Summary
Presenteren we een protocol voor het meten van zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring in Drosophila melanogaster larvale en volwassen hersenen. Een metabole analyzer wordt gebruikt met een aangepast en geoptimaliseerd protocol. Micro-weefsel beperkingen werden zijn een essentieel onderdeel van dit protocol en ontworpen en gemaakt speciaal voor hun gebruik in deze analyse.
Abstract
Dit protocol beschrijft een methode voor het meten van het metabolisme in Drosophila melanogaster larvale en volwassen hersenen. Kwantificeren van de metabolisme in hele organen biedt een weefsel-niveau begrip van energie gebruik die niet kan worden vastgelegd bij het analyseren van primaire cellen en cellijnen. Terwijl deze analyse ex vivo is, het staat voor de meting van een aantal gespecialiseerde cellen werken samen om het uitvoeren van een functie in een weefsel en nauwer het orgel in vivo modellen. Metabole herprogrammering is waargenomen in veel neurologische ziekten, waaronder neoplasie, en neurodegeneratieve ziekten. Dit protocol werd ontwikkeld ter ondersteuning van de Gemeenschap van de D. melanogaster onderzoek naar metabolisme in neurologische ziekte modellen met behulp van een commercieel beschikbare metabole analyzer. Meten van metabolisme van hele hersenen in de metabole analyzer is een uitdaging als gevolg van de geometrie van de hersenen. Deze analyzer vereist monsters te blijven op de bodem van een 96-wells-plaat. Celsteekproeven en weefsel stempels kunnen houden aan het oppervlak van de plaat van de cel of gebruiken sferoïde platen, respectievelijk. Echter, de sferische, driedimensionale vorm van D. melanogaster hersenen verhindert het weefsel vast te houden aan de plaat. Dit protocol vereist een speciaal ontworpen en vervaardigde micro-weefsel terughoudendheid die dit probleem omzeilt door te voorkomen dat elke beweging van de hersenen terwijl nog steeds metabole metingen uit van de analyzer twee solid-state sensor sondes. Zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring tarieven zijn reproduceerbaar en gevoelig zijn voor een behandeling met metabole remmers. Met een kleine optimalisatie, kan dit protocol worden aangepast voor gebruik met elke hele weefsel en/of modelsysteem, mits de grootte van de steekproef niet groter is dan de kamer die is gegenereerd door de terughoudendheid. Terwijl basale metabole metingen en een analyse na een behandeling met mitochondriale remmers worden beschreven in dit protocol, kunnen talloze experimentele omstandigheden, zoals energie bron voorkeur en fokken milieu, worden ondervraagd.
Introduction
Metabole herprogrammering is geconstateerd in veel neurologische ziekten, met inbegrip van Glioblastoma Multiforme (GBM), de ziekte van Huntington en grote depressieve stoornis (MDD)1,2,3. Metabolisme naarmate de focus van therapeutische strategieën, geavanceerde hulpmiddelen voor metabole basisonderzoek. Echter werden de meeste van deze methoden ontworpen om cellijnen en primaire cellen te studeren of te analyseren van grotere weefsels na fixatie of -bevriezing. Aantal benaderingen hebben vertrouwd op kits te simplistisch meten van specifieke metabolieten, terwijl anderen meer dure en complexe analyses met behulp van chromatografie in combinatie met massaspectrometrie4 voor hetzelfde doel hebben gebruikt. Om te begrijpen van de groter metabole landschap, metabole profilering van5,6 en metabole flux-analyse (MFA)7 ontstaan ter aanvulling van de grootschalige proteomic en genomische studies. Profilering biedt een kwantitatieve aanduiding van metabolieten in een cel of een weefsel op een gegeven moment in de tijd, terwijl MFA dit breidt doordat het volgen van gelabelde metabolieten na verloop van tijd. De laatste nuttig geweest in onthullen hoe energiebronnen anders worden gebruikt in een cel of een weefsel bij een ziekte staat8. Deze methoden omvatten echter geen de meting van de totale stofwisseling.
Als u wilt de totale metabole toestand van de kleine modelsystemen ondervragen, kunnen traditionele methoden, zoals de Clark-elektrode9 en indirecte calorimetrie10, worden gebruikt voor het meten van zuurstofverbruik of geconfigureerd voor stop stroom respirometrie, te meten van zuurstof en kooldioxide concentratie, respectievelijk. Deze technieken, hebben terwijl het nauwkeurig inzicht bijbrengen in de uitlezing van metabole herprogrammering op het niveau organisme, beperkingen. Het gebruik van de Clark-elektrode kan technisch uitdagende en is niet ontworpen voor high-throughput onderzoek. De stop stroom respirometer functioneren niet met de gevoeligheid moet gehaltebepaling van cellen of weefsels. Enkele jaren geleden, werd nieuwe technologie speciaal ontwikkeld voor deze kleinere toepassingen11. Deze instrumenten waren in eerste instantie bedoeld voor het meten van het zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring van cellijnen en primaire cellen in een 24 - of 96-Wells-indeling. De eenvoud van de set-up en gegevens output opgericht deze methode als een alternatief voor de traditionele benaderingen. Deze methodologie is een krachtig hulpmiddel voor cellen, en recente vooruitgang hebben toegestaan voor het meten van weefsel stoten12,13,14. De methoden die zijn gebruikt in deze onderzoeken laat echter niet voor de meting van hele organen van kleine modelsystemen.
De metabole analyse van ziekte modellen vereist vaak de interactie tussen cellen van gespecialiseerde functie woonachtig binnen de dezelfde weefsel. Bijvoorbeeld produceren gliale cellen metabolieten gebruikt door de neuronen. Deze metabole interacties zijn vereist voor de neuronale overleven15. Kleine modelsystemen zijn voordelig voor het onderzoeken van vragen als deze. Studies voor het meten van het metabolisme van een hele orgel, met allerlei soorten cellen, zal toevoegen aan het begrip van de energie-gebruik in vivo. Becker et al. rapporteerde onlangs, een methode voor het meten van het zuurstofverbruik in hele vliegen hoofden16. Door het bundelen van een aantal hoofden samen in een put van een 24-well cel plaat, werden zuurstof verbruik lezingen verkregen met behulp van een metabole analyzer. Terwijl dit goed voor de hoofden, die gemakkelijk gescheiden van het lichaam werkt zijn, is het veel moeilijker te gebruiken voor organen zoals larvale hersenen, omdat een grote hoeveelheid moet worden ontleed voor deze methode. Daarom werd een methode met behulp van een 96-Wells cel plaat, die de gevoeligheid van het zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring lezingen verhoogt, ontwikkeld om de gehaltebepaling van een enkel geheel larvale hersenen.
