Summary
Nous présentons un protocole permettant de mesurer la consommation d’oxygène et l’acidification extracellulaire dans le cerveau larvaire et adulte de Drosophila melanogaster . Un analyseur métabolique est utilisé avec un protocole adapté et optimisé. Micro-tissu restrictions sont un élément essentiel du présent protocole et ont été conçues et créées spécialement pour leur utilisation dans cette analyse.
Abstract
Ce protocole décrit une méthode pour mesurer le métabolisme dans les cerveaux larvaire et adulte de Drosophila melanogaster . Quantifier le métabolisme des organes entiers permet de comprendre au niveau du tissu de l’utilisation de l’énergie qui ne peuvent pas être capturée lors de l’analyse des cellules primaires et des lignées cellulaires. Bien que cette analyse soit ex vivo, il permet la mesure d’un certain nombre de cellules spécialisées, travaillant ensemble pour exercer une fonction dans un tissu et modèles plus étroitement l’orgue in vivo . Reprogrammation métabolique a été observée dans de nombreuses maladies neurologiques, notamment la néoplasie et maladies neurodégénératives. Ce protocole a été développé afin d’aider l’enquête de la communauté de d. melanogaster du métabolisme dans les modèles de maladies neurologiques avec un analyseur de métabolique disponible dans le commerce. Mesure du métabolisme du cerveau entier dans l’analyseur de métabolique est difficile en raison de la géométrie du cerveau. Cet analyseur nécessite des échantillons de rester au fond d’une plaque de 96 puits. Échantillons cellulaires et tissulaires poinçons peuvent adhérer à la surface de la plaque cellulaire ou d’utiliser des plaques de sphéroïde, respectivement. Cependant, la forme sphérique, en trois dimensions des cerveaux de d. melanogaster empêche les tissus n’adhère à la plaque. Ce protocole requiert une retenue de micro-tissu spécialement conçue et fabriquée qui contourne ce problème en empêchant tout mouvement du cerveau tout en permettant des mesures métaboliques de deux sondes de capteur à semi-conducteur de l’analyseur. Consommation d’oxygène et le taux d’acidification extracellulaire sont sensibles à un traitement par des inhibiteurs métaboliques et reproductible. Avec une optimisation des mineure, ce protocole peut être adapté pour être utilisé avec n’importe quel tissus entiers et/ou le système modèle, pourvu que la taille de l’échantillon ne dépasse pas la chambre générée par le dispositif de retenue. Alors que les mensurations métaboliques basales et une analyse après un traitement avec des inhibiteurs mitochondries sont décrites dans le présent protocole, d’innombrables conditions expérimentales, telles que l’énergie source préférence et milieu d’élevage, pourraient être interrogées.
Introduction
Reprogrammation métabolique a été identifiée dans de nombreuses maladies neurologiques, y compris le glioblastome Multiforme (GBM), maladie de Huntington et le trouble dépressif majeur (TDM)1,2,3. Comme métabolisme devient la mise au point de stratégies thérapeutiques, outils pour la recherche métabolique fondamentale ont progressé. Cependant, la plupart de ces méthodes ont été conçue pour étudier les lignées cellulaires et les cellules primaires ou d’analyser des tissus plus grandes après fixation ou - gel. Certaines approches ont compté sur les kits pour mesurer de manière simpliste des métabolites spécifiques, tandis que d’autres ont utilisé des analyses plus complexes et coûteux utilisant chromatographie en combinaison avec la spectrométrie de masse4 pour le même objectif. Pour comprendre le paysage plu métabolique, métabolique profilage5,6 et analyse de flux métaboliques (MFA)7 a émergé pour compléter les études génomiques et protéomique à grande échelle. Profilage fournit une représentation quantitative de métabolites dans une cellule ou un tissu à un moment donné dans le temps, alors que l’AMF a élargit cela en permettant le suivi des métabolites marqués au fil du temps. Ce dernier a été utile en révélant comment les sources d’énergie sont utilisés différemment dans une cellule ou un tissu lorsque dans un état de maladie8. Toutefois, ces méthodes ne comprennent pas la mesure du taux métabolique général.
Pour interroger l’état métabolique général des systèmes de petite dimension, les méthodes traditionnelles, telles que l' électrode de Clark9 et10de calorimétrie indirecte, peuvent être utilisés pour mesurer la consommation d’oxygène ou configurés pour arrêt respirométrie de débit, à mesure d’oxygène et de dioxyde de carbone, respectivement. Ces techniques, tout en donnant avec précision un aperçu dans la lecture de reprogrammation métabolique au niveau de l’organisme, ont des limites. L’utilisation de l’électrode de Clark peut être techniquement difficile et n’est pas conçue pour des études de haut débit. Le respiromètre de flux d’arrêt ne peut pas fonctionner avec la sensibilité nécessaire pour doser les cellules ou tissus. Il y a plusieurs années nouvelle technologie a été développée spécifiquement pour ces petites applications11. Ces instruments ont été conçus pour mesurer la consommation d’oxygène et l’acidification extracellulaire des lignées cellulaires et les cellules primaires dans un format de 24 ou 96 puits. La simplicité de la sortie de la mise en place et des données mis en place cette méthode comme une alternative aux approches traditionnelles. Cette méthodologie est un outil puissant pour les cellules, et les progrès récents ont permis pour la mesure des tissus poinçons12,13,14. Cependant, les méthodes utilisées dans ces essais ne permettent pas pour le mesurage des organes entiers de systèmes de petit modèle.
L’analyse métabolique des modèles de maladies implique souvent l’interaction entre les cellules de fonction spécialisée résidant dans le même tissu. Par exemple, les cellules gliales produisent des métabolites utilisés par les neurones. Ces interactions métaboliques sont nécessaires pour la survie neuronale15. Systèmes de petit modèle sont avantageux pour enquêter sur ces questions. Études pour mesurer le métabolisme d’un organe entier, contenant une variété de types de cellules, ajoutera à la compréhension de l’énergie utilisation in vivo. Récemment, Becker et coll. ont signalé une méthode pour mesurer la consommation d’oxygène dans les têtes ensemble mouche16. En mettant en commun un certain nombre de têtes ensemble dans un puits d’une plaque de cellules de 24 puits, lectures de consommation d’oxygène ont été obtenues à l’aide d’un analyseur métabolique. Tandis que cela fonctionne bien pour les chefs, qui sont facilement séparés de corps, il est beaucoup plus difficile à utiliser pour les organes comme le cerveau de larve, car une grande quantité doit être disséqué pour cette méthode. Par conséquent, une méthode utilisant une plaque 96 puits de cellules, ce qui augmente la sensibilité de la consommation d’oxygène et de lectures de l’acidification extracellulaire, a été développée pour analyser un seul cerveau entier larvaire.
L’analyseur métabolique utilisée dans cette étude nécessite l’échantillon à mesurer pour rester au fond du puits d’une plaque 96 puits de cellules. Pour les cellules et les tissus relativement plats, ce n’est pas un défi ; Toutefois, pour les cerveaux de larves et adultes de d. melanogaster , il n’est pas possible à l’aide de protocoles de revêtement plaque traditionnelle. La forme sphérique en trois dimensions des cerveaux n’adhèrera pas fiable à la surface de la plaque, et ceux qui le font sont souvent endommagés lors de la tentative de les placer correctement dans le puits. Un élément essentiel de ce nouveau protocole est la conception et le développement des micro-tissu restrictions17 qui fournissent une petite chambre pour le cerveau de résider dans sans interférer avec les mesures métaboliques. La chambre générée est environ 0,016 en hauteur et offre assez d’espace pour contenir facilement plusieurs cerveaux de d. melanogaster . Le dispositif de retenue consistant en mailles de nylon attaché à un anneau de polymère inerte et on le verra plus loin dans les Résultats de représentant. À l’aide de ces ensembles de retenue réduit le temps nécessaire pour préparer les cerveaux disséqués pour la mesure métabolique. Optimiser le procédé de mesure génère la consommation d’oxygène constant et reproductible et taux d’acidification extracellulaire après six cycles de mesure (de 25 min). Les cerveaux restent métaboliquement actives dans ces conditions pendant un minimum de 2 h, ce qui permet à des injections de produits thérapeutiques, inhibiteurs ou autres traitements via les ports de livraison de drogue cartouche analyseur métabolique. Ce protocole peut également être facilement adapté pour d’autres tissus et un petit modèle systèmes18.
Le protocole détaillé ci-dessous décrit comment analyser la consommation d’oxygène dans le cerveau de larve un ensemble Drosophila quand défié avec stress mitochondrial. Pour souligner le cerveau, l’oligomycine est ajouté pour inhiber l’ATP synthase19. La diminution de la consommation d’oxygène de lectures basales montre une mesure de la quantité d’ATP-dépendant de la respiration dans le cerveau. Autres diminutions de la consommation d’oxygène après des traitements avec roténone20 et l’antimycine A21, inhibiteurs des complexes de chaîne de transport d’électrons I et III, respectivement, indiquer le montant de la consommation d’oxygène non-mitochondriale dans la cerveau. Ce test est un exemple de la respiration mitochondriale comment un cerveau mouche pourrait être comparé, et comment ce protocole peut être utilisé pour comparer le métabolisme chez les génotypes différents. Toutefois, le présent protocole peut être adapté pour mesurer la consommation d’oxygène simplement basale et taux d’acidification extracellulaire ainsi quant à des études plus élaborées enquêter sur l’utilisation de l’énergie spécifique ou substrat utilisation des hypothèses de conception.
Protocol
1. MODE OPERATOIRE Préparation (jour 1)
- Mettre l’analyseur métabolique (Table des matières) dans un incubateur ou dans une pièce à température contrôlée réglé à 11 ° C.
Remarque : Cette température est idéale pour les mesures prises à 25 ° C, car il permet à la fluctuation de température d’environ 14 ° C qui se produit pendant l’exécution de l’essai. Ceci est causé par la chaleur dégagée par l’appareil pendant la course. - Ouvrir le logiciel approprié sur l’ordinateur attaché à l’analyseur métabolique. Cliquez sur la température numérique en bas à gauche de l’écran. Dans la nouvelle fenêtre qui s’ouvre, cliquez sur la case en regard de la commande « Chauffage » et assurer qu'une coche s’affiche. Ajuster la température à 25 ° C et d’ajuster la plage de tolérance de 0,2 ° C, en utilisant les flèches.
Remarque : Plusieurs heures sont nécessaires pour atteindre des températures stables. - Ouvrez le conteneur de la cartouche (Table des matières) et retirer la cartouche de la plaque de l’utilitaire sans toucher les sondes.
Remarque : La plaque de l’utilitaire est utilisée lors de l’étalonnage de la cartouche et n’est pas utilisée pendant l’exécution de l’essai métabolique. - Ajouter 200 μL d’une solution de degré (Table des matières) à la plaque de l’utilitaire et placer la cartouche en haut de la plaque d’utilitaire pour réhydrater le capteur des sondes sur la cartouche. Ne pas toucher les sondes et les protéger de la lumière.
- Joint de la cartouche avec le film de paraffine.
- Incuber la cartouche durant la nuit à 25 ° C.
2. MODE OPERATOIRE médias préparation (jour 2)
- Ajouter 10 mM de glucose et de pyruvate de sodium 10 mM pour le milieu.
- Incuber le milieu à 25 ° C jusqu'à ce que le liquide a équilibrée à cette température.
- Ajuster le pH à 7.4 à l’aide d’un pH-mètre.
3. installation du logiciel pour l’analyse métabolique des cerveaux Drosophila melanogaster (jour 2)
- Mettre en place le logiciel métabolique sur l’analyseur métabolique utilisé à l’étape 1.2.
- Sélectionnez « Modèle » sur l’écran d’accueil logiciel.
- Double-cliquez sur « Blanc » pour commencer une nouvelle conception de l’essai.
- Cliquez sur le bouton « Carte de plaque » dans la barre d’outils supérieure pour afficher la conception de la plaque de test cellulaire.
Remarque : La plaque de test cellulaire contient des échantillons de cerveau et sera associée à la cartouche avant de commencer l’épreuve métabolique. -
Cliquez sur l’ajouter bouton de groupes x 3.
- Double-cliquez sur l’étiquette de « Groupe 1 » et le renommer en « Expérimental ».
NOTE : Ce groupe contiendra un cerveau mouche et une retenue de micro-tissus traités avec des médicaments. - Double-cliquez sur l’étiquette de « Groupe 2 » et le renommer en « Contrôle ».
NOTE : Ce groupe contiendra un cerveau mouche et une retenue de micro-tissu avec aucun traitement de la toxicomanie. - Double-cliquez sur le "groupe 3" étiqueter et renommez-le à "retenue seulement ».
Remarque : Ce groupe contiendra un dispositif de retenue de tissus micro sans cervelle ou traitement de la toxicomanie.
- Double-cliquez sur l’étiquette de « Groupe 1 » et le renommer en « Expérimental ».
-
Affecter les puits à chaque groupe en fonction où les échantillons dans la plaque cellulaire sont destinés à être placés.
- Cliquez sur l’étiquette de « Expérimental » et puis mettez en surbrillance puits B2 - B8 sur le plan de la plaque.
- Cliquez sur l’étiquette de « Contrôle » et puis mettez en surbrillance puits C2-C8 sur le plan de la plaque.
- Cliquez sur le « retenue seulement "" label et puis des matchs du puits D2-D8 sur le plan de la plaque.
- Vérifiez que tous les quatre coins (A1, A12, H1 et H12) sont désignés comme toile de fond.
Remarque : Les puits le long du périmètre de la plaque ne servent pas à réduire tout effet de bord. Il s’agit d’un paramètre par défaut dans le logiciel.
-
Cliquez sur le bouton « Protocole » dans la barre d’outils supérieure de mettre en place le protocole.
- Cliquez sur les « détails de mesure Edit » dans la zone de mesure de référence.
- Ajuster le temps que l’analyseur métabolique mesurera le cerveau en changeant la base mesure temps de cycle à « 03:00 » en cliquant sur le haut et vers le bas de flèches.
- Régler le délai d’attente entre les différentes mesures de cerveau en changeant l’attente basale des temps de cycle à l’analyseur métabolique « 0:00 » en cliquant sur le haut et vers le bas de flèches.
- Ajuster le temps que l’analyseur métabolique se mélangera les médias avant de mesurer le cerveau en changeant la basale mélanger des temps de cycle à « 01:00 » en cliquant sur le haut et vers le bas de flèches.
- Ajuster le nombre total de cycles basales, qui comprend la mesure, d’attente et des cycles de mélange, de "7" en cliquant sur le haut et vers le bas de flèches.
Remarque : Les mesures des taux de consommation d’oxygène Stable sont obtenues après ~ 25 min depuis le début de l’essai. - Cliquez sur le bouton « Ajouter injection », situé dans la barre d’outils de gauche supérieure.
- Cliquez sur l’étiquette de « Injection » et le changer à « L’oligomycine ».
- Ajuster la mesure d’injection, d’attente et temps de mélange pour correspondre à celles de la basale.
- Ajuster le nombre de cycles d’injection à « 6 » en cliquant sur le haut et vers le bas de flèches.
- Répétez les étapes 3.7.6 - 3.7.8 mais changer l’étiquette de « Rot/AA » et ajuster le nombre de cycles d’injection à 7 en cliquant sur le haut et vers le bas de flèches.
- Cliquez sur le bouton « Exécuter Assay » dans la barre d’outils supérieure.
- « Sauver » l’essai et commencer la mise en place de la cartouche de dosage (Table des matières).
4. préparation de la cartouche pour l’étalonnage (jour 2)
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Retirez la cartouche de l’incubateur de 25 ° C et retirer le couvercle.
- Ajouter 20 μL de 100 μM oligomycine au port petite injection circulaire gauche supérieure, port A, dans la cartouche pour les puits expérimentales tout correspondants sur la plaque cellulaire et ajouter 20 μL de médias de dosage au port A dans tous les autres puits, y compris les puits de contrôle et d’arrière-plan.
NOTE : La cartouche contient 4 ports (A-D) pour chacun des 96 puits correspondant à la plaque cellulaire ce qui contiendra les échantillons. Cette étape est faite avant d’ajouter les échantillons. Ajouter 20 μL de 100 résultats d’oligomycine μM dans une concentration finale de l’oligomycine de 10 μM dans la plaque cellulaire bien une fois que le médicament est injecté par l’analyseur métabolique. L’oligomycine est un inhibiteur de l’ATP synthase. La valeur de la consommation de l’oxygène reflète la quantité d’ATP-lié de la respiration dans le cerveau. Afin de correctement les UDI dans les puits spécifiés, tous les ports de la même lettre doivent être remplis avec le même volume de liquide, même si ce n’est en cours d’utilisation. - Ajouter 22 μL de 50 μM roténone / l’antimycine A dans l’orifice supérieur droit tronqué, port B, dans la cartouche pour les puits expérimentales tout correspondants sur la plaque cellulaire et ajouter 22 μL de médias de dosage au port B de tous les autres puits, y compris les puits de contrôle et d’arrière-plan.
Remarque : Cela se traduit par une finale roténone/antimycine une concentration de 5 μM dans la plaque cellulaire bien une fois que le médicament est injecté par l’analyseur métabolique. Roténone et l’antimycine A sont inhibiteurs du transport des électrons de la chaîne des complexes I et III, respectivement. La valeur de la consommation de l’oxygène reflètera la respiration mitochondriale-non dans le cerveau. - Cliquez sur « Start run » de placer la cartouche avec la plaque de l’utilitaire dans l’analyseur métabolique avec A1 bien positionné dans le coin supérieur gauche, face à l’instrument, avec le chargeur de la plaque qui s’étend du côté droit de la machine.
- Ajouter 20 μL de 100 μM oligomycine au port petite injection circulaire gauche supérieure, port A, dans la cartouche pour les puits expérimentales tout correspondants sur la plaque cellulaire et ajouter 20 μL de médias de dosage au port A dans tous les autres puits, y compris les puits de contrôle et d’arrière-plan.
- Sélectionnez « I'm Ready » dans le logiciel pour commencer l’équilibration et l’étalonnage de la cartouche avant de commencer le test métabolique avec la plaque cellulaire contenant les échantillons.
Remarque : Le programme vous demandera d’enregistrer le fichier et ensuite commencer équilibration et l’étalonnage. Ces mesures peuvent prendre jusqu'à 1 h. étapes 5 à 8 sont effectuées pendant le temps d’équilibration et d’étalonnage.
5. préparation de la retenue de Micro-tissus (jour 2)
- Sélectionnez 1 micro-tissu retenue par le cerveau qui est mesuré, plus au moins 3 pour une utilisation en tant que contrôles retenue uniquement, dans le conteneur de stockage (contient de l’éthanol à 70 %).
- Rincer les dispositifs de retenue avec l’éthanol à 70 % frais et lavez-les à l’eau désionisée 3 x 2 mn chacune, à l’aide d’un panier de maille et de la plaque 6 puits (Table des matières). Ajouter l’eau additionnelle se lave si le dispositif de retenue toujours dégage une odeur d’alcool.
- Laver les contraintes micro-tissu dans les médias de dosage et les laisser dans cette solution jusqu'à ce qu’ils sont prêts à l’emploi.
6. dissection de la Drosophila melanogaster cerveau larvaire (jour 2)
- Sélectionnez fin (errant) troisième stade larvaire d’un flacon d’élevage mouches Oregon-R à l’aide de haute précision, style 5 pincettes (0,10 x 0,06 mm2).
- Placez la larve dans le puits d’une plaque spot dissection (Table des matières) propre contenant 500 μl de PBS 1 x.
Remarque : Une plaque spot est une plaque de verre avec des dépressions, utilisé pour disséquer les organismes et les tissus des petits. - Laver la larve en le secouant doucement dans le puits, à l’aide de la pince à épiler.
- Déplacer la larve du propre puits d’une plaque spot contenant 500 μl de PBS 1 x.
- Placer la plaque en place sous le microscope à dissection.
- Saisir la larve à sa section médiane avec une paire de pincettes, tout en saisissant les crochets à œil avec une deuxième paire de pincettes.
- Doucement et régulièrement tirer la larve dans des directions opposées en utilisant les deux ensembles de pinces à épiler.
- Visualiser le cerveau, ce qui typiquement reste attaché à des crochets de le œil et seront ont couramment des disques oeil-antennaire attaché à elle.
- Retirez soigneusement les autres tissus du cerveau, à le œil des crochets pour maintenir le cerveau en place. Enfin, séparer les crochets de le œil du cerveau.
- Utiliser les pinces vers le cerveau disséqué un nouveau puits sur une plaque spot contenant 1 x PBS.
- Répétez les étapes 6.1 – 6.10 jusqu'à 14 cerveaux est disséqués.
Remarque : La durée totale depuis le début de la dissection de l’exécution de l’essai ne doit pas dépasser 30 min.
7. Ajout des cerveaux disséqués à la plaque de cellules métaboliques 96 puits Assay (jour 2)
- Ajouter 50 μL de médias de dosage dans les puits de la plaque de 96 puits métabolique dosage (Table des matières) utilisé dans l’expérience, y compris l’expérimental, le contrôle, retenue seulement et le puits de fond.
- Placer soigneusement un cerveau dans chaque puits de A8-A2 et B2-B8 de la plaque cellulaire, à l’aide de la pince à épiler, une spatule ou une pipette.
Remarque : Cela peut se faire loin le microscope à dissection. - Sous le microscope à dissection, utilisez une aiguille tordue micro-sonde pour couler le cerveau au fond du puits.
- Doucement, positionner le cerveau au milieu de trois sphères surélevés à l’aide de la sonde.
8. Ajout du Micro-tissu de restrictions à la plaque de cellules métaboliques 96 puits Assay (jour 2)
- À l’aide de pinces à épiler, placez le dispositif de retenue de micro-tissu sur le bord de la plaque de test bien et utiliser le microscope pour vérifier qu’il est orienté avec l’anneau en plastique vers le bas et le maillage sur le dessus.
- Retirer la plaque sous le microscope et utiliser des pinces pour saisir la retenue des deux côtés, puis déposez-le doucement dans le puits.
- Utiliser une aiguille tordue micro-sonde à enfoncer le dispositif de retenue dans le puits.
- Sous le microscope, vérifiez que le cerveau peut être vu à travers le dispositif de retenue de tissu et qu’elle soit centrée dans le puits.
- Répétez les étapes 8.1 à 8.4 pour tous les puits qui seront dans le test — A2-A8, B8-B2 et C2-C8.
- Ajouter avec précaution 130 μL de médias de dosage à chacun de l’expérimental, le contrôle et les puits retenue uniquement.
- Vérifiez que les cerveaux et les tissus micro contraintes n'ont pas bougé lors de l’ajout des médias en les visualisant sous le microscope.
- Ajouter 180 μL de médias de dosage dans les puits les quatre angles pour servir de contrôle de fond.
9. Ajout de la plaque cellulaire à l’analyseur métabolique et le début de l’essai (jour 2)
- Vérifiez que l’équilibration et l’étalonnage sont faites en attendant que le logiciel demander la plaque de la cellule contenant l’échantillon.
- Sélectionnez « Ouvrez le bac » et attendre que l’instrument éjecter la plaque de l’utilitaire.
- Retirer la plaque de l’utilitaire et ajouter la plaque cellulaire, sans couvercle, dans la même orientation.
- Sélectionnez « Load Cell Plate » pour l’instrument à prendre à la plaque cellulaire et fermer le tiroir et avant de commencer le test.
- Découvre les mesures en temps réel avec des barres d’erreur sur l’écran de l’ordinateur exécutant le logiciel.
- Retirer la cartouche et éjecté plaque cellulaire lorsque le test est terminé.
NOTE : Paires de cartouches et plaques cellulaires peut être ré-utilisé 5 x.
10. après mesure analyse (jour 2)
- Un microscope à dissection permet de vérifier que les cerveaux et les contraintes de micro-tissus sont toujours positionnés correctement dans le puits une fois l’analyse terminée. Exclure tout puits présentant des anomalies de l’analyse.
- Exporter le taux de consommation d’oxygène (OCR) et les données de taux d’Acidification extracellulaire (ECAR) pour une analyse ultérieure.
Representative Results
Le protocole présenté ici requiert l’utilisation de moyens de contention micro-tissu répondant aux spécifications décrites ci-dessous. Utiliser d’autres méthodes pour contenir le cerveau en place au bas de la plaque de 96 puits cellulaire ont échoué (Figure 2 a et 2 b). Tout d’abord, divers acteurs pour augmenter l’adhérence du tissu à la plaque ont été testés. Un adhésif de tissu disponible dans le commerce (Table des matières) est recommandé pour l’utilisation de cellules et d’organoïdes avec plaques de la cellule et sphéroïde, respectivement. Au départ, cerveaux semble adhérer à la surface du bien ; Toutefois, les relevés de consommation (OCR) oxygène étaient faibles, et observant les puits après l’essai a révélé que le cerveau n’était n’est plus attaché à la surface bien (Figure 2 a). Les mêmes résultats ont eu lieu avec la colle superbe (Figure 2 a). Ensuite, petits écrans pour contenir le cerveau dans une petite chambre au fond du puits a été tentée de fabrication (Figure 2 b).
Des écrans métalliques produites hautes lectures OCR seuls, comme l’a fait en métal écrans avec un anneau de polymère maintenant l’écran en place (Figure 2 b). Filets de maille en plastique a été utilisé avec la même bague de polymère. Ce dispositif a causé une lecture OCR négative à obtenir. Enfin, micro-tissu restrictions ont été conçues à l’aide d’un polymère inerte pour l’anneau de mesurer un diamètre extérieur de 0,146 0.1335 dans, une épaisseur de 0,0125 dans de diamètre intérieur, et une hauteur de 0,016 po (Table des matières). Super colle (Table des matières) a été utilisée pour relier l’anneau à une maille en nylon avec une taille de pores spécifique de 0,0039 en diamètre (Table des matières). La taille des pores est critique, car il permet l’échange de médias et métabolite sans formation de bulles d’air, et pourtant toujours agit comme une barrière à la cervelle. Ces restrictions lui seules entraînent peu à aucune OCR lecture et lorsqu’il est utilisé avec des cerveaux, permettent des lectures reproductibles (Figure 2 a et 2 b). La vérification après que l’essai a montré que le cerveau était toujours correctement positionné dans les puits. Ces restrictions tissulaires ne sont actuellement pas disponibles dans le commerce mais peuvent être fabriquées en suivant la spécification ci-dessus. Même si cela nécessite la fabrication précise, la plupart des magasins de machine sera capables de reproduire cette contrainte en utilisant les matériaux mentionnés ci-dessus.
Le protocole a été optimalisé pour expliquer les médias de l’essai, le délai avant l’exécution de l’essai et la température (Figure 3). Au départ, dosages ont été mis en place dans le milieu de Schneider pour modéliser l’environnement larvaire en vivo . Cependant, le support utilisé ne peut pas contenir des agents de mise en mémoire tampon puisque pH sert à mesurer l’ECAR. Ce média, par conséquent, doit être personnalisé fait, qui est coûteux. Pour optimiser cela, un média de test disponible dans le commerce destiné à l’analyse métabolique (Table des matières) a été utilisé à la place des médias de Schneider. Les niveaux de l’OCR n’avaient pas changé, même lors de l’augmentation du taux de glucose légèrement aux conditions du milieu d’essai modèle (Figure 3 a). Tous les essais à partir de ce moment ont été menées dans le milieu. Les suppléments aux médias ont été optimisées en observant si la consommation d’oxygène et le taux d’acidification extracellulaire ont montré une réponse lorsque traités avec des inhibiteurs connus de mitochondries. Ensuite, le temps d’attente entre les dissections et les pistes d’essai a été analysé. Une incubation de 3 h a chuté significativement les niveaux de l’OCR (Figure 3 b). Figure 3D montre la différence au sixième point de temps, c'est-à-dire lorsque les niveaux de l’OCR et ECAR stabilisent pour les adultes et les larves des cerveaux. Le protocole indique donc, pour commencer le test qui suit immédiatement les dissections, à moins que l’expérience exige une équilibration de la température, dans lequel cas une incubation pendant moins de 30 min est suggéré. L’analyseur métabolique est stocké dans une étuve réglée à 11 ° C afin de permettre une température de 25 ° C tout au long de l’essai. Si les températures sont élevées en raison de la température ambiante et le fonctionnement de l’appareil, des niveaux réduits de OCR sont observés (Figure 3). C’est possible pour être en raison de la mort des tissus.
Lorsque les conditions optimisées sont suivies, les essais avec les larves et les adultes brains résultat dans lectures de OCR légèrement supérieure à 150 pmol/min à la stabilisée fois sixième point, ~ 25 min dans l’essai (Figure 4 b). Ce taux est maintenu pendant au moins 30 min (Figure 4 a) et jusqu'à 2 h (données non présentées). L’ECAR est légèrement inférieure dans le cerveau adulte que dans les cerveaux de larves au point du sixième temps (Figure 4) et est maintenu pendant au moins 30 min (Figure 4). Cette constatation correspond à une augmentation de la glycolyse pendant les stades larvaires pour soutenir la croissance. Une injection avec un inhibiteur de mitochondries, tels que l’oligomycine, abaisse la lecture OCR pour révéler la respiration de l’ATP-dépendante et autre traitement avec roténone et l’antimycine A réduit l’OCR pour révéler la consommation d’oxygène non-mitochondriale (Figure 5 a ). Ces données montrent que ces inhibiteurs sont capables de pénétrer le tissu cérébral et peuvent être utilisés pour comparer la respiration mitochondriale dans les cerveaux des génotypes différents. Pour ce test, le mélange, attendre, et temps de mesure ont été optimisées en observant les niveaux d’oxygène, pas le taux de consommation et en veillant à ce que le mélange, le niveau d’oxygène rétablies au niveau avant la mesure.
Figure 1 : une représentation schématique du cerveau larvaire OCR ECAR mesures et dans l’analyseur métabolique. La cartouche est préparée un jour avant d’exécuter le test. Le lendemain, médicaments sont ajoutés aux ports d’injection de la cartouche. D. melanogaster cerveau larvaire est disséqués et micro-tissu restrictions sont ajoutées pour garantir le cerveau au fond du puits. La plaque cellulaire avec le cerveau est analysée dans l’analyseur de métabolique et les données sont analysées. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Micro-tissu restrictions ne sont pas actives métaboliquement et tiennent le cerveau dans une chambre au fond d’une assiette bien. (A) The OCR des cerveaux larvaire de Oregon-R D. melanogaster est mesurée dans les puits recouvert d’adhésif de tissu (Table des matières) ou lorsque les cerveaux sont super collées au fond du puits. Les résultats sont comparés à ceux des cerveaux positionné au fond du puits à l’aide de micro-tissu restrictions. (B) The OCR est mesurée dans les puits contenant des médias de dosage et métal, métal avec un anneau de polymère, filet maille en plastique et un anneau de polymère ou micro-tissu restrictions. p-valeur < 0,05, ** p-valeur < 0,01, *** p-valeur < 0,001, *** p-valeur < 0,0001. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : optimisation des médias, le temps d’incubation et la température. (A) The OCR est mesurée en Oregon-R D. melanogaster cerveaux larves à l’aide de médias Schneider (S2) avec pyruvate de sodium ajouté, S2 avec le glucose et le pyruvate de sodium ajouté et médias de dosage avec pyruvate de sodium et de glucose ajouté. (B) The OCR est mesurée dans les cerveaux de larves après 3 h d’incubation avant l’essai, ou après 30 min d’incubation avant l’essai. (C) The OCR est mesurée dans les cerveaux de larves à l’épreuve des températures de 33 ° C et 25 ° C. Le sixième point de temps est sous forme graphique. (D) l’OCR est mesurée dans les cerveaux de larves après 3 h d’incubation avant l’essai, ou après 30 min d’incubation avant l’essai. Les données sont rapportées pour le sixième point de temps. p-valeur < 0,05, ** p-valeur < 0,01, *** p-valeur < 0,001, *** p-valeur < 0,0001. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : L’OCR et ECAR sont reproductibles mesurées chez les adultes et les larves d. melanogaster cerveaux. (A) The OCR est mesuré dans le cerveau adulte et larvaire de Oregon-R D. melanogaster pour 30 min. (B) données de l’OCR du sixième temps point du groupe A sont sous forme graphique. C’est le point de temps au cours de laquelle la lecture OCR stabilise. (C) l’ECAR est mesuré dans le cerveau adulte et larvaire de d. melanogaster pour 30 min. (D) données de l’ECAR du sixième temps point de panneau A sont sous forme graphique. C’est le point de temps au cours de laquelle les lectures ECAR stabilisent. p-valeur < 0,05, ** p-valeur < 0,01, *** p-valeur < 0,001, *** p-valeur < 0,0001. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : L’oligomycine abaisse les niveaux de cerveau larvaire OCR de d. melanogaster pour révéler la respiration ATP-dépendante, et roténone / l’antimycine une autre abaisse l’OCR pour révéler la consommation d’oxygène non-mitochondriale. (A) The OCR est mesurée en Oregon-Rd. melanogaster cerveaux larves après un traitement avec un mélange de roténone / l’antimycine A de 5 µM et le µM oligomycine 20. Le contrôle et la seule retenue puits ont été injectés avec les médias de dosage. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Discussion
Ici, une nouvelle méthode pour l’analyse métabolique de d. melanogaster cerveau larvaire et adulte ex vivo est décrite. Dans des conditions basales, la consommation d’oxygène et le taux d’acidification extracellulaire indiquent comment métaboliquement active le cerveau est et peut déterminer si un tissu est devenu plus dépendant des mitochondrial contre glycolytique respiration, respectivement11.
Traiter le cerveau avec des inhibiteurs ou des médicaments thérapeutiques peut fournir plus d’informations sur l’état métabolique du tissu. Substrats métaboliques peuvent également être ajoutées pour déterminer les dépendances sur les métabolites spécifiques, tels que le glucose pour tester la Warburg effet22 ou la glutamine pour enquêter sur glutaminolyse23— les deux communes en reprogrammation métabolique. Pour les études à long terme, des larves ou des mouches pourraient également être nourris médicaments au lieu d’utiliser les ports de l’injection, et cerveau pouvait être dosés à intervalles ou à la fin, selon le protocole expérimental. Cette méthode peut être optimisée pour de nombreuses applications.
Cette méthode a été optimisée pour le cerveau mais peut être utilisée pour analyser les autres larves18 et les tissus adultes. En outre, autres systèmes de petits modèles peuvent utiliser cette méthode pour mesurer toute organismes18 ou tissus. La seule limitation à l’optimisation de cette méthode pour d’autres systèmes est la taille de l’organe, tissu ou l’organisme. La chambre créée par le dispositif de retenue de micro-tissu est la barrière de taille à l’exécution de l’essai. Si la sortie métabolique est trop faible pour le cerveau ou les tissus mis à l’essai et la taille de l’échantillon n’est pas une contrainte, la mise en commun des échantillons peut être utilisé afin d’accroître les mesures de dosage et de la sensibilité. Modifier ce protocole pour d’autres applications devrait seulement exigent des optimisations mineures, y compris 1) choisir la mesure appropriée et mélanger nombre de cycle et le calendrier et 2) Détermination des concentrations de traitement efficace pour les tissus. La mesure et l’époque mélange ont été déterminées par la concentration en oxygène mesurée par l’analyseur métabolique au cours de chaque cycle de surveillance. Ceci peut être vu en sélectionnant O2 dans le bouton d’axe Y2 dans la fenêtre d’aperçu, après que la série est terminée. Au cours de chaque cycle, il devrait y avoir une concentration d’oxygène encastrée reflétant la consommation d’oxygène du tissu pendant le temps chronométré, suivie d’un retour à la concentration en oxygène initiale durant le cycle d’agitation. Les temps de mélange et de mesure doivent être testées jusqu'à ce que cette tendance est observée. En utilisant cette méthode, les autres insectes cerveaux ont été étudiés. Ces cerveaux était plus gros que le cerveau de mouche utilisée ici mais toujours d’entrer dans la chambre générée par le dispositif de retenue de tissu. Les lectures de l’OCR de ces cerveaux étaient aussi élevées que 400 pmol/min (données non présentées). Les résultats de ces études, ainsi que les taux d’OCR qui s’harmonisent avec les autres études qui mesurent les volée tout oxygène consommation18,24, suggèrent que le cerveau de d. melanogaster n’était pas limitées en oxygène. Pour les cerveaux de d. melanogaster et tissus provenant d’autres organismes, en appliquant cette méthode nécessite une attention particulière aux quatre étapes critiques.
Pour réaliser avec succès des mesures reproductibles et biologiquement pertinentes, il y a des étapes critiques du protocole qui doivent être suivies. Tout d’abord, l’utilisation d’un dispositif de retenue de micro-tissu est requise pour cette méthode. Il est essentiel de fabrication de ces contraintes en utilisant les spécifications et le matériel énuméré. Les matériaux ont été choisis en raison de leur composition chimique inerte et leur capacité à permettre l’échange de médias appropriés durant les étapes de mélange sans la création de bulles d’air. En second lieu, une préparation en temps opportun de la dissection et la plaque est nécessaire pour maximiser la production métabolique du tissu. Temps de dissection court ne devraient pas limitent de façon importante le cerveau. D’autres études ont montré que mouche cerveaux peut rester vivantes pendant des heures pour jours après dissection si entreposé dans une perfusion de chambre25. Toutefois, comme on le voit dans la Figure 3 b et 3D, si les cerveaux restent assis dans les médias de dosage pendant de longues périodes de temps avant l’essai, les taux de consommation d’oxygène sont diminuées. Pendant le test, les échantillons subissent un mélange pas au cours de chaque cycle. Ce mélange non seulement le sida avec les injections de composés chimiques, mais agit aussi pour recycler les médias et fournir de l’oxygène. Les cerveaux sont en mesure de rester métaboliquement actives plus longtemps au cours de ces cycles de mesure-mix qu’ils pourraient être en incubation dans les médias sur la paillasse. Par conséquent, la dissection du cerveau larvaire devrait être maîtrisée avant de commencer à mettre en place ce test. Lorsque la mise en place de cet essai, analyser un petit nombre de génotypes à un moment, pour réduire le nombre de cerveaux nécessaires et puits utilisés. Cela évitera les retards entre la dissection et les mesures d’essai. En troisième lieu, maintenir une température stable est nécessaire pour analyser le taux de métabolisme dans des conditions physiologiques pertinentes. Températures d’essai accrue peuvent causer la mort de tissu, observée par le plus faibles taux de consommation d’oxygène (Figure 3). Si les mouches sont élevés à une température différente à des fins expérimentales, les mesures devraient également être effectuées à cette température. Alors que les dissections seront très probablement exécutées à température ambiante, si l’essai sera effectué à une température différente, le cerveau plaqué et de retenue doit être incubé à la température requise pendant 15 min avant d’exécuter le test. Enfin, observant le post-test puits est essentiel pour déterminer si le positionnement du tissu affecté les mesures. Parfois, il y aura une valeur aberrante bien que, après avoir observé la plaque sous le microscope à dissection, peut être éliminée de l’analyse des données en raison d’une perte de tissu ou de mispositioning, où le cerveau a glissé hors du centre du puits et qu’il est coincé sous l’anneau de polymère de la contrainte. Le tissu peut être perdu si la restriction n’était pas correctement arrimée dans le puits et a été perturbée pendant les cycles de mélange. Alors qu’aucun de ces événements se produit souvent, si elles ne sont pas exclues de l’analyse, ils feront baisser substantiellement les valeurs de taux.
La mesure de l’ensemble des tissus de flux métabolique par suivi de consommation d’oxygène et de l’acidification extracellulaire fournit une méthode biologiquement pertinente pour comprendre comment le métabolisme est altéré par le paysage génétique ou autres conditions expérimentales. Cette méthode est assez sensible pour détecter des changements métaboliques dans un seul cerveau de d. melanogaster , ce qui n’est pas possible à l’aide de respirométrie coule-stop ou calorimétrie indirecte. Il est également moins techniquement difficile que d’utiliser une électrode de Clark pour mesurer la consommation d’oxygène. Un autre avantage de ce protocole est la capacité d’analyser un cerveau entier par puits. Le format 96 puits permet des lectures plus sensibles, et ainsi, plus d’un génotype peut être analysé à la fois en raison du plus petit nombre d’échantillons requis par test. Alors que la mesure du métabolisme dans le tissu est toujours difficile et nécessite soigneusement élevés et animaux synchronisés, ce protocole décrit une méthode rapide et relativement simpliste et a le potentiel pour analyser les nombreuses sensibilités métaboliques en D. melanogaster cerveau larvaire et adulte.
Disclosures
M. Tipping est titulaire d’un brevet provisoire pour les micro-tissu restrictions décrits dans le présent protocole17.
Acknowledgments
Les stocks provenant de la drosophile Bloomington Stock Center (NIH P40OD018637) ont été utilisées dans cette étude. La recherche rapportée dans cette publication a été soutenue par le réseau Institutional Development Award (IDeA) pour l’Excellence de la recherche biomédicale de la National Institute of General Medical Sciences, de la National Institutes of Health, sous le numéro de licence P20GM103430 et par la Fondation d’île de Rhode. Auteurs remercient J. Waters et P. Snodgrass-ceinture pour leur soutien dans l’élaboration de ce protocole.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Assay medium | Agilent | 102365-100 | |
| Calibrant solution | Agilent | 100840-000 | |
| Corning Cell-Tak Cell Tissue Adhesive | Sigma Aldrich | DLW354240 | |
| delrin | Grainger | 2XMK6 | |
| Drosophila Schneider Media | Thermo Fisher | 21720-024 | |
| Dumont High Precision Tweezers (style 5) | Ted Pella | 5622 | |
| Loctite 409 | Amazon | ||
| Mitostress kit | Agilent | 103015-100 | oligomycin, rotenone, and antimycin A included |
| Netwell inserts (6-well) | VWR | 29442-136 | |
| nylon mesh | Component Supply | U-CMN-64 | |
| Parafilm M wrapping film | Fisher Scientific | S37440 | |
| PYREX spot plate | Fisher Scientific | 13-748B | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | ||
| Wave v2.4 XFe96 analyzer software | Agilent | https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/software-download-for-wave-desktop | free download to mac or windows |
| XFe96 catridge and cell plates | Agilent | 102416-100 |
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