Summary
Мы представляем собой протокол для измерения потребления кислорода и внеклеточной подкисления в Drosophila melanogaster личинок и взрослых мозги. Метаболический анализатор используется с протоколом адаптирована и оптимизирована. Микро ткани ограничения являются критически важным компонентом этого протокола и были спроектированы и созданы специально для их использования в этом анализе.
Abstract
Этот протокол описывает метод для измерения метаболизм в Drosophila melanogaster личинок и взрослых мозги. Количественная оценка метаболизма в целых органов обеспечивает понимание ткани уровень использования энергии, которые не могут быть захвачены при анализе первичной клеток и клеточных линий. Хотя этот анализ ex vivo, он позволяет для измерения из целого ряда специализированных клеток, работающих вместе для выполнения функции в одной ткани и более тесно модели органа в естественных условиях . Метаболические перепрограммирования наблюдается во многих неврологических заболеваний, включая злокачественные новообразования и нейродегенеративных заболеваний. Этот протокол был разработан для оказания помощи общине D. melanogaster расследования метаболизма в моделях неврологических заболеваний, использование коммерчески доступных метаболический анализатор. Измерения метаболизм весь мозг в метаболический анализатор является сложной задачей благодаря геометрии головного мозга. Этот анализатор требует образцы остаются в нижней части пластины 96-луночных. Образцы клетки и ткани пуансонов может придерживаться поверхности плиты клетки или использовать пластины сфероида, соответственно. Однако шаровидные, трехмерная форма D. melanogaster мозги предотвращает ткани от присоединения к пластине. Этот протокол требует специально спроектированы и изготовлены микро ткани сдержанности, который обходит эту проблему путем предотвращения любого движения мозга пока все еще позволяющ метаболически измерений от анализатора двух твердотельных датчиков зондов. Потребление кислорода и внеклеточной подкисления ставки воспроизводимость и чувствительных к лечения метаболического ингибиторами. С незначительными оптимизации этот протокол может быть адаптирован для использования с любой цельной ткани или модель системы, при том условии, что размер выборки не превышает камеры, порожденных сдержанность. Хотя базальный метаболически измерения и анализ после лечения с ингибиторов митохондриальных описаны в рамках настоящего Протокола, бесчисленные экспериментальные условия, такие как предпочтения источника энергии и воспитании окружающей среды, могут быть допрошены.
Introduction
Метаболические перепрограммирования была обнаружена во многих неврологических заболеваний, в том числе глиобластомы мультиформной (GBM), болезнь Хантингтона и основных депрессивного расстройства (MDD)1,2,3. Метаболизм становится в центре внимания терапевтические стратегии, инструменты для фундаментальных исследований метаболизма продвинулись. Однако большинство из этих методов были разработаны для изучения клеточных линий и главные ячейки или для анализа больших тканей после фиксации или - замораживания. Некоторые подходы опираются на комплекты для упрощенно измерения конкретных метаболитов, в то время как другие воспользовались более дорогостоящий и сложный анализ, используя хроматографии в сочетании с4 масс-спектрометрии для той же цели. Чтобы понять больше метаболических пейзаж, метаболические,5,6 и метаболический поток анализа профилирования (МИД)7 появились в дополнение к крупномасштабной протеомных и геномных исследований. Профилирование предоставляет представление количественных метаболитов в клетки или ткани в одной точке во времени, в то время как МИД расширяет это, позволяя отслеживания помечены метаболитов с течением времени. Последняя была полезной в выявлении как источники энергии используются по-разному в клетки или ткани в состояние болезни8. Однако эти методы не включают в себя измерение общего метаболизма.
Опросить состояние общей метаболической маленькая модель систем, традиционные методы, такие как Кларк электрода9 и косвенные калориметрии10, могут быть использованы для измерения потребления кислорода или настроен для остановки потока respirometry, чтобы Измерьте кислорода и концентрация углекислого газа, соответственно. Эти методы, обеспечивая точное понимание индикация метаболических перепрограммирования на уровне организма, имеют ограничения. Использование Кларк электрода может быть технически сложным и не предназначен для исследования высокой пропускной способности. Остановка потока респирометра не может функционировать с чувствительность, необходимые для анализа клеток или тканей. Несколько лет назад, Новая технология была разработана специально для этих небольших приложения11. Эти инструменты были первоначально предназначены для измерения потребления кислорода и внеклеточной подкисления клеточных линий и главные ячейки в формате 24 - или 96-луночных. Простота настройки и данных вывода создан этот метод как альтернатива традиционным подходам. Эта методология является мощным инструментом для клеток, и последние достижения позволили для измерения ткани пробойники12,,1314. Однако методы, используемые в этих анализов не позволяют для измерения целых органов от небольших моделей систем.
Метаболический Анализ моделей болезни часто включает в себя взаимодействие между клетки специализированные функции, находящейся в пределах же ткани. Например глиальные клетки производят метаболитов, используемых нейронов. Эти метаболического взаимодействия необходимы для выживаемость нейронов15. Маленькая модель системы являются выгодными для изучения таких вопросов. Исследования для измерения метаболизм весь орган, содержащие различные типы клеток, будет добавить к пониманию использования энергии в естественных условиях. Недавно Беккер et al. сообщили метод измерения потребления кислорода в целом летать главы16. Путем объединения ряда руководителей вместе в одной скважине плиты клетки 24-Ну, потребление кислорода чтений были получены с помощью метаболический анализатор. Хотя это хорошо работает для руководителей, которые легко отделяются от тела, это гораздо более трудно использовать для органов, таких как личиночной мозги, потому что большое количество нужно быть расчленены для данного метода. Таким образом метод использования 96-луночных клеток плиты, который увеличивает чувствительность потребления кислорода и внеклеточной подкисления чтений, был разработан для анализа одного целом личиночной мозга.