De metabole analyzer gebruikt in deze studie vereist het monster wordt gemeten om te blijven op de bodem van de put van een 96-Wells cel plaat. Voor relatief vlakke weefsels en cellen is dit niet een uitdaging; voor D. melanogaster larvale en volwassen hersenen is het echter niet mogelijk met behulp van traditionele plaat coating protocollen. De driedimensionale bolvorm van de hersenen zal niet op betrouwbare wijze voldoen aan het oppervlak van de plaat, en degenen die wel zijn vaak beschadigd tijdens een poging om hen goed te plaatsen in de put. Een cruciaal onderdeel van dit nieuwe protocol is het ontwerp en de ontwikkeling van micro-weefsel beperkingen17 waarmee een kleine kamer voor de hersenen om in te verblijven zonder interferentie met de metabole metingen. De kamer die gegenereerd is ongeveer 0.016 in in hoogte en biedt voldoende ruimte, zodat het gemakkelijk houden veel D. melanogaster hersenen. De beperkingen bestaan uit nylon mesh gekoppeld aan een ring van inerte polymeren en zal verder worden besproken in de Resultaten van de vertegenwoordiger. Met behulp van deze beperkingen minimaliseert de benodigde tijd voor het bereiden van ontleed hersenen voor de metabole meting. Optimaliseren van de meetprocedure genereert gestage, reproduceerbare zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring tarieven na zes cycli van de meting (van 25 min). De hersenen blijven metabolisch actief onder deze omstandigheden voor een minimum van 2 h, waarmee injecties van therapeutiek, remmers of andere behandelingen via de metabole analyzer cartridge drug-uitvoerpoorten. Dit protocol kan ook gemakkelijk aan te passen voor andere weefsels en kleine model systemen18worden.
Het protocol dat hieronder wordt beschreven hoe het zuurstofverbruik in een hele Drosophila larvale hersenen wanneer uitgedaagd met mitochondriale stress-test. Om te benadrukken de hersenen, wordt oligomycin toegevoegd voor de remming van de ATP-synthase19. De daling van zuurstofverbruik van basale lezingen toont een meting van de hoeveelheid ATP-afhankelijk van ademhaling in de hersenen. Verdere dalingen in het zuurstofverbruik na behandelingen met rotenon20 en antimycin een21, remmers van elektronentransport ketencomplexen I en III, respectievelijk, geeft de hoeveelheid niet-mitochondriale zuurstofverbruik in de hersenen. Deze test is een voorbeeld van hoe mitochondriale ademhaling in een vlieg hersenen vergeleken kan worden en hoe dit protocol kan worden gebruikt voor het vergelijken van het metabolisme in verschillende genotypen. Dit protocol kan echter worden aangepast om gewoon basale zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring tarieven, evenals over de uitgebreidere ontwerpstudies onderzoek naar specifieke energie gebruik of substraat gebruik hypothesen te meten.
Protocol
1. assay voorbereiding (dag 1)
- Plaats de metabole analyzer (Tabel van materialen) in een broedmachine of een temperatuurgevoelig kamer ingesteld op 11 ° C.
Opmerking: Deze temperatuur is ideaal voor metingen bij 25 ° C, omdat het zorgt voor de ~ 14 ° C temperatuur schommelingen die optreedt tijdens het uitvoeren van de test. Dit wordt veroorzaakt door de warmte die door het instrument tijdens de run. - Open de juiste software op de computer aangesloten op de metabole analyzer. Klik op de numerieke temperatuur in de linker onderkant van het scherm. In het nieuwe venster dat opent, klikt u op het vak naast de opdracht "Kachel op" en controleer dat wordt een vinkje weergegeven. Pas de temperatuur 25 ° C en aanpassen van de tolerantiebereik tot 0,2 ° C met behulp van de pijlen.
Opmerking: Enkele uren zijn nodig om het bereiken van stabiele temperaturen. - Open de container van de cartridge (Tabel van materialen) en verwijder de cassette van de utility plaat zonder het aanraken van de sondes.
Opmerking: Het hulpprogramma plaat wordt gebruikt tijdens de kalibratie van de patroon en wordt niet gebruikt tijdens het uitvoeren van de metabole test. - 200 μl van een kalibrant oplossing (Tabel van materialen) aan het hulpprogramma plaat en plaats de cartridge terug aan de top de hulpprogramma-plaat om te hydrateren de sensor sondes op de cartridge toevoegen. Raak de sondes en hen te beschermen tegen licht.
- Het zegel van de cartridge met de paraffine-film.
- Incubeer de cartridge's nachts bij 25 ° C.
2. assay Media voorbereiding (dag 2)
- Glucose van 10 mM en 10 mM natrium pyruvaat toevoegen aan het medium assay.
- Incubeer het medium bij 25 ° C, totdat de vloeistof heeft geëquilibreerd tot deze temperatuur.
- Breng de pH op 7.4 met behulp van een pH-meter.
3. installatie van de Software voor de metabole analyse van de Drosophila melanogaster hersenen (dag 2)
- Instellen van de metabole software op de metabole analyzer in stap 1.2 gebruikt.
- Selecteer "Sjabloon" op het hoofdscherm van de software.
- Dubbelklik op "Leeg" om te beginnen een nieuw ontwerp van de bepaling.
- Klik op de "Plaat kaart" knop in de bovenste werkbalk weergeven van het ontwerp van de cel assay plaat.
Opmerking: De cel assay plaat bevat de hersenen monsters en zal gekoppeld worden aan de cartridge voordat u begint met de metabole test uitvoeren. -
Klik op de toevoegen groepen knop 3 x.
- Dubbelklik op het label "Groep 1" en hernoem het naar "Experimenteel".
Opmerking: Deze groep bevat een vlieg hersenen en een beperking van de micro-weefsel behandeld met medicijnen. - Dubbelklik op het label "Groep 2" en hernoem het naar "Control".
Opmerking: Deze groep bevat een vlieg hersenen en een beperking van de micro-weefsel met geen medicamenteuze behandeling. - Dubbelklik op de "groep 3" label en hernoem het naar "terughoudendheid alleen".
Opmerking: Deze groep bevat een beperking van de micro-weefsel zonder hersenen of medicamenteuze behandeling.
- Dubbelklik op het label "Groep 1" en hernoem het naar "Experimenteel".
-
De putjes toewijzen aan elke groep gebaseerd op waar de monsters in de cel-plaat zijn bedoeld om te worden geplaatst.
- Klik op het label "Experimenteel" en markeer vervolgens wells B2 - B8 op de kaart van de plaat.
- Klik op de "Control"-label en markeer vervolgens wells C2-C8 op de kaart van de plaat.
- Klik op de "terughoudendheid enige' ' etiket en vervolgens hoogtepunt wells D2-D8 op de kaart van de plaat.
- Controleer dat alle vier de hoeken (A1, A12, H1 en H12) zijn aangewezen als achtergrond.
NB: Wells langs de omtrek van de plaat worden niet gebruikt om eventuele randeffecten. Dit is een standaardinstelling in de software.
-
Klik op de knop 'Protocol' in de bovenste werkbalk instellen van het protocol.
- Klik op de "meting details bewerken' in het vak basislijn meting.
- De tijd dat de metabole analyzer zal het meten van de hersenen door het veranderen van de basale maatregel cyclustijd naar "3:00" aanpassen door te klikken op de omhoog en pijl-omlaag.
- De tijd dat de metabole analyzer tussen hersenen metingen wachten zal door het veranderen van het basale wachten cyclustijd naar aanpassen "0:00" door te klikken op de omhoog en pijl-omlaag.
- De tijd dat de metabole analyzer zal de media mix aanpassen voorafgaand aan het meten van de hersenen door het veranderen van de basale Meng cyclustijd naar "1:00" door te klikken op de omhoog en pijl-omlaag.
- Het totale aantal basale cycli, waarin de maatregel, wachten en mix cycli, tot aanpassen "7" door te klikken op de omhoog en pijl-omlaag.
Opmerking: Stabiele zuurstof verbruik tarief metingen worden verkregen na ~ 25 min vanaf het begin van de test. - Klik op de knop "Add injectie", gelegen in de bovenste werkbalk links.
- Klik op de "injectie label" en veranderen in "Oligomycin".
- De injectie maatregel, wachten en mix vaak moet overeenkomen met die voor de basale aanpassen.
- Het totale aantal cycli van de injectie te '6' aanpassen door te klikken op de omhoog en pijl-omlaag.
- Herhaal stap 3.7.6 - 3.7.8 maar het label wijzigen naar "Rot/AA" en het totale aantal cycli van de injectie tot en met 7 aanpassen door te klikken op de omhoog en pijl-omlaag.
- Klik op de "Uitvoeren Assay" knop in de bovenste werkbalk.
- "Save" de bepaling en beginnen met het opzetten van de test patroon (Tabel van materialen).
4. voorbereiding van de patroon van de kalibratie (dag 2)
-
Verwijder de cassette uit de 25 ° C incubator en opstijgen van de cover.
- 20 μL van 100 μM oligomycin naar de linker bovenste kleine cirkelvormige injectie-haven, haven A, in de cartridge voor alle overeenkomstige experimentele putten op de plaat van de cel en voeg toe 20 μL van assay media naar poort A in alle andere putjes, met inbegrip van de controle en achtergrond putten.
Opmerking: De cartridge bevat 4 poorten (A-D) voor elk van de 96 putten die overeenkomt met de cel plaat wat de monsters zal bevatten. Deze stap is gedaan vóór het toevoegen van de monsters. Toevoegen van 20 μL van 100 μM oligomycin resultaten in een concentratie van de uiteindelijke oligomycin van 10 μM in de cel plaat goed zodra het geneesmiddel is geïnjecteerd door de metabole analyzer. Oligomycin is een remmer van ATP-synthase. De resultaatwaarde zuurstof verbruik zal weerspiegelen het bedrag van ATP-verbonden ademhaling in de hersenen. Om goed de drugs te injecteren in de opgegeven putten, moeten alle havens van dezelfde letter worden gevuld met hetzelfde volume van vloeistof, zelfs indien niet in gebruik. - 22 μL van 50 μM rotenon/antimycin A aan de kleine bovenste rechts circulaire poort toevoegen, poort B, in de cartridge voor alle overeenkomstige experimentele putten op de plaat van de cel en 22 μL van assay media toevoegen aan poort B van alle andere putjes, met inbegrip van de controle en achtergrond putten.
Opmerking: Dit resulteert in een definitieve rotenon/Antimycin een concentratie van 5 μM in de cel plaat goed zodra het geneesmiddel is geïnjecteerd door de metabole analyzer. Rotenon en antimycin A zijn remmers van elektronentransport keten complexen I en III, respectievelijk. De resultaatwaarde zuurstof verbruik zal weerspiegelen niet-mitochondriale ademhaling in de hersenen. - Klik op "Start uitvoeren" de geladen patroon met het hulpprogramma plaat in de metabole analyzer met goed A1 geplaatst in de linkerbovenhoek wordt getoond wanneer geconfronteerd met het instrument, met de loader van de plaat zich uitstrekt van de rechterkant van de machine plaatsen.
- 20 μL van 100 μM oligomycin naar de linker bovenste kleine cirkelvormige injectie-haven, haven A, in de cartridge voor alle overeenkomstige experimentele putten op de plaat van de cel en voeg toe 20 μL van assay media naar poort A in alle andere putjes, met inbegrip van de controle en achtergrond putten.
- Selecteer "I 'm Ready" in de software om te beginnen de evenwichtsinstelling en de kalibratie van de cartridge voorafgaand aan het begin van de metabole test met de plaat van de cel met de monsters.
Opmerking: Het programma wordt u gevraagd het bestand opslaan en vervolgens beginnen zo en kalibreren. Deze stappen kun je tot 1 h. stappen 5 tot en met 8 worden uitgevoerd tijdens de evenwichtsinstelling en kalibratie.
5. bereiding van de beperkingen van de Micro-weefsel (dag 2)
- Selecteer 1 micro-weefsel terughoudendheid per hersenen die wordt gemeten, vermeerderd met ten minste 3 voor gebruik als terughoudendheid-alleen besturingselementen uit de opslagcontainer (bevat 70% ethanol).
- Spoel de beperkingen met verse 70% ethanol en spoel ze met gedeïoniseerd water 3 x voor 2 minuten elk, met behulp van een mesh mand en 6-well plaat (Tabel van materialen). Voeg extra water wast als de beperkingen nog steeds geven een alcohol geur af.
- Wassen van de beperkingen van de micro-weefsel in assay media en verlaat hen in deze oplossing totdat ze klaar voor gebruik zijn.
6. dissectie van de Drosophila melanogaster larvale hersenen (dag 2)
- Selecteer eind (zwervende) derde instar-larven in een flesje van gekweekte Oregon-R vliegen met behulp van hoge precisie, stijl van 5 (0.10 x 0,06 mm2) pincet.
- Plaats de larve in de put van een schone ontleden plek plaat (Tabel of Materials) met 500 μL van 1 x PBS.
Opmerking: Een plek plaat is een glasplaat met depressies, gebruikt om te ontleden kleine weefsels en organismen. - De larve door zachtjes schudden in de put, wassen, gebruik pincet.
- Verplaats de larve naar de schone put van een plek plaat met 500 μL van 1 x PBS.
- Plaats de plek plaat onder de Microscoop ontleden.
- Pak de larve op zijn buik met een pincet, terwijl het oog haken met een tweede pincet grijpen.
- Trek de larve in tegengestelde richtingen met behulp van de twee sets pincet zacht en soepel.
- Visualiseren van de hersenen, die doorgaans verblijven aan het oog haken en zal vaak oog-antennal schijven wordt toegevoegd.
- Verwijder voorzichtig extra weefsels van de hersenen, de ogen haken met de hersenen op zijn plaats houden. Tot slot, scheiden de oog haken van de hersenen.
- Pincet gebruiken om de ontleed hersenen naar een nieuwe put op een plek plaat met 1 x PBS.
- Herhaal de stappen 6.1 – 6.10 om 14 hersenen worden ontleed.
Opmerking: De totale tijd vanaf het begin van de dissectie tot het punt van de test mag niet meer dan 30 min.
7. de toevoeging van de ontleed hersenen aan de 96-Wells metabole Assay cel plaat (dag 2)
- Voeg 50 l assay media aan de putjes van de plaat van de 96-Wells metabole assay (Tabel of Materials) wordt gebruikt in het experiment, met inbegrip van de experimentele, de controle, terughoudendheid-only, en de achtergrond putten.
- Zorgvuldig plaatst een hersenen in elk putje van de A2-A8 en B2-B8 van de cel plaat, met pincet, spatel of een pipet.
Opmerking: Dit kan worden gedaan vanaf de ontleden Microscoop. - Onder de Microscoop dissectie, kunt een gebogen naald micro-sonde de hersenen zinken naar de bodem van de put.
- Voorzichtig plaats de hersenen in het midden van de drie hogere sferen met de sonde.
8. de toevoeging van de Micro-weefsel beperkingen aan de 96-Wells metabole Assay cel plaat (dag 2)
- Gebruik pincet, leg de terughoudendheid van de micro-weefsel op de rand van de plaat assay goed, en de Microscoop gebruiken om te controleren dat er gericht met de kunststof ring naar beneden en de Maas op de top.
- Verwijderen van de plaat onder de Microscoop en gebruik pincet te begrijpen de terughoudendheid aan beide zijden en zachtjes laten vallen in de put.
- Gebruik een gebogen naald micro-sonde om duw de terughoudendheid naar beneden in de put.
- Controleer onder de Microscoop, of dat de hersenen door de terughoudendheid van het weefsel kan worden gezien en dat het gecentreerd is in de put.
- Herhaal stap 8.1-8.4 voor alle putjes die in de bepaling worden zal — A2-A8, B2-B8 en C2-C8.
- Voeg voorzichtig 130 μL van assay media aan elk van de experimentele, controle, en dit is een alleen-terughoudendheid wells.
- Controleer of de hersenen en de micro-weefsel beperkingen niet verplaatst hebben, terwijl het toevoegen van de media door het visualiseren van hen onder de Microscoop.
- 180 μL van assay media toevoegen aan de vier hoek putten voor gebruik als achtergrond controle.
9. de toevoeging van de plaat van de cel naar de metabole Analyzer en het begin van de test (dag 2)
- Controleer of de evenwichtsinstelling en Kalibratie voltooid door te wachten voor de software wordt gevraagd om de plaat van de cel met het monster.
- Selecteer "Open Tray" en wacht op het instrument om uit te werpen de hulpprogramma-plaat.
- Verwijderen van het hulpprogramma plaat en de plaat van de cel, zonder deksel, toe te voegen in dezelfde afdrukstand.
- "Load cel plaat" voor het instrument te nemen in de cel-plaat en sluit de lade selecteren en vervolgens beginnen met de test.
- Bekijken van de metingen in realtime met foutbalken op het computerscherm waarop de software draait.
- Verwijder de uitgeworpen cel plaat en de cartridge wanneer de test voltooid is.
Opmerking: Gepaarde cartridges en platen van de cel kan worden hergebruikt 5 x.
10. na meting analyse (dag 2)
- Gebruik een ontleden Microscoop om te controleren dat de hersenen en de micro-weefsel beperkingen zijn nog steeds goed gepositioneerd in de put nadat de test is voltooid. Eventuele putjes met afwijkingen van de analyse uitsluiten.
- De zuurstof verbruik tarief (OCR) en de extracellulaire verzuring tarief (ECAR) gegevens voor verdere analyse exporteren.
Representative Results
Het hier gepresenteerde protocol vereist het gebruik van micro-weefsel beperkingen die voldoen aan de specificaties die hieronder worden beschreven. Met behulp van andere methoden om te houden van de hersenen in plaats aan de onderkant van de 96-Wells cel plaat mislukten (figuur 2A en 2B). Ten eerste, verschillende agenten om de naleving van het weefsel aan de plaat werden getest. Een commercieel beschikbare weefsel lijm (Tabel of Materials) wordt aanbevolen voor het gebruik van cellen en organoids cel platen en sferoïde platen, respectievelijk. Aanvankelijk verscheen de hersenen zich te houden aan het goed oppervlak; echter de zuurstof verbruik (OCR) lezingen waren laag, en observeren van de putten na de test bleek dat de hersenen werden niet langer gekoppeld aan het goed oppervlak (figuur 2A). Dezelfde resultaten is opgetreden met superlijm (figuur 2A). Volgende, productie op kleine schermen om te houden van de hersenen in een kleine kamer op de bodem van de put werd geprobeerd (figuur 2B).
Metalen schermen geproduceerd hoge OCR lezingen alleen, zoals schermen metal met een polymeer-ring die het scherm op zijn plaats (figuur 2B). Netwave verrekening werd gebruikt met de dezelfde polymeer-ring. Dit apparaat veroorzaakt een negatieve OCR-lezing te verkrijgen. Ten slotte, micro-weefsel beperkingen werden ontworpen met een inert polymeer voor de ring meten een buitendiameter van 0.146 in, een inwendige diameter van 0.1335 in, een dikte van 0.0125 in, en een hoogte van 0.016 in (Tabel van materialen). Super lijm (Tabel of Materials) werd gebruikt om de ring hechten aan een nylon gaas met een specifieke poriegrootte van 0.0039 in diameter (Tabel van materialen). De poriegrootte is kritisch, als het mogelijk maakt om de media en metaboliet wisselen zonder de vorming van luchtbellen, maar nog steeds een barrière voor de hersenen vormt. Deze beperkingen alleen leiden tot weinig tot geen OCR lezen, en bij gebruik in combinatie met de hersenen, toestaan voor reproduceerbare metingen (figuur 2A en 2B). De verificatie na de test bleek dat de hersenen nog steeds goed zijn gepositioneerd in de putjes. Deze beperkingen weefsel is momenteel niet commercieel beschikbaar, maar kunnen worden geproduceerd door het volgen van de bovenstaande specificaties. Hoewel dit nauwkeurige productie vereist, zal de meeste winkels van de machine zitten kundig voor deze terughoudendheid met behulp van de hierboven vermelde materialen reproduceren.
Het protocol is verder geoptimaliseerd op account voor de assay-media, de termijn voordat de test uitvoert, en de temperatuur (Figuur 3). In eerste instantie testen opgezet in het Schneider-medium model het milieu larvale in vivo . De gebruikte media kan niet bevatten echter buffer agenten omdat pH wordt gebruikt voor het meten van de ECAR. Deze media, heeft dus op maat gemaakt, die is duur. Om dit te optimaliseren, was een commercieel beschikbare assay media ontworpen voor metabole analyse (Tabel of Materials) gebruikt in plaats van de Schneider-media. De OCR-niveaus waren ongewijzigd, zelfs wanneer de verhoging van de niveaus van de bloedglucose iets naar model assay media voorwaarden (figuur 3A). Alle testen vanaf dit punt werden uitgevoerd in het test medium. De aanvullingen op de media werden geoptimaliseerd door het observeren van of het zuurstofverbruik en de extracellulaire verzuring tarieven een reactie toonde wanneer behandeld met bekende mitochondriale remmers. Vervolgens was de wachttijd tussen de ontledingen en de test loopt geanalyseerd. Een incubatietijd van 3 h aanzienlijk gedaald de OCR-niveaus (figuur 3B). Figuur 3D toont het verschil op het zesde punt van de tijd, dat is wanneer de OCR en ECAR niveaus voor zowel de larven als de volwassen hersenen stabiliseren. Het protocol geeft dus aan om te beginnen met de test direct na de ontledingen, tenzij het experiment een temperatuur evenwichtsinstelling vereist, in dat geval een incubatie gedurende minder dan 30 min wordt gesuggereerd. De metabole analyzer wordt opgeslagen in een incubator ingesteld op 11 ° C te voorzien in een temperatuur van 25 ° C in de test. Als de temperaturen worden verhoogd als gevolg van de omgevingstemperatuur en de werking van het instrument, worden verminderde OCR niveaus waargenomen (Figuur 3 c). Dit is veronderstelde om te worden als gevolg van dood weefsel.
Wanneer de geoptimaliseerde voorwaarden worden gevolgd, het testen met de larven en de volwassen hersenen resulteren in lezingen voor OCR 150 pmol/min. bij de gestabiliseerde enigszins te overschrijden zesde keer aanwijst, ~ 25 min in de assay (figuur 4B). Dit tempo wordt aangehouden, voor ten minste 30 min (figuur 4A) en maximaal 2 h (gegevens niet worden weergegeven). De ECAR is iets lager in volwassen hersenen dan in larvale hersenen op het zesde punt van de tijd (Figuur 4 d) en wordt onderhouden gedurende ten minste 30 minuten (figuur 4C). Deze bevinding komt overeen met een toename van de glycolyse tijdens de larvale stadia om groei te ondersteunen. Een injectie met een mitochondriaal-remmer, zoals oligomycin, verlaagt de OCR-lezingen te onthullen van de ATP-afhankelijke ademhaling, verdere behandeling met rotenon en antimycin A verlaagt de OCR te onthullen van niet-mitochondriale zuurstofverbruik (figuur 5A ). Deze gegevens blijkt dat deze remmers kunnen penetreren het hersenweefsel en kunnen worden gebruikt voor het vergelijken van mitochondriale ademhaling in de hersenen van verschillende genotypen. Voor deze test, de mix, wachten, en maatregel tijden werden geoptimaliseerd door het observeren van de zuurstofniveaus, niet het verbruik tarief, en ervoor te zorgen dat na het mengen, het zuurstofgehalte keerde terug naar het niveau vóór de meting.
Figuur 1: een schematische voorstelling van larvale hersenen OCR en ECAR metingen in de metabole analyzer. De cartridge is bereid een dag voordat u de test uitvoert. De volgende dag, worden drugs toegevoegd aan de poorten van de injectie van de cartridge. D. melanogaster larvale hersenen worden ontleed en micro-weefsel beperkingen worden toegevoegd aan het beveiligen van de hersenen naar de bodem van de put. De plaat van de cel met de hersenen in de metabole analyzer is bepaald en de gegevens worden geanalyseerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Micro-weefsel beperkingen niet metabolisch actief zijn en houden van de hersenen in een kamer aan de onderkant van een plaat goed. (A) de OCR van Oregon-R D. melanogaster larvale hersenen wordt gemeten in putten gestreken met weefsel lijm (Tabel of Materials) of wanneer de hersenen zijn super vastgelijmd aan de bodem van de put. De resultaten worden vergeleken met die van de hersenen bij de bodem van de put met behulp van micro-weefsel beperkingen geplaatst. (B) de OCR wordt gemeten in putten met assay media en metaal, metalen met een polymeer-ring, netwave verrekening en een polymeer-ring of micro-weefsel beperkingen. p-waarde < 0,05, ** p-waarde < 0,01, *** p-waarde < 0.001, *** p-waarde < 0,0001. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: optimalisatie van de media, incubatietijd en temperatuur. (A) de OCR wordt gemeten in Oregon-R D. melanogaster larvale hersenen Schneider media (S2) met natrium pyruvaat toegevoegd, S2 met glucose en pyruvaat natrium toegevoegd en gehaltebepaling van media met glucose en natrium pyruvaat toegevoegd. (B) de OCR wordt gemeten in larvale hersenen na 3 uur incubatie vóór de bepaling, of na 30 min van incubatie vóór de bepaling. (C) de OCR wordt gemeten in larvale hersenen op test run temperaturen van 33 ° C en 25 ° C. Het zesde punt van de tijd is opgenomen in een grafiek. (D) de OCR wordt gemeten in larvale hersenen na 3 uur incubatie vóór de bepaling, of na 30 min van incubatie vóór de bepaling. De gegevens wordt voor de zesde tijdstip gerapporteerd. p-waarde < 0,05, ** p-waarde < 0,01, *** p-waarde < 0.001, *** p-waarde < 0,0001. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: De OCR en ECAR reproducibly worden gemeten in volwassen en larvale D. melanogaster brains. (A) de OCR wordt gemeten in Oregon-R D. melanogaster volwassen en larvale hersenen voor 30 min. (B) de OCR-gegevens van het zesde punt van de tijd van paneel A is opgenomen in een grafiek. Dit is het punt van de tijd waarop de OCR-lezingen stabiliseren. (C) de ECAR wordt gemeten in D. melanogaster volwassen en larvale hersenen voor 30 min. (D) de ECAR gegevens van het zesde punt van de tijd van paneel A is opgenomen in een grafiek. Dit is het punt van de tijd waartegen de ECAR lezingen stabiliseren. p-waarde < 0,05, ** p-waarde < 0,01, *** p-waarde < 0.001, *** p-waarde < 0,0001. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: Oligomycin verlaagt de D. melanogaster larvale hersenen OCR niveaus te onthullen van de ATP-afhankelijke ademhaling, en een verdere rotenon/antimycin verlaagt de OCR te onthullen van niet-mitochondriale zuurstofverbruik. (A) de OCR wordt gemeten in Oregon-RD. melanogaster larvale hersenen na een behandeling met een 20 µM oligomycin en 5 µM rotenon/antimycin A mengsel. De controle- en dit is een alleen-terughoudendheid wells waren geïnjecteerd met assay media. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Hier, wordt een nieuwe methode voor de metabole analyse van D. melanogaster larvale en volwassen hersenen ex vivo beschreven. Onder basale omstandigheden geven zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring tarieven hoe metabolisch actief de hersenen is en kunt bepalen of een weefsel afhankelijker van mitochondriale versus glycolytic ademhaling geworden, respectievelijk11.
Behandeling van de hersenen met remmers of therapeutische drugs kan verdere informatie verstrekken over de metabole status van het weefsel. Metabole substraten kunnen ook worden toegevoegd aan het bepalen van de afhankelijkheden van specifieke metabolieten, zoals glucose te testen voor het Warburg effect22 of glutamine te onderzoeken glutaminolysis23— beide common in metabole herprogrammering. Langetermijnstudies, larven of vliegen kunnen ook worden gevoed drugs in plaats van met behulp van injectie poorten en hersenen kunnen worden bepaald met regelmaat of het eindpunt, afhankelijk van de proefopzet. Deze methode kan worden geoptimaliseerd voor tal van toepassingen.
Deze methode is geoptimaliseerd voor de hersenen, maar kan worden gebruikt om andere larvale18 en volwassen weefsels te analyseren. Bovendien kunnen andere kleine modelsystemen gebruiken deze methode voor het meten van de hele organismen18 of weefsels. De enige beperking voor het optimaliseren van deze methode voor andere systemen is de grootte van het orgaan, weefsel of organisme. De kamer die is gemaakt door de terughoudendheid van de micro-weefsel is de barrière van de grootte tot het uitvoeren van de test. Als de metabole output is te laag voor de hersenen of het weefsel wordt getest, en de grootte van de steekproef niet een beperking is, kan bundeling van monsters worden gebruikt om de assay metingen en de gevoeligheid te verhogen. Wijziging van dit protocol voor andere toepassingen moet alleen kleine optimalisaties, waaronder 1) het kiezen van de passende maatregelen vereist en meng cyclus getallen en timing, en 2) bepalen van de effectieve behandeling concentraties voor het weefsel. De maatregel en mengen tijden werden vastgesteld door de monitoring zuurstofconcentratie gemeten door de metabole analyzer tijdens elke cyclus. Dit kan worden bekeken door het selecteren van O2 in de Y2 as-knop in het overzichtsvenster na de run voltooid is. Tijdens elke cyclus, moet er een drop-in zuurstofconcentratie als gevolg van het weefsel van zuurstofverbruik gedurende de gemeten tijd, gevolgd door een terugkeer naar de oorspronkelijke zuurstofconcentratie tijdens het mengen cyclus. De maatregel en mix tijden moeten worden getest, totdat dit patroon wordt waargenomen. Met behulp van deze methode, zijn andere insecten hersenen bestudeerd. Deze hersenen waren groter dan de vliegen hersenen hier gebruikt maar nog binnen de zaal gegenereerd door het weefsel terughoudendheid past. De OCR-lezingen van deze hersenen waren maar liefst 400 pmol/min (gegevens niet worden weergegeven). De resultaten van deze studies, alsook de tarieven van de OCR die uitlijnen met andere studies meten geheel-fly zuurstof verbruik18,24, suggereren dat de D. melanogaster hersenen geen zuurstof beperkt waren. Voor zowel D. melanogaster hersenen en weefsels van andere organismen vereist toepassing van deze methode speciale aandacht voor vier kritische stappen.
Om te slagen reproduceerbaar zijn en biologisch relevante metingen, zijn er kritische stappen van het protocol dat moet worden gevolgd. Ten eerste, het gebruik van een micro-weefsel bevestigingssysteem is vereist voor deze methode. Deze beperkingen met behulp van de specificaties en de opgenomen grondstoffen productie is van essentieel belang. De materialen werden gekozen vanwege hun inerte chemische samenstelling, en hun vermogen om de juiste media uitwisseling mogelijk te maken tijdens het mengen stappen zonder de totstandbrenging van luchtbellen. Ten tweede, een tijdige voorbereiding van de dissectie en plaat is vereist voor het maximaliseren van de metabole output van het weefsel. Korte dissectie keer moeten aanzienlijk geen afbreuk doen aan de hersenen. Andere studies hebben aangetoond dat vliegen hersenen worden in leven voor uren tot dagen gehouden kunnen na dissectie als correct opgeslagen in een perfusie kamer25. Echter, zoals te zien in figuur 3B en 3D, als hersenen blijven zitten in assay media voor lange perioden voorafgaand aan de test, zijn de zuurstof verbruik daalde. Tijdens de test ondergaan monsters een mengen stap tijdens elke cyclus. Dit mengen niet alleen helpt met de injecties van chemische stoffen, maar ook om te recirculate van de media en zuurstof. De hersenen kunnen metabolisch actief voor langere perioden tijdens deze maatregel-mix-cycli dan zij zou worden aan het broeden in de media op de top van de Bank te blijven. Daarom moet de dissectie van larvale hersenen voordat u begint aan het instellen van deze test worden beheerst. Wanneer het opzetten van deze bepaling, een klein aantal genotypen analyseren op een moment, tot een minimum beperken van het aantal hersenen nodig en putten gebruikt. Dit voorkomt vertragingen tussen de ontleden en de assay-metingen. Ten derde, behoud van een stabiele temperatuur is vereist voor het analyseren van de stofwisseling in fysiologisch relevante voorwaarden. Verhoogde assay temperaturen kunnen leiden tot weefsel dood, waargenomen door lagere zuurstof verbruik (Figuur 3 c). Als vliegen worden gefokt op een verschillende temperatuur voor experimentele doeleinden, moeten ook de metingen worden uitgevoerd op deze temperatuur. Terwijl dissecties zal waarschijnlijk worden uitgevoerd bij kamertemperatuur, als de bepaling bij een verschillende temperatuur zal plaatsvinden, moeten de vergulde en ingetogen hersenen worden geïncubeerd op de vereiste temperatuur gedurende 15 minuten staan voordat u de test uitvoert. Tot slot, observeren de putten na bepaling is van cruciaal belang om te bepalen als de metingen weefsel positionering beïnvloed. Soms zal er een uitschieter goed dat, na het observeren van de plaat onder de ontleden Microscoop, kan worden geëlimineerd uit de data-analyse als gevolg van een verlies van weefsel of mispositioning, waar de hersenen heeft gleed uit het midden van de put en zit vast onder de polymeer-ring van de beperking. Weefsel kan verloren gaan als de terughoudendheid was niet goed beveiligd aan het putje en werd verstoord tijdens het mengen cycli. Terwijl geen van deze gebeurtenissen vaak, gebeurt als ze niet worden uitgesloten van de analyse, zal ze de waarden van de snelheid aanzienlijk lager.
De meting van de metabole flux geheel-weefsel door toezicht zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring biedt een biologisch relevante methode om inzicht te krijgen hoe metabolisme door de genetische landschap of andere experimentele omstandigheden wordt gewijzigd. Deze methode is gevoelig genoeg voor het detecteren van metabole veranderingen in één D. melanogaster hersenen, die is niet mogelijk met behulp van stop-flow respirometrie of indirecte calorimetrie. Het is ook minder technisch uitdagend dan het gebruik van een Clark-elektrode voor het meten van zuurstofverbruik. Een bijkomend voordeel van dit protocol is de mogelijkheid om te analyseren een hele hersenen per putje. De 96-Wells-formaat zorgt voor meer gevoelige lezingen, en dus meer dan één genotype kan worden vehiculumcontrolegroep tegelijk vanwege het kleinere aantal monsters per bepaling. Terwijl het meten van metabolisme in weefsel nog uitdagend is en zorgvuldig vereist gefokt en gesynchroniseerde dieren, dit protocol beschrijft een snelle, relatief simplistische methode, en heeft het potentieel om het analyseren van talrijke metabole gevoeligheden in overleden melanogaster larven en de volwassen hersenen.
Disclosures
M. Tipping heeft een voorlopige patent voor de beperkingen van de micro-weefsel in dit protocol17beschreven.
Acknowledgments
Aandelen verkregen van de Bloomington Drosophila voorraad Center (NIH P40OD018637) werden gebruikt in deze studie. Het onderzoek gemeld in deze publicatie werd gesteund door de institutionele Development Award (idee) netwerk voor biomedische Research Excellence van de National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health onder grant nummer P20GM103430, en door de Stichting van Rhode Island. Auteurs bedanken J. wateren en P. Snodgrass-riem voor hun steun bij de ontwikkeling van dit protocol.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Assay medium | Agilent | 102365-100 | |
| Calibrant solution | Agilent | 100840-000 | |
| Corning Cell-Tak Cell Tissue Adhesive | Sigma Aldrich | DLW354240 | |
| delrin | Grainger | 2XMK6 | |
| Drosophila Schneider Media | Thermo Fisher | 21720-024 | |
| Dumont High Precision Tweezers (style 5) | Ted Pella | 5622 | |
| Loctite 409 | Amazon | ||
| Mitostress kit | Agilent | 103015-100 | oligomycin, rotenone, and antimycin A included |
| Netwell inserts (6-well) | VWR | 29442-136 | |
| nylon mesh | Component Supply | U-CMN-64 | |
| Parafilm M wrapping film | Fisher Scientific | S37440 | |
| PYREX spot plate | Fisher Scientific | 13-748B | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | ||
| Wave v2.4 XFe96 analyzer software | Agilent | https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/software-download-for-wave-desktop | free download to mac or windows |
| XFe96 catridge and cell plates | Agilent | 102416-100 |
References
- Cai, H., et al. Metabolic dysfunction in Alzheimer's disease and related neurodegenerative disorders. Current Alzheimer Research. 9 (1), 5-17 (2012).
- Zhao, S., et al. Glioma-derived mutations in IDH1 dominantly inhibit IDH1 catalytic activity and induce HIF-1alpha. Science. 324 (5924), New York, NY. 261-265 (2009).
- Brody, A. L., et al. Brain metabolic changes in major depressive disorder from pre- to post-treatment with paroxetine. Psychiatry Research. 91 (3), 127-139 (1999).
- Nagana Gowda, G. A., Djukovic, D. Overview of mass spectrometry-based metabolomics: Opportunities and challenges. Methods in Molecular Biology. 1198, 3-12 (2014).
- Dona, A. C., et al. A guide to the identification of metabolites in NMR-based metabonomics/metabolomics experiments. Computational and Structural Biotechnology Journal. 14, 135-153 (2016).
- Yuan, M., Breitkopf, S. B., Yang, X., Asara, J. M. A positive/negative ion-switching, targeted mass spectrometry-based metabolomics platform for bodily fluids, cells, and fresh and fixed tissue. Nature Protocols. 7 (5), 872-881 (2012).
- Zamboni, N., Fendt, S. -M., Rühl, M., Sauer, U. 13C-based metabolic flux analysis. Nature Protocols. 4 (6), 878-892 (2009).
- Duckwall, C. S., Murphy, T. A., Young, J. D. Mapping cancer cell metabolism with(13)C flux analysis: Recent progress and future challenges. Journal of Carcinogenesis. 12, 13 (2013).
- Clark, L. C., et al. Continuous recording of blood oxygen tensions by polarography. Journal of Applied Physiology. 6 (3), 189-193 (1953).
- Lighton, J. R. B. Measuring Metabolic Rates. Spatial Epidemiology: Methods and Applications. , 87-103 (2000).
- Ferrick, D. A., Neilson, A., Beeson, C. Advances in measuring cellular bioenergetics using extracellular flux. Drug Discovery Today. 13 (5-6), 268-274 (2008).
- Dunham-Snary, K. J., Sandel, M. W., Westbrook, D. G., Ballinger, S. W. A method for assessing mitochondrial bioenergetics in whole white adipose tissues. Redox Biology. 2 (1), 656-660 (2014).
- Fan, Y. -Y., Davidson, L. A., Callaway, E. S., Wright, G. A., Safe, S., Chapkin, R. S. A bioassay to measure energy metabolism in mouse colonic crypts, organoids, and sorted stem cells. American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (1), G1-G9 (2015).
- Lee, H., et al. Increased mitochondrial activity in renal proximal tubule cells from young spontaneously hypertensive rats. Kidney International. 85 (3), 561-569 (2014).
- Volkenhoff, A., et al. Glial glycolysis is essential for neuronal survival in drosophila. Cell Metabolism. 22 (3), 437-447 (2015).
- Becker, L., Nogueira, M. S., Klima, C., De Angelis, M. H., Peleg, S. Rapid and transient oxygen consumption increase following acute HDAC/KDAC inhibition in Drosophila tissue. Scientific Reports. 8 (1), (2018).
- Method and device for restraining contents of a cell plate. United States patent. Tipping, M., Waters, J. , 62/491,431 (2017).
- Neville, K. E., et al. A novel ex vivo method for measuring whole brain metabolism in model systems. Journal of Neuroscience Methods. 296, 32-43 (2018).
- Lardy, H. A., Johnson, D., McMurray, W. C. Antibiotics as tools for metabolic studies. I. A survey of toxic antibiotics in respiratory, phosphorylative and glycolytic systems. Archives of Biochemistry and Biophysics. 78 (2), 587-597 (1958).
- Turrens, J. F., Boveris, A. Generation of superoxide anion by the NADH dehydrogenase of bovine heart mitochondria. Biochemical Journal. 191, 421-427 (1980).
- Potter, V. R., Reif, A. E. Inhibition of an electron transport component by antimycin A. The Journal of Biological Chemistry. 194 (1), 287-297 (1952).
- Warburg, O. On the Origin of Cancer Cells. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
- Yang, L., Venneti, S., Nagrath, D. Glutaminolysis: A Hallmark of Cancer Metabolism. Annual Review of Biomedical Engineering. 19 (1), 163-194 (2017).
- Van Voorhies, W. A. Metabolic function in Drosophila melanogaster in response to hypoxia and pure oxygen. The Journal of Experimental Biology. 212 (19), 3132-3141 (2009).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (37), e1936 (2010).
