Summary
Vi presentiamo un protocollo per misurare il consumo di ossigeno e l'acidificazione extracellulare nei cervelli di larve e adulti di Drosophila melanogaster . Un analizzatore metabolico è utilizzato con un protocollo adattato e ottimizzato. Vincoli di micro-tessuto sono una componente fondamentale del presente protocollo e progettate e create appositamente per il loro uso in questa analisi.
Abstract
Questo protocollo descrive un metodo per misurare il metabolismo nel cervello di Drosophila melanogaster larvale e adulto. Quantificazione del metabolismo in organi interi fornisce una comprensione a livello del tessuto di utilizzazione di energia che non può essere catturato quando si analizzano le cellule primarie e linee cellulari. Mentre questa analisi è ex vivo, esso consente la misurazione da un numero di cellule specializzate che lavorano insieme per eseguire una funzione in un tessuto e modelli più da vicino l'organo in vivo . Riprogrammazione metabolico è stato osservato in molte malattie neurologiche, compreso neoplasia e malattie neurodegenerative. Questo protocollo è stato sviluppato per assistere l'indagine della Comunità d. melanogaster del metabolismo nei modelli di malattia neurologica usando un analizzatore metabolico commercialmente disponibile. Misurazione del metabolismo del cervello intero nell'analizzatore metabolico è impegnativo a causa della geometria del cervello. Questo analizzatore richiede campioni di rimanere nella parte inferiore di una piastra a 96 pozzetti. Campioni di cellule e tessuti pugni possono aderire alla superficie della piastra cellulare o utilizzare piastre sferoide, rispettivamente. Tuttavia, la forma sferica, tridimensionale dei cervelli di d. melanogaster impedisce il tessuto di aderire alla piastra. Questo protocollo richiede una moderazione di micro-tessuto appositamente progettato e fabbricato che aggira questo problema impedendo qualsiasi movimento del cervello pur consentendo misurazioni metaboliche da due sonde sensore a stato solido dell'analizzatore. Consumo di ossigeno e tassi di acidificazione extracellulare sono riproducibili e sensibili ad un trattamento con inibitori metabolici. Con una minore ottimizzazione, questo protocollo può essere adattato per l'uso con qualsiasi tessuto intero e/o sistema modello, purché la dimensione del campione non superi la camera generata dal sistema di ritenuta. Mentre misure metaboliche basale e un'analisi dopo un trattamento con inibitori mitocondriali sono descritte all'interno di questo protocollo, innumerevoli condizioni sperimentali, come preferenza di fonte di energia e ambiente di allevamento, potranno essere interrogate.
Introduction
Riprogrammazione metabolica è stata identificata in molte malattie neurologiche, compreso il Glioblastoma Multiforme (GBM), malattia di Huntington e disturbo depressivo maggiore (MDD)1,2,3. Come metabolismo diventa il fulcro delle strategie terapeutiche, strumenti per la ricerca di base metabolica hanno avanzato. Tuttavia, la maggior parte di questi metodi sono stata progettata per lo studio di linee cellulari e cellule primarie o per analizzare più grandi tessuti post-fissazione o - congelamento. Alcuni approcci hanno contato sui kit per misurare semplicisticamente specifici metaboliti, mentre altri hanno utilizzato più costose e complesse analisi che utilizza cromatografia in combinazione con spettrometria di massa4 per lo stesso obiettivo. Per capire il più grande paesaggio metabolico, metabolica profilatura5,6 e analisi di cambiamento continuo metabolico (MFA)7 è emerso per completare la proteomica su larga scala e studi genomici. Profilatura fornisce una rappresentazione quantitativa di metaboliti in una cella o un tessuto ad un certo punto nel tempo, mentre MFA si espande su questo consentendo il monitoraggio dei metaboliti identificati nel corso del tempo. Quest'ultimo è stato utile nel rivelare come fonti di energia vengono utilizzate in modo diverso in una cella o un tessuto quando in una malattia statale8. Tuttavia, questi metodi non includono la misurazione del tasso metabolico in generale.
Per interrogare lo stato metabolico nel complesso dei sistemi modello piccolo, i metodi tradizionali, come l' elettrodo di Clark9 e la calorimetria indiretta10, possono essere utilizzati per misurare il consumo di ossigeno o configurati per fermata manometrica di flusso, per misura dell'ossigeno e la concentrazione di biossido di carbonio, rispettivamente. Queste tecniche, fornendo con precisione spaccato la lettura della riprogrammazione metabolica a livello di organismo, hanno limitazioni. L'uso dell'elettrodo di Clark può essere tecnicamente impegnativo e non è progettato per gli studi di alto-rendimento. Il respirometro flusso fermata non può funzionare con la sensibilità necessaria per analisi di cellule o tessuti. Diversi anni fa, nuova tecnologia è stata sviluppata appositamente per queste applicazioni più piccole11. Questi strumenti sono stati inizialmente progettati per misurare il consumo di ossigeno e l'acidificazione extracellulare di linee cellulari e cellule primarie in un formato di 24 o 96 pozzetti. La semplicità dell'output set-up e dati stabilito questo metodo come alternativa agli approcci tradizionali. Questa metodologia è uno strumento potente per le cellule e gli avanzamenti recenti hanno permesso per la misurazione del tessuto punzoni12,13,14. Tuttavia, i metodi utilizzati in questi esperimenti non consentono la misurazione di organi interi da sistemi modello piccolo.
L'analisi metabolica dei modelli di malattia coinvolge spesso l'interazione tra cellule di funzione specializzata che risiedono all'interno del tessuto stesso. Ad esempio, le cellule gliali producono metaboliti utilizzati dai neuroni. Queste interazioni metaboliche sono necessari per la sopravvivenza neuronale15. Sistemi modello piccolo sono vantaggiosi per indagare questioni come queste. Studi per misurare il metabolismo di un intero organo, che contiene una varietà di tipi cellulari, aggiungerà alla comprensione dell'energia l'utilizzo in vivo. Recentemente, Becker et al ha segnalato un metodo di misurazione del consumo di ossigeno in tutta Mosca teste16. Unendo un numero di teste insieme in un pozzetto di una piastra di cella 24 pozzetti, letture di consumo di ossigeno sono state ottenute utilizzando un analizzatore metabolico. Mentre questo funziona bene per teste, che sono facilmente separate dal corpo, è molto più difficile da usare per organi quali cervello larvale, perché una grande quantità deve essere sezionato per questo metodo. Di conseguenza, un metodo che utilizza una piastra a 96 pozzetti delle cellule, che aumenta la sensibilità del consumo di ossigeno e letture di acidificazione extracellulare, è stato sviluppato per analizzare un singolo cervello intero larvale.
L'analizzatore metabolico utilizzato in questo studio richiede il campione da misurare per rimanere nella parte inferiore del pozzo di una piastra a 96 pozzetti delle cellule. Per cellule e tessuti relativamente piatte, questa non è una sfida; Tuttavia, per i cervelli larvali e adulti di d. melanogaster , non è possibile utilizzando protocolli di rivestimento del piatto tradizionale. La forma sferica tridimensionale dei cervelli in modo affidabile non aderisca alla superficie della placca, e quelli che lo fanno sono spesso danneggiati durante il tentativo di inserirli correttamente nel pozzo. Una parte fondamentale di questo nuovo protocollo è la progettazione e lo sviluppo di micro-tessuto vincoli17 che forniscono una piccola camera per il cervello a risiedere in senza interferire con le misurazioni metaboliche. La camera generata è circa 0,016 in altezza e offre spazio sufficiente per contenere facilmente molti cervelli di d. melanogaster . I vincoli sono costituiti da maglia di nylon attaccata un anello di polimero inerte e sarà discusso ulteriormente nei Risultati di rappresentante. Utilizzando questi vincoli riduce al minimo il tempo necessario per preparare i cervelli sezionati per la misurazione metabolica. Ottimizzare la procedura di misurazione genera il consumo di ossigeno costante, riproducibile e tassi di acidificazione extracellulare dopo sei cicli di misura (di 25 min). I cervelli rimangono metabolicamente attivi in queste condizioni per un minimo di 2 h, che consente di utilizzare iniezioni di terapeutica, inibitori o altri trattamenti tramite l'analizzatore metabolico cartuccia droga consegna porte. Questo protocollo può anche essere facilmente adattato per altri tessuti e piccolo modello sistemi18.
Il protocollo descritto di seguito viene descritto come analizzare il consumo di ossigeno in un intero cervello larvale della drosofila quando sfidato con sforzo mitocondriale. Per sottolineare il cervello, oligomycin è aggiunto per inibire la ATP sintasi19. La diminuzione nel consumo di ossigeno da letture basale Mostra una misura della quantità di ATP, a seconda di respirazione nel cervello. Ulteriori diminuzioni del consumo di ossigeno dopo trattamenti con rotenone20 e antimycin A21, inibitori dei complessi della catena di trasporto degli elettroni, I e III, rispettivamente, indicano la quantità di consumo di ossigeno non mitocondriale nella cervello. Questo test è un esempio di respirazione come mitocondriale in un cervello Vola potrebbe essere confrontato e come questo protocollo può essere usato per confrontare il metabolismo in diversi genotipi. Tuttavia, questo protocollo può essere adattato per misurare il consumo di ossigeno semplicemente basale e tassi di acidificazione extracellulare, nonché progettare più elaborati studi che studiano l'utilizzo dell'energia specifica o ipotesi di utilizzazione del substrato.
Protocol
1. metodo del dosaggio preparazione (giorno 1)
- Posizionare l'analizzatore metabolico (Tabella materiali) in un'incubatrice o una camera a temperatura controllata impostato a 11 ° C.
Nota: Questa temperatura è ideale per le misurazioni effettuate a 25 ° C, poiché permette la fluttuazione di temperatura di ~ 14 ° C che si verifica durante l'esecuzione del dosaggio. Questo è causato dal calore generato dallo strumento durante l'esecuzione. - Aprire il software appropriato sul computer collegato all'analizzatore metabolico. Fare clic sulla temperatura numerica in basso a sinistra dello schermo. Nella nuova finestra che si apre, fare clic sulla casella accanto al comando di "Riscaldamento" e assicurarsi che un segno di spunta venga visualizzato. Regolate la temperatura a 25 ° C e la gamma di tolleranza a 0,2 ° C, utilizzando le frecce.
Nota: Alcune ore sono necessari per raggiungere temperature stabili. - Aprire il contenitore della cartuccia (Tabella materiali) e rimuovere la cartuccia dalla piastra di utilità senza toccare le sonde.
Nota: La piastra di utilità viene utilizzata durante la taratura della cartuccia e non viene utilizzata mentre viene eseguito il test metabolico. - Aggiungere 200 μL di soluzione di calibratore (Tabella materiali) alla piastra di utilità e posto la cartuccia indietro sopra la piastra di utilità per reidratare il sensore sonde sulla cartuccia. Non toccare le sonde e proteggerli dalla luce.
- Sigillare la cartuccia con il film di paraffina.
- Incubare la cartuccia durante la notte a 25 ° C.
2. analisi Media preparazione (giorno 2)
- Aggiungere il glucosio di 10 mM e 10 mM sodio piruvato al medium di analisi.
- Incubare il mezzo a 25 ° C fino a quando il liquido ha equilibrati a questa temperatura.
- Regolare il pH a 7,4 utilizzando un pH-metro.
3. installazione del Software per l'analisi metabolica dei cervelli Drosophila melanogaster (Day 2)
- Impostare il software metabolico sull'analizzatore metabolico utilizzato nel passaggio 1.2.
- Selezionare "Modello" sulla schermata iniziale del software.
- Fare doppio clic su "Vuoto" per avviare un nuovo progetto di assay.
- Fare clic sul pulsante "Mappa di piastra" nella barra degli strumenti superiore per visualizzare il disegno del piatto di analisi delle cellule.
