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Neuroscience

Drosophila melanogaster लार्वा और वयस्क दिमाग का चयापचय विश्लेषण

Published: August 7, 2018 doi: 10.3791/58007

Summary

हम Drosophila melanogaster लार्वा और वयस्क दिमाग में ऑक्सीजन की खपत और extracellular अंलीकरण को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । एक चयापचय विश्लेषक एक अनुकूलित और अनुकूलित प्रोटोकॉल के साथ उपयोग किया जाता है । सूक्ष्म ऊतक संयम इस प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण घटक है और डिजाइन किए गए थे और इस विश्लेषण में उनके उपयोग के लिए विशेष रूप से बनाया ।

Abstract

इस प्रोटोकॉल Drosophila melanogaster लार्वा और वयस्क दिमाग में चयापचय को मापने के लिए एक विधि का वर्णन । पूरे अंगों में चयापचय को बढ़ाता है एक ऊतक ऊर्जा उपयोग के स्तर की समझ है कि जब प्राथमिक कोशिकाओं और सेल लाइनों का विश्लेषण पर कब्जा नहीं किया जा सकता प्रदान करता है । हालांकि यह विश्लेषण पूर्व vivoहै, यह विशेष कोशिकाओं के एक नंबर से माप के लिए एक साथ काम कर एक ऊतक में एक समारोह और अधिक बारीकी से मॉडल vivo अंग में प्रदर्शन करने के लिए अनुमति देता है. चयापचय reprogramminging कई स्नायविक रोगों में मनाया गया है, neoplasia सहित, और neurodegenerative रोगों । इस प्रोटोकॉल के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध चयापचय विश्लेषक का उपयोग स्नायविक रोग मॉडल में चयापचय के melanogaster समुदाय की जांच की सहायता के लिए विकसित किया गया था । चयापचय विश्लेषक में पूरे दिमाग के चयापचय को मापने मस्तिष्क की ज्यामिति के कारण चुनौतीपूर्ण है । यह विश्लेषक एक ९६-well प्लेट के तल पर रहने के लिए नमूनों की आवश्यकता है । सेल नमूने और ऊतक घूंसे सेल प्लेट की सतह का पालन करें या अंडाकार आकृति प्लेटों का उपयोग कर सकते हैं, क्रमशः । हालांकि, melanogaster दिमाग की गोलाकार, तीन आयामी आकृति ऊतक को प्लेट में पालन करने से रोकती है । इस प्रोटोकॉल एक विशेष रूप से डिजाइन और निर्मित सूक्ष्म ऊतक संयम है कि मस्तिष्क के किसी भी आंदोलन को रोकने जबकि अभी भी विश्लेषक के दो ठोस राज्य संवेदक जांच से चयापचय माप की अनुमति से इस समस्या को दरकिनार की आवश्यकता है । ऑक्सीजन की खपत और extracellular अंलीकरण दर reproducible और चयापचय अवरोधकों के साथ एक इलाज के प्रति संवेदनशील हैं । एक छोटे से अनुकूलन के साथ, इस प्रोटोकॉल किसी भी पूरे ऊतक और/या मॉडल प्रणाली के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, बशर्ते कि नमूना आकार संयम द्वारा उत्पंन चैंबर से अधिक नहीं है । जबकि बेसल चयापचय माप और mitochondrial अवरोधकों के साथ एक इलाज के बाद एक विश्लेषण इस प्रोटोकॉल के भीतर वर्णित हैं, ऐसे ऊर्जा स्रोत वरीयता और पालन वातावरण के रूप में अनगिनत प्रयोगात्मक शर्तों, पूछताछ की जा सकती है ।

Introduction

चयापचय reprogramminging ग्लियोब्लास्टोमा मल्टीफार्मी (जीबीएम), Huntington रोग, और प्रमुख अवसादग्रस्तता विकार (MDD)1,2,3सहित कई स्नायविक रोगों, में की पहचान की गई है । के रूप में चयापचय चिकित्सकीय रणनीतियों का ध्यान केंद्रित हो जाता है, बुनियादी चयापचय अनुसंधान के लिए उपकरण उंनत है । हालांकि, इन पद्धतियों के अधिकांश सेल लाइनों और प्राथमिक कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए या बड़े ऊतकों के बाद निर्धारण या-ठंड का विश्लेषण करने के लिए डिजाइन किए गए थे । कुछ दृष्टिकोण किट पर भरोसा करने के लिए सरलीकृत विशिष्ट चयापचयों उपाय है, जबकि अंय अधिक महंगा और जटिल विश्लेषण एक ही लक्ष्य के लिए जन स्पेक्ट्रोमेट्री4 के साथ संयोजन में क्रोमैटोग्राफी का उपयोग का उपयोग किया है । बड़ा चयापचय परिदृश्य को समझने के लिए, चयापचय profiling5,6 और चयापचय फ्लक्स विश्लेषण (एमएफए)7 बड़े पैमाने पर proteomic और जीनोमिक अध्ययन पूरक करने के लिए उभरा. profiling समय में एक बिंदु पर एक कोशिका या ऊतक में चयापचयों का एक मात्रात्मक प्रतिनिधित्व प्रदान करता है, जबकि एमएफए समय पर लेबल चयापचयों की ट्रैकिंग की अनुमति देकर इस पर फैलता है । उत्तरार्द्ध कैसे ऊर्जा स्रोतों अलग एक कोशिका या ऊतक में उपयोग किया जाता है खुलासा करने में उपयोगी है जब एक रोग8राज्य में । हालांकि, इन पद्धतियों समग्र चयापचय दर का माप शामिल नहीं है ।

छोटे मॉडल प्रणालियों, क्लार्क इलेक्ट्रोड9 और अप्रत्यक्ष calorimetry10के रूप में पारंपरिक तरीकों, के समग्र चयापचय राज्य पूछताछ करने के लिए ऑक्सीजन की खपत को मापने या बंद प्रवाह respirometry के लिए विन्यस्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, ऑक्सीजन और कार्बन डाइऑक्साइड एकाग्रता, क्रमशः उपाय । इन तकनीकों, जबकि सही जीव स्तर पर चयापचय reprogramminging के readout में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं, सीमाएं हैं । क्लार्क इलेक्ट्रोड का उपयोग तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकता है और उच्च प्रवाह अध्ययन के लिए तैयार नहीं है. रोक प्रवाह आत्मशोधन परख कोशिकाओं या ऊतकों के लिए आवश्यक संवेदनशीलता के साथ काम नहीं कर सकता । कई साल पहले, नई तकनीक इन छोटे अनुप्रयोगों के लिए विशेष रूप से विकसित किया गया था11। इन उपकरणों शुरू में एक 24 या ९६-अच्छी तरह से प्रारूप में ऑक्सीजन की खपत और सेल लाइनों और प्राथमिक कोशिकाओं के extracellular अंलीकरण उपाय करने के लिए डिजाइन किए गए थे । सेट अप और डेटा उत्पादन की सादगी पारंपरिक दृष्टिकोण के लिए एक विकल्प के रूप में इस विधि की स्थापना की । इस पद्धति कोशिकाओं के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है, और हाल ही में प्रगति ऊतक घूंसे की माप के लिए अनुमति दी है12,13,14. हालांकि, इन तरीकों को परख में उपयोग छोटे मॉडल प्रणालियों से पूरे अंगों की माप के लिए अनुमति नहीं है ।

रोग मॉडल के चयापचय विश्लेषण अक्सर विशिष्ट एक ही ऊतक के भीतर रहने वाले समारोह की कोशिकाओं के बीच बातचीत शामिल है । उदाहरण के लिए, glial कोशिकाओं न्यूरॉन्स द्वारा उपयोग चयापचयों का उत्पादन. ये चयापचय बातचीत के लिए आवश्यक है न्यूरॉन्स अस्तित्व15. छोटे मॉडल प्रणालियों ऐसे इन के रूप में सवालों की जांच के लिए लाभप्रद हैं । एक पूरे अंग के चयापचय को मापने के लिए अध्ययन, कोशिका प्रकार की एक किस्म युक्त, vivo मेंऊर्जा उपयोग की समझ के लिए जोड़ देगा. हाल ही में, बेकर एट अल । पूरे मक्खी16सिर में ऑक्सीजन की खपत को मापने की एक विधि की सूचना दी । सिर की एक संख्या एक साथ एक 24-अच्छी तरह से सेल प्लेट की एक अच्छी तरह से पूलिंग, ऑक्सीजन की खपत रीडिंग एक चयापचय विश्लेषक का उपयोग कर प्राप्त किया गया । जबकि यह सिर के लिए अच्छी तरह से काम करता है, जो आसानी से शरीर से अलग कर रहे हैं, यह लार्वा दिमाग जैसे अंगों के लिए उपयोग करने के लिए और अधिक कठिन है, क्योंकि एक बड़ी मात्रा इस विधि के लिए विदारक होने की जरूरत है । इसलिए, एक ९६-अच्छी तरह से सेल प्लेट का उपयोग विधि, जो ऑक्सीजन की खपत और extracellular अंलीकरण रीडिंग की संवेदनशीलता बढ़ जाती है, एक ही पूरे लार्वा मस्तिष्क परख करने के लिए विकसित किया गया था ।

इस अध्ययन में प्रयुक्त चयापचय विश्लेषक नमूना एक ९६-well सेल प्लेट के कुआं के तल पर रहने के लिए मापा जा रहा है की आवश्यकता है । कोशिकाओं और अपेक्षाकृत सपाट ऊतकों के लिए, यह एक चुनौती नहीं है; हालांकि, D. melanogaster लार्वा और वयस्क दिमाग के लिए, यह पारंपरिक थाली कोटिंग प्रोटोकॉल का उपयोग संभव नहीं है । गोलाकार तीन-मस्तिष्क के आयामी आकार मज़बूती से प्लेट की सतह का पालन नहीं होगा, और उन है कि अक्सर उन्हें ठीक से अच्छी तरह से जगह के लिए प्रयास करते समय क्षतिग्रस्त हो रहे हैं. इस नए प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण हिस्सा डिजाइन और सूक्ष्म ऊतक संयम17 के विकास है कि मस्तिष्क के लिए एक छोटे से कक्ष प्रदान करने के लिए चयापचय माप के साथ हस्तक्षेप के बिना में रहते हैं । उत्पंन चैंबर में लगभग ०.०१६ ऊंचाई में है और पर्याप्त स्थान प्रदान करता है आसानी से कई घ. melanogaster दिमाग पकड़ । संयमी नायलॉन एक निष्क्रिय बहुलक अंगूठी से जुड़ी जाल से मिलकर बनता है और प्रतिनिधि परिणामोंमें आगे चर्चा की जाएगी । इन संयम का प्रयोग चयापचय माप के लिए विच्छेदित दिमाग तैयार करने के लिए आवश्यक समय को कम करता है । मापने की प्रक्रिया को अनुकूलित स्थिर, reproducible ऑक्सीजन की खपत और extracellular अंलीकरण दरों छह माप चक्र के बाद (25 मिनट) उत्पंन करता है । मस्तिष्क चयापचय विश्लेषक कारतूस दवा वितरण बंदरगाहों के माध्यम से चिकित्सकीय, अवरोधकों, या अन्य उपचार के इंजेक्शन में सक्षम बनाता है जो 2 एच की एक न्यूनतम के लिए इन शर्तों के तहत मेटाबोलिक सक्रिय रहते हैं. इस प्रोटोकॉल को भी आसानी से अंय ऊतकों और छोटे मॉडल प्रणालियों18के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

नीचे विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे परख करने के लिए एक पूरी Drosophila लार्वा मस्तिष्क में ऑक्सीजन की खपत जब mitochondrial तनाव के साथ चुनौती दी । मस्तिष्क को तनाव, oligomycin को बाधित करने के लिए जोड़ा गया है एटीपी सिंथेस19. बेसल रीडिंग से ऑक्सीजन की खपत में कमी एटीपी की मात्रा का एक माप-मस्तिष्क में श्वसन के आधार पर पता चलता है । इसके अलावा रोटेनोन के साथ उपचार के बाद ऑक्सीजन की खपत में कमी आती है20 और antimycin एक21, इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला परिसरों मैं और III के अवरोधकों क्रमशः, गैर mitochondrial ऑक्सीजन खपत की मात्रा में संकेत मिलता है मस्तिष्क. यह परख कैसे एक मक्खी मस्तिष्क में mitochondrial श्वसन की तुलना में हो सकता है की एक उदाहरण है और कैसे इस प्रोटोकॉल को बदलती पादी में चयापचय की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, इस प्रोटोकॉल को मापने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है बस बेसल ऑक्सीजन की खपत और extracellular अंलीकरण दरों, के रूप में अच्छी तरह के रूप में डिजाइन करने के लिए और अधिक विस्तृत अध्ययन विशिष्ट ऊर्जा उपयोग या सब्सट्रेट उपयोग परिकल्पनाओं की जांच ।

Protocol

1. परख तैयारी (Day 1)

  1. एक मशीन या तापमान में 11 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट नियंत्रित कमरे में चयापचय विश्लेषक (सामग्री की मेज) प्लेस ।
    ध्यान दें: यह तापमान 25 डिग्री सेल्सियस पर लिया माप के लिए आदर्श है, के रूप में यह ~ 14 ° c तापमान अस्थिरता है कि जबकि परख चल रहा है के लिए अनुमति देता है । यह रन के दौरान साधन द्वारा उत्पन्न गर्मी के कारण होता है ।
  2. चयापचय विश्लेषक से अनुलग्न कंप्यूटर पर उपयुक्त सॉफ़्टवेयर खोलें । स्क्रीन के नीचे बाईं ओर संख्यात्मक तापमान पर क्लिक करें । खोलता है कि नई विंडो में, "पर हीटर" आदेश के बगल में बॉक्स पर क्लिक करें और एक चेक मार्क सुनिश्चित प्रकट होता है । 25 ° c करने के लिए तापमान समायोजित करें और ०.२ डिग्री सेल्सियस तीर का उपयोग करने के लिए सहिष्णुता रेंज समायोजित करें ।
    नोट: स्थिर तापमान हासिल करने के लिए कई घंटे की आवश्यकता होती है ।
  3. कारतूस कंटेनर (सामग्री की मेज) खोलें और उपयोगिता थाली से कारतूस को छूने के बिना जांच ।
    नोट: उपयोगिता प्लेट कारतूस के अंशांकन के दौरान प्रयोग किया जाता है और चयापचय परख चलाया जाता है, जबकि इस्तेमाल नहीं किया जाता है ।
  4. एक calibrant समाधान के २०० μL जोड़ें (सामग्री की मेज) उपयोगिता थाली के लिए और कारतूस उपयोगिता थाली के शीर्ष पर वापस जगह कारतूस पर संवेदक जांच rehydrat । जांच को स्पर्श न कर उन्हें रोशनी से बचाएं ।
  5. आयल फिल्म के साथ कारतूस सील ।
  6. 25 डिग्री सेल्सियस पर रात भर कारतूस की मशीन ।

2. परख मीडिया की तैयारी (दिवस 2)

  1. 10 मिमी ग्लूकोज और 10 मिमी सोडियम पाइरूवेट परख मध्यम जोड़ें ।
  2. 25 डिग्री सेल्सियस पर मध्यम गर्मी जब तक तरल इस तापमान के लिए equilibrated है ।
  3. पीएच एक पीएच मीटर का उपयोग कर ७.४ को समायोजित करें ।

3. Drosophila melanogaster दिमाग के चयापचय विश्लेषण के लिए सॉफ्टवेयर का सेटअप (2 दिन)

  1. मेटाबोलिक सॉफ़्टवेयर चरण १.२ में उपयोग किया गया चयापचय विश्लेषक पर सेट करें ।
  2. सॉफ्टवेयर होम स्क्रीन पर "टेम्पलेट" का चयन करें ।
  3. डबल पर क्लिक करें "रिक्त" एक नया परख डिजाइन शुरू करने के लिए ।
  4. सेल परख प्लेट के डिजाइन देखने के लिए शीर्ष टूलबार में "प्लेट मानचित्र" बटन पर क्लिक करें ।
    नोट: सेल परख प्लेट मस्तिष्क के नमूनों को नियंत्रित करेगा और चयापचय परख चलाने शुरुआत से पहले कारतूस के साथ जोड़ा जाएगा ।
  5. समूह जोड़ें बटन 3x क्लिक करें ।
    1. "1 समूह" लेबल पर डबल-क्लिक करें और इसे "प्रायोगिक" के लिए नाम बदलें ।
      नोट: इस समूह में एक मक्खी मस्तिष्क और एक सूक्ष्म ऊतक दवाओं के साथ इलाज संयम शामिल होंगे ।
    2. "2 समूह" लेबल पर डबल-क्लिक करें और इसे "नियंत्रण" करने के लिए नाम बदलें ।
      नोट: इस समूह में कोई दवा उपचार के साथ एक मक्खी मस्तिष्क और एक सूक्ष्म ऊतक संयम शामिल होंगे ।
    3. "समूह 3" लेबल पर डबल-क्लिक करें और "केवल संयम"करने के लिए इसका नाम बदलें ।
      नोट: इस समूह में किसी भी दिमाग या नशीली दवाओं के उपचार के बिना एक सूक्ष्म ऊतक संयम शामिल होंगे ।
  6. जहां सेल प्लेट में नमूनों को रखा जा करने के लिए इरादा कर रहे है के आधार पर प्रत्येक समूह को कुओं निरुपित ।
    1. "प्रायोगिक" लेबल पर क्लिक करें और फिर वेल्स B2-B8 प्लेट के नक्शे पर प्रकाश डाला ।
    2. "नियंत्रण" लेबल पर क्लिक करें और फिर वेल्स C2-C8 प्लेट मैप पर हाइलाइट ।
    3. "संयम केवल" लेबल पर क्लिक करें और फिर वेल्स D2-प्लेट मानचित्र पर D8 पर प्रकाश डाला ।
    4. जांच करें कि सभी चार कोनों (A1, A12, H1, और H12) को पृष्ठभूमि के रूप में निर्दिष्ट किया गया है ।
      नोट: प्लेट की परिधि के साथ कुओं किसी भी बढ़त प्रभाव को कम करने के लिए इस्तेमाल नहीं कर रहे हैं. यह सॉफ्टवेयर में एक डिफ़ॉल्ट सेटिंग है ।
  7. प्रोटोकॉल सेट अप करने के लिए शीर्ष टूलबार में "प्रोटोकॉल" बटन पर क्लिक करें ।
    1. आधार रेखा माप बॉक्स में "संपादित करें माप विवरण" पर क्लिक करें ।
    2. चयापचय विश्लेषक बेसल उपाय चक्र समय "3:00" को बदलने के ऊपर और नीचे तीर पर क्लिक करके मस्तिष्क को मापने जाएगा कि समय को समायोजित करें ।
    3. चयापचय विश्लेषक मस्तिष्क माप के बीच बेसल प्रतीक्षा चक्र समय बदलकर "0:00" करने के लिए ऊपर और नीचे तीर पर क्लिक करके इंतजार करेंगे कि समय को समायोजित करें ।
    4. चयापचय विश्लेषक मीडिया को "1:00" के लिए बेसल मिश्रण चक्र समय बदलकर ऊपर और नीचे तीर पर क्लिक करके मस्तिष्क को मापने से पहले मिश्रण होगा कि समय को समायोजित करें ।
    5. बेसल चक्र की कुल संख्या को समायोजित करें, जो माप, रुको, और मिश्रण चक्र, "7" के लिए ऊपर और नीचे तीर क्लिक करके शामिल हैं ।
      नोट: स्थिर ऑक्सीजन खपत दर माप के बाद प्राप्त कर रहे है ~ 25 मिनट के शुरू से ही परख ।
    6. ऊपरी बाएँ टूलबार में स्थित "इंजेक्शन जोड़ें" बटन पर क्लिक करें ।
    7. "इंजेक्शन लेबल" पर क्लिक करें और इसे "Oligomycin" में बदलें ।
    8. इंजेक्शन उपाय समायोजित करें, प्रतीक्षा करें, और मिश्रण बार बेसल के लिए उन से मेल करने के लिए ।
    9. ऊपर और नीचे तीर क्लिक करके "6" के लिए इंजेक्शन चक्र की कुल संख्या को समायोजित करें ।
    10. दोहराएँ चरण 3.7.6-3.7.8 लेकिन लेबल "सड़ांध/AA" करने के लिए परिवर्तित करें और अप और डाउन तीरों पर क्लिक करके 7 करने के लिए इंजेक्शन चक्र की कुल संख्या समायोजित करें ।
    11. शीर्ष टूलबार में "चलाएं परख" बटन पर क्लिक करें ।
    12. "सहेजें" परख और ऊपर परख कारतूस (सामग्री की तालिका) कीस्थापना शुरू करते हैं ।

4. अंशांकन (दिन 2) के लिए कारतूस की तैयारी

  1. 25 डिग्री सेल्सियस मशीन से कारतूस निकालें और कवर दूर ले ।
    1. छोटे ऊपरी बाएँ परिपत्र इंजेक्शन बंदरगाह के लिए १०० माइक्रोन oligomycin के 20 μL जोड़ें, सेल प्लेट पर सभी इसी प्रयोगात्मक कुओं के लिए कारतूस में बंदरगाह, और नियंत्रण और पृष्ठभूमि कुओं सहित सभी अन्य कुओं में एक बंदरगाह के लिए परख मीडिया के 20 μL जोड़ें.
      नोट: कारतूस ९६ कुओं में से प्रत्येक के लिए सेल प्लेट क्या नमूने शामिल होंगे इसी के लिए 4 बंदरगाहों (A-D) शामिल हैं । यह कदम नमूनों को जोड़ने से पहले किया जाता है । सेल प्लेट में 10 माइक्रोन की एक अंतिम oligomycin एकाग्रता में १०० माइक्रोन oligomycin परिणामों के 20 μL जोड़ना अच्छी तरह से एक बार दवा चयापचय विश्लेषक द्वारा इंजेक्ट किया जाता है. Oligomycin एटीपी सिंथेस का अवरोधक है । परिणामस्वरूप ऑक्सीजन खपत मान मस्तिष्क में एटीपी से जुड़ी संवेदनाएं की मात्रा को प्रतिबिंबित करेगा । आदेश में ठीक से दवाओं को निर्दिष्ट कुओं में इंजेक्शन के लिए, एक ही पत्र के सभी बंदरगाहों तरल की एक ही मात्रा के साथ भरा जाना चाहिए, भले ही उपयोग में नहीं है ।
    2. ५० माइक्रोन रोटेनोन के 22 μL जोड़ें/antimycin एक छोटे से ऊपरी दाएँ परिपत्र बंदरगाह के लिए, बंदरगाह बी, सेल प्लेट पर सभी इसी प्रयोगात्मक कुओं के लिए कारतूस में, और नियंत्रण और पृष्ठभूमि कुओं सहित अन्य सभी कुओं के बंदरगाह बी करने के लिए 22 μL परख मीडिया जोड़ें ।
      नोट: यह एक अंतिम रोटेनोन में परिणाम/Antimycin एक बार दवा चयापचय विश्लेषक द्वारा इंजेक्ट किया जाता है अच्छी तरह से सेल प्लेट में 5 माइक्रोन की एकाग्रता । रोटेनोन और antimycin एक इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला परिसरों मैं और III, क्रमशः के अवरोधकों हैं । परिणामस्वरूप ऑक्सीजन खपत मूल्य मस्तिष्क में गैर mitochondrial श्वसन को प्रतिबिंबित करेगा ।
    3. मशीन के दाईं ओर से विस्तार प्लेट लोडर के साथ, उपकरण का सामना करना पड़ जब साधन का सामना करना पड़ता है, अच्छी तरह से A1 ऊपरी बाएँ कोने में तैनात के साथ चयापचय विश्लेषक में उपयोगिता थाली के साथ लोड कारतूस रखने के लिए "प्रारंभ भागो" पर क्लिक करें ।
  2. चुनें "मैं तैयार हूं" सॉफ्टवेयर में equilibration और कारतूस के अंशांकन सेल नमूने युक्त थाली के साथ चयापचय परख शुरू करने से पहले शुरू करने के लिए ।
    नोट: कार्यक्रम फ़ाइल को बचाने के लिए और फिर equilibrating शुरू और जांचना पूछना होगा । इन चरणों 1 h तक ले जा सकते हैं । चरण 5 – 8 equilibration और अंशांकन समय के दौरान आयोजित किए जाते हैं ।

5. सूक्ष्म ऊतक संयम की तैयारी (दिवस 2)

  1. का चयन करें 1 मस्तिष्क कि मापा जा रहा है प्रति सूक्ष्म ऊतक संयम, प्लस कम से अधिक संयम के रूप में उपयोग के लिए केवल नियंत्रण, भंडारण कंटेनर से (शामिल ७०% इथेनॉल) ।
  2. ताजा ७०% इथेनॉल के साथ संयमी कुल्ला और उंहें 2 मिनट प्रत्येक के लिए पानी 3x के साथ धोने, एक मेष टोकरी और 6 अच्छी तरह से प्लेट (सामग्री की मेज) का उपयोग कर । अतिरिक्त पानी बहाकर जोड़ें अगर संयम अभी भी बंद एक शराब गंध दे ।
  3. सूक्ष्म ऊतक संयमी परख मीडिया में धो लें और उंहें इस समाधान में छोड़ जब तक वे उपयोग के लिए तैयार हैं ।

6. Drosophila melanogaster लार्वा दिमाग का विच्छेदन (Day 2)

  1. देर से चुनें (भटक) एक शीशी से तीसरे instar लार्वा संस्कृतिपूर्ण ओरेगन-आर मक्खियों का उपयोग उच्च परिशुद्धता, शैली 5 (०.१० x ०.०६ mm2) चिमटी ।
  2. 1x पंजाब के ५०० μL युक्त एक स्वच्छ विदारक स्पॉट प्लेट (सामग्री तालिका) के कुआं में लार्वा रखें ।
    नोट: एक स्पॉट प्लेट अवसादग्रस्तता के साथ एक ग्लास प्लेट है, जो छोटे ऊतकों और जीवों को काटना करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है ।
  3. धीरे से यह अच्छी तरह से मिलाते हुए, चिमटी का उपयोग करके लार्वा धो लें ।
  4. 1x पंजाब के ५०० μL युक्त एक स्थान प्लेट की साफ अच्छी तरह से लार्वा ले जाएं ।
  5. स्पॉट प्लेट को विदारक माइक्रोस्कोप के नीचे रखें ।
  6. चिमटी से एक जोड़ी के साथ अपने midsection में लार्वा को काबू, जबकि आंख को चिमटी की एक दूसरी जोड़ी के साथ हुक लोभी ।
  7. धीरे और आसानी से चिमटी के दो सेट का उपयोग कर विपरीत दिशाओं में लार्वा खींचो ।
  8. मस्तिष्क, जो आम तौर पर आंख से जुड़ा रहता है कल्पना हुक और आमतौर पर आंख से जुड़ी antennal डिस्क होगा ।
  9. ध्यान से मस्तिष्क से अतिरिक्त ऊतकों को हटाने, आंख हुक का उपयोग करने के लिए जगह में मस्तिष्क पकड़ । अन्त में, आंख के हुक को मस्तिष्क से अलग करें ।
  10. विच्छेदित मस्तिष्क को एक नई अच्छी तरह से एक स्थान प्लेट पर ले जाने के लिए चिमटी का प्रयोग करें 1x पंजाबियों युक्त ।
  11. दोहराएं कदम 6.1-6.10 तक 14 दिमाग को विच्छेदित कर रहे हैं ।
    नोट: विच्छेदन के शुरू से परख चलाने के लिए कुल समय 30 मिनट से अधिक नहीं होना चाहिए ।

7. ९६-अच्छी तरह से चयापचय परख सेल प्लेट (2 दिन) के लिए विच्छेदित दिमाग के अलावा

  1. जोड़ें ५० परख मीडिया के μL के कुओं को ९६-अच्छी तरह से चयापचय परख प्लेट (सामग्री की मेज) प्रयोगात्मक, नियंत्रण, संयम ही, और पृष्ठभूमि कुओं सहित प्रयोग, में इस्तेमाल किया जा रहा है ।
  2. सावधानी से प्रत्येक अच्छी तरह से A2-A8 और B2-सेल प्लेट के B8, चिमटी, एक रंग, या एक पिपेट का उपयोग करके में एक मस्तिष्क जगह है ।
    नोट: यह विदारक माइक्रोस्कोप से दूर किया जा सकता है ।
  3. विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, एक तुला सुई माइक्रो जांच का उपयोग करने के लिए अच्छी तरह से नीचे करने के लिए दिमाग सिंक ।
  4. धीरे जांच का उपयोग कर तीन उठाया क्षेत्रों के बीच में मस्तिष्क की स्थिति ।

8. ९६-अच्छी तरह से चयापचय परख सेल प्लेट (2 दिन) के लिए माइक्रो ऊतक संयम के अलावा

  1. चिमटी का प्रयोग, परख थाली के किनारे पर माइक्रो ऊतक संयम जगह अच्छी तरह से, और माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए निरीक्षण है कि यह नीचे का सामना करना पड़ प्लास्टिक की अंगूठी और शीर्ष पर जाल के साथ उंमुख है ।
  2. माइक्रोस्कोप के नीचे से प्लेट निकालें और दोनों पक्षों पर संयम समझ और धीरे से इसे अच्छी तरह से ड्रॉप करने के लिए चिमटी का उपयोग करें ।
  3. एक तुला सुई माइक्रो जांच का उपयोग करने के लिए अच्छी तरह से नीचे संयम धक्का ।
  4. माइक्रोस्कोप के तहत, सत्यापित करें कि मस्तिष्क ऊतक संयम के माध्यम से देखा जा सकता है और है कि यह अच्छी तरह से केंद्रित है ।
  5. दोहराएँ चरण 8.1 – 8.4 सभी कुओं कि परख में हो जाएगा के लिए — A2-A8, B2-B8, और C2-C8.
  6. ध्यान से प्रत्येक प्रयोगात्मक, नियंत्रण, और संयम केवल कुओं के लिए परख मीडिया के १३० μL जोड़ें ।
  7. सत्यापित करें कि दिमाग और सूक्ष्म ऊतक संयमी जबकि माइक्रोस्कोप के तहत उन्हें visualizing द्वारा मीडिया को जोड़ने के लिए स्थानांतरित नहीं किया है.
  8. जोड़ें १८० परख मीडिया के चार कोने कुओं को पृष्ठभूमि नियंत्रण के रूप में उपयोग के लिए μL ।

9. चयापचय विश्लेषक और परख के शुरू करने के लिए सेल प्लेट के अलावा (2 दिन)

  1. सत्यापित करें कि equilibration और अंशांकन नमूना युक्त कक्ष प्लेट के लिए संकेत करने के लिए सॉफ़्टवेयर के लिए प्रतीक्षा कर पूरा कर रहे हैं ।
  2. चुनें "ओपन ट्रे" और साधन के लिए प्रतीक्षा करने के लिए उपयोगिता थाली बेदखल ।
  3. उपयोगिता प्लेट निकालें और सेल प्लेट जोड़ने के लिए, ढक्कन के बिना, एक ही अभिविंयास में ।
  4. सेल प्लेट में लेने के लिए और ट्रे को बंद करने के लिए साधन के लिए "लोड सेल प्लेट" का चयन करें, और फिर परख शुरू करते हैं ।
  5. सॉफ्टवेयर चलाने के कंप्यूटर स्क्रीन पर त्रुटि सलाखों के साथ वास्तविक समय में माप देखें ।
  6. बाहर निकाली सेल प्लेट और कारतूस निकालें जब परख पूरा हो गया है ।
    नोट: युग्मित कारतूस और सेल प्लेट्स को फिर से 5x किया जा सकता है ।

10. पोस्ट-माप विश्लेषण (Day 2)

  1. एक विदारक माइक्रोस्कोप का प्रयोग कर यह सत्यापित करने के लिए कि दिमाग और सूक्ष्म ऊतक संयम अभी भी ठीक से तैनात है परख पूरी होने के बाद । विश्लेषण से विषमताओं के साथ किसी भी कुओं को बाहर निकालें ।
  2. आगे के विश्लेषण के लिए ऑक्सीजन उपभोग दर (ओसीआर) और Extracellular अंलीकरण रेट (ीकार) डेटा का निर्यात करें ।

Representative Results

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल सूक्ष्म ऊतक संयम का उपयोग करें कि नीचे वर्णित विनिर्देशों से मिलने की आवश्यकता है । अंय तरीकों का प्रयोग ९६ के तल पर जगह में दिमाग पकड़-अच्छी तरह से सेल प्लेट असफल रहे थे (चित्रा 2a और बी) । सबसे पहले, विभिंन एजेंटों थाली के लिए ऊतक पालन बढ़ाने के लिए परीक्षण किया गया । एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ऊतक चिपकने वाला (सामग्री की मेज) सेल प्लेटों और अंडाकार आकृति प्लेटों, क्रमशः के साथ कोशिकाओं और organoids के उपयोग के लिए सिफारिश की है । शुरू में, दिमाग अच्छी तरह से सतह का पालन करने के लिए दिखाई दिया; हालांकि, ऑक्सीजन की खपत (ओसीआर) रीडिंग कम थे, और कुओं को देख परख के बाद पता चला कि दिमाग अब अच्छी तरह से सतह (चित्रा 2a) से जुड़े थे । एक ही परिणाम सुपर गोंद (चित्रा 2a) के साथ हुई । अगले, छोटे परदे के निर्माण के लिए अच्छी तरह के तल पर एक छोटे से चैंबर के भीतर दिमाग पकड़ (चित्रा बी) की कोशिश की थी ।

धातु स्क्रीन उच्च ओसीआर रीडिंग अकेले का उत्पादन किया, के रूप में एक बहुलक अंगूठी जगह में स्क्रीन धारण (चित्रा बी) के साथ धातु स्क्रीन था । प्लास्टिक मेष जाल एक ही बहुलक अंगूठी के साथ प्रयोग किया जाता था । यह डिवाइस एक नकारात्मक ओसीआर पढ़ने के कारण प्राप्त किया जा करने के लिए । अंत में, सूक्ष्म ऊतक संयम की अंगूठी के लिए एक निष्क्रिय बहुलक का उपयोग कर तैयार किया गया में ०.१४६ के एक बाहरी व्यास को मापने, ०.१३३५ में एक भीतरी व्यास, ०.०१२५ की मोटाई में, और ०.०१६ की ऊंचाई में (सामग्री की तालिका) । सुपर गोंद (सामग्री की तालिका) में व्यास (सामग्री की तालिका) में ०.००३९ के एक विशिष्ट ताकना आकार के साथ एक नायलॉन जाल के लिए अंगूठी संलग्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । ताकना आकार महत्वपूर्ण है, के रूप में यह हवा बुलबुले के गठन के बिना मीडिया और metabolite मुद्रा की अनुमति देता है, अभी तक अभी भी दिमाग के लिए एक बाधा के रूप में कार्य करता है । ये अकेला संयम कोई ओसीआर पढ़ने के लिए थोड़ा परिणाम है, और जब दिमाग के साथ इस्तेमाल किया, reproducible रीडिंग (चित्रा 2a और बी) के लिए अनुमति देते हैं । सत्यापन के बाद परख करने पर पता चला कि दिमाग अभी भी कुएं में ठीक से तैनात था. इन ऊतक संयम वर्तमान में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं हैं, लेकिन ऊपर विनिर्देशन का पालन करके निर्मित किया जा सकता है । हालांकि यह सटीक निर्माण की आवश्यकता है, सबसे मशीन की दुकानों के ऊपर संदर्भित सामग्री का उपयोग कर इस संयम को पुन: पेश करने में सक्षम हो जाएगा ।

प्रोटोकॉल आगे परख मीडिया के लिए खाते के लिए अनुकूलित किया गया था, समय परख चलाने से पहले की अनुमति दी, और तापमान (चित्रा 3) । शुरू में, परख Schneider माध्यम में स्थापित किया गया था vivo वातावरण में लार्वा मॉडल । हालांकि, उपयोग मीडिया बफ़रिंग एजेंट्स नहीं हो सकता क्योंकि pH ीकार को मापने के लिए उपयोग किया जाता है । इस मीडिया, इस प्रकार, कस्टम बनाया है, जो महंगा है । इस ऑप्टिमाइज़ करने के लिए, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध परख मीडिया चयापचय विश्लेषण (सामग्री की तालिका) के लिए डिजाइन Schneider मीडिया के स्थान पर इस्तेमाल किया गया था । ओसीआर का स्तर अपरिवर्तित रहे थे, यहां तक कि जब ग्लूकोज थोड़ा मॉडल परख मीडिया की स्थिति (आंकड़ा 3ए) को बढ़ाने । पर इस बिंदु से सभी परख परख माध्यम में आयोजित किए गए थे । मीडिया की खुराक को देख कर अनुकूलित किया गया है कि ऑक्सीजन की खपत और extracellular अंलीकरण दरों एक प्रतिक्रिया जब ज्ञात mitochondrial अवरोधकों के साथ इलाज दिखाया । आगे, विच्छेदों और परख रन के बीच प्रतीक्षा समय का विश्लेषण किया गया । 3 एच की एक मशीन काफी ओसीआर का स्तर (आंकड़ा 3बी) गिरा दिया । चित्रा 3 डी छठी बार बिंदु पर अंतर है, जो है जब ओसीआर और ीकार स्तर दोनों वयस्क और लार्वा दिमाग के लिए स्थिर दर्शाता है । इस प्रकार, प्रोटोकॉल के लिए तुरंत विच्छेदन के बाद परख शुरू इंगित करता है, जब तक प्रयोग एक तापमान equilibration, जो मामले में कम 30 मिनट के लिए एक मशीन का सुझाव दिया है की आवश्यकता है । चयापचय विश्लेषक एक मशीन में संग्रहीत है 11 ° c करने के लिए सेट परख भर में एक 25 डिग्री सेल्सियस तापमान के लिए अनुमति देते हैं । तापमान परिवेश के तापमान और साधन आपरेशन के कारण बुलंद कर रहे हैं, कम ओसीआर स्तर (चित्रा 3सी) मनाया जाता है । यह ऊतक मौत के कारण होने की कल्पना की है ।

जब अनुकूलित शर्तों का पालन कर रहे हैं, लार्वा और वयस्क दिमाग के साथ परख थोड़ा स्थिर छठी बार बिंदु पर १५० pmol/मिनट से अधिक ओसीआर के रीडिंग में परिणाम, ~ परख में 25 मिनट (चित्रा 4B) । इस दर के लिए बनाए रखा है कम से कम 30 (चित्रा 4a) मिनट और अप करने के लिए 2 एच (डेटा नहीं दिखाया गया है). ीकार थोड़ा लार्वा दिमाग की तुलना में छठी बार बिंदु (चित्रा 4d) में वयस्क दिमाग में कम है और के लिए बनाए रखा है कम से 30 मिनट (चित्र 4c) । यह खोज glycolysis में वृद्धि का समर्थन करने के लिए लार्वा चरणों के दौरान वृद्धि करने के लिए संगत करता है । ऐसे oligomycin के रूप में एक mitochondrial अवरोध करनेवाला के साथ एक इंजेक्शन, ओसीआर रीडिंग को कम करता है एटीपी पर निर्भर श्वसन प्रकट करने के लिए, और रोटेनोन और antimycin के साथ आगे के इलाज के लिए एक कम करता है ओसीआर को प्रकट करने के लिए गैर mitochondrial ऑक्सीजन की खपत (आंकड़ा 5 ए ). इस डेटा को दर्शाता है कि इन अवरोधकों मस्तिष्क ऊतक घुसना करने में सक्षम है और पादी बदलती के दिमाग में mitochondrial श्वसन तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस परख के लिए, मिश्रण, रुको, और माप बार ऑक्सीजन का स्तर देख द्वारा अनुकूलित किया गया, नहीं खपत दर, और सुनिश्चित करना है कि मिश्रण के बाद, ऑक्सीजन स्तर माप करने से पहले स्तर पर लौट आए ।

Figure 1
चित्रा 1: लार्वा मस्तिष्क ओसीआर और चयापचय विश्लेषक में ीकार माप की एक योजनाबद्ध. कारतूस को परख कर चलाने के लिए एक दिन पूर्व तैयार किया जाता है । अगले दिन, दवाओं कारतूस के इंजेक्शन बंदरगाहों के लिए जोड़ रहे हैं । घ. melanogaster लार्वा दिमाग को विच्छेदित कर रहे हैं, और सूक्ष्म ऊतक संयमी अच्छी तरह से नीचे करने के लिए मस्तिष्क को सुरक्षित करने के लिए जोड़ रहे हैं । दिमाग के साथ सेल प्लेट चयापचय विश्लेषक में परख और डेटा का विश्लेषण किया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: सूक्ष्म ऊतक संयम चयापचय सक्रिय नहीं कर रहे हैं और एक प्लेट के तल पर एक चैंबर में मस्तिष्क अच्छी तरह से पकड़. () ओरेगन के ओसीआर -R D. melanogaster लार्वा दिमाग ऊतक चिपकने वाला (सामग्री की तालिका) के साथ लेपित कुओं में मापा जाता है या जब दिमाग अच्छी तरह से नीचे सुपर चिपके होते हैं । परिणाम अच्छी तरह से सूक्ष्म ऊतक संयम का उपयोग कर के तल पर तैनात दिमाग की उन लोगों की तुलना कर रहे हैं । () ओसीआर परख मीडिया और धातु, एक बहुलक अंगूठी के साथ धातु, प्लास्टिक जाल और एक बहुलक अंगूठी, या सूक्ष्म ऊतक मजबूरी से युक्त कुओं में मापा जाता है । * p-मान < 0.05, * * p-मान < 0.01, * * * p-मान < 0.001, * * * * p-मान < 0.0001 । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: मीडिया, मशीन समय, और तापमान का अनुकूलन । () ओसीआर ओरेगन में मापा जाता है -R melanogaster लार्वा दिमाग Schneider मीडिया का उपयोग (s2) सोडियम पाइरूवेट के साथ जोड़ा गया, ग्लूकोज के साथ s2 और सोडियम पाइरूवेट जोड़ा, और परख ग्लूकोज और सोडियम पाइरूवेट के साथ मीडिया जोड़ा । () ओसीआर लार्वा दिमाग में मापा जाता है के बाद 3 गर्मी से पहले परख करने के लिए, या के बाद 30 मशीन के मिनट परख करने से पहले । () ओसीआर लार्वा दिमाग में परख पर मापा जाता है ३३ डिग्री सेल्सियस और 25 डिग्री सेल्सियस के तापमान चलाते हैं । छठी बार प्वाइंट का ग्राफ बढ़ा है । () ओसीआर लार्वा दिमाग में मापा जाता है के बाद 3 गर्मी से पहले परख करने के लिए, या के बाद 30 मशीन के मिनट परख करने से पहले । डेटा छठे समय बिंदु के लिए सूचित किया है । * p-मान < 0.05, * * p-मान < 0.01, * * * p-मान < 0.001, * * * * p-मान < 0.0001 । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: ओसीआर और ीकार वयस्क और लार्वा D. melanogaster दिमाग में reproducibly मापा जाता है । () ओसीआर ओरेगन में मापा जाता है -R D. melanogaster वयस्क और लार्वा दिमाग 30 मिनट के लिए () पैनल से छठी बार बिंदु के ओसीआर डेटा ग्राफी है । इस समय बिंदु जिस पर ओसीआर रीडिंग स्थिर है । () ीकार melanogaster वयस्क और लार्वा दिमाग में 30 मिनट के लिए मापा जाता है () पैनल से छठी बार बिंदु के ीकार डेटा ग्राफी है । यह समय बिंदु है जिस पर ीकार रीडिंग स्थिर है । * p-मान < 0.05, * * p-मान < 0.01, * * * p-मान < 0.001, * * * * p-मान < 0.0001 । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: Oligomycin एटीपी निर्भर श्वसन प्रकट करने के लिए डी. melanogaster लार्वा मस्तिष्क ओसीआर के स्तर को कम करती है, और रोटेनोन/antimycin एक आगे के लिए गैर mitochondrial ऑक्सीजन की खपत को उजागर ओसीआर कम करती है । () ओसीआर ओरेगन में मापा जाता है RD. melanogaster लार्वा एक इलाज के बाद दिमाग के साथ एक 20 µ m oligomycin और 5 µ m रोटेनोन/antimycin एक मिश्रण । नियंत्रण और संयम-केवल कुओं को परख मीडिया के साथ इंजेक्ट किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

यहां, melanogaster लार्वा और वयस्क दिमाग के चयापचय विश्लेषण के लिए एक उपंयास विधि पूर्व vivo बताया गया है । बेसल शर्तों के तहत, ऑक्सीजन की खपत और extracellular अंलीकरण दरों से संकेत मिलता है कि कैसे चयापचय सक्रिय मस्तिष्क है और निर्धारित कर सकते हैं कि क्या एक ऊतक mitochondrial बनाम glycolytic श्वसन पर अधिक निर्भर हो गया है, क्रमशः11.

अवरोधकों या चिकित्सीय दवाओं के साथ दिमाग का इलाज ऊतक के चयापचय की स्थिति के बारे में अधिक जानकारी प्रदान कर सकते हैं । चयापचय सब्सट्रेट भी विशिष्ट चयापचयों पर निर्भरता का निर्धारण करने के लिए जोड़ा जा सकता, ऐसे ग्लूकोज Warburg प्रभाव के लिए परीक्षण करने के लिए22 या glutamine glutaminolysis23की जांच करने के लिए-चयापचय reprogramminging में दोनों आम. लंबी अवधि के अध्ययन के लिए, लार्वा या मक्खियों भी इंजेक्शन बंदरगाहों का उपयोग कर के बजाय दवाओं खिलाया जा सकता है, और दिमाग के अंतराल पर या अंत में परख हो सकता है, प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर । इस विधि कई अनुप्रयोगों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

इस विधि दिमाग के लिए अनुकूलित किया गया है, लेकिन अंय लार्वा18 और वयस्क ऊतकों का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, अंय छोटे मॉडल प्रणालियों इस विधि का उपयोग करने के लिए पूरे जीवों18 या ऊतकों को मापने कर सकते हैं । अंय प्रणालियों के लिए इस विधि के अनुकूलन के लिए केवल सीमा अंग, ऊतक, या जीव का आकार है । सूक्ष्म ऊतक संयम के द्वारा बनाई गई कक्ष परख चलाने के लिए आकार बाधा है । चयापचय उत्पादन मस्तिष्क या ऊतक परीक्षण किया जा रहा है के लिए बहुत कम है, और नमूना आकार एक बाधा नहीं है, तो नमूने पूलिंग परख माप और संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । अंय अनुप्रयोगों के लिए इस प्रोटोकॉल को संशोधित केवल मामूली अनुकूलन की आवश्यकता होती है, 1 सहित) उचित उपाय और मिश्रण चक्र संख्या और समय का चयन, और 2) ऊतक के लिए प्रभावी उपचार सांद्रता का निर्धारण । माप और मिश्रण बार प्रत्येक चक्र के दौरान चयापचय विश्लेषक द्वारा मापा निगरानी ऑक्सीजन एकाग्रता द्वारा निर्धारित किया गया था. यह रन पूरा होने के बाद सिंहावलोकन विंडो में Y2 अक्ष बटन में 2 का चयन करके देखा जा सकता है. प्रत्येक चक्र के दौरान, वहाँ एक बूंद ऑक्सीजन एकाग्रता में मापा समय के दौरान ऊतक ऑक्सीजन की खपत को दर्शाती होना चाहिए, मिश्रण चक्र के दौरान प्रारंभिक ऑक्सीजन एकाग्रता के लिए एक वापसी के बाद. इस पैटर्न मनाया जाता है जब तक उपाय और मिश्रण बार परीक्षण किया जाना चाहिए. इस विधि के प्रयोग से अन्य कीट दिमागों का अध्ययन किया गया है । इन दिमाग मक्खी दिमाग यहां इस्तेमाल किया, लेकिन अभी भी ऊतक संयम द्वारा उत्पंन चैंबर के भीतर फिट से बड़ा थे । इन दिमाग से ओसीआर रीडिंग ४०० pmol के रूप में उच्च के रूप में थे/ इन अध्ययनों से परिणाम है, साथ ही ओसीआर दरों कि अंय पूरे मापने के अध्ययन के साथ संरेखित करें ऑक्सीजन की खपत18,24, सुझाव है कि melanogaster दिमाग ऑक्सीजन सीमित नहीं थे । D. melanogaster दिमाग और अन्य जीवों से ऊतकों के लिए, इस विधि को लागू करने के लिए चार महत्वपूर्ण चरणों पर विशेष ध्यान देने की आवश्यकता है ।

सफलतापूर्वक reproducible और जैविक रूप से प्रासंगिक माप को प्राप्त करने के लिए, प्रोटोकॉल का पालन किया जाना चाहिए के महत्वपूर्ण कदम हैं । सबसे पहले, एक सूक्ष्म ऊतक संयम का उपयोग इस विधि के लिए आवश्यक है । इन विनिर्माण विनिर्देशों और सूचीबद्ध सामग्री का उपयोग कर संयम जरूरी है । सामग्री उनके निष्क्रिय रासायनिक संरचना के कारण चयन किया गया, और उनके लिए हवा के बुलबुले के निर्माण के बिना मिश्रण कदम के दौरान उचित मीडिया विनिमय की अनुमति देने की क्षमता । दूसरा, एक समय पर विच्छेदन और थाली तैयारी ऊतक के चयापचय उत्पादन को अधिकतम करने के लिए आवश्यक है । कम विच्छेदन बार काफी मस्तिष्क ख़राब नहीं करना चाहिए । अंय अध्ययनों से पता चला है कि मक्खी दिमाग घंटे के लिए दिन के लिए जिंदा रखा जा सकता है अगर ठीक से एक छिड़काव चैंबर25में संग्रहित । हालांकि, के रूप में चित्र 3 बी और 3dमें देखा है, अगर दिमाग परख मीडिया में समय की लंबी अवधि के लिए बैठे छोड़ रहे है परख से पहले, ऑक्सीजन की खपत दरों में कमी कर रहे हैं । परख के दौरान, नमूने हर चक्र के दौरान एक मिश्रण कदम से गुजरना । यह मिश्रण न केवल रासायनिक यौगिकों के इंजेक्शन के साथ एड्स, लेकिन यह भी मीडिया को फिर से प्रसारित और ऑक्सीजन प्रदान करने के लिए काम करता है । दिमाग इन उपाय के दौरान लंबे समय तक चयापचय सक्रिय रहने के लिए सक्षम हैं-मिश्रण चक्र से वे बेंच शीर्ष पर मीडिया में गर्मी होगी । इसलिए, लार्वा दिमाग का विच्छेदन इस परख स्थापित करने के लिए शुरू करने से पहले महारत हासिल होना चाहिए । जब इस परख की स्थापना, एक समय में पादी की एक छोटी संख्या का विश्लेषण, दिमाग की जरूरत है और कुओं का उपयोग की संख्या को कम करने के लिए । इससे विदारक और परख माप के बीच होने वाली देरी को रोका जा सकेगा । तीसरा, एक स्थिर तापमान को बनाए रखने के लिए शारीरिक रूप से प्रासंगिक स्थितियों में चयापचय दर का विश्लेषण करने की आवश्यकता है । वृद्धि की परख तापमान ऊतक मौत का कारण बन सकता है, कम ऑक्सीजन खपत दर (आंकड़ा 3सी) द्वारा मनाया । यदि मक्खियों प्रयोगात्मक प्रयोजनों के लिए एक अलग तापमान पर पालन कर रहे हैं, माप भी इस तापमान पर किया जाना चाहिए । जबकि विच्छेदन सबसे अधिक संभावना कमरे के तापमान पर प्रदर्शन किया जाएगा, अगर परख एक अलग तापमान पर आयोजित किया जाएगा, चढ़ाया और रोका दिमाग 15 मिनट के लिए आवश्यक तापमान पर गर्मी की परख चलाने से पहले किया जाना चाहिए । अंत में, कुओं के बाद देख परख अगर ऊतक स्थिति माप प्रभावित निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है । कभी-कभार, वहां एक ग़ैर अच्छी तरह से होगा कि, विदारक खुर्दबीन के नीचे थाली देख के बाद, डेटा विश्लेषण से समाप्त किया जा सकता है या तो ऊतक या स्थिति के नुकसान के कारण, जहां मस्तिष्क के केंद्र से बाहर फिसल गया है अच्छी तरह से और फंस गया है के तहत संयम की बहुलक अंगूठी । ऊतक खो दिया जा सकता है अगर संयम ठीक से सुरक्षित नहीं था और मिश्रण चक्र के दौरान परेशान था । हालांकि इन घटनाओं का न तो अक्सर होता है, अगर वे विश्लेषण से बाहर नहीं हैं, वे दर मूल्यों को काफी कम होगा ।

ऑक्सीजन की खपत और extracellular अंलीकरण निगरानी द्वारा पूरे ऊतक चयापचय फ्लक्स की माप कैसे चयापचय आनुवंशिक परिदृश्य या अन्य प्रयोगात्मक स्थितियों द्वारा बदल दिया है समझने के लिए एक जैविक रूप से प्रासंगिक विधि प्रदान करता है । यह विधि एक एकल melanogaster मस्तिष्क में चयापचय परिवर्तन का पता लगाने के लिए काफी संवेदनशील है, जो रोक प्रवाह respirometry या अप्रत्यक्ष calorimetry का उपयोग संभव नहीं है । यह भी कम तकनीकी रूप से एक क्लार्क इलेक्ट्रोड का उपयोग करने ऑक्सीजन की खपत को मापने से चुनौतीपूर्ण है । इस प्रोटोकॉल का एक अतिरिक्त लाभ के प्रति अच्छी तरह से एक पूरे मस्तिष्क का विश्लेषण करने की क्षमता है । ९६-अच्छी तरह से प्रारूप और अधिक संवेदनशील रीडिंग के लिए अनुमति देता है, और इस प्रकार, एक से अधिक जीनोटाइप परख प्रति आवश्यक नमूनों की छोटी संख्या के कारण एक समय में परख की जा सकती है । जबकि ऊतक में चयापचय को मापने अभी भी चुनौतीपूर्ण है और सावधानी से और सिंक्रनाइज़ पशुओं की आवश्यकता है, इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक तेजी से, अपेक्षाकृत सरलीकृत विधि, और डी में कई चयापचय संवेदनशीलता का विश्लेषण करने की क्षमता है । melanogaster लार्वा और वयस्क दिमाग ।

Disclosures

एम tipping सूक्ष्म ऊतक इस प्रोटोकॉल17में वर्णित संयम के लिए एक अनंतिम पेटेंट रखती है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन में ब्लूमिंगटन Drosophila स्टॉक सेंटर (NIH P40OD018637) से प्राप्त स्टॉक्स का इस्तेमाल किया गया । इस प्रकाशन में दी गई रिसर्च को संस्थागत विकास पुरस्कार (आइडिया) नेटवर्क द्वारा नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंसेज के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के अनुदान संख्या के तहत चिकित्सा अनुसंधान उत्कृष्टता के लिए समर्थित किया गया था P20GM103430, और रोड आइलैंड फाउंडेशन द्वारा । लेखक जे जल और पी Snodgrass-बेल्ट इस प्रोटोकॉल के विकास में उनके समर्थन के लिए धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Assay medium Agilent 102365-100
Calibrant solution Agilent 100840-000
Corning Cell-Tak Cell Tissue Adhesive Sigma Aldrich DLW354240
delrin Grainger 2XMK6
Drosophila Schneider Media Thermo Fisher 21720-024
Dumont High Precision Tweezers (style 5) Ted Pella 5622
Loctite 409 Amazon
Mitostress kit  Agilent 103015-100 oligomycin, rotenone, and antimycin A included
Netwell inserts (6-well) VWR 29442-136
nylon mesh Component Supply U-CMN-64
Parafilm M wrapping film Fisher Scientific S37440
PYREX spot plate Fisher Scientific 13-748B
Seahorse XFe96 Analyzer Agilent
Wave v2.4 XFe96 analyzer software Agilent https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/software-download-for-wave-desktop free download to mac or windows
XFe96 catridge and cell plates Agilent 102416-100

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Neville, K. E., Bosse, T. L.,More

Neville, K. E., Bosse, T. L., Klekos, M., Mills, J. F., Tipping, M. Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains. J. Vis. Exp. (138), e58007, doi:10.3791/58007 (2018).

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