Метаболический анализатор, используемый в данном исследовании требует образца измеряется остаться в нижней части скважины 96-луночных клеток плиты. Для клеток и относительно ровной тканей это не проблема; Однако для D. melanogaster личинок и взрослых мозг, это не возможно с использованием традиционной плиты покрытия протоколов. Сферические трехмерную форму мозги не будет надежно придерживаться поверхности пластины, и те, которые делают часто повреждаются при попытке разместить их должным образом в колодец. Важной частью этого нового протокола является проектирование и разработка микро ткани ограничения17 , предоставить небольшую камеру для мозга проживать в без мешать с метаболической измерения. Находится примерно в камере генерируется 0.016 в высоту и обеспечивает достаточно пространства для легко держать много D. melanogaster мозги. Ограничения состоят из сетки нейлона, придает инертных полимера кольца и будет обсуждаться далее в Представитель результаты. С помощью этих ограничений минимизирует время, необходимое для подготовки расчлененных мозги метаболических измерения. Оптимизация выполнения измерений генерирует потребления кислорода устойчивый, воспроизводимые и внеклеточной подкисления ставок после шести измерение циклов (25 мин). Мозги по-прежнему метаболически активные в этих условиях для минимум 2 h, который позволяет инъекций терапии, ингибиторы, или другие методы лечения через порты доставки наркотиков метаболический анализатор картриджей. Этот протокол также может быть легко адаптирована для других тканей и маленькая модель систем18.
Протокол, ниже подробно описывается пробирного потребление кислорода в целом дрозофилы личиночной мозга когда оспаривается с митохондриальных стресс. Чтобы подчеркнуть мозга, oligomycin добавляется для ингибирования АТФ синтазы19. Снижение потребления кислорода от базальной чтений показывает измерение количества АТФ зависящ дыхания в головном мозге. Дальнейшее сокращение потребления кислорода после лечения с ротенон20 и antimycin21, ингибиторы комплексов цепи переноса электронов I и III, соответственно, указывают количество потребления не митохондриальной кислорода в мозг. Этот assay является одним из примеров как митохондриальное дыхание в летать мозга могут сопоставляться и как этот протокол может использоваться для сравнения обменные процессы в различных генотипов. Однако этот протокол может быть адаптирована для измерения потребления кислорода просто базальной и цены внеклеточного подкисления, а также разрабатывать более сложные исследования, изучения использования конкретных энергии или субстрат использования гипотезы.
Protocol
1. анализа подготовка (1 день)
- Место метаболический анализатор (Таблица материалов) в инкубаторе или контролем температуры комнаты присвоено 11 ° C.
Примечание: Эта температура идеально подходит для измерений при 25 ° C, как он позволяет колебания температуры ~ 14 ° C, которое происходит во время выполнения анализа. Это вызвано тепла инструмента во время выполнения. - Откройте соответствующее программное обеспечение на компьютере, подключенном к метаболический анализатор. Нажмите на численных температуры в нижней левой части экрана. В новом окне, которое откроется нажмите на поле рядом с командой «Нагреватель на» и убедитесь, что появляется флажок. Отрегулируйте температуру до 25 ° C и скорректировать диапазон допуска до 0,2 ° C, с помощью стрелок.
Примечание: Для достижения стабильной температуры необходимы несколько часов. - Откройте контейнер картриджа (Таблица материалов) и выньте картридж из утилиты плиты без касатьться зондов.
Примечание: Утилита пластина используется во время калибровки картриджа и не используется при метаболических assay. - Добавьте 200 мкл раствора calibrant (Таблица материалов) утилита пластины и место картридж обратно поверх плиты утилита увлажняет датчик зонды на картридже. Не трогайте зондов и защитить их от света.
- Уплотнение патрон с парафином фильм.
- Инкубировать картридж на ночь при 25 ° C.
2. анализа СМИ подготовка (день 2)
- Добавление глюкозы 10 мм и 10 мм пируват натрия пробирного средний.
- Инкубируйте среднего при 25 ° C, до тех пор, пока жидкость достижение равновесного уровня до этой температуры.
- Отрегулируйте пэ-аш до 7,4, с помощью рН метр.
3. Установка программного обеспечения для Метаболический Анализ Drosophila melanogaster мозги (день 2)
- Установите вверх метаболических программного обеспечения на метаболический анализатор, используемый на шаге 1.2.
- Выберите «Шаблон» на домашнем экране программного обеспечения.
- Дважды щелкните на «Пустым», чтобы начать новый дизайн пробирного.
- Нажмите на кнопку «Пластины карта» на верхней панели инструментов для просмотра ячейки пробирного таблички.
Примечание: Пластину пробирного ячейка будет содержать образцы мозга и будет в паре с картридж перед началом запуска метаболические assay. -
Нажмите кнопку Добавить группы кнопка 3 x.
- Дважды щелкните на ярлыке «Группа 1» и переименовать его в «Экспериментальные».
Примечание: Эта группа будет содержать весь мозг и микро ткани сдержанность, препаратами. - Дважды щелкните на ярлыке «Группа 2» и переименовать его в «Контроль».
Примечание: Эта группа будет содержать весь мозг и сдержанность микро ткани без наркотиков лечения. - Дважды щелкните на «Группа 3" ярлык и переименовать его в «сдержанность только».
Примечание: Эта группа будет содержать микро ткани сдержанность без каких-либо мозги или медикаментозное лечение.
- Дважды щелкните на ярлыке «Группа 1» и переименовать его в «Экспериментальные».
-
Назначьте каждой группе, основанный на где образцы в пластину ячейки предназначены для размещения скважин.
- Нажмите на ярлык «Экспериментальные» и затем выделите B2 - B8 на карте тарелка скважин.
- Нажмите на ярлык «Контроль» и затем выделите скважин C2-C8 на карте пластины.
- Нажмите на «сдержанность только» метку и затем выделить скважин D2-D8 на карте пластины.
- Проверьте, что все четыре угла (А1, A12, H1 и H12) определяются как фон.
Примечание: Не скважин по периметру плиты используются для уменьшения любые эффекты краев. Это параметр по умолчанию в программном обеспечении.
-
Нажмите на кнопку «Протокол» на верхней панели инструментов, чтобы настроить протокол.
- Нажмите на «изменить измерения детали» в поле базового измерения.
- Отрегулируйте время, что метаболический анализатор будет измерить мозг, изменив базальной мера время цикла «3:00», нажав вверх и вниз стрелками.
- Отрегулируйте время метаболический анализатор будет ждать между измерениями мозга путем изменения базальной ждать время цикла «0:00», нажав вверх и вниз стрелками.
- Отрегулируйте время метаболический анализатор будет смешивать СМИ до измерения мозга путем изменения базальной смешать время цикла «1:00», нажав вверх и вниз стрелками.
- Настроить общее количество базальной циклов, который включает в себя меру, ожидания и сочетание циклов, до «7» , нажав вверх и вниз стрелками.
Примечание: Стабильные скорости потребления кислорода измерения получаются после ~ 25 мин от начала assay. - Нажмите на кнопку «Добавить инъекции», расположенного в верхней левой панели инструментов.
- Нажмите на ярлык «инъекции» и измените его на «Oligomycin».
- Отрегулируйте инъекции мера, ожидания и смесь раз совпадают для базальной.
- Настройте общее количество инъекций циклов до «6», нажав вверх и вниз стрелками.
- Повторите шаги 3.7.6 - 3.7.8 но изменить метку на «Rot/AA» и настроить общее количество инъекций циклов до 7, нажав вверх и вниз стрелками.
- Нажмите на кнопку «Запустить Assay» на верхней панели инструментов.
- «Сохранить» проба и начать создание пробирного картриджа (Таблица материалов).
4. Подготовка картриджа для калибровки (день 2)
-
Выньте картридж из инкубатора 25 ° C и снять крышку.
- Добавить 20 мкл 100 мкм oligomycin небольшой верхней левой круговой инъекции порт, порт A, в картридже для всех соответствующих экспериментальных скважин на пластину клеток и добавить 20 мкл пробирного СМИ в порт A в всех других скважин, включая контроль и фон скважин.
Примечание: Картридж содержит 4 порта (A-D) для каждого из 96 скважин, соответствующие ячейки плиты что будет содержать образцы. Этот шаг выполняется перед добавлением образцы. Добавление 20 мкл, 100 мкм oligomycin результатов в окончательном oligomycin концентрации 10 мкм в пластину клеток, хорошо, когда препарат вводят метаболический анализатор. Oligomycin является ингибитором АТФ-синтазы. Результирующее значение потребления кислорода будет отражать количество АТФ связаны дыхания в головном мозге. Для того, чтобы должным образом инъекционные наркотики в указанный скважины, все порты той же буквы должны быть заполнены с такой же объем жидкости, даже если не используется. - Добавить 22 мкл 50 мкм ротенон/antimycin A в небольшой верхней прямой круговой порт, порт картриджа для всех соответствующих экспериментальных скважин на пластину клетки B и добавить 22 мкл пробирного СМИ в порт B всех других скважин, включая контроль и фон скважин.
Примечание: Это приводит к окончательной ротенон/Antimycin В концентрации 5 мкм в пластину клетки хорошо, когда препарат вводят метаболический анализатор. Ротенон и antimycin A являются ингибиторы электрон-транспортной цепи комплексы I и III, соответственно. Результирующее значение потребления кислорода будет отражать не митохондриальное дыхание в головном мозге. - Нажмите кнопку «Начать выполнения» поместить загруженного патрон с утилита пластины в метаболический анализатор с хорошо А1, расположено в верхнем левом углу, когда сталкивается с инструмента, с пластины погрузчик, простирающейся от правой стороны машины.
- Добавить 20 мкл 100 мкм oligomycin небольшой верхней левой круговой инъекции порт, порт A, в картридже для всех соответствующих экспериментальных скважин на пластину клеток и добавить 20 мкл пробирного СМИ в порт A в всех других скважин, включая контроль и фон скважин.
