for Scalable Spatially Oversampled Neural Recording. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 63 (1), 120-130 (2016).
  10. Schiller, P. H. The Central Visual System. Vision Research. 26 (9), 1351-1386 (1986).
  11. Benabid, A. L., Chabardes, S., Mitrofanis, J., Pollak, P. Deep brain stimulation of the subthalamic nucleus for the treatment of Parkinson's disease. The Lancet Neurology. 8 (1), 67-81 (2009).
  12. Hochberg, L. R., et al. Reach and grasp by people with tetraplegia using a neurally controlled robotic arm. Nature. 485 (7398), 372-375 (2012).
  13. Lebedev, M. A., Nicolelis, M. A. Brain-Machine Interfaces: From Basic Science to Neuroprostheses and Neurorehabilitation. Physiological Reviews. 97 (2), 767-837 (2017).
  14. Polikov, V. S., Tresco, P. A., Reichert, W. M. Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 148 (1), 1-18 (2005).
  15. Perge, J. A., et al. Intra-day signal instabilities affect decoding performance in an intracortical neural interface system. Journal of Neural Engineering. 10 (3), 036004 (2013).
  16. Hong, G., Yang, X., Zhou, T., Lieber, C. M. Mesh electronics: a new paradigm for tissue-like brain probes. Current Opinion in Neurobiology. 50, 33-41 (2017).
  17. Dai, X., Hong, G., Gao, T., Lieber, C. M. Mesh Nanoelectronics: Seamless Integration of Electronics with Tissues. Accounts of Chemical Research. 51 (2), 309-318 (2018).
  18. Feiner, R., Dvir, T. Tissue-electronics interfaces: from implantable devices to engineered tissues. Nature Reviews Materials. 3 (1), 17076 (2017).
  19. Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M., Siegelbaum, S. A., Hudspeth, A. J. Principles of Neural Science. , McFraw-Hill. (2013).
  20. Rousche, P. J., et al. Flexible polyimide-based intracortical electrode arrays with bioactive capability. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 48 (3), 361-371 (2001).
  21. Liu, J., et al. Syringe-injectable electronics. Nature Nanotechnology. 10 (7), 629-636 (2015).
  22. Kasthuri, N., et al. Saturated Reconstruction of a Volume of Neocortex. Cell. 162 (3), 648-661 (2015).
  23. Saxena, T., Bellamkonda, R. V. A sensor web for neurons. Nature Materials. 14, 1190-1191 (2015).
  24. Xie, C., et al. Three-dimensional macroporous nanoelectronic networks as minimally invasive brain probes. Nature Materials. 14 (12), 1286-1292 (2015).
  25. Hong, G., et al. Syringe Injectable Electronics: Precise Targeted Delivery with Quantitative Input/Output Connectivity. Nano Letters. 15 (10), 6979-6984 (2015).
  26. Zhou, T., et al. Syringe-injectable mesh electronics integrate seamlessly with minimal chronic immune response in the brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (23), 5894-5899 (2017).
  27. Fu, T. M., et al. Stable long-term chronic brain mapping at the single-neuron level. Nature Methods. 13 (10), 875-882 (2016).
  28. Fu, T. M., Hong, G., Viveros, R. D., Zhou, T., Lieber, C. M. Highly scalable multichannel mesh electronics for stable chronic brain electrophysiology. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (47), E10046-E10055 (2017).
  29. Schuhmann, T. G. Jr, Yao, J., Hong, G., Fu, T. M., Lieber, C. M. Syringe-Injectable Electronics with a Plug-and-Play Input/Output Interface. Nano Letters. 17 (9), 5836-5842 (2017).
  30. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
  31. Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. Stereotaxic surgery for excitotoxic lesion of specific brain areas in the adult rat. Journal of Visualized Experiments. (65), e4079 (2012).
  32. Gage, G. J., et al. Surgical implantation of chronic neural electrodes for recording single unit activity and electrocorticographic signals. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).
  33. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Rodent Handling and Restraint Techniques. , Journal of Visualized Experiments. Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/10221/rodent-handling-and-restraint-techniques (2018).
  34. Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons. Journal of Visualized Experiments. 10 (99), e52293 (2015).
  35. Sodagar, A. M., Perlin, G. E., Yao, Y., Najafi, K., Wise, K. D. An Implantable 64-Channel Wireless Microsystem for Single-Unit Neural Recording. IEEE Journal of Solid-State Circuits. 44 (9), 2591-2604 (2009).
  36. Wentz, C. T., et al. A wirelessly powered and controlled device for optical neural control of freely-behaving animals. Journal of Neural Engineering. 8 (4), 046021 (2011).
  37. Harrison, R. R., et al. Wireless neural recording with single low-power integrated circuit. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 17 (4), 322-329 (2009).
  38. Landa, N., et al. Effect of injectable alginate implant on cardiac remodeling and function after recent and old infarcts in rat. Circulation. 117 (11), 1388-1396 (2008).
  39. Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
  40. Zhang, A., Lieber, C. M. Nano-Bioelectronics. Chemical Reviews. 116 (1), 215-257 (2016).
  41. Zhou, W., Dai, X., Lieber, C. M. Advances in nanowire bioelectronics. Reports on Progress in Physics. 80 (1), 016701 (2017).
  42. Dai, X., Zhou, W., Gao, T., Liu, J., Lieber, C. M. Three-dimensional mapping and regulation of action potential propagation in nanoelectronics-innervated tissues. Nature Nanotechnology. 11 (9), 776-782 (2016).

Tags

Bioteknologi sag 137 hjernen sonde neurale interface plug-and-play tilslutning bioelektronik storstilet neurale optagelse kronisk brain mapping væv-lignende ultraflexible nano-bio interface
Sprøjte-injicerbar Mesh elektronik til stabil kronisk gnaver Elektrofysiologi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schuhmann Jr., T. G., Zhou, T.,… More

Schuhmann Jr., T. G., Zhou, T., Hong, G., Lee, J. M., Fu, T. M., Park, H. G., Lieber, C. M. Syringe-injectable Mesh Electronics for Stable Chronic Rodent Electrophysiology. J. Vis. Exp. (137), e58003, doi:10.3791/58003 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter