Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Sprøyte-injectable Mesh elektronikk for stabil kronisk gnager elektrofysiologi

Published: July 21, 2018 doi: 10.3791/58003
Automatic Translation
1, 2, 2, 2,3, 2, 3, 1,2
1John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences, Harvard University, 2Department of Chemistry and Chemical Biology, Harvard University, 3Department of Physics, Korea University

Summary

Mesh elektronikk sonder sømløst integrere og gir stabil, langsiktig, enkelt-Nevron opptak i hjernen. Denne protokollen bruker mesh elektronikk for i vivo eksperimenter, som involverer fabrikasjon av mesh elektronikk, laster inn nåler, stereotaxic injeksjon, inngang/utgang grensesnitt, innspillingen eksperimenter og histology av vev som inneholder mesh sonder.

Abstract

Implanterbare hjernen elektrofysiologi sonder er verdifulle verktøy i nevrovitenskap evne til å nevrale aktiviteten med høy spatiotemporal oppløsning fra grunne og dype hjernen regioner. Bruken har blitt hindret, men av mekanisk og strukturelle uoverensstemmelser mellom sonder og hjernen vev som vanligvis føre til micromotion og gliosis med fører signal ustabilitet i kronisk opptak eksperimenter. I kontrast, etter implantering av ultraflexible maske elektronikk via sprøyte injeksjon, sonder mesh skjemaet en sømløs, gliosis-fri grensesnitt med omkringliggende hjernevev hvor stabil sporing av individuelle neurons på minst et år tidsskalaen. Denne protokollen detaljer de viktigste trinnene i en vanlig mus nevrale opptak eksperimentere med sprøyte-injectable mesh elektronikk, inkludert fabrikasjon av mesh elektronikk i en standard klima og jordsmonn-baserte prosess mulig på mange universiteter, lasting mesh elektronikk i standard kapillær nåler, stereotaxic injeksjon i vivo, tilkobling av mesh inndata/utdata til standard instrumentering grensesnitt, behersket eller fritt flytte innspillingene, og histologiske snitting av hjernen vev som inneholder maske elektronikk. Representant nevrale opptak og histology data presenteres. Etterforskerne kjent med denne protokollen har kunnskaper til å innlemme mesh elektronikk i egne eksperimenter og dra nytte av de unike mulighetene som gis av langsiktig stabil neural grensesnitt, som studier av aldring prosesser, hjernens utvikling og patogenesen av hjernesykdom.

Introduction

Utvikling av verktøy kan tilordne hjernen med enkelt-Nevron oppløsning er av sentral betydning for Nevrologi og nevrovitenskap. Noninvasiv teknologier for neural studier som Elektroencefalogram (EEG), magnetoencephalography (MEG) og funksjonell magnetisk resonans imaging (fMRI) har vist seg verdifulle samkjøre hjerneaktiviteten med atferd i mennesker1, 2, men de mangler den spatiotemporal nødvendige oppløsingen for studerer strukturen og dynamikken i nevrale nettverk på deres grunnleggende mikrometer og millisekund skalaer, henholdsvis3,4. Visse electrocorticography (ECoG) prober og optisk tenkelig metoder å bruke spenning-sensitive fargestoffer har lyktes i opptak enheter skyter aktivitet i vivo5,6, men de er generelt effektive bare nær den hjernen overflaten, begrense anvendelighet til studier av grunne hjernen regioner. Derimot implanterbare elektrisk sonder kan måle enkelt-Nevron elektrofysiologi i fritt flytte dyr fra nesten alle hjernen regionen uten behov for fluorescerende merking, gjør dem uunnværlige til systemer nivå nevrovitenskap, spesielt som microfabrication teknikker fra semiconductor industry har skjøvet teller kanal i hundrevis og tusenvis3,7,8,9. I kraft av disse mulighetene har implanterbare elektrisk sonder gjort mange viktige bidrag til nevrovitenskap og nevrologi, inkludert grunnleggende studier av informasjonsbehandling i visuelle systemet10, behandling av nevrologiske lidelser som Parkinsons sykdom11og demonstrasjon av hjerne-maskin-grensesnitt (BMIs) for avansert protetikk12,13.

Likevel, langsiktig ustabilitet manifestert som reduserer spike amplitudes og ustabil signaler på tidsskalaer uker til måneder14,15 har begrenset anvendbarhet av implanterbare sonder til studiet av relativt kortsiktige fenomener, leaving spørsmål som hjernens aldring og utvikling i stor grad ubesvart. Begrensningene i langsiktig ustabilitet er et resultat av en konflikt mellom konvensjonelle sonder og hjernevev i størrelse, mekanikk og topologi,14,,15,,16,,17,,18. I størrelse, mens neuronal synapser og somata er omtrent ti nanometer titalls mikrometer i diameter19, henholdsvis tradisjonelle sonder er ofte betydelig større, i tilfelle av silisium microelectrode matriser > 4 ganger størrelsen på en enkelt Nevron celle kroppen7,8. Den relativt store størrelsen av disse sonder kan forstyrre den naturlige strukturen og tilkobling av tett nevrale vevet, dermed bidra til kronisk immunrespons og perturbing nerve kretssystem blir studert. I form av mekaniske egenskaper er tradisjonelle sonder drastisk stivere enn ekstremt nevrale bløtvev der de er implantert; selv "fleksible" sonder fra 10-20 µm tykt ark av polyimid (pi) er minst 100.000 ganger stivere enn hjernen vev20,21. Denne konflikten i bøying stivhet forårsaker relative skjær bevegelse mellom sonde og hjernen vev, fører til upålitelige enheter sporing under utvidet opptak og inducing kronisk gliosis på webområdet implantasjon. Endelig ekskluderer topologisk strukturen av konvensjonelle hjernen sonder nødvendigvis et solid volum av vev. Slike feil i topologi forstyrrer tilkobling av nevrale kretser, utelukker naturlig tredimensjonale (3D) interpenetrated distribusjon av neurons, gliacellene og blodårer i hjernen vev22og hindrer 3D transport av signalnettverk molekyler23. Sammen har disse svakhetene av konvensjonelle sonder gjort dem bommer langsiktige kompatibiliteten søkt for klinisk bruk og langsgående nevrovitenskap studier på enkelt-neuron nivå.

For å overvinne disse svakhetene, ønsket vi å dimme linjen mellom nevrale og elektroniske systemer ved å utvikle et nytt paradigme av "vev-like" nevrale sonder kalt mesh elektronikk16,21,24. Mesh elektronikk løser problemene ovenfor samsvarende i størrelse, mekanikk og topologi ved å innlemme (1) strukturelle funksjoner av den samme nanometer mikrometer størrelse skala av nevrale vev, (2) mekaniske egenskaper ligner på de av hjernevevet, og (3) en 3D macroporous-topologi som > 90% åpne plass og dermed tilpasset interpenetration av neurons og spredningen av molekyler gjennom det ekstracellulære miljøet. Mesh elektronikk sonder kan leveres til bestemte hjernen regioner nettopp gjennom en sprøyte og en nål, forårsaker minimal akutte skader mens implanting selv i dypt hjernen regioner21,25. Neuronal soma og axons har vist seg å interpenetrate åpne 3D-nett elektronikk sonde strukturen i uker etter injeksjon, og dermed skape en sømløs, gliosis-fri grensesnittet mellom opptak elektronikk og omgir hjernen vev21 , 26 , 27. disse unike funksjoner har aktivert mesh elektronikk sonder stabilt spore skyter aktivitet fra samme individuelle neurons over minst et år tidsskalaen27. Videre gir fabrikasjon av mesh elektronikk basert på klima og jordsmonn (PL) høy skalerbarhet antall elektroder som kan innlemmes, med demonstrert kanal teller opptil 128 elektroder per sonde med enkel kontakt maske Litografi 28 og en plug-and-play inndata/utdata (i/u) design som tillater for rask tilkobling til eksterne elektronikk uten spesialisert utstyr29.

En rekke studier kan nytte innlemmer mesh elektronikk i måling protokoller. De fleste intracortical innspillingen eksperimenter kan ha nytte av mesh elektronikk minimal invasiv implantasjon prosedyrer via sprøyte injeksjon, drastisk redusert immunrespons etter implantasjon, og muligheten til å forlate mesh elektronikk i den vev under påfølgende histologi og immunostai-for analyse av biologiske miljøet rundt opptaksrom. Kronisk opptak eksperimenter vil spesielt få fra unike evne til mesh elektronikk til å spore mange individuelle neurons for måneder til år. Dette skaper muligheter for studier med enkelt-Nevron oppløsning som var tidligere upraktisk, som langsgående aldring studier av nevrale kretser, undersøkelser av utvikle hjernen og henvendelser i patogenesen av encephalopathies16.

I denne protokollen beskriver vi alle nøkkelen trinn i en vanlig mus nevrale opptak eksperimentere med sprøyte-injectable mesh elektronikk (se figur 1). Fremgangsmåten er fabrikasjon av mesh elektronikk i en standard PL-baserte prosessen mulig på mange universiteter, lasting maske elektronikk til standard kapillær nåler, stereotaxic injeksjon mesh elektronikk i vivo, tilkobling av den maske I/O standard instrumentering grensesnitt, behersket eller fritt bevegelige innspillingen og histologiske snitting av hjernevev som inneholder mesh elektronikk. Noen forskere bruke mesh elektronikk bare for histology studier krever ikke elektrisk grensesnitt og opptak, da de kan hoppe over disse trinnene. Etter kjent seg med denne protokollen, bør etterforskere ha all kunnskapen som er nødvendig å bruke mesh elektronikk i egne eksperimenter.

Protocol

Alle prosedyrer utført på vertebrate dyr fag ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av Harvard University.

1. fabrikasjon av Mesh elektronikk

Merk: Fremgangsmåten som er beskrevet i denne delen er ment for bruk i en standard universitetet rent anlegg, for eksempel for nanoskala systemer (CNS) ved Harvard University. Dette anlegget samt lignende fasiliteter er tilgjengelige for eksterne brukere rundt USA, for eksempel som en del av den nasjonale nanoteknologi infrastruktur nettverk (NNIN) støttes av National Science Foundation (NSF). I disse fasilitetene, mange av de verktøy, utstyr og materialer som er beskrevet i denne delen leveres med tilgang til funksjonen rent og ville ikke kreve separate kjøp.

Advarsel: Mange av kjemikaliene som brukes i produksjon av mesh elektronikk er farlige, inkludert motstår, CD-26, fjerne PG, SU-8 utvikler og Ni etsing løsningen. Se materialer HMS-Datablad (MSDS) for disse kjemikaliene før bruk og implementere og følge riktige sikkerhetstiltak hele tiden.

  1. Termisk fordampe 100 nm i Ni på en ren Si wafer.
    Merk: Typisk avsetning parametere er base presset av 5 x 10-7 T og på 1 – 2 Å/s. Tynne lag av Ni fungerer som en oppofrende lag som vil senere oppløses for å løslate mesh elektronikk fra kjeks.
  2. Bruk den første PL masken (PL maske-1) for å definere bunnen passivating laget av mesh med SU-8 negative photoresist (figur 2A).
    Merk: PL er en standard microfabrication teknikk der ultrafiolett (UV) lys skinte på en maske holdt over en lysfølsomme substrat. Lys enten gjør uløselig (negativ motstår) eller løselig (positiv motstår) utsatte områder på underlaget. Maskene er i dataassistert konstruksjon (CAD) programvare og deretter vanligvis bestilt fra en leverandør. En maske aligner brukes til å justere masker til eksisterende mønstre på et substrat og utsette dem for UV-lyset. Fabrikasjon av mesh krever fire forskjellige masker (PL maske-1 til PL maske-4). Våre maske design er tilgjengelig ved forespørsel eller fra ressursen nettsted, meshelectronics.org.
    1. Spin-coat SU-8 2000.5 negative photoresist bort på kjeks ved 4000 rpm for en omtrentlig SU-8 tykkelsen på 400-500 nm.
    2. Myk bake kjeks på en kokeplate for 1 min på 65 ° C etterfulgt av 1 min på 95 ° C.
    3. Legg kjeks i en maske aligner å avsløre de SU-8 med PL maske-1 tilsvarer mesh SU-8 botnlaget. Utsette på en i-line (365 nm wavelength) dose av 100 mJ/cm2.
    4. Innlegget bake kjeks på en kokeplate for 1 min på 65 ° C etterfulgt av 1 min på 95 ° C.
    5. Fordype kjeks i en skuff av SU-8 developer. Forsiktig agitere løsningen for 2 min til mesh mønsteret i SU-8 er fullt utviklet. Skyll i en skuff av isopropyl alkohol for 1 min og blåse tørr.
    6. Hardt bake kjeks på en kokeplate ved 180 ° C i 1 time.
      Merk: SU-8 er vanligvis vanskelig bakt mellom 150 ° C og 250 ° C etter utvikling. Hard bake anneals overflaten sprekker som kan være under utvikling og ytterligere krysskoblinger SU-8 for å sikre mekanisk stabilitet. Hardt bakervarer på 180 ° C for SU-8 botnlaget og 190 ° C i toppen SU-8 lag gir gode resultater for mesh elektronikk.
  3. Bruk PL maske-2 å definere metall forbindelser og I/O pads (figur 2B).
    1. Spin-coat LOR3A bort på kjeks ved 4000 rpm for en omtrentlig tykkelsen på 300 nm.
      Merk: LOR3A er en polydimethylglutarimide-basert motstå hvilke hastigheter undercutting under påfølgende metallization prosedyren.
    2. Stek kjeks på en kokeplate ved 180 ° C i 5 minutter.
    3. Spin-coat S1805 positive photoresist ved 4000 rpm for en omtrentlig tykkelsen på 500 nm.
    4. Stek kjeks på en kokeplate ved 115 ° C i 1 minutt.
    5. Legg kjeks i en maske aligner å utsette S1805 med PL maske-2 tilsvarer metall forbindelser og I/O pads. Utsette på en h-linje (405 nm wavelength) dose 40 mJ/cm2.
    6. Fordype kjeks i en brett av CD-26 photoresist utvikler. Forsiktig agitere løsningen for 1 min til metall sammenkoblinger mønster er fullt utviklet. Skyll i en skuff deionisert vann (DI) for 1 min og blåse tørr.
    7. Termisk fordampe 3 nm i Cr etterfulgt av 80 nm i Au.
      Merk: En base presset av minst 5 x 10-7 T og deponering rate 1 Å/s vanligvis gi den beste filmkvalitet.
    8. Dyppe kjeks i et flatt beaker av remover PG for ca 3 timer før metall har fullt undergrave, forlater metall bare i ønsket interconnect og I/O pad regioner av mesh elektronikk. Skyll i isopropyl alkohol og blåse tørr.
  4. Bruk PL maske-3 for å definere Pt elektroder (figur 2C).
    1. Gjenta 1.3.1 gjennom 1.3.4.
    2. Legg kjeks i masken aligner å avsløre S1805 PL maske-3 tilsvarer Pt elektrodene. Utsette på en h-linje dose 40 mJ/cm2.
    3. Fordype kjeks i en brett av CD-26 photoresist utvikler. Forsiktig agitere løsningen for 1 min til Pt elektroder mønsteret er fullt utviklet. Skyll i en skuff av DI for 1 min og blåse tørr.
    4. Bruke et elektron strålen fordamperen for innskudd 3 nm i Cr etterfulgt av 50 nm i Pt.
      Merk: Typisk avsetning parametere er et base Trykk på 5 x 10-7 T og på 2 Å / s.
    5. Dyppe kjeks i et flatt beaker av remover PG for ca 3 timer før metall har fullt undergrave, forlater Pt bare ved ønsket elektrode maske elektronikk. Skyll i isopropyl alkohol og blåse tørr.
  5. Bruk PL maske-4 for å definere de passivating laget av mesh med SU-8 negative photoresist (figur 2D).
    1. Gjenta 1.2.1 gjennom 1.2.5, unntatt utsette med PL maske-4 tilsvarer det øverste passivating maske laget SU-8.
    2. Hardt bake kjeks på en kokeplate ved 190 ° C i 1 time.
      Merk: Denne temperaturen er 10 ° C høyere enn for hardt bake av bunnen SU-8 (trinn 1.2.6). Denne høy temperatur litt flyten tilpasses bunnen SU-8, slik at den flettes med topplaget SU-8 og dermed danne en enkelt, ubrutt SU-8 struktur.
  6. Mesh elektronikk er nå fylle ut (figur 2E og Figur 3). slipp dem fra Si kjeks ved å løse opp det Ni oppofrende laget.
    1. Behandle kjeks med oksygen plasma 50 W for 1 min. Dette oxidizes SU-8 overflaten, noe som gjør det hydrofile og tillater mesh deaktiveres lett i vandig løsning.
    2. I et flatt beaker, kombinere saltsyre, ferric chloride og DI i volumetriske forholdet 1:1:20 henholdsvis å lage en løsning av Ni etsematerialer.
    3. Dyppe kjeks i et flatt beaker Ni etsematerialer løsningen ca 3 timer før mesh elektronikk er helt frigitt fra Si kjeks.
    4. Bruk en Pasteur pipette overføre utgitt mesh elektronikk sonder fra Ni etsematerialer til en 100 mL kanne av DI. Overføre mesh elektronikk til en frisk kanne av DI minst 3 ganger for å sikre skylling.
    5. Bruke en Pasteur pipette for å overføre mesh elektronikk til en 70/30% etanol/vann-løsning, og bruk pipette overføre mesh elektronikk til sterilt vann til skylling.
      Merk: Etter sterilisering, mesh elektronikk kan overføres til andre løsninger for functionalization. For eksempel for å fremme mobilnettet vedheft, kan mesh elektronikk overføres til en vandig løsning av poly-D-lysin (1 mg/mL) for 24 timer.
    6. Bruk en Pasteur pipette overføre mesh elektronikk sonder til en 100 mL kanne av sterile 1 x fosfat bufret saltvann (PBS) før injeksjon i vivo.

2. legge Mesh elektronikk i nåler

  1. Pipetter holderen som kjøpt er åpen å strømme i begge ender. Forsegle end opposite den sirkulære skruen lås med epoxy, så det er ingen lekkasje under injeksjon (figur 4A). La epoxy stivne før du fortsetter.
  2. En glass kapillær nål inn pipette abonnenten. Feste det på plass med sirkulær stramme skruen og kjegle SKIVE (figur 4B). En 400 µm indre diameter (650 µm ytre diameter) glass kapillær nål ble brukt for denne protokollen. Andre kapillær nål materialer (f.eks., metall) og diametere kan brukes, men kan kreve endringer i utformingen av mesh å sikre injectability.
    Merk: Kapillær nåler mellom 150 µm 1,17 mm indre diameter (250 µm til 1,5 mm ytre diameter) har blitt brukt i vårt laboratorium. Injeksjon gjennom mindre nåler kan fremmes ved gjør vinkelen krysset mellom transverse og langsgående SU-8 mesh elementene mer akutt, redusere bredden på SU-8 mesh elementene, bruke tynnere SU-8, og bruke en grovere (dvs., større enhet celle) mesh struktur. Photomasks for nett utviklet for mindre kapillær nåler er tilgjengelig ved forespørsel eller fra ressursen nettsted, meshelectronics.org. Glass kapillær nåler med en diameter på 400 µm og ytre diameter på 550 µm er også tilgjengelig kommersielt. Dette reduserer den akutte vevsskade forårsaket av injeksjon mens opprettholde kompatibilitet med maskene krever at en 400-µm indre diameter, men de ble ikke brukt for studiene beskrevet her.
  3. Fest 1 mL sprøyte siden utløpet av pipette holderen med en 2-4 cm lengde på kapillære rør.
  4. Glass kapillær nålen inn 100 mL begeret på PBS med mesh elektronikk. Plasser slutten av nålen nær I/O pads av en mesh elektronikk sonde og manuelt trekke sprøyten for å tegne en mesh elektronikk sonde inn nålen (figur 5 og supplerende Video 1).
    Merk: I/O pads, stilk interconnect regionen, og mesh enheten regionen er lett gjenkjennelige med blotte øye når mesh elektronikk sonder er suspendert i løsningen. Dette gjør entydig lasting av mesh inn nåler med riktig retning.
  5. Skyv/trekk sprøytestempelet mens fortsatt midt i saltvann for å justere plasseringen av mesh elektronikk i nålen.
    Merk: Ideal posisjonering er med ultraflexible maske enheten regionen som nær slutten av nålen som mulig. Denne konfigurasjonen reduserer volumet av væske som vil bli satt inn i hjernen mens garanterer regionen enheten injiseres først og I/O pads sist.
  6. Nøye koble kapillær slangen siden utløpet av pipette holderen. Koble den sakte for å unngå å skape en suge styrke som kan endre plasseringen av mesh elektronikk i nålen.

3. stereotaxic injeksjon Mesh elektronikk i levende mus hjernen

Merk: Mus var anesthetized ved intraperitoneal injeksjon med en blanding av 75 mg/kg ketamin og 1 mg/kg dexdomitor. Graden av anestesi ble bekreftet med metoden tå knipe før begynnelsen kirurgi. Kroppstemperatur ble opprettholdt ved å plassere musen på en 37 ° C homeothermic teppe under anestesi. Riktig steril teknikk implementert for kirurgi, inkludert men ikke begrenset til autoklavering alle metall Kirurgiske instrumenter for 1 h før bruk, bruke steriliserte hansker, benytter en hot perle sterilisere hele operasjonen, vedlikehold av et sterilt felt rundt kirurgiske området, desinfisering av plast instrumenter med 70% etanol og depilated hodebunnen ble huden prepped med iodophor før snitt. For overlevelse operasjoner, etter kirurgi, antiobiotic salve ble brukt rundt såret, og musen ble returnert til et bur utstyrt med 37 ° C varmeputen. Mus var ikke tilsyn til de hadde vunnet tilbake tilstrekkelig bevissthet for å opprettholde sternal recumbency. Mus fikk buprenorfin analgesi via intraperitoneal injeksjon på en dose 0,05 mg/kg kroppsvekt hver 12 h opptil 72 h etter operasjonen. Mus ble isolert fra andre dyr etter operasjonen. Mus var euthanized via enten intraperitoneal injeksjon av pentobarbital på en dose av 270 mg/kg kroppsvekt eller via transcardial perfusjon (se trinn 6.1). Etterforskerne kan være Geiger, et al. 30, Kirby, et al. 31og Gage, et al. 32 for detaljer om gnager stereotaxic kirurgi.

  1. Bedøve musen og fastsette den i en stereotaxic ramme.
  2. Bruke okulær smøremiddel på musen er øynene å hindre tørrhet under anestesi.
  3. Bruk en tannlege bore og stereotaxic ramme for å åpne en craniotomy på ønsket koordinatene på skallen. Åpne en andre craniotomy fra injeksjonsstedet for innsetting av en rustfritt stål jording skruen eller wire.
  4. Fikse en klem substrat til skallen med dental sement. Skjær en ca 1 mm store gapet i underlaget å forbedre påliteligheten av folding trinn senere i prosedyren.
    Merk: En flat fleksibel kabel (FFC) kuttet til en "L" figur fungerer godt (figur 7A), selv om mange materialer ville arbeide idet lang idet de er av riktig tykkelse for 32-kanalen null innsetting kraft (ZIF) kontakt (utviklet for 0,18 ± 0.05 mm tykke kabler).
  5. Montere pipette holderen med nålen som inneholder mesh elektronikk stereotaxic til rammen ved hjelp av en rettvinklet slutten klemme (figur 4C og figur 6A).
  6. Knytte siden utløpet av pipette holderen til 5 mL sprøyte festet i en sprøyte pumpe (figur 6D) med en ca 0,5-1 m lengde kapillær rør.
    Merk: Kontroller at det er ingen bobler kapillær slangen før du kobler den til pipette abonnenten. Bobler kan avbryte under injeksjon og hindre en jevn og kontrollert levering av mesh elektronikk.
  7. Bruk stereotaxic rammen for å plassere spissen av nålen på ønsket startstedet i hjernen.
    Merk: Mesh elektronikk sonder her er designet med innspillingen elektroder spredt over en lengde på ca. 2 mm og med første elektroden ligger ca. 0,5 mm fra Start kanten av mesh elektronikk (venstre kant i figur 3A). Derfor bør stereotaxic koordinatene velges slik at igangsettingen plasseringen er 0,5 mm dypere enn hjernen regionen rundt. Spredningen og plasseringen av opptak elektrodene i mesh elektronikk kan velges fritt under maske utformingen og bør velges så innspillingen elektrodene span hjernen områdene av interesse som de er injisert langs deres stereotaxic bane.
  8. Plasser kameraet (figur 6B) for å vise toppen av maske elektronikk sonden i glass nålen. Noen programvare lar brukeren å tegne en linje på skjermen for å merke originalen holdning av mesh elektronikk.
  9. Starte strømmen ved at sprøytepumpen til en lav hastighet og trykker på Start. 10 mL/t er en typisk Start flow rate for en 400 µm indre diameter kapillær nål. Sakte øke infusjonshastigheten hvis mesh elektronikk sonden ikke beveger seg innenfor nålen.
    Merk: Det er viktig å redusere volumet av væske injisert i hjernen da dette kan skade vevet rundt injeksjonsstedet. Best resultat med injeksjon volumer mindre enn 25 µL per 1 mm injisert mesh lengde. Elle verdier er mindre enn halvparten av dette volumet; i vårt laboratorium, vi vanligvis sette inn 10-50 µL per en 4 mm injisert mesh lengde.
  10. Som mesh elektronikk sonden begynner å flytte innenfor nålen, bruk stereotaxic rammen til å tilbakekalle nålen i samme takt som mesh elektronikk sonden er blitt injisert, med merket utgangsposisjonen mesh elektronikk som en guide.
    Merk: Denne fremgangsmåten, kalt synsfelt (FoV) injeksjon metoden25, tillater presis levering av mesh elektronikk til en målrettet hjernen regionen uten crumpling eller forvridning. Ofte reduseres infusjonshastigheten når mesh elektronikk sonden begynner flytte innen nålen. I vårt laboratorium, flyt priser på 20-30 mL/t er ofte nødvendig å overvinne statisk friksjon mellom mesh og kapillær nål vegger, men hastigheten kan deretter bli redusert til 10 mL/t når injeksjon prosessen er igangsatt. Flyt priser og injeksjon volumer er vanligvis mindre for mindre diameter kapillær nåler.
  11. Fortsett strømmer saltvann og trekke nålen før nålen er avsluttet skallen. Stoppe strømmen fra sprøytepumpen.

4. input/output grensesnitt

Merk: på dette punktet, mesh elektronikk sonden har blitt injisert fra ønsket startpunktet i hjernen langs valgte banen. Nålen er blitt ta tilbake og er like over craniotomy med mesh elektronikk forbindelser som spenner fra hjernen til nålen og i/o pads fortsatt inne nålen (figur 7B). Denne delen bruker et kretskort (PCB; Figur 7 Figur 8) grensesnitt på mesh elektronikk sonde. PCB kobler en ZIF-kontakten til en 32-kanals standard forsterker kontakt gjennom et isolerende substrat som blir leder-scenen for neural opptak eksperimenter. PCB er passelig å imøtekomme forskjellige hodet-trinns konfigurasjoner. Vårt design-filer er tilgjengelig på forespørsel eller fra ressurs nettsted, meshelectronics.org og kan brukes til å kjøpe PCB billig fra leverandører av PCB produksjon og montering tjenester.

  1. Bruk stereotaxic rammen å nøye nålen FFC clamping substrat og over gapet, flyter løsningen med sprøytepumpen generere slakk i mesh elektronikk forbindelser (figur 7C).
  2. Når nålen er over klem underlaget og over gapet, fortsette flyten med en rask hastighet å mate mesh elektronikk I/O pads på klem underlaget (figur 7 d).
  3. Bruke pinsett og en pipette av DI, bøye I/O pads til ca. 90° vinkel som nær første I/O puten som mulig.
    Merk: Bøying er nødvendig slik at putene skal settes inn i ZIF-kontakten på en PCB i et senere trinn. ZIF-kontakten er nøyaktig samme bredde som den 32 I/O putene i mesh elektronikk sonden, så en imperfektum 90° bøye, eller en sving ikke oppstår rett før første I/O puten, vil resultere i måtte skjære av I/O pads (venstre pads i figur 7E).
  4. Når I/O pads er justert, utviklet seg, og i 90° vinkel å mesh stammen, tørr dem på plass med forsiktig strømmer komprimert luft.
    Merk: Mesh elektronikk sonder med færre enn 32 kanaler kan være interfaced til med samme 32-kanalen grensesnittet styret. Våre lab bruker for eksempel ofte 16-kanal maske elektronikk sonder med 32-kanals PCB. Dette gir ekstra plass i ZIF-kontakten, gjør grensesnitt enklere, og flere uncontacted kanalene er lett identifiseres som åpne kretser med impedans testing under innspillingen.
  5. Kuttet klem underlaget på en rettlinjet ca 0,5-1 mm fra kanten av I/O pads. Også kuttet av overflødige deler av klem underlaget som vil hindre innsetting i PCB-montert 32-kanals ZIF-kontakten (figur 7F).
  6. Sett I/O pads i ZIF-kontakten på Kretskortet og Lukk låsen (figur 7G). Bruk måling elektronikk måle impedansen mellom kanalene og bakken skruen å bekrefte vellykket grensesnitt. Hvis impedans verdiene er for høy, unlatch i ZIF-kontakten, justere innsetting og retest til vellykket tilkobling er bekreftet.
  7. Dekker ZIF-kontakten og utsatte mesh elektronikk sammenkoblinger med dental sement for beskyttelse. Vend Kretskortet ved gap i underlaget og ordne PCB med sement på musen skallen (figur 7 H).
    Merk: Bøying FFC ved gap reduserer mekanisk belastning som kan noen ganger bryte mesh elektronikk forbindelser.
  8. La sement å stivne, snu PCB i en robust, kompakt hodet-scene for grensesnitt under påfølgende innspillingen (figur 7I).

5. nevrale opptak eksperimenter

  1. Plass musen i et tailveiner eller andre restrainer33. Sett inn forforsterker PCB i standard forsterker kontakten på hodet-trinns PCB. Bruke en egen kabel til bakken referanse skruen.
  2. Behersket opptak, drar du musen i restrainer. Registrere dataene med oppkjøpet datasystemet for den ønskede tidsperioden (figur 8A).
  3. For fritt flytte innspillinger, slipp museknappen fra restrainer etter innsetting forforsterker PCB og jording referanse skruen. Posten for ønsket tidsrom bruke data oppkjøpet systemet når musen oppfører seg fritt (figur 8B).
  4. På slutten av innspillingen, legger du musen tilbake i restrainer, om nødvendig. Fjerne jording ledningen og forforsterker, og slipp museknappen til buret sitt og returnere det til dyr anlegget til neste innspilling.

6. histologiske snitting flekker og Imaging

  1. Vent til ønsket tid etter injeksjon, deretter bedøve musen og transcardially perfuse med formaldehyd. Fjern, fryse og cryosection hjernen i 10-µm tykke skiver. En detaljert protokoll på immunohistochemistry og og kryosnitt av gnager hjernevev finnes i Evilsizor, et al. 34.
    Merk: Hjernevev inneholder mesh elektronikk kan fast og delt normalt, selv om overvåking elektronikk er igjen inne. Dette er en unik evne i forhold til konvensjonelle nevrale sonder, som må fjernes før snitting derfor endre vevet og kan gjøre det vanskelig å analysere probe-vevet grensesnittet.
  2. Skyll avsnittene frosne hjernen vev 3 ganger i 1 x PBS.
  3. Blokkere delene i en løsning av 0,3% Triton X-100 og 5% geit serum i 1 x PBS. La sitte i romtemperatur i 1 time.
  4. Inkuber delene med løsningen av primære antistoffer. Den primære antistoff løsninger her var kanin anti-NeuN (1:200 fortynning), mus anti-Neurofilament (1:400 fortynning) og rotten anti-GFAP (1:500 fortynning) med 0,3% Triton X-100 og 3% geit serum. Ruge over natten på 4 ° C.
  5. Skyll delene 9 ganger for totalt 40 min med 1 x PBS.
  6. Inkuber hjernen avsnittene med løsningen av sekundær antistoffer. Sekundær antistoff løsningene her var Alexa Fluor 488 geit anti-kanin (1:200 fortynning), Alexa Fluor 568 geit anti-musen (1:200 fortynning) og Alexa Fluor 647 geit anti-rotte (1:200 fortynning). Inkuber delene 1t ved romtemperatur.
  7. Skyll delene 9 ganger for totalt 30 min med 1 x PBS.
  8. Montere delene på glass lysbilder med coverslips bruker antifade tilstopper. La lysbildene i mørket minst 24 timer før bildebehandling.
  9. Bilde lysbildene med AC confocal mikroskop med 488 nm, 561 nm, og 633 nm lasere som eksitasjon kildene for Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568 og Alexa Fluor 647, henholdsvis. Bruk differensial forstyrrelser kontrast (DIC) for å image mesh elektronikk på samme mikroskopet for påfølgende overliggende bilder og analyse.

Representative Results

Resultatene vil variere avhengig av dyrearter i studien, målrettet hjernen regionen, tiden siden, mengden av akutte skader påført under injeksjon, og suksessen til i/u grensesnitt prosedyre, blant andre faktorer. Enheter skyter aktivitet kan ikke vises før 1 dag (ved 150 µm indre diameter nåler) til 1 uke etter injeksjon og spike amplituder kan variere 4-6 uker. Figur 9 viser representant elektrofysiologiske data fra en 32-kanals mesh elektronikk sonde injisert i hippocampus og primære somatosensory cortex av en voksen mann C57BL/6J mus. Ca 300-µV amplituden lokale feltet potensialer (LFPs) ble registrert på alle 32 kanaler og enheter skyter aktivitet ble spilt inn på 26 kanaler. LFPs og isolert toppene forble ligner mellom 2 og 4 måneder, antyder en svært stabile grensesnittet mellom opptak elektronikk og neurons over dette utvidet periode. Figur 10 viser representant resultatene av histologiske snitting og immunostai-av hjernevev som inneholder mesh elektronikk 1 år etter injeksjon. Flekker for NeuN, en markør for neural somata og neurofilament, en markør for neural axons, avslører lite eller ingen tap av vev på injeksjonsstedet, antyde sømløs grensesnitt mellom elektronikk og hjernen vev mesh. Flekker for GFAP (en markør for astrocyttene) ytterligere avslører nær-bakgrunn nivåer av astrocyttene rundt mesh elektronikk, indikerer at sin tilstedeværelse utløser lite kronisk immunrespons.

Figure 1
Figur 1: trinnene i en sprøyte-injectable mesh elektronikk eksperimentet. Denne protokollen beskriver alle viktige trinn i et typisk gnager nevrale opptak eksperiment med mesh elektronikk. Eksperimenter vanligvis innebære, for implementering, (1) fabrikasjon av mesh elektronikk, (2) lessing av mesh i kapillær nåler, (3) stereotaxic injeksjon av mesh i hjernen, (4) elektrisk I/O grensesnitt for å mesh elektronikk, (5) behersket eller fritt bevegelige innspillinger og (6) mesh/vev snitting og flekker for histology. I noen studier, kan bare histology data være ønskelig, da trinn (4) og (5) kan hoppet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: skjematisk viser fabrikasjon prosedyren for plug-and-play mesh elektronikk i regionen ultraflexible enhet (øverste rad), stilk sammenkoblinger region (midterste rad) og I/O område (nederste rad). (A) SU-8 negative photoresist (rød) er mønstret med PL maske-1 definere bunnen passivating laget av hver plug-and-play mesh elektronikk probe. (B) mønstre med PL maske-2, termisk fordampning og metall lift-off definere Au forbindelser og I/O pads (gull). (C) mønstre med PL maske-3, elektron strålen fordampning og metall lift-off definere Pt elektroder (blå). (D) SU-8 negative photoresist (rød) er mønstret med PL maske-4 for å definere det øverste passivating laget. Åpninger i SU-8 igjen på hver Pt elektrode og I/O pute. (E) A fullført mesh elektronikk sonde med stiplede boksene som angir plasseringen utvidet på toppen, midten og bunnen rader. Photomask design-filer er tilgjengelig ved forespørsel fra forfatterne eller ressurs området, meshelectronics.org. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: fotografier og optisk mikroskop bilder av plug-and-play mesh elektronikk. (A) flislagt optisk mikroskop bilder av en sprøyte-injectable mesh elektronikk sonde med plug-and-play I/O. Sonden ble avbildet etter ferdigstillelse av fabrikasjon trinn i figur 2 , men før utgivelsen fra Ni-belagt underlaget. Stiplede boksene svarer fra venstre til høyre til deler av den ultraflexible enheten regionen, stammen og I/O region forstørret i C, D og E, henholdsvis. Skala bar = 1 mm. (B) fotografi av en 3 tommers Si wafer inneholder 20 fullført mesh elektronikk sonder. Skala bar = 20 mm. (C) optisk mikroskop-bilde av 20 µm diameter Pt opptak elektrodene i regionen ultraflexible enheten. Skala bar = 100 µm. (D) optisk mikroskop-bilde av høy tetthet Au koblinger i stammen regionen. Hver Au interconnect isolert elektrisk og kobler en enkelt Pt elektrode til en enkelt I/O pad. Skala bar = 100 µm. (E) optisk mikroskop-bilde av I/O pads. Hver blokk består av en sammenleggbar mesh region og en kontinuerlig tynn-film region på stammen. Ikke-ledende SU-8 bånd koble mesh deler av putene sammen for å opprettholde justering. Skala bar = 200 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: montering av apparatet for å holde kapillær nåler under injeksjon. (A) bilde av komponentene i apparatet. Komponenter inkluderer (1) en glass kapillær nål, (2) en pipette holder, (3) en sirkulær skruen lås for pipette holderen, og (4) en kjegle vaskemaskinen for pipette abonnenten. Elementer (2) gjennom (4) er inkludert ved kjøp av en pipette holder. Pilen markerer utløpet av pipette holderen som må limes lukket med epoxy. (B) bilde av pipette holderen etter montering og innsetting av en glass kapillær nål. Ekstra epoxy er synlig ved topp utløpet av pipette holderen (markert med pil) og kapillær rør kobler pipette abonnenten til en sprøyte (vises ikke). (C) bilde av pipette holderen og kapillær nålen etter vedlegget til stereotaxic rammen med en rettvinklet slutten klemme. Skala barer er 1 cm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: lasting av mesh i glass nåler. (A) skjematisk illustrasjon av lasting prosedyren for plug-and-play mesh elektronikk. En glass nål er plassert nær I/O slutten av en mesh elektronikk sonde mens det er suspendert i løsningen. Sprøytestempelet er deretter manuelt trukket for å tegne i mesh elektronikk sonden. Ideal posisjonering er regionen ultraflexible enheten bare innenfor enden på nålen. (B) bilder tilsvarer (A) av en mesh elektronikk sonde som lastes inn i en glass nål. Skalere barer = 2 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: skjematisk stereotaxic kirurgi stasjonen. En motorisert stereotaxic ramme (A) med vedlagte pipette holder brukes til å plassere nålen inn ønsket hjernen regionen. Plasseringen av p og lastet mesh elektronikk overvåkes med en linsen og festet kameraet (B) og vises på en datamaskin (C). En sprøytepumpe (D) renner presis mengder saltvann gjennom nålen, tillater for nøyaktig, kontrollert injeksjon av mesh i ønsket hjernen regionen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: Plug-and-play I/O grensesnitt prosedyren. (A) en FFC clamping underlaget er sikret med dental sement ved siden av craniotomy. (B) Plug-and-play mesh elektronikk som stereotaxically injiseres i ønsket hjernen regionen med metoden FoV. (C) på p, med den I/O putene i mesh elektronikk sonde fortsatt inne, er flyttet over FFC clamping substrat. (D) flyt er gjenopptatt gjennom nålen å mate I/O pads på FFC clamping substrat. (E) I/O putene er bøyd 90 ° i forhold til stammen, utfoldet med gjennomfører siden vendt opp, og tørket på plass. (F) av FFC underlaget er trimmet med saks en lineær ca. 0,5 mm fra kanten av I/O pads. Overflødig underlaget er kuttet bort for å tillate innsetting i en 32-kanals ZIF-kontakten. (G) i/o pads settes inn i en 32-kanals ZIF-kontakten montert på en egendefinert PCB. ZIF-kontakten er låst stengt å kontakt med I/O pads. (H) låsen er sementert lukket, PCB er venda på skallen og PCB er fastmontert med dental sement. (jeg) The PCB danner en kompakt headstage med standard forsterker-kontakt for enkel grensesnitt under innspillingen. Skalere barer = 1 cm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8: behersket og fritt flyttende. (A) bilde av en mannlig C57BL/6J mus i en restrainer under en innspilling. En 32-kanals forforsterker PCB er satt inn i standard forsterker kontakten. (B) bilde av samme musen med 32-kanals forforsterker PCB under en fritt flyttende opptak eksperiment. Skalere barer = 1 cm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 9
Figur 9: representant nevrale opptak resultater. (A) representant LFP varme kart fra 32-kanals mesh elektronikk sonder injiseres i mus hippocampus og somatosensory cortex. Dataene ble spilt inn mens musen fritt utforsket buret sitt på 2 måneder (øverst) og 4 måneder (nederst) etter injeksjon. LFP amplituden er fargekodet etter fargelinjen til høyre. Høypass-filtrerte spor (svart) viser skyter aktivitet er plassert på spectrogram for hver av de 32 kanalene. (B) toppene isolert etter sorterer dataene tegnes i (A). Enheter skyter aktivitet ble oppdaget på 26 til 32 kanaler begge to måneder etter injeksjon (øverst) og 4 måneder etter injeksjon (nederst). Tallene ovenfor hver klynge av toppene tilsvarer kanalnumrene i (A). Dette tallet har blitt endret fra Fu, et al. 28. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 10
Figur 10: representant histology resultater. (A) skjematisk illustrerer retningen av mesh i vannrett (midten panel) og sagittal (nedre panelet) hjernen skiver. (B) fluorescens mikroskop-bilde av en 10 µm tykk kortikale hjernen skive ett år etter injeksjon av en 16-kanal maske elektronikk sonde. Stykket har vært immunostained for NeuN (grønn). (C) samme hjernen stykke immunostained for neurofilament (rød). (D) det samme hjernen stykke immunostained for GFAP (cyan). (E) A sammensatt bilde av (B) til (D) viser elektronikk/vev mesh grensesnitt med merket NeuN (grønn), neurofilament (rød), GFAP (cyan), og mesh elektronikk (blå). Skalere barer = 100 µm. Dette tallet har blitt endret fra Fu et al. 27. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplerende Video 1: gjentatt lasting og injeksjon av mesh i løsningen. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Alle trinn i fabrikasjon og bruk av maske elektronikk er viktig, men noen er spesielt viktig. Før slippe mesh elektronikk fra deres wafer, er det viktig å oksidere overflaten for å gjøre nettet lett suspendert i vandig løsning (trinn 1.6.1). Hvis dette trinnet blir hoppet, maskene vanligvis flyter på overflaten av vannet, noe som gjør dem vanskelig å laste inn nåler, og hvis de kan bli lastet, de ofte holde seg til sidene av glasset nålene krever store mengder (> 100 µL) for injeksjon. Unnlatelse av å oksidere overflaten før utgivelsen, derfor betyr vanligvis at maskene ikke kan brukes og fabrikasjon må være re utføres fra begynnelsen. Et annet viktig skritt er bøyd mesh elektronikk "stem" til ~ 90° under i/u grensesnitt (trinn 4.3). Hvis vinkelen er mindre enn 90°, deretter passer alle 32 I/O putene ikke inn i ZIF-kontakten; noen vil ha til å være kuttet slutten for å tillate innsetting, redusere antall tilkoblede elektroder. Prosessen må også gjøres forsiktig for å forhindre at stammen brytes.

Utformingen av mesh elektronikk kan tilpasses for ulike applikasjoner ved å endre photomasks og bruke den samme fabrikasjon fremgangsmåten beskrevet i figur 2. For eksempel, mens mesh elektronikk sonder brukes til å registrere data i figur 9 ble utformet å ha 32 opptak elektroder span musen hippocampus og primære somatosensory cortex, kan elektrodeplassering i ultraflexible nettet være valgt for å målrette nesten alle hjernen områdene, eller større elektroder stimulering kan være innarbeidet27. Samme grunnleggende mesh struktur og fabrikasjon fremgangsmåte beholdes, men elektrodeplassering og design er justert for å møte behovene til studien. Etterforskerne forsiktig, imidlertid, og alltid teste at endret design kan injiseres lett gjennom tiltenkte nålene. Små endringer i bøying mekanikken i mesh elektronikk kan ha stor innvirkning på injectability. Ett eksempel er at en 45° vinkel mellom transverse og langsgående SU-8-bånd gir en mesh elektronikk sonde som kan injiseres facilely men en 90-graders vinkel resulterer i en som crumples og tresko nåler21.

Måle impedans på opptak elektrodene er nyttig for feilsøking. En 20-µm diameter runde Pt elektrode bør ha en impedans omfanget nær 1 MΩ målt på en frekvens på 1 kHz i vivo eller 1 x PBS29. En impedans betydelig større enn dette innebærer at elektroden ikke utsatt, som kan skje hvis det er forurenset med photoresist rester eller ikke elektrisk koblet. Sistnevnte kan oppstå hvis, for eksempel det er støv på bildet masken under PL som resulterer i en frakobling i Au kobler, eller hvis en av mesh I/O pads ikke kontaktes av ZIF-kontakten pinner under I/O grensesnitt. En impedans omfanget omtrent halvparten forventet verdi antyder at kanalen kan være kortsluttet til den tilstøtende, opprette en krets av to elektrode impedances parallelt med hverandre. Målt impedans verdiene fungerer som styreskinner under feilsøking; kombinert med optisk mikroskopi av mesh elektronikk sonder, kilden til problemet kan vanligvis identifiseres og korrigeres tilsvarende i neste fabrikasjon kjøre eller I/O grensesnitt forsøk.

Bruk av sprøyte-injectable mesh elektronikk for akutt studier er begrenset i at enheter skyter aktivitet vanligvis ikke er observert til 1 uke innlegget injeksjon27, selv om nyere arbeider (upublisert) viser at problemet er lett overvinne. Viktige faktorer som bestemmer tiden det tar å se skyter aktivitet er mesh design, volumet av væske injisert i hjernen med mesh elektronikk og diameteren på nålen brukes for injeksjon, så dette påvirker graden av vevsskade under den injeksjon og frekvensen av helbredelse. Store injeksjon volumer kan være nødvendig hvis mesh elektronikk ikke behandles med oksygen plasma før utgivelsen i Ni etsematerialer; dvs hvis mesh ikke er hydrofile, overholde glass nålen. Noen ganger har maskene som fører til bøying mekanikere som lager dem vanskelig å injisere. Under innlasting av mesh elektronikk er det viktig å sjekke at maskene er flytte enkelt og greit i nålen (som vist i supplerende Video 1). Hvis ikke, en maske elektronisk sonde skal brukes. Beste resultater for sømløs neural grensesnitt vil oppnås med ideelle injeksjon mengder 10-50 µL per 4 mm injisert mesh lengde. Nyere resultater med finere mesh elektronikk sonder injisert og/eller mindre diameter kapillær nåler (så lite som 150 µm indre diameter, 250 µm ytre diameter) viser at enhet skyter kan observeres fra kort tid etter injeksjon (akutt mål) gjennom lengre tid. Maske design-filer for disse finere mesh strukturer er tilgjengelig ved forespørsel eller fra ressurs nettsted, meshelectronics.org. Vi beregne totale avkastningen av våre i vivo mesh injeksjon prosedyrer over 400 µm indre diameter (650 µm ytre diameter) pinner for å være rundt 70%, selv om avkastningen er nærmere 80-90% for nyere arbeidet med 150 µm indre diameter (250 µm ytre diameter ) nåler. De vanligste årsakene til feil er (1) at nettet ikke injisere jevnt, resulterer i hjernen ødem fra uventet injeksjon volumer i hjernen, (2) mesh brudd under manuell manipulering kreves i i/o grensesnitt prosedyren og (3) blødning fra å skade en blodåre under injeksjon. Skade en blodåre under injeksjon er sjelden (årsaken til mindre enn 10% feil) og kan reduseres ytterligere ved å bruke bilde-guidede kirurgi. Vi også oppmerksom på at skader blodårene er en vanlig begrensning av alle prosedyrer som involverer gjennomtrengning av hjernevevet, inkludert injeksjon av virus partikler for hva, implantasjon av stive hjernen sonder, og injeksjon av mesh elektronikk.

Mesh elektronikk sonder er kjøpedyktig fortegnelse fra stabilt og spore de samme individuelle nervecellene i minst måneder til år tidsrammer og fremkalle nesten ingen kronisk immunforsvaret, som vist i figur 9 og Figur 10, henholdsvis. Dette representerer en betydelig fordel i forhold til konvensjonen dybde elektrodene, som ofte lider av synkende spike amplituder, ustabil signaler og kronisk betennelse i løpet av langsiktig opptak eksperimenter14, 15. i tillegg mesh elektronikk har fordelen at de kan stå i vevet under histologiske snitting, flekker, og bildebehandling, i motsetning til konvensjonelle sonder, som er for stive og må derfor fjernes før histology analyser. Derfor tillate mesh elektronikk den unike muligheten til å bruke immunohistochemical analyse nettopp studere mobilnettet miljøet rundt opptaksrom.

Protokollen presentert her åpner opp spennende nye muligheter i nevrovitenskap. Den minimal invasiv leveringsmåte og sømløs integrasjon av mesh med hjernevev minimerer avbrudd i nevrale kretser og unngår kronisk immunforsvaret, som kan nytte de fleste typer kronisk nevrale opptak eksperimenter. Evne til mesh elektronikk til å registrere og spore de samme enkelt nervecellene for lange perioder blir særlig interesse etterforskere søker å korrelere millisekund skala skyter aktivitet med måned til år lange prosesser som aldring, den patogenesen hjernesykdom eller hjernen utvikling16,18. I tillegg finnes det store muligheter til å utvide og tilpasse denne protokollen, for eksempel aktiv elektronikk til PCB hodet-scenen til å implementere funksjoner som digital multipleksing8,35, trådløs kommunikasjon35,36,37, og signalbehandling35, co injisere stamceller eller polymerer med mesh elektronikk til hjelp i vev gjenfødelse18,38, 39, og omfatter nanowire felt - effekt transistorer (NW-fet) i mesh elektronikk for svært lokaliserte og multifunksjonelle hjernen sonder24,29,40,41 ,42.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

C.M.L. anerkjenner støtte fra dette arbeidet ved Luftforsvaret Office for forskning (FA9550-14-1-0136), en Harvard University naturvitenskap og Engineering Accelerator award og en nasjonale institutter for helse Director's Pioneer Award ( 1DP1EB025835-01). T.G.S. anerkjenner støtte av Department of Defense (DoD) gjennom National Defense Science & Engineering Graduate Fellowship (NDSEG) programmet. G.H. erkjenner fellesskap støtte fra American Heart Association (16POST27250219) og veien til uavhengighet Award (overordnet K99/R00) fra National Institute on Aging av National Institutes of Health. Dette arbeidet ble utført delvis ved Harvard University Center for nanoskala systemer (CNS), medlem av det nasjonale nanoteknologi koordinert infrastruktur nettverk (NNCI), som støttes av National Science Foundation under NSF ECCS Award nr. 1541959.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Motorized stereotaxic frame World Precision Instruments MTM-3 For mouse stereotaxic surgery
512-channel recording controller Intan Technologies C3004 A component of the neural recording system
RHD2132 amplifier board Intan Technologies C3314 A component of the neural recording system
RHD2000 3 feet ultra thin SPI interface cable Intan Technologies C3213 A component of the neural recording system
Mouse restrainer Braintree Scientific TV-150 STD Standard 1.25 inch inner diameter; used to restrain the mouse during restrained recording sessions.
Si wafers Nova Electronic Materials 3" P <100> .001-.005 ohm-cm 356-406 μm Thick
Prime Grade SSP Si wafers w/2 Semi-Std. Flats &
6,000 A°±5% Wet Thermal Oxide on both sides.
Photomasks (chrome on soda lime glass) Advance Reproductions Advance Reproductions and other vendors manufacture photomasks from provided design files. Our photomask design files are available by request or from the resource website, meshelectronics.org. Alternatively, some university clean rooms have mask writers for making photomasks on site.
AutoCAD software Autodesk Inc. Design software for drawing photomasks. A free alternative is LayoutEditor. Our photomask design files are available by request or from the resource website, meshelectronics.org.
Thermal evaporator Sharon Vacuum Used to evaporate Ni, Cr, and Au onto mesh electronics during fabrication. Many university clean rooms have this or a similar tool.
SU-8 2000.5 negative photoresist MicroChem Corp. Negative photoresist used to define the bottom and top passivating layers of mesh electronics.
MA6 mask aligner Karl Suss Microtec AG Used to align each photomask to the pattern on the wafer and expose the wafer to UV light. Most university clean rooms have this or a similar tool.
SU-8 developer MicroChem Corp. Used to develop SU-8 negative photoresist following exposure to UV light.
LOR3A lift-off resist MicroChem Corp. Used with Shipley 1805 photoresist to promote undercutting during metal lift-off processes
Shipley 1805 positive photoresist Microposit, The Dow Chemical Company Positive photoresist used to define metal interconnects and Pt electrodes in mesh electronics
MF-CD-26 positive photoresist developer Microposit, The Dow Chemical Company To develop S1805 positive photoresist after exposure in a mask aligner. Many university clean rooms stock this chemical.
Spin coater Reynolds Tech For coating wafers with positive and negative resists. Most university clean rooms have spin coaters.
PJ plasma surface treatment system AST Products, Inc. Used to oxidize the surface of mesh electronics prior to release into aqueous solution. Most university clean rooms have this or a similar tool.
Electron beam evaporator Denton Vacuum For evaporating Cr and Pt during fabrication of mesh electronics. Many university clean rooms have this or a similar tool.
Remover PG MicroChem Corp. Used to dissolve LOR3A and Shipley S1805 resists during metal lift-off
Ferric chloride solution MG Chemicals 415-1L A component of Ni etching solution
36% hydrochloric acid solution Kanto Corp. A component of Ni etching solution
Glass capillary needles Drummond Scientific Co. Inner diameter 0.40 mm, outer diameter 0.65 mm. Other diameters are available.
Micropipette holder U-type Molecular Devices, LLC 1-HL-U Used to hold the glass capillary needles during stereotaxic injection
1 mL syringe NORM-JECT®, Henke Sass Wolf Used for manual loading of mesh electronics into capillary needles
Polyethylene intrademic catheter tubing Becton Dickinson and Company Inner diameter 1.19 mm, outer diameter 1.70 mm
5 mL syringe Becton Dickinson and Company Used in the syringe pump for injection of mesh electronics in vivo
Eyepiece camera Thorlabs Inc. DCC1240C Used to view mesh electronics within capillary needles during injection
ThorCam uc480 image acquisition software for USB cameras Thorlabs Inc. Used to view mesh electronics within capillary needles during injection
Syringe pump Harvard Apparatus PHD 2000 Used to flow precise volumes of solution through capillary needles during injection of mesh electronics
EXL-M40 dental drill Osada 3144-830 For drilling the craniotomy
0.9 mm drill burr Fine Science Tools 19007-09 For drilling the craniotomy
Hot bead sterilizer 14 cm Fine Science Tools 18000-50 Used to sterlize surgical instruments
CM1950 cryosectioning instrument Leica Microsystems Used to slice frozen tissue into sections. Many universities have this or a similar tool available in a shared facility.
0.3% Triton x-100 Life Technologies Used for histology
5% goat serum Life Technologies Used for histology
3% goat serum Life Technologies Used for histology
Rabbit anti-NeuN Abcam ab177487 Used for histology
Mouse anti-Neurofilament Abcam ab8135 Used for histology
Rat anti-GFAP Thermo Fisher Scientific Inc. PA516291 Used for histology
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific Inc. P36930 Used for histology
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich Corp. P6407-5MG Molecular weight = 70-150 kDA
Right-angle end clamp Thorlabs Inc. RA180/M Used to attach the pipette holder to the stereotaxic frame
Printed circuit board (PCB) Advanced Circuits Used to interface between mesh electronics and peripheral measurement electronics such as the Intan recording system. Advanced Circuits and other vendors manufacture and assemble PCBs based on provided design files. Our PCB design files are available by request or at the resource site meshelectronics.org
32-channel standard amplifier connector Omnetics Connector Corp. A79024-001 Component assembled onto the PCB
32-channel flat flexible cable (FFC) Molex, LLC 152660339 Used as a clamping substrate when interfacing to mesh electronics I/O pads with the PCB-mounted ZIF connector
32-channel zero insertion force (ZIF) connector Hirose Electric Co., LTD FH12A-32S-0.5SH(55) Component assembled onto the PCB