- Выберите «Я готов» в программное обеспечение, чтобы начать уравновешивания и калибровка картриджа до начала метаболических пробу с пластиной ячейки, содержащие образцы.
Примечание: Программа будет просить, чтобы сохранить файл, а затем начать equilibrating и калибровки. Эти шаги могут занять до 1 ч. шаги 5-8 проводятся во время уравновешивания и калибровки.
5. Подготовка микро ткани ограничений (день 2)
- Выберите 1 микро ткани сдержанность в мозг, что измеряется, плюс по крайней мере 3 для использования в качестве сдержанность только элементы управления, от контейнера хранения (содержит 70% этиловом спирте).
- Промойте ограничения с свежими 70% этанола и промойте деионизованной воды 3 x 2 минут каждый, с использованием сетки корзина и 6-ну пластины (Таблица материалов). Добавьте дополнительные вода омывает если ограничения по-прежнему выделяют запах алкоголя.
- Вымойте микро ткани ограничения в средствах массовой информации пробирного и оставить их в это решение, до тех пор, пока они готовы для использования.
6. рассечение Drosophila melanogaster личиночной мозги (день 2)
- Выберите поздно (Блуждающие) третий instar личинок из флакона культивировали мух Орегон-R с использованием высокой точности, стиль 5 пинцет (0.10 x 0,06 мм2).
- Место личинка в хорошо чистого рассечения пятно плиты (Таблица материалов) содержащий 500 мкл ПБС.
Примечание: Место пластина является стеклянной пластины с депрессиями, используемый для того чтобы рассечь малых тканей и организмов. - Вымойте личинка, слегка покачивая его в скважину, с помощью пинцета.
- Переместите личинка Чистый колодец пятно пластины, содержащий 500 мкл ПБС.
- Место пластину пятно под микроскопом рассечения.
- Схватить личинки на его животик с одной парой пинцетов, защелки глаз крючки с второй парой пинцетов.
- Мягко и плавно потяните личинка в противоположных направлениях, с использованием двух наборов пинцетом.
- Визуализации мозга, которая обычно остается придает глаз крючки и будет обычно иметь глаз усиков диски, прилагается к нему.
- Осторожно удалите дополнительные ткани из мозга, используя крючки глаз провести мозга на месте. Наконец отдельные крючки глаз от мозга.
- Используйте пинцет для перемещения расчлененных мозг новую скважину на место пластину, содержащие ПБС.
- Повторите шаги 6.1-6.10, до тех пор, пока 14 мозги разделяются.
Примечание: Общее время от начала диссекции для выполнения анализа не должна превышать 30 мин.
7. Добавление расчлененных мозги на 96-луночных метаболических Assay клетки пластину (день 2)
- Добавьте 50 мкл пробирного СМИ к скважинам 96-луночных метаболических пробирного пластины (Таблица материалов) используется в эксперимент, включая экспериментальный, управления, ограничение только и фон скважин.
- Осторожно поместите один мозг в каждой скважине от A2-A8 и B2-B8 ячейки листа, используя пинцет, шпателя или пипетки.
Примечание: Это может быть сделано от рассечения микроскопа. - Под микроскопом рассечение используйте изогнутой иглы микро зонд для раковины мозги на дно колодца.
- Аккуратно позиция мозга в середине трех сферах поднял с помощью зонда.
8. Помимо ограничений микро ткани на 96-луночных метаболических Assay клетки пластину (день 2)
- С помощью пинцета, поместите микро ткани сдержанность на краю пластины пробирного хорошо и использовать микроскоп для проверки, что он ориентирован с пластиковым кольцом вниз и сетки на вершине.
- Снять пластину из-под микроскопом и использовать пинцеты понять сдержанность с обеих сторон и осторожно поместите его в скважину.
- Используйте изогнутой иглы микро зонд надавите сдержанность в колодец.
- Под микроскопом убедитесь, что мозг можно увидеть через ткани сдержанность и что он центрируется в колодец.
- Повторите шаги 8.1 – 8.4 для всех скважин, которые будут находиться в assay — A2-A8, B2-B8 и C2-C8.
- Аккуратно добавьте 130 мкл пробирного средств массовой информации для каждого из экспериментальной, управления и сдержанность только скважин.
- Убедитесь, что мозги и микро ткани ограничения не переехали при добавлении средств массовой информации посредством визуализации их под микроскопом.
- Добавьте 180 мкл пробирного СМИ в четырех угловых скважин для использования в качестве фона элемента управления.
9. Помимо клеток пластины метаболический анализатор и начала анализа (день 2)
- Убедитесь, что уравновешивания и калибровки полностью ожидая программного обеспечения для запроса пластину ячейки, содержащие образец.
- Выберите «Лоток открыт» и ждать для инструмента для извлечения полезности пластины.
- Удалить пластину утилита и добавьте пластину клеток, без крышки, в ту же ориентацию.
- Выберите «клеток пластины» для инструмента принять в пластину клеток и закрыть лоток, а затем начать пробу.
- Просмотр измерения в реальном времени с погрешностей на экране компьютера под управлением программного обеспечения.
- Снимите выбрасывается клеток и картриджа, после завершения анализа.
Примечание: Спаренные патроны и сотовый плит может быть повторно использован 5 x.
10. После измерения анализ (день 2)
- Используйте рассечения микроскоп для проверки, что мозги и микро ткани ограничения по-прежнему расположены правильно в скважине после завершения анализа. Исключите любой скважин с отклонениями от анализа.
- Экспортируйте скорость потребления кислорода (OCR) и внеклеточного показатель подкисления (ECAR) данные для дальнейшего анализа.
Representative Results
Протокола, представленные здесь требует использования ограничений микро ткани, которые отвечают спецификациям, описанные ниже. Использование других методов для хранения мозги на месте в нижней части пластины 96-луночных ячейки были неудачными (рисунок 2A и 2B). Во-первых были протестированы различные агенты для увеличения ткани присоединения к пластине. Коммерчески доступные ткань клей (Таблица материалов) рекомендуется для использования клеток и organoids с сотовый плит и пластин сфероида, соответственно. Первоначально мозги, как представляется, придерживаться хорошо поверхности; Однако кислорода потребления (OCR) чтений были низкими, и наблюдая скважины после анализа показали, что мозги больше не были прикреплены к поверхности хорошо (рисунок 2A). Те же результаты произошло с супер клей (рис. 2A). Далее, производство небольших экранов провести мозги в пределах небольшой камеры в нижней части скважины была предпринята попытка (рис. 2B).
Грохоты из металла производится высокая OCR чтений только, как металлические экраны с кольцом полимер холдинг экран в месте (Рисунок 2Б). Пластиковые сетки рабицы был использован с то же кольцо полимера. Это устройство вызвало негативные OCR чтения должны быть получены. Наконец ограничения микро ткани были разработаны с использованием инертных полимер для кольца, измерения наружный диаметр 0.146 внутренний диаметр 0.1335 толщиной 0,0125 в, и высота 0,016 дюйма (Таблица материалов). Супер клей (Таблица материалов) был использован для присоединения кольцо к нейлоновая сетка с размером определенного поры 0.0039 в в диаметре (Таблица материалов). Размер пор является критическим, поскольку это позволяет средства массовой информации и метаболит exchange без воздушных пузырьков, но по-прежнему действует как барьер для мозгов. Эти ограничения только привести к практически нет OCR чтения и при использовании с мозгами, позволяют воспроизводимости показаний (рисунок 2A и 2B). Проверка после анализа показали, что мозги по-прежнему были надлежащим образом размещены в скважинах. Эти ткани ограничений в настоящее время не имеющиеся, но может быть изготовлен, следуя выше спецификации. Хотя это требует точного производства, большинство магазинов машина будет в состоянии воспроизвести эту сдержанность, с использованием материалов, указанных выше.
Протокол был оптимизирован для учета пробирного СМИ, время запуска пробирного и температуры (рис. 3). Первоначально анализы были созданы в среде Шнайдер для моделирования среды личинок в естественных условиях . Однако используются средства массовой информации могут содержать буферизации агентов с pH используется для измерения ECAR. Это средства массовой информации, таким образом, должен быть пользовательские сделал, который является дорогостоящим. Для оптимизации это, коммерчески доступных пробирного СМИ, предназначенная для анализа метаболические (Таблица материалов) был использован вместо Шнайдер СМИ. OCR уровни были неизменными, даже при увеличении уровня глюкозы слегка на модель анализа СМИ условия (рис. 3A). Все анализы с этой точки зрения были проведены в средстве анализа. Добавки в СМИ были оптимизированы, наблюдая ли потребление кислорода и внеклеточной подкисления ставки показан ответ при лечении ингибиторами известных митохондриальных. Далее было проанализировано время ожидания между Анатомирование и выполнения анализа. Инкубационный 3 h значительно упал уровень распознавания (рис. 3B). 3D рисунок демонстрирует разницу в шестой момент времени, когда OCR и ECAR уровни стабилизации для взрослых и личинок мозги. Таким образом протокол указывает начать пробу сразу после вскрытия, если эксперимент требует температуры уравновешивания, в котором предлагается случае инкубации для менее чем за 30 мин. Метаболический анализатор хранится в инкубаторе присвоено 11 ° C для температуре 25 ° C на протяжении assay. Если температура повышаются благодаря температуры окружающей среды и управления прибором, снижение уровня OCR наблюдаются (рис. 3 c). Это предположить, чтобы быть из-за смерти ткани.
Когда оптимизированные условия соблюдаются, анализов с личинок и взрослых мозги результат в чтениях OCR, немного более 150 пмоль/мин на стабилизированной шестой раз точка, ~ 25 мин в assay (рис. 4В). Этот курс поддерживается по крайней мере 30 минут (рис. 4A) и до 2 ч (данные не показаны). ECAR немного ниже в взрослых мозгов, чем в личиночной мозги в шестой раз точке (рис. 4 d) и поддерживается по крайней мере 30 минут (рис. 4 c). Этот вывод соответствует увеличению в гликолизе на личиночной стадии для поддержки роста. Инъекции с митохондриальных ингибиторы, такие как oligomycin, понижает OCR чтений выявить АТФ зависимые дыхания, и дальнейшее лечение с ротенон и antimycin A понижает OCR раскрыть потребление не митохондриальной кислорода (Рисунок 5A ). Эти данные показывает, что эти ингибиторы способны проникать в ткани мозга и может быть использован для сравнения митохондриальное дыхание различных генотипов в мозгах. Этот assay, смеси, подождите, и мера раз были оптимизированы, наблюдая уровни кислорода, не расход и обеспечение того, чтобы после смешивания, уровень кислорода вернулись на уровень до измерения.
Рисунок 1: схема личиночной мозга OCR и ECAR измерений в анализаторе метаболических. Патрон готовится за день до запуска assay. Следующий день, наркотики добавляются к портам инъекции картриджа. D. melanogaster личиночной мозги разделяются, и микро ткани ограничения добавляются для защиты мозга в нижней части скважины. Пластину ячейки с мозги assayed в метаболический анализатор и анализа данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: микро ткани ограничения метаболически неактивны и держать мозг в камере в нижней части пластины хорошо. (A) OCR Орегон-R D. melanogaster личиночной мозги измеряется в лунках ткань клей (Таблица материалов) или когда мозги супер приклеен к нижней части колодца. Результаты сравниваются с те мозги, расположены в нижней части скважины с помощью микро ткани ограничений. OCR (B) измеряется в скважинах содержащих пробирного СМИ и металл, металл с полимерной кольцо, пластиковые сетки рабицы и полимерные кольца или микро ткани ограничений. p-значение < 0,05, ** p-значение < 0.01, *** p-значение < 0,001, *** p-значение < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: оптимизация средств массовой информации, время инкубации и температуры. OCR (A) измеряется в Орегон-R D. melanogaster Ларвальная носители Шнайдер (S2) с пируват натрия мозги добавил, S2 с глюкозой и пируват натрия добавил и анализа СМИ с глюкозы и натрия пируват добавил. OCR (B) измеряется в личиночной мозги после 3 ч инкубации до assay, или 30 минут инкубации до assay. OCR (C) измеряется в личиночной мозги в Пробирной запустить температура 33 ° C и 25 ° C. Шестой момент графике. OCR (D) измеряется в личиночной мозги после 3 ч инкубации до assay, или 30 минут инкубации до assay. Данные передаются на шестом этапе. p-значение < 0,05, ** p-значение < 0.01, *** p-значение < 0,001, *** p-значение < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: OCR и ECAR можно воспроизвести измеряются в взрослых и мозги личиночной D. melanogaster . OCR (A) измеряется в Орегон-R D. melanogaster взрослых и личинок мозги на графике 30 мин (B) распознавания данных шестого точки время от группы A . Это время точка, в которой OCR чтений стабилизации. (C) ECAR измеряется в D. melanogaster взрослых и личинок мозги за 30 мин (D) ECAR данных шестого точки время от группы В графике. Это время точка, в которой стабилизировать ECAR чтений. p-значение < 0,05, ** p-значение < 0.01, *** p-значение < 0,001, *** p-значение < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: Oligomycin снижает уровень личиночной мозга OCR D. melanogaster раскрыть АТФ зависимые дыхания, и ротенон/antimycin еще снижает OCR раскрыть потребление кислорода не митохондриальной. OCR (A) измеряется в Орегон-RD. melanogaster личиночной мозги после лечения с 20 мкм oligomycin и смесь ротенон/antimycin A 5 мкм. Управления и сдержанность только скважин вводили с Пробирной СМИ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Здесь описан новый метод для метаболического анализа D. melanogaster личинок и взрослых мозги ex vivo . Базальных условиях потребление кислорода и внеклеточной подкисления цены указывают как метаболически активные мозг и может определить ли ткани стали более зависимыми от митохондриальной против гликолитических дыхания, соответственно11.
Лечение мозги с ингибиторами или лечебных препаратов может представить дополнительную информацию о метаболического статуса ткани. Метаболизма субстратов также могут быть добавлены для определения зависимостей на конкретных метаболитов, таких как глюкоза для проверки Варбург эффект22 или глютамина для расследования glutaminolysis23— обоих распространены в метаболических перепрограммирования. Для долгосрочных исследований личинки или мух могут также подаваться наркотиков вместо инъекции портов, и мозги может быть assayed интервалы времени или в конечной точке, в зависимости от экспериментальный дизайн. Этот метод может быть оптимизирован для многочисленных приложений.
Этот метод был оптимизирован для мозги, но могут быть использованы для анализа других личиночных18 и взрослых тканях. Кроме того другие малые модели системы могут использовать этот метод для измерения всего организмов18 или тканей. Единственное ограничение для оптимизации этот метод для других систем является размер органа, ткани или организма. Палата, созданная микро ткани сдержанность является размер барьером для запуска анализа. Если метаболических результат слишком мал для мозга или ткани тестируется, и размер выборки не является ограничением, объединения образцов может использоваться для увеличения пробирного измерений и чувствительность. Изменение этот протокол для других приложений следует только требуют незначительных оптимизации, включая 1) выбор надлежащей мерой и смешайте цикла число и сроки и 2) определение концентрации эффективное лечение для ткани. Мера и смешивания раз были определены путем мониторинга концентрации кислорода, измеряется метаболический анализатор во время каждого цикла. Это можно просмотреть, выбрав O2 в кнопке оси Y2 в окне Обзор, после завершения выполнения. Во время каждого цикла должна быть концентрация кислорода дроп-ин, отражающие ткани потребление кислорода во время измерения времени, а затем вернуться к концентрации первоначального кислорода во время смешивания цикла. Время измерения и смеси должны быть проверены до тех пор, пока эта картина наблюдается. С помощью этого метода, были изучены другие насекомых мозг. Эти мозги были больше, чем весь мозг используется здесь, но по-прежнему вписывается в камере, порожденных ткани сдержанность. OCR чтений из этих мозги были выше, чем 400 пмоль/мин (данные не показаны). Результаты этих исследований, а также OCR ставки, которые совпадают с другими исследованиями, измерение потребления кислорода целом лету18,24, предположить, что D. melanogaster мозги не были кислорода ограниченной. D. melanogaster мозги и тканей от других организмов применяя этот метод требует особого внимания на четырех важнейших шагов.
Для успешного достижения воспроизводимость и биологически соответствующих измерений, есть критические шаги протокола, которые должны соблюдаться. Во-первых для этого метода требуется использование микро ткани сдержанность. Изготовление этих ограничений, используя спецификации и материалы перечисленных имеет важное значение. Материалы были выбраны благодаря их инертным химическим составом и их способность разрешить обмен надлежащей СМИ во время смешивания шаги без создания воздушных пузырьков. Во-вторых своевременной подготовки диссекции и плиты требуется увеличить метаболические вывода ткани. Короткие рассечение раз не должен значительно ухудшить мозга. Другие исследования показали, что летать мозги может поддерживаться для часов до суток после того, как рассечение, если правильно сохранены в перфузии камеры25. Однако как видно на рисунке 3B и 3D, если мозги остаются сидя в Пробирной СМИ для длительных периодов времени до assay, снизились показатели потребления кислорода. В процессе анализа образцы проходят смешивания шаг во время каждого цикла. Это смешение не только СПИД с инъекции химических соединений, но и действует для рециркуляции средств массовой информации и обеспечивают кислорода. Мозги в состоянии остаться метаболически активные для более длительных периодов во время этих циклов измерения микс, чем они будут инкубации в СМИ на вершине скамейке. Таким образом следует освоил рассечение личиночной мозги до начала настроить этот assay. При создании этот assay, анализировать небольшое количество генотипов в то время, чтобы свести к минимуму количество мозги необходимы и скважин используются. Это позволит предотвратить задержки между рассечения и анализа измерений. В-третьих поддержание стабильной температуры требуется проанализировать уровень метаболизма в физиологически соответствующих условий. Увеличение пробирного температуры может вызвать отмиранию тканей, отмеченные ниже нормы потребления кислорода (рис. 3 c). Если мухи выращиваются при другой температуре для экспериментальных целей, измерения должны производиться при этой температуре. В то время как Анатомирование наиболее вероятно будет выполняться при комнатной температуре, если анализ будет проводиться при разных температурах, покрытием и сдержанной мозги следует инкубировали при требуемой температуре за 15 мин до запуска assay. И наконец, наблюдая скважин после анализа важно определить если ткани позиционирования измерения. Иногда там будет один останец хорошо, что, после наблюдения за пластину под микроскопом рассечения, могут быть исключены из анализа данных за счет либо потерей ткани или съёмке, где мозг выскользнул из центра скважины и застрял под кольцо полимер сдержанность. Ткани могут быть потеряны, если сдержанность не был должным образом защищены хорошо и была нарушена во время смешивания циклов. В то время как ни одно из этих событий происходит часто, если они не исключены из анализа, они будут существенно ниже значения интенсивности.
Измерение всего ткани метаболических поток мониторинга потребления кислорода и внеклеточной подкисления обеспечивает биологически соответствующий метод для понимания, как метаболизм изменяется генетических пейзаж или других экспериментальных условиях. Этот метод является достаточно чувствительным, чтобы обнаружить метаболические изменения в едином D. melanogaster мозга, который не возможно с использованием стоп потока respirometry или косвенные калориметрии. Это также менее технически сложно чем используя Кларк электродом для измерения потребления кислорода. Дополнительным преимуществом этого протокола является способность анализировать один целый мозг за хорошо. 96-луночных формат позволяет для более чувствительных чтений, и таким образом, более чем одного генотип можно быть assayed одновременно из-за меньшего количества образцов, требуется для каждого анализа. Хотя измерения метаболизма в тканях еще сложной и требует тщательно воспитал и синхронизированные животных, этот протокол описывает метод для быстрого и относительно упрощенным и имеет потенциал для анализа многочисленных метаболических чувствительности в D. melanogaster личинок и взрослых мозги.
Disclosures
М. чаевые проводит предварительный патент для микро ткани ограничения, описанные в этом протоколе17.
Acknowledgments
В этом исследовании были использованы запасы, полученные от центра Bloomington дрозофилы фондовой (низ P40OD018637). Исследования в этой публикации было поддержано институционального развития Award (IDeA) сети для биомедицинских исследований передового опыта из Национального института Генеральной медицинских наук национальных институтов здоровья под номером Грант P20GM103430 и Фонд Род-Айленд. Авторы благодарят J. воды и P. Snodgrass-пояса за их поддержку в разработке этого протокола.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Assay medium | Agilent | 102365-100 | |
| Calibrant solution | Agilent | 100840-000 | |
| Corning Cell-Tak Cell Tissue Adhesive | Sigma Aldrich | DLW354240 | |
| delrin | Grainger | 2XMK6 | |
| Drosophila Schneider Media | Thermo Fisher | 21720-024 | |
| Dumont High Precision Tweezers (style 5) | Ted Pella | 5622 | |
| Loctite 409 | Amazon | ||
| Mitostress kit | Agilent | 103015-100 | oligomycin, rotenone, and antimycin A included |
| Netwell inserts (6-well) | VWR | 29442-136 | |
| nylon mesh | Component Supply | U-CMN-64 | |
| Parafilm M wrapping film | Fisher Scientific | S37440 | |
| PYREX spot plate | Fisher Scientific | 13-748B | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | ||
| Wave v2.4 XFe96 analyzer software | Agilent | https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/software-download-for-wave-desktop | free download to mac or windows |
| XFe96 catridge and cell plates | Agilent | 102416-100 |
References
- Cai, H., et al. Metabolic dysfunction in Alzheimer's disease and related neurodegenerative disorders. Current Alzheimer Research. 9 (1), 5-17 (2012).
- Zhao, S., et al. Glioma-derived mutations in IDH1 dominantly inhibit IDH1 catalytic activity and induce HIF-1alpha. Science. 324 (5924), New York, NY. 261-265 (2009).
- Brody, A. L., et al. Brain metabolic changes in major depressive disorder from pre- to post-treatment with paroxetine. Psychiatry Research. 91 (3), 127-139 (1999).
- Nagana Gowda, G. A., Djukovic, D. Overview of mass spectrometry-based metabolomics: Opportunities and challenges. Methods in Molecular Biology. 1198, 3-12 (2014).
- Dona, A. C., et al. A guide to the identification of metabolites in NMR-based metabonomics/metabolomics experiments. Computational and Structural Biotechnology Journal. 14, 135-153 (2016).
- Yuan, M., Breitkopf, S. B., Yang, X., Asara, J. M. A positive/negative ion-switching, targeted mass spectrometry-based metabolomics platform for bodily fluids, cells, and fresh and fixed tissue. Nature Protocols. 7 (5), 872-881 (2012).
- Zamboni, N., Fendt, S. -M., Rühl, M., Sauer, U. 13C-based metabolic flux analysis. Nature Protocols. 4 (6), 878-892 (2009).
- Duckwall, C. S., Murphy, T. A., Young, J. D. Mapping cancer cell metabolism with(13)C flux analysis: Recent progress and future challenges. Journal of Carcinogenesis. 12, 13 (2013).
- Clark, L. C., et al. Continuous recording of blood oxygen tensions by polarography. Journal of Applied Physiology. 6 (3), 189-193 (1953).
- Lighton, J. R. B. Measuring Metabolic Rates. Spatial Epidemiology: Methods and Applications. , 87-103 (2000).
- Ferrick, D. A., Neilson, A., Beeson, C. Advances in measuring cellular bioenergetics using extracellular flux. Drug Discovery Today. 13 (5-6), 268-274 (2008).
- Dunham-Snary, K. J., Sandel, M. W., Westbrook, D. G., Ballinger, S. W. A method for assessing mitochondrial bioenergetics in whole white adipose tissues. Redox Biology. 2 (1), 656-660 (2014).
- Fan, Y. -Y., Davidson, L. A., Callaway, E. S., Wright, G. A., Safe, S., Chapkin, R. S. A bioassay to measure energy metabolism in mouse colonic crypts, organoids, and sorted stem cells. American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (1), G1-G9 (2015).
- Lee, H., et al. Increased mitochondrial activity in renal proximal tubule cells from young spontaneously hypertensive rats. Kidney International. 85 (3), 561-569 (2014).
- Volkenhoff, A., et al. Glial glycolysis is essential for neuronal survival in drosophila. Cell Metabolism. 22 (3), 437-447 (2015).
- Becker, L., Nogueira, M. S., Klima, C., De Angelis, M. H., Peleg, S. Rapid and transient oxygen consumption increase following acute HDAC/KDAC inhibition in Drosophila tissue. Scientific Reports. 8 (1), (2018).
- Method and device for restraining contents of a cell plate. United States patent. Tipping, M., Waters, J. , 62/491,431 (2017).
- Neville, K. E., et al. A novel ex vivo method for measuring whole brain metabolism in model systems. Journal of Neuroscience Methods. 296, 32-43 (2018).
- Lardy, H. A., Johnson, D., McMurray, W. C. Antibiotics as tools for metabolic studies. I. A survey of toxic antibiotics in respiratory, phosphorylative and glycolytic systems. Archives of Biochemistry and Biophysics. 78 (2), 587-597 (1958).
- Turrens, J. F., Boveris, A. Generation of superoxide anion by the NADH dehydrogenase of bovine heart mitochondria. Biochemical Journal. 191, 421-427 (1980).
- Potter, V. R., Reif, A. E. Inhibition of an electron transport component by antimycin A. The Journal of Biological Chemistry. 194 (1), 287-297 (1952).
- Warburg, O. On the Origin of Cancer Cells. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
- Yang, L., Venneti, S., Nagrath, D. Glutaminolysis: A Hallmark of Cancer Metabolism. Annual Review of Biomedical Engineering. 19 (1), 163-194 (2017).
- Van Voorhies, W. A. Metabolic function in Drosophila melanogaster in response to hypoxia and pure oxygen. The Journal of Experimental Biology. 212 (19), 3132-3141 (2009).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (37), e1936 (2010).