Nota: La piastra di dosaggio di cella conterrà i campioni di cervello e sarà abbinata con la cartuccia prima di iniziare l'analisi metabolica del saggio. -
Fare clic su Aggiungi gruppi pulsante 3x.
- Fare doppio clic sull'etichetta del "Gruppo 1" e rinominarlo in "Sperimentale".
Nota: Questo gruppo conterrà un cervello volo e un sistema di ritenuta del micro-tessuto trattato con farmaci. - Fare doppio clic sull'etichetta del "Gruppo 2" e rinominarlo in "Controllo".
Nota: Questo gruppo conterrà un cervello volo e un sistema di ritenuta del micro-tessuto con nessun trattamento farmacologico. - Fare doppio clic sul "gruppo 3" etichetta e rinominarlo in "ritenuta solo".
Nota: Questo gruppo conterrà un sistema di ritenuta del micro-tessuto senza cervello o trattamento farmacologico.
- Fare doppio clic sull'etichetta del "Gruppo 1" e rinominarlo in "Sperimentale".
-
Assegnare i pozzi a ogni gruppo in base a dove campioni nella piastra di cella sono destinati ad essere immessi.
- Clicca sull'etichetta "Sperimentale" e quindi evidenziare pozzi B2 - B8 sulla mappa piastra.
- Clicca sull'etichetta "Controllo" e quindi evidenziare pozzetti C2-C8 sulla mappa piastra.
- Fare clic sulla "moderazione solo" etichetta e quindi evidenziare pozzi D2-D8 sulla mappa piastra.
- Verifica che tutti i quattro angoli (A1, A12, H1 e H12) sono designati come sfondo.
Nota: Pozzi lungo il perimetro della piastra non vengono utilizzati per ridurre eventuali effetti di bordo. Si tratta di un'impostazione predefinita nel software.
-
Fare clic sul pulsante "Protocollo" nella barra superiore per impostare il protocollo.
- Cliccate su "modifica misura dati" nella finestra di misurazione della linea di base.
- Regolare il tempo che l'analizzatore metabolico misurerà il cervello modificando la misura basale tempo di ciclo "03:00" facendo l'alto e giù le frecce.
- Regolare il tempo di attesa fra le misure di cervello modificando l'attesa basale tempo di ciclo per l'analizzatore metabolico "0:00" facendo l'alto e giù le frecce.
- Regolare il tempo che l'analizzatore metabolico si mescolerà i media prima della misura il cervello modificando il basale mescolare il tempo di ciclo per "01:00" facendo l'alto e giù le frecce.
- Regolare il numero totale di cicli basale, che comprende la misura, attendere e cicli di mix, a "7" facendo l'alto e giù le frecce.
Nota: Tasso di consumo di ossigeno stabile misure è ottenute dopo ~ 25 min dall'inizio del test. - Fare clic sul pulsante "Aggiungi iniezione", situato nella barra di sinistra superiore.
- Clicca sull'etichetta"iniezione" e cambiarlo in "Oligomycin".
- Regolare la misura di iniezione, attendere e mix volte affinché corrispondano a quelle per il basale.
- Regolare il numero totale di cicli di iniezione a "6" facendo l'alto e giù le frecce.
- Ripetere i passaggi 3.7.6 - 3.7.8 ma modificare l'etichetta di "Rot/AA" e regolare il numero totale di cicli di iniezione a 7 facendo l'alto e giù le frecce.
- Fare clic sul pulsante "Esegui test" nella barra degli strumenti superiore.
- "Salvare" il saggio e iniziare a impostare la cartuccia (Tabella materiali).
4. preparazione della cartuccia per la calibrazione (giorno 2)
-
Rimuovere la cartuccia dall'incubatrice 25 ° C e togliere il coperchio.
- Aggiungere 20 μL di 100 μM oligomycin alla porta piccola iniezione circolare sinistra superiore, porta A, nella cartuccia per tutti i corrispondenti pozzi sperimentali sulla piastra cellulare e aggiungere 20 μL di media analisi alla porta A in tutti gli altri pozzi, compresi i pozzetti di controllo e sfondo.
Nota: La cartuccia contiene 4 porte (A-D) per ciascuno dei 96 pozzetti corrispondenti alla piastra cellulare cosa conterrà i campioni. Questo passaggio è fatto prima di aggiungere i campioni. Aggiungere 20 μL di 100 risultati di oligomycin μM a una concentrazione finale oligomycin 10 μm nella piastra cellulare bene una volta che il farmaco viene iniettato dall'analizzatore metabolico. Oligomycin è un inibitore dell'ATP sintasi. Il valore di consumo di ossigeno risultante rifletterà la quantità di ATP-collegata di respirazione nel cervello. Al fine di iniettare correttamente i farmaci nei pozzetti specificati, tutte le porte della stessa lettera devono essere riempite con lo stesso volume di liquido, anche se non in uso. - Aggiungere 22 μL di 50 μM rotenone/antimycin alla piccola porta circolare destra superiore, porta B, nella cartuccia per tutti i corrispondenti pozzi sperimentali sulla piastra cellulare e aggiungere 22 μL di media analisi alla porta B di tutti gli altri pozzi, compresi i pozzetti di controllo e sfondo.
Nota: Ciò provoca un finale rotenone/Antimycin una concentrazione di 5 μM nella piastra cellulare bene una volta che il farmaco viene iniettato dall'analizzatore metabolico. Rotenone e antimycin A sono inibitori del trasporto dell'elettrone catena complessi I e III, rispettivamente. Il valore di consumo di ossigeno risultante rifletterà la respirazione non mitocondriale nel cervello. - Fare clic su "Start Esegui" per inserire la cartuccia caricata con la piastra di utilità l'analizzatore metabolico con pozzetto A1 posizionato nell'angolo superiore sinistro quando rivolto verso lo strumento, con il caricatore di piastra che si estende dal lato destro della macchina.
- Aggiungere 20 μL di 100 μM oligomycin alla porta piccola iniezione circolare sinistra superiore, porta A, nella cartuccia per tutti i corrispondenti pozzi sperimentali sulla piastra cellulare e aggiungere 20 μL di media analisi alla porta A in tutti gli altri pozzi, compresi i pozzetti di controllo e sfondo.
- Selezionare "I ' m Ready" nel software per iniziare l'equilibrazione e taratura della cartuccia prima di iniziare il dosaggio metabolico con la piastra di cella che contiene i campioni.
Nota: Il programma vi chiederà di salvare il file e quindi iniziare equilibrare e calibrazione. Questa procedura può richiedere fino a 1 h. passaggi 5 – 8 sono condotte durante il tempo di equilibrazione e calibrazione.
5. preparazione delle restrizioni di Micro-tessuto (giorno 2)
- Selezionare 1 micro-tessuto fermo al cervello che viene misurato, più almeno 3 per uso come i controlli di sola ritenuta, dal contenitore di stoccaggio (contiene 70% di etanolo).
- Sciacquare le restrizioni con etanolo al 70% e lavarli con acqua deionizzata 3 x per 2 min ciascuno, utilizzando un cestello in rete e la piastra a 6 pozzetti (Tabella materiali). Aggiungere ulteriore acqua lava se le restrizioni ancora emanano un odore di alcol.
- Lavare le restrizioni di micro-tessuto in media di dosaggio e lasciarli in questa soluzione, finché non sono pronti per l'uso.
6. dissezione di Drosophila melanogaster larvale cervelli (giorno 2)
- Selezionare larve instar (errante) tardo terza da un flacone di colture mosche Oregon-R utilizzando ad alta precisione, stile 5 pinzette (0,10 x 0,06 mm2).
- Posizionare la larva nel pozzetto di una piastra spot per dissezione pulita (Tabella materiali) contenente 500 μL di PBS 1X.
Nota: Un punto piatto è una lastra di vetro con depressioni, utilizzato per sezionare piccole tessuti e organismi. - Lavare la larva scuotendolo delicatamente nel pozzo, con una pinzetta.
- Spostare la larva al pozzo pulito di una piastra spot contenente 500 μL di PBS 1X.
- Posizionare la piastra posto sotto il microscopio per dissezione.
- Afferrare la larva al suo tronco con un paio di pinzette, mentre afferra i ganci dell'occhio con un secondo paio di pinzette.
- Delicatamente e uniformemente tirare la larva in direzioni opposte, utilizzando le due serie di pinzette.
- Visualizzare il cervello, che in genere soggiorni attaccati ai ganci occhio e comunemente saranno occhio-antennali dischi collegato ad esso.
- Rimuovere attentamente ulteriori tessuti del cervello, usando i ganci dell'occhio per mantenere il cervello in posizione. Infine, separare i ganci dell'occhio dal cervello.
- Utilizzare una pinzetta per muovere il cervello sezionato per un nuovo pozzo su un piatto posto contenente 1X PBS.
- Ripetere i passaggi 6.1 – 6,10 14 cervelli vengono sezionati.
Nota: Il tempo totale dall'inizio della dissezione per il dosaggio non deve superare 30 min.
7. aggiunta dei cervelli sezionati alla piastra 96 pozzetti metabolica Assay (giorno 2)
- Aggiungere 50 μL di media di dosaggio per i pozzetti della piastra 96 pozzetti metabolica analisi (Tabella materiali) utilizzato in esperimento, tra cui la sperimentale, controllo, ritenuta da solo e pozzi di sfondo.
- Posizionare con attenzione un cervello in ciascun pozzetto da A8 A2 e B2-B8 della piastra cellulare, con una pinzetta, una spatola o una pipetta.
Nota: Questo può essere fatto lontano il microscopio per dissezione. - Sotto il microscopio di dissezione, utilizzare un ago piegato microsonda per affondare il cervello sul fondo del pozzo.
- Appoggiate delicatamente il cervello nel mezzo le tre sfere sollevate usando la sonda.
8. l'aggiunta di Micro-tessuto vincoli alla piastra 96 pozzetti metabolica analisi delle cellule (giorno 2)
- Con una pinzetta, posizionare il sistema di ritenuta del micro-tessuto sul bordo della piastra dosaggio ben e utilizzare il microscopio per controllare che sia orientata con l'anello di plastica rivolto verso il basso e la maglia sulla parte superiore.
- Rimuovere la piastra da sotto il microscopio e utilizzare pinzette per afferrare il sistema di ritenuta su entrambi i lati e dolcemente cadere nel pozzo.
- Utilizzare un ago piegato microsonda per spingere il fermo verso il basso nel pozzo.
- Sotto il microscopio, verificare che il cervello può essere visto attraverso il sistema di ritenuta del tessuto e che sia centrato nel pozzo.
- Ripetere i passaggi da 8.1 – 8,4 per tutti i pozzi che saranno nel dosaggio — A2-A8, B8-B2 e C2-C8.
- Aggiungere con cautela 130 μL di media di dosaggio a ciascuno di quella sperimentale, controllo e sola ritenuta pozzi.
- Verificare che il cervello e la micro-tessuto restrizioni non siano spostati durante l'aggiunta di media visualizzando li sotto il microscopio.
- Aggiungere 180 μL di media analisi quattro angolo pozzetti per l'uso come controllo dello sfondo.
9. aggiunta della piastra delle cellule per l'analizzatore metabolico e l'inizio del test (giorno 2)
- Verificare che l'equilibrazione e calibrazione sono completi di attesa per il software richiedere la piastra di cella contenente il campione.
- Selezionare "Aprire il vassoio" e attendere che lo strumento espellere la piastra di utilità.
- Rimuovere la piastra di utilità e aggiungere alla piastra, senza il coperchio, nello stesso orientamento.
- Selezionare "Load Cell piastra" per lo strumento a prendere alla piastra e chiudere il vassoio e poi iniziare il dosaggio.
- Visualizzare le misurazioni in tempo reale con barre di errore sullo schermo del computer che esegue il software.
- Rimuovere la piastra di cella espulsa e la cartuccia quando l'analisi è completa.
Nota: Cartucce accoppiate e placche delle celle può essere riutilizzato 5 x.
10. post-misurazione analisi (giorno 2)
- Per verificare che i cervelli e le restrizioni di micro-tessuto sono ancora posizionate correttamente nel pozzo una volta completata l'analisi, utilizzare un microscopio per dissezione. Escludere qualsiasi pozzi con le anomalie dall'analisi.
- Esportare il tasso di consumo di ossigeno (OCR) e i dati di velocità di acidificazione extracellulare (ECAR) per ulteriori analisi.
Representative Results
Il protocollo qui presentato richiede l'utilizzo di vincoli di micro-tessuto che soddisfano le specifiche descritte di seguito. Utilizzare altri metodi per tenere il cervello a posto nella parte inferiore della piastra 96 pozzetti cella era infruttuoso (Figura 2A e 2B). In primo luogo, sono stati testati vari agenti per aumentare l'aderenza del tessuto alla piastra. Un adesivo del tessuto disponibile in commercio (Tabella materiali) è raccomandato per l'uso di cellule e organoids con piastre di cella e piastre sferoide, rispettivamente. Inizialmente, cervelli sembravano aderire alla superficie ben; Tuttavia, le letture di consumo (OCR) di ossigeno erano basse, e osservando i pozzetti dopo l'analisi ha rivelato che i cervelli sono stati non più attaccati alla superficie ben (Figura 2A). Gli stessi risultati si sono verificati con colla super (Figura 2A). Avanti, schermi di piccole dimensioni per contenere i cervelli all'interno di una piccola camera nella parte inferiore del pozzo è stata tentata di produzione (Figura 2B).
Schermi di metallo prodotto alte letture OCR da solo, come ha fatto in metallo schermi con un anello di polimero che tiene lo schermo in posizione (Figura 2B). Pezze di rete di plastica è stata utilizzata con lo stesso anello di polimero. Questo dispositivo ha causato una lettura OCR negativa essere ottenuti. Infine, micro-tessuto vincoli sono stati progettati utilizzando un polimero inerte per l'anello misura un diametro esterno di 0,146 in, un diametro interno di 0.1335 in, uno spessore di 0,0125 in e un'altezza di 0,016 in (Tabella materiali). Colla super (Tabella materiali) è stata utilizzata per fissare l'anello di una rete di nylon con un specifico dei pori di 0,0039 in diametro (Tabella materiali). La dimensione dei pori è critica, in quanto permette lo scambio di media e metabolita senza formazione di bolle d'aria, ma ancora agisce come una barriera per i cervelli. Questi vincoli solo provocare poco o nessun OCR lettura e quando utilizzato con il cervello, consentono letture riproducibile (Figura 2A e 2B). La verifica dopo il test ha mostrato che i cervelli erano ancora posizionati correttamente nei pozzetti. Questi vincoli di tessuto non sono attualmente disponibili in commercio, ma possono essere prodotte seguendo le specifiche di cui sopra. Mentre questo richiede fabbricazione precisa, maggior parte dei negozi di macchina sarà in grado di riprodurre questo fermo utilizzando i materiali di cui sopra.
Il protocollo è stato ulteriormente ottimizzato al conto per il supporto di test, il tempo consentita prima di eseguire l'analisi e la temperatura (Figura 3). Inizialmente, le analisi sono stata istituite nel medium Schneider modellare l'ambiente larvale in vivo . Tuttavia, i supporti utilizzati non possono contenere agenti di buffering poiché pH è usato per misurare l'ECAR. Questo media, pertanto, deve essere personalizzato fatto, che è costosa. Per ottimizzare questo, una media di dosaggio disponibili in commercio progettato per analisi metabolica (Tabella materiali) è stato usato al posto dei media di Schneider. I livelli di OCR erano immutati, anche quando l'aumento dei livelli di glucosio leggermente in termini di modello analisi media (Figura 3A). Tutte le analisi da questo punto in poi sono state condotte nel medium di analisi. I supplementi ai media sono stati ottimizzati osservando se il consumo di ossigeno e i tassi di acidificazione extracellulare ha mostrato una risposta quando trattati con inibitori noti mitocondriali. Successivamente, è stato analizzato il tempo di attesa tra le dissezioni e le esecuzioni di test. Un'incubazione di 3 h caduto significativamente i livelli di OCR (Figura 3B). Figura 3D dimostra la differenza presso il sesto punto di tempo, ovvero quando i livelli di OCR ed ECAR stabilizzano al posto del cervello sia in adulti e larve. Così, il protocollo indica per iniziare il test immediatamente dopo le dissezioni, a meno che l'esperimento richiede un equilibrio di temperatura, in cui è suggerito caso un'incubazione per meno di 30 min. L'analizzatore metabolico è memorizzato in un incubatore impostato a 11 ° C per consentire una temperatura di 25 ° C durante tutto il test. Se le temperature sono elevate a causa della temperatura ambiente e funzionamento dello strumento, livelli ridotti di OCR sono osservati (Figura 3). Questo è supposta per essere a causa di morte del tessuto.
Quando le condizioni ottimizzate sono seguite, i saggi con il larvale e adulto cervelli risultato nelle letture di OCR leggermente superiore a 150 pmol/min presso lo stabilizzato tempo sesto punto, ~ 25 min in test (Figura 4B). Questo tasso è mantenuto per almeno 30 min (Figura 4A) e fino a 2 h (dati non mostrati). L'ECAR è leggermente inferiore nel cervello adulto rispetto nei cervelli larvali presso il sesto punto di tempo (Figura 4) e viene mantenuto per almeno 30 min (Figura 4). Questo risultato corrisponde ad un aumento nella glicolisi durante gli stadi larvali per sostenere la crescita. Un'iniezione con un inibitore mitocondriale, come oligomycin, abbassa le letture di OCR per rivelare la respirazione di ATP-dipendente e ulteriore trattamento con rotenone e antimycin A abbassa l'OCR per rivelare il consumo di ossigeno non mitocondriale (Figura 5A ). Questi dati dimostrano che questi inibitori sono in grado di penetrare il tessuto cerebrale e possono essere utilizzati per confrontare la respirazione mitocondriale nei cervelli dei vari genotipi. Per questo test, il mix, aspettare, e tempi di misura sono state ottimizzate osservando i livelli di ossigeno, non il tasso di consumo, e garantire che dopo la miscelazione, il livello di ossigeno rinviato al livello precedente la misura.
Figura 1: schema delle misurazioni di OCR ed ECAR larvale cervello nell'analizzatore metabolico. La cartuccia viene preparata un giorno prima per l'esecuzione del dosaggio. Il giorno successivo, farmaci vengono aggiunti per i porti di iniezione della cartuccia. D. melanogaster larvali cervelli vengono sezionati e micro-tessuto vincoli vengono aggiunti per garantire il cervello sul fondo del pozzo. Alla piastra con i cervelli è analizzata nell'analizzatore metabolico e i dati vengono analizzati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Micro-tessuto vincoli non sono metabolicamente attive e tenere il cervello in una camera nella parte inferiore di una piastra ben. (A) The OCR dei cervelli larvali Oregon-R D. melanogaster è misurata in pozzetti sensibilizzati con adesivo del tessuto (Tabella materiali) o quando i cervelli sono super incollati al fondo del pozzo. I risultati sono paragonati a quelli dei cervelli posizionati nella parte inferiore del pozzo utilizzando micro-tessuto restrizioni. (B) The OCR è misurata in pozzetti contenenti analisi media e metallo, metallo con un anello di polimero, pezze di rete di plastica e un anello di polimero o vincoli di micro-tessuto. p-valore < 0.05, * * p-valore < 0.01, * * * p-valore < 0,001, * * * p-valore < 0,0001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: ottimizzazione dei media, tempo di incubazione e temperatura. (A) The OCR è misurata in Oregon-R D. melanogaster larvali cervelli utilizzando media Schneider (S2) con piruvato di sodio aggiunto, S2 con glucosio e sodio piruvato aggiunto e analisi media con glucosio e sodio piruvato aggiunto. (B) The OCR è misurato in cervelli larvali dopo 3 h di incubazione prima del dosaggio, o dopo 30 min di incubazione prima del dosaggio. (C) The OCR è misurato in cervelli larvali alle analisi del saggio temperatura di 33 ° C e 25 ° C. Il sesto punto di tempo è rappresentato graficamente. (D) The OCR è misurato in cervelli larvali dopo 3 h di incubazione prima del dosaggio, o dopo 30 min di incubazione prima del dosaggio. I dati sono segnalati per il sesto punto di tempo. p-valore < 0.05, * * p-valore < 0.01, * * * p-valore < 0,001, * * * p-valore < 0,0001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: L'OCR ed ECAR riproducibile sono misurati in adulto e larvale d. melanogaster cervelli. (A) The OCR viene misurata nel cervello adulto e larvale Oregon-R D. melanogaster , per 30 min (B) dati di The OCR del sesto punto tempo da pannello A sono rappresentato graficamente. Questo è il punto di tempo in cui le letture OCR stabilizzano. (C) The ECAR viene misurata nel cervello adulto e larvale di d. melanogaster , per 30 min (D) dati di The ECAR del sesto punto tempo dal pannello A sono rappresentato graficamente. Questo è il punto di tempo in cui le letture di ECAR stabilizzano. p-valore < 0.05, * * p-valore < 0.01, * * * p-valore < 0,001, * * * p-valore < 0,0001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Oligomycin abbassa i livelli di cervello larvale OCR di d. melanogaster per rivelare la respirazione ATP-dipendente, e un ulteriore di rotenone e antimycin abbassa l'OCR per rivelare il consumo di ossigeno non mitocondriale. (A) The OCR è misurata in Oregon-Rd. melanogaster larvali cervelli dopo un trattamento con un 20 µM oligomycin e miscela di rotenone/antimycin A 5 µM. Il controllo e la sola ritenuta pozzi sono stati iniettati con media di dosaggio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Qui, un nuovo metodo per l'analisi metabolica di d. melanogaster cervelli larvale e adulto ex vivo è descritto. In condizioni basali, consumo di ossigeno e tassi di acidificazione extracellulare indicano come metabolicamente attiva il cervello è e può determinare se un tessuto è diventato più dipendente dalla respirazione mitocondriale rispetto a glicolitico rispettivamente11.
Trattando i cervelli con inibitori o farmaci terapeutici può fornire ulteriori informazioni sullo stato metabolico del tessuto. Substrati metabolici possono anche essere aggiunto per determinare le dipendenze su specifici metaboliti, come il glucosio per verificare il Warburg effetto22 o glutamina per indagare glutaminolysis23— sia comune nella riprogrammazione metabolica. Per studi a lungo termine, larve o mosche potrebbero anche essere somministrati farmaci invece di utilizzare porte di iniezione e cervelli potrebbero essere dosati a intervalli o nel punto finale, a seconda del design sperimentale. Questo metodo può essere ottimizzato per numerose applicazioni.
Questo metodo è stato ottimizzato per il cervello, ma può essere utilizzato per analizzare altri larvale18 e tessuti adulti. Inoltre, altri sistemi di piccolo modello possono utilizzare questo metodo per misurare tutto organismi18 o tessuti. L'unica limitazione di questo metodo per altri sistemi di ottimizzazione è la dimensione dell'organismo, tessuto o organo. La camera di creato da sistema di ritenuta di micro-tessuto è la barriera di dimensioni per l'esecuzione del dosaggio. Se l'output metabolica è troppo basso per il cervello o del tessuto in fase di test, e la dimensione del campione non è un vincolo, pool di campioni può essere utilizzato per aumentare le misure di analisi e sensibilità. Modifica questo protocollo per altre applicazioni deve solo richiedere ottimizzazioni minori, tra cui 1) scegliere la misura adatta e mescolare ciclo numeri e tempi e 2) determinare le concentrazioni di trattamento efficace per il tessuto. La misura e tempi di miscelazione sono state determinate mediante il monitoraggio concentrazione di ossigeno misurata dall'analizzatore metabolico durante ogni ciclo. Questo può essere visto selezionando O2 nel pulsante asse Y2 nella finestra panoramica dopo che viene completata l'esecuzione. Durante ogni ciclo, dovrebbe esserci una concentrazione di ossigeno di drop-in che riflette il consumo di ossigeno del tessuto durante il tempo misurato, seguito da un ritorno alla concentrazione iniziale di ossigeno durante il ciclo di miscelazione. I tempi di misura e mix dovrebbero essere testati fino a quando questo modello è osservato. Utilizzando questo metodo, sono stati studiati altri cervelli dell'insetto. Questi cervelli sono stati più grandi cervelli volare qui usato ma ancora in forma all'interno della camera generata dal sistema di ritenuta del tessuto. Le letture di OCR da questi cervelli erano alte come 400 pmol/min (dati non mostrati). I risultati di questi studi, come pure i tassi di OCR che si allineano con altri studi misura intera-fly ossigeno consumo18,24, suggeriscono che i cervelli di d. melanogaster non erano ossigeno limitato. Per entrambi i cervelli di d. melanogaster e tessuti da altri organismi, l'applicazione di questo metodo richiede una particolare attenzione a quattro passaggi critici.
Per raggiungere con successo misure riproducibili e biologicamente rilevanti, ci sono passaggi critici del protocollo che deve essere seguita. In primo luogo, l'uso di un sistema di ritenuta del micro-tessuto è richiesto per questo metodo. Queste restrizioni utilizzando le specifiche e i materiali elencati di produzione è essenziale. I materiali sono stati selezionati a causa della loro composizione chimica inerte e la loro capacità per consentire lo scambio di supporto corretto durante le fasi di miscelazione senza la creazione di bolle d'aria. In secondo luogo, per massimizzare l'output metabolica del tessuto è necessaria una tempestiva preparazione di dissezione e piastra. Tempi brevi dissezione non dovrebbero alterare significativamente il cervello. Altri studi hanno indicato che cervelli volare possono essere mantenuti vivi per ore o giorni dopo dissezione se correttamente conservato in un'aspersione camera25. Tuttavia, come visto in Figura 3B e 3D, se cervelli sono rimasto seduto nei media di dosaggio per lunghi periodi di tempo prima del dosaggio, sono diminuiti i tassi di consumo di ossigeno. Durante il test i campioni subiscono un miscelazione passo durante ogni ciclo. Questa miscelazione non solo aiuta con le iniezioni di composti chimici, ma agisce anche per ricircolare i media e fornire ossigeno. I cervelli sono in grado di rimanere metabolicamente attivo per periodi più lunghi durante questi cicli di misura-mix di essi sarebbe essere incubando nei media sulla parte superiore del banco. Pertanto, la dissezione del cervello larvale dovrebbe essere padroneggiata prima di iniziare a impostare la pagina di questo saggio. Quando questo test, che istituisce un piccolo numero di genotipi di analizzare contemporaneamente, per ridurre al minimo il numero dei cervelli necessari e pozzi utilizzati. Questo consentirà di evitare ritardi tra la dissezione e le misurazioni di dosaggio. In terzo luogo, mantenere una temperatura stabile è necessaria per analizzare i tassi metabolici in condizioni fisiologicamente rilevanti. Temperature aumentato dosaggio possono causare la morte del tessuto, osservato da più bassi tassi di consumo di ossigeno (Figura 3). Se le mosche sono allevati ad una temperatura diversa per scopi sperimentali, le misure dovrebbero essere effettuate anche a questa temperatura. Mentre le dissezioni probabilmente verranno eseguite a temperatura ambiente, se l'analisi sarà condotta ad una temperatura diversa, i cervelli placcati e sobri vanno incubati a temperatura richiesta per 15 min prima di eseguire il test. Infine, osservando post-l'analisi pozzi è fondamentale per determinare se il posizionamento del tessuto interessato le misurazioni. Occasionalmente, ci sarà un valore erratico di ben che, dopo aver osservato la piastra sotto il microscopio per dissezione, possa essere eliminato dall'analisi dei dati a causa di una perdita di tessuto o mispositioning, in cui il cervello è scivolato fuori dal centro del pozzo ed è bloccato sotto l'anello in polimero del sistema di ritenuta. Tessuto può essere perso se il sistema di ritenuta non è fissato bene al pozzo ed è stato disturbato durante i cicli di miscelazione. Mentre nessuno di questi eventi non accade spesso, se non vengono esclusi dall'analisi, essi si abbassa sostanzialmente i valori della frequenza.
La misura del cambiamento continuo metabolico del intero-tessuto di monitoraggio consumo di ossigeno e l'acidificazione extracellulare fornisce un metodo biologicamente rilevante per la comprensione di come il metabolismo è alterato da panorama genetico o altre condizioni sperimentali. Questo metodo è abbastanza sensibile per rilevare cambiamenti metabolici in un unico cervello di d. melanogaster , che non è possibile utilizzare stop-flow manometrica o calorimetria indiretta. Inoltre è tecnicamente meno difficile rispetto all'utilizzo di un elettrodo di Clark per misurare il consumo di ossigeno. Un ulteriore vantaggio di questo protocollo è la capacità di analizzare un intero cervello per pozzetto. Il formato di 96 pozzetti consente letture più sensibile, e così, più di un genotipo può essere analizzato in un momento a causa del numero ridotto di campioni richiesti per test. Mentre la misurazione del metabolismo nel tessuto è comunque impegnativo e richiede attentamente allevati e sincronizzati animali, questo protocollo descrive un metodo veloce, relativamente semplice ed ha il potenziale di analizzare numerose sensibilità metabolica in D. melanogaster cervelli larvali e adulti.
Disclosures
M. Tipping detiene un brevetto provvisorio per le restrizioni di micro-tessuto descritto in questo protocollo17.
Acknowledgments
Titoli ottenuti da Bloomington Drosophila Stock Center (NIH P40OD018637) sono stati utilizzati in questo studio. La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata supportata dalla rete istituzionale Development Award (IDeA) per eccellenza di ricerca biomedica dal National Institute of General Medical Sciences del National Institutes of Health, sotto concessione numero P20GM103430 e dalla Fondazione Rhode Island. Autori ringraziano J. Waters e P. Snodgrass-cintura per il loro supporto nello sviluppo di questo protocollo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Assay medium | Agilent | 102365-100 | |
| Calibrant solution | Agilent | 100840-000 | |
| Corning Cell-Tak Cell Tissue Adhesive | Sigma Aldrich | DLW354240 | |
| delrin | Grainger | 2XMK6 | |
| Drosophila Schneider Media | Thermo Fisher | 21720-024 | |
| Dumont High Precision Tweezers (style 5) | Ted Pella | 5622 | |
| Loctite 409 | Amazon | ||
| Mitostress kit | Agilent | 103015-100 | oligomycin, rotenone, and antimycin A included |
| Netwell inserts (6-well) | VWR | 29442-136 | |
| nylon mesh | Component Supply | U-CMN-64 | |
| Parafilm M wrapping film | Fisher Scientific | S37440 | |
| PYREX spot plate | Fisher Scientific | 13-748B | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | ||
| Wave v2.4 XFe96 analyzer software | Agilent | https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/software-download-for-wave-desktop | free download to mac or windows |
| XFe96 catridge and cell plates | Agilent | 102416-100 |
References
- Cai, H., et al. Metabolic dysfunction in Alzheimer's disease and related neurodegenerative disorders. Current Alzheimer Research. 9 (1), 5-17 (2012).
- Zhao, S., et al. Glioma-derived mutations in IDH1 dominantly inhibit IDH1 catalytic activity and induce HIF-1alpha. Science. 324 (5924), New York, NY. 261-265 (2009).
- Brody, A. L., et al. Brain metabolic changes in major depressive disorder from pre- to post-treatment with paroxetine. Psychiatry Research. 91 (3), 127-139 (1999).
- Nagana Gowda, G. A., Djukovic, D. Overview of mass spectrometry-based metabolomics: Opportunities and challenges. Methods in Molecular Biology. 1198, 3-12 (2014).
- Dona, A. C., et al. A guide to the identification of metabolites in NMR-based metabonomics/metabolomics experiments. Computational and Structural Biotechnology Journal. 14, 135-153 (2016).
- Yuan, M., Breitkopf, S. B., Yang, X., Asara, J. M. A positive/negative ion-switching, targeted mass spectrometry-based metabolomics platform for bodily fluids, cells, and fresh and fixed tissue. Nature Protocols. 7 (5), 872-881 (2012).
- Zamboni, N., Fendt, S. -M., Rühl, M., Sauer, U. 13C-based metabolic flux analysis. Nature Protocols. 4 (6), 878-892 (2009).
- Duckwall, C. S., Murphy, T. A., Young, J. D. Mapping cancer cell metabolism with(13)C flux analysis: Recent progress and future challenges. Journal of Carcinogenesis. 12, 13 (2013).
- Clark, L. C., et al. Continuous recording of blood oxygen tensions by polarography. Journal of Applied Physiology. 6 (3), 189-193 (1953).
- Lighton, J. R. B. Measuring Metabolic Rates. Spatial Epidemiology: Methods and Applications. , 87-103 (2000).
- Ferrick, D. A., Neilson, A., Beeson, C. Advances in measuring cellular bioenergetics using extracellular flux. Drug Discovery Today. 13 (5-6), 268-274 (2008).
- Dunham-Snary, K. J., Sandel, M. W., Westbrook, D. G., Ballinger, S. W. A method for assessing mitochondrial bioenergetics in whole white adipose tissues. Redox Biology. 2 (1), 656-660 (2014).
- Fan, Y. -Y., Davidson, L. A., Callaway, E. S., Wright, G. A., Safe, S., Chapkin, R. S. A bioassay to measure energy metabolism in mouse colonic crypts, organoids, and sorted stem cells. American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (1), G1-G9 (2015).
- Lee, H., et al. Increased mitochondrial activity in renal proximal tubule cells from young spontaneously hypertensive rats. Kidney International. 85 (3), 561-569 (2014).
- Volkenhoff, A., et al. Glial glycolysis is essential for neuronal survival in drosophila. Cell Metabolism. 22 (3), 437-447 (2015).
- Becker, L., Nogueira, M. S., Klima, C., De Angelis, M. H., Peleg, S. Rapid and transient oxygen consumption increase following acute HDAC/KDAC inhibition in Drosophila tissue. Scientific Reports. 8 (1), (2018).
- Method and device for restraining contents of a cell plate. United States patent. Tipping, M., Waters, J. , 62/491,431 (2017).
- Neville, K. E., et al. A novel ex vivo method for measuring whole brain metabolism in model systems. Journal of Neuroscience Methods. 296, 32-43 (2018).
- Lardy, H. A., Johnson, D., McMurray, W. C. Antibiotics as tools for metabolic studies. I. A survey of toxic antibiotics in respiratory, phosphorylative and glycolytic systems. Archives of Biochemistry and Biophysics. 78 (2), 587-597 (1958).
- Turrens, J. F., Boveris, A. Generation of superoxide anion by the NADH dehydrogenase of bovine heart mitochondria. Biochemical Journal. 191, 421-427 (1980).
- Potter, V. R., Reif, A. E. Inhibition of an electron transport component by antimycin A. The Journal of Biological Chemistry. 194 (1), 287-297 (1952).
- Warburg, O. On the Origin of Cancer Cells. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
- Yang, L., Venneti, S., Nagrath, D. Glutaminolysis: A Hallmark of Cancer Metabolism. Annual Review of Biomedical Engineering. 19 (1), 163-194 (2017).
- Van Voorhies, W. A. Metabolic function in Drosophila melanogaster in response to hypoxia and pure oxygen. The Journal of Experimental Biology. 212 (19), 3132-3141 (2009).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (37), e1936 (2010).