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lopes da Silva, F. EEG and MEG: relevance to neuroscience. Neuron. 80 (5), 1112-1128 (2013).
  2. Logothetis, N. K. What we can do and what we cannot do with fMRI. Nature. 453 (7197), 869-878 (2008).
  3. Seymour, J. P., Wu, F., Wise, K. D., Yoon, E. State-of-the-art MEMS and microsystem tools for brain research. Microsystems & Nanoengineering. 3, 16066 (2017).
  4. Buzsaki, G. Rhythms of the Brain. , Oxford University Press. (2006).
  5. Khodagholy, D., et al. NeuroGrid: recording action potentials from the surface of the brain. Nature Neuroscience. , (2014).
  6. Hamel, E. J., Grewe, B. F., Parker, J. G., Schnitzer, M. J. Cellular level brain imaging in behaving mammals: an engineering approach. Neuron. 86 (1), 140-159 (2015).
  7. Jun, J. J., et al. Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature. 551 (7679), 232-236 (2017).
  8. Berenyi, A., et al. Large-scale, high-density (up to 512 channels) recording of local circuits in behaving animals. Journal of Neurophysiology. 111 (5), 1132-1149 (2014).
  9. Scholvin, J., et al. Close-Packed Silicon Microelectrodes for Scalable Spatially Oversampled Neural Recording. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 63 (1), 120-130 (2016).
  10. Schiller, P. H. The Central Visual System. Vision Research. 26 (9), 1351-1386 (1986).
  11. Benabid, A. L., Chabardes, S., Mitrofanis, J., Pollak, P. Deep brain stimulation of the subthalamic nucleus for the treatment of Parkinson's disease. The Lancet Neurology. 8 (1), 67-81 (2009).
  12. Hochberg, L. R., et al. Reach and grasp by people with tetraplegia using a neurally controlled robotic arm. Nature. 485 (7398), 372-375 (2012).
  13. Lebedev, M. A., Nicolelis, M. A. Brain-Machine Interfaces: From Basic Science to Neuroprostheses and Neurorehabilitation. Physiological Reviews. 97 (2), 767-837 (2017).
  14. Polikov, V. S., Tresco, P. A., Reichert, W. M. Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 148 (1), 1-18 (2005).
  15. Perge, J. A., et al. Intra-day signal instabilities affect decoding performance in an intracortical neural interface system. Journal of Neural Engineering. 10 (3), 036004 (2013).
  16. Hong, G., Yang, X., Zhou, T., Lieber, C. M. Mesh electronics: a new paradigm for tissue-like brain probes. Current Opinion in Neurobiology. 50, 33-41 (2017).
  17. Dai, X., Hong, G., Gao, T., Lieber, C. M. Mesh Nanoelectronics: Seamless Integration of Electronics with Tissues. Accounts of Chemical Research. 51 (2), 309-318 (2018).
  18. Feiner, R., Dvir, T. Tissue-electronics interfaces: from implantable devices to engineered tissues. Nature Reviews Materials. 3 (1), 17076 (2017).
  19. Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M., Siegelbaum, S. A., Hudspeth, A. J. Principles of Neural Science. , McFraw-Hill. (2013).
  20. Rousche, P. J., et al. Flexible polyimide-based intracortical electrode arrays with bioactive capability. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 48 (3), 361-371 (2001).
  21. Liu, J., et al. Syringe-injectable electronics. Nature Nanotechnology. 10 (7), 629-636 (2015).
  22. Kasthuri, N., et al. Saturated Reconstruction of a Volume of Neocortex. Cell. 162 (3), 648-661 (2015).
  23. Saxena, T., Bellamkonda, R. V. A sensor web for neurons. Nature Materials. 14, 1190-1191 (2015).
  24. Xie, C., et al. Three-dimensional macroporous nanoelectronic networks as minimally invasive brain probes. Nature Materials. 14 (12), 1286-1292 (2015).
  25. Hong, G., et al. Syringe Injectable Electronics: Precise Targeted Delivery with Quantitative Input/Output Connectivity. Nano Letters. 15 (10), 6979-6984 (2015).
  26. Zhou, T., et al. Syringe-injectable mesh electronics integrate seamlessly with minimal chronic immune response in the brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (23), 5894-5899 (2017).
  27. Fu, T. M., et al. Stable long-term chronic brain mapping at the single-neuron level. Nature Methods. 13 (10), 875-882 (2016).
  28. Fu, T. M., Hong, G., Viveros, R. D., Zhou, T., Lieber, C. M. Highly scalable multichannel mesh electronics for stable chronic brain electrophysiology. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (47), E10046-E10055 (2017).
  29. Schuhmann, T. G. Jr, Yao, J., Hong, G., Fu, T. M., Lieber, C. M. Syringe-Injectable Electronics with a Plug-and-Play Input/Output Interface. Nano Letters. 17 (9), 5836-5842 (2017).
  30. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
  31. Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. Stereotaxic surgery for excitotoxic lesion of specific brain areas in the adult rat. Journal of Visualized Experiments. (65), e4079 (2012).
  32. Gage, G. J., et al. Surgical implantation of chronic neural electrodes for recording single unit activity and electrocorticographic signals. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).
  33. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Rodent Handling and Restraint Techniques. , Journal of Visualized Experiments. Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/10221/rodent-handling-and-restraint-techniques (2018).
  34. Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons. Journal of Visualized Experiments. 10 (99), e52293 (2015).
  35. Sodagar, A. M., Perlin, G. E., Yao, Y., Najafi, K., Wise, K. D. An Implantable 64-Channel Wireless Microsystem for Single-Unit Neural Recording. IEEE Journal of Solid-State Circuits. 44 (9), 2591-2604 (2009).
  36. Wentz, C. T., et al. A wirelessly powered and controlled device for optical neural control of freely-behaving animals. Journal of Neural Engineering. 8 (4), 046021 (2011).
  37. Harrison, R. R., et al. Wireless neural recording with single low-power integrated circuit. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 17 (4), 322-329 (2009).
  38. Landa, N., et al. Effect of injectable alginate implant on cardiac remodeling and function after recent and old infarcts in rat. Circulation. 117 (11), 1388-1396 (2008).
  39. Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
  40. Zhang, A., Lieber, C. M. Nano-Bioelectronics. Chemical Reviews. 116 (1), 215-257 (2016).
  41. Zhou, W., Dai, X., Lieber, C. M. Advances in nanowire bioelectronics. Reports on Progress in Physics. 80 (1), 016701 (2017).
  42. Dai, X., Zhou, W., Gao, T., Liu, J., Lieber, C. M. Three-dimensional mapping and regulation of action potential propagation in nanoelectronics-innervated tissues. Nature Nanotechnology. 11 (9), 776-782 (2016).

Tags

Bioteknologi problemet 137 hjernen sonde neural grensesnitt plug-and-play-tilkobling bioelectronics store nevrale opptak kronisk hjerne kartlegging vev-aktig ultraflexible nano-bio-grensesnitt
Sprøyte-injectable Mesh elektronikk for stabil kronisk gnager elektrofysiologi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schuhmann Jr., T. G., Zhou, T.,… More

Schuhmann Jr., T. G., Zhou, T., Hong, G., Lee, J. M., Fu, T. M., Park, H. G., Lieber, C. M. Syringe-injectable Mesh Electronics for Stable Chronic Rodent Electrophysiology. J. Vis. Exp. (137), e58003, doi:10.3791/58003 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter