Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

التحليل الأيضي اليرقات melanogaster المورفولوجية و "العقول الكبار"

Published: August 7, 2018 doi: 10.3791/58007
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biology, Providence College

Summary

نقدم بروتوكولا لقياس استهلاك الأوكسجين وتحمض خارج الخلية في العقول melanogaster المورفولوجية اليرقات والكبار. ويستخدم هو محلل ايضية مع بروتوكولا مدروسا والأمثل. القيود الأنسجة الدقيقة هي عنصر حاسم لهذا البروتوكول وصممت وأنشئت خصيصا لاستخدامها في هذا التحليل.

Abstract

ويصف هذا البروتوكول وسيلة لقياس التمثيل الغذائي في العقول melanogaster المورفولوجية اليرقات والكبار. التحديد الكمي للتمثيل الغذائي في الأجهزة كلها توفر فهم مستوى الأنسجة لاستغلال الطاقة التي لا يمكن التقاطها عند تحليل خطوط الخلايا والخلايا الأولية. أن هذا التحليل السابقين فيفو، فإنه يسمح لقياس عدد من الخلايا المتخصصة التي تعمل معا لأداء وظيفة في نسيج واحد وأوثق نماذج الجهاز في فيفو . وقد لوحظ إعادة برمجة التمثيل الغذائي في العديد من الأمراض العصبية، بما في ذلك نيوبلسا، وأمراض الأعصاب. تم تطوير هذا البروتوكول لمساعدة الطائفة melanogaster دال- التحقيق في الأيض في الأمراض العصبية نماذج استخدام محلل ايضية متاحة تجارياً. قياس التمثيل الغذائي للعقول كلها في محلل الأيضية يمثل تحديا بسبب الشكل الهندسي للدماغ. ويتطلب هذا المحلل عينات تبقى في الجزء السفلي من لوحة 96-جيدا. عينات الخلايا والأنسجة اللكمات يمكن التمسك بسطح لوحة الخلية أو استخدام ألواح كروي، على التوالي. ومع ذلك، شكل العقول melanogaster دال- كروي، ثلاثية الأبعاد يمنع الأنسجة من الانضمام إلى اللوحة. ويتطلب هذا البروتوكول النفس الأنسجة الدقيقة المصممة خصيصا والمصنعة التي تلتف هذه المشكلة عن طريق منع أي حركة للدماغ بينما لا يزال تسمح القياسات الأيضية من مجسات استشعار الحالة الصلبة اثنين محلل. استهلاك الأوكسجين ومعدلات تحمض خارج الخلية يتم استنساخه والحساسة لعلاج بمثبطات الأيض. مع طفيفة تحسين، يمكن تكييفها للاستخدام مع أي أنسجة كاملة و/أو النظام النموذجي، هذا البروتوكول شريطة أن لا يتجاوز حجم العينة الدائرة المتولدة عن ضبط النفس. بينما يرد القياسات الأيضية القاعدية وتحليل بعد علاج بمثبطات الميتوكوندريا داخل هذا البروتوكول، يمكن استجواب عدد لا يحصى من الظروف التجريبية، مثل تفضيل مصدر الطاقة، والبيئة، وتربية.

Introduction

تم التعرف على برمجة التمثيل الغذائي في العديد من الأمراض العصبية، بما في ذلك عديدة الأشكال Glioblastoma (GBM)، ومرض هنتنغتون، واضطراب الاكتئاب الرئيسي (MDD)2،،من13. كما الأيض ويصبح محور الاستراتيجيات العلاجية، أدوات للبحوث الأيضية الأساسية قد متقدمة. ومع ذلك، صممت معظم هذه الأساليب لدراسة خطوط الخلايا والخلايا الأولية أو لتحليل الأنسجة أكبر بعد انتهاء التثبيت أو-تجميد. لقد اعتمدت بعض النهج على مجموعات ننجرف قياس نواتج الأيض محددة، بينما البعض الآخر استخدمت تحليلات أكثر تكلفة وتعقيداً استخدام الفصل اللوني في تركيبة مع الطيف الكتلي4 لنفس الهدف. لفهم المشهد الأيضية أكبر، الأيضية التنميط5،6 وتحليل تدفق الأيضية (وزارة الخارجية)7 ظهرت استكمالا للبروتين على نطاق واسع والدراسات الجينية. التنميط يوفر تمثيل كمي لنواتج الأيض في الخلايا أو الأنسجة في نقطة واحدة في الوقت المناسب، بينما ترتيب المنسوجات المتعددة الألياف ويتوسع هذا بالسماح بتتبع والايضات المسمى على مر الزمن. هذه الأخيرة كانت مفيدة في الكشف عن كيفية استخدام مصادر الطاقة بشكل مختلف في خلية أو الأنسجة عندما تكون في حالة المرض8. ومع ذلك، لا تتضمن هذه الأساليب بقياس معدل الأيض عموما.

يمكن استجواب الدولة الأيضية الشاملة للنظم النموذجية الصغيرة، المستخدمة لقياس استهلاك الأوكسجين أو تكوين من أجل وقف تدفق ريسبيروميتري، إلى الأساليب التقليدية، مثل كلارك قطب9 و10من القياس غير المباشر، قياس الأوكسجين وتركيز ثاني أكسيد الكربون، على التوالي. هذه التقنيات، بينما توفر دقة نظرة ثاقبة قراءات لإعادة برمجة التمثيل الغذائي على مستوى الكائن، لها حدود. يمكن أن يكون تحديا من الناحية التقنية استخدام مسرى كلارك وليست مصممة للدراسات الفائق. لا يمكن أن تعمل وقف تدفق ريسبيروميتير بالحساسية المطلوبة للاعتداء الخلايا أو الأنسجة. منذ عدة سنوات، وتكنولوجيا جديدة وضعت خصيصا لهذه التطبيقات الصغيرة11. في البداية صممت هذه الأدوات لقياس استهلاك الأوكسجين وتحمض خارج الخلية من خطوط الخلايا والخلايا الأولية في شكل جيد 24 أو 96. بساطة الإخراج الإنشاء والبيانات المنشأة بهذا الأسلوب كبديل للنهج التقليدية. وهذه المنهجية أداة قوية للخلايا، وأتاحت التطورات الحديثة لقياس الأنسجة اللكمات12،،من1314. ومع ذلك، لا تسمح الأساليب المستخدمة في هذه الاختبارات لقياس أجهزة كاملة من نظم نموذجية صغيرة.

غالباً ما ينطوي على تحليل نماذج الأمراض الأيضية التفاعل بين الخلايا المتخصصة وظيفة المقيمين داخل النسيج نفسه. على سبيل المثال، تنتج الخلايا الدبقية والايضات تستخدمها الخلايا العصبية. هذه التفاعلات الأيضية مطلوبة ل بقاء الخلايا العصبية15. نظم نموذجية صغيرة مفيدة للتحقيق في مسائل كهذه. دراسات لقياس التمثيل الغذائي لجهاز كامل، التي تحتوي على مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا، إضافة إلى فهم استخدام الطاقة في الجسم الحي. مؤخرا، بيكر وآخرون عن طريقة لقياس استهلاك الأوكسجين في أسرة يطير رؤساء16. بتجميع عدد من رؤساء معا في بئر واحدة من صفيحة خلية 24-حسنا، تم الحصول على قراءات استهلاك الأوكسجين استخدام محلل ايضية. بينما هذا يعمل بشكل جيد للرؤساء، الذي يتم فصله بسهولة من الجسم، أنها أصعب بكثير ﻻستخدام أجهزة مثل اليرقات العقول، لأنه يحتاج إلى كمية كبيرة أن تشريح لهذا الأسلوب. ولذلك، وضعت طريقة استخدام لوحة خلية 96-جيدا، مما يزيد من حساسية لاستهلاك الأوكسجين وقراءات تحمض خارج الخلية، للاعتداء في المخ يرقات أسرة واحدة.

محلل الأيضية المستخدمة في هذه الدراسة يتطلب العينة يتم قياسه بالبقاء في الجزء السفلي من لوحة خلية 96-جيدا جيدا. للخلايا والأنسجة المسطحة نسبيا، وهذا ليس تحديا؛ ومع ذلك، للعقول ميلانوجاستير دال- اليرقات والكبار، من غير الممكن استخدام بروتوكولات طلاء اللوحة التقليدية. كروية الشكل ثلاثي الأبعاد للعقول لا تلتزم موثوق بها على سطح اللوحة، وتلك التي تفعل كثيرا ما تضررت أثناء محاولة وضعها بشكل صحيح في البئر. هو جزء هام من هذا البروتوكول الجديد تصميم وتطوير القيود الأنسجة الدقيقة17 التي توفر غرفة صغيرة للدماغ للإقامة بدون التدخل مع القياسات الأيضية. الدائرة التي تم إنشاؤها بحوالي 0.016 في ارتفاعها وتوفر مساحة كافية لاستيعاب العديد من ميلانوجاستير دال- العقول بسهولة. القيود التي تتكون من شبكة النايلون يعلق على عصابة بوليمر خاملة، وستناقش كذلك في نتائج الممثل. باستخدام هذه القيود يقلل من الوقت اللازم لإعداد العقول تشريح لقياس التمثيل الغذائي. تحسين إجراءات قياس يولد معدلات تحمض خارج الخلية واستهلاك الأوكسجين مطرد واستنساخه بعد ست دورات القياس (من 25 دقيقة). العقول تبقى أيضي نشطة في ظل هذه الظروف للحد أدنى من ح 2، التي تمكن الحقن للتداوي، ومثبطات، أو أخرى العلاجات عبر منافذ توصيل المخدرات خرطوشة محلل الأيضية. هذا البروتوكول يمكن تكييفها بسهولة للأنسجة ونموذج صغير نظم18الأخرى أيضا.

البروتوكول بالتفصيل أدناه توضح كيفية الاعتداء باستهلاك الأوكسجين في دماغ المورفولوجية يرقات كاملة عندما تحدت مع الإجهاد المتقدرية. أن أشدد على الدماغ، يتم إضافة أوليجوميسين إلى تمنع ال ATP synthase19. ويبين الانخفاض في استهلاك الأوكسجين من القراءات القاعدية قياس كمية ATP يعتمد التنفس في الدماغ. مزيدا من الانخفاضات في استهلاك الأوكسجين بعد العلاج مع والروتينون20 و21أنتيميسين ومثبطات لمجمعات سلسلة نقل الإلكترون الأول والثالث، على التوالي، تبين مقدار استهلاك الأوكسجين غير المتقدرية في الدماغ. هذا التحليل هو قد يمكن مقارنة مثال واحد كيف المتقدرية التنفس في المخ يطير وكيف يمكن استخدام هذا البروتوكول لمقارنة الأيض في الأنماط الوراثية متفاوتة. ومع ذلك، يمكن تكييفها هذا البروتوكول لقياس استهلاك الأوكسجين ببساطة القاعدية ومعدلات تحمض خارج الخلية، فضلا عن تصميم دراسات أكثر تفصيلاً التحقيق في استغلال الطاقة محددة أو فرضيات استخدام الركيزة.

Protocol

1-فحص إعداد (اليوم الأول)

  1. ضع محلل الأيضية (جدول المواد) في حاضنة أو غرفة التحكم في درجة الحرارة لتعيين إلى 11 درجة مئوية.
    ملاحظة: درجة حرارة هذا يعتبر مثاليا للقياسات التي اتخذت عند 25 درجة مئوية، كما أنه يسمح للتقلب ~ 14 درجة مئوية درجة الحرارة التي تحدث أثناء تشغيل في التحليل. يحدث هذا بسبب الحرارة المتولدة عن الصك أثناء التشغيل.
  2. قم بفتح البرنامج المناسب على الكمبيوتر المرفق بمحلل الأيضية. انقر فوق درجة حرارة العددية في الجانب الأيسر السفلي من الشاشة. في الإطار الجديد الذي يتم فتحه، انقر فوق المربع بجانب الأمر "سخان في" والتأكد من ظهور علامة الاختيار. ضبط درجة الحرارة إلى 25 درجة مئوية، وضبط نطاق التسامح إلى 0.2 درجة مئوية باستخدام الأسهم.
    ملاحظة: عدة ساعات مطلوبة لتحقيق درجات الحرارة مستقرة.
  3. فتح حاوية خرطوشة (جدول المواد) وإزالة الخرطوشة من لوحة الأداة المساعدة دون لمس التحقيقات.
    ملاحظة: لوحة الأداة المستخدمة أثناء معايرة الخرطوشة ولا يستخدم أثناء تشغيل الفحص الأيضي.
  4. إضافة 200 ميكروليتر من حل كاليبرانت (جدول المواد) إلى لوحة الأداة ومكان خرطوشة مرة أخرى على رأس لوحة الأداة المساعدة ترطيب الاستشعار يسبر على الخرطوشة. لا تلمس التحقيقات وحمايتهم من الضوء.
  5. ختم الخرطوشة مع الفيلم البارافين.
  6. احتضان خرطوشة بين عشية وضحاها في 25 درجة مئوية.

2-تحليل وسائل الإعلام إعداد (اليوم 2)

  1. إضافة الجلوكوز 10 مم و 10 مم بيروفات صوديوم إلى المتوسطة المقايسة.
  2. احتضان المتوسطة عند 25 درجة مئوية حتى السائل وقد اكويليبراتيد إلى درجة الحرارة هذه.
  3. قم بضبط ال pH إلى 7.4 باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني.

3-إعداد البرامج "التحليل الأيضي" للعقول melanogaster المورفولوجية (2 يوم)

  1. إعداد البرنامج الأيضي في محلل الأيضية المستخدمة في الخطوة 1.2.
  2. حدد "قالب" في شاشة البرنامج الرئيسية.
  3. انقر نقراً مزدوجاً فوق "فارغ" لبدء تصميم اختبار جديد.
  4. انقر فوق الزر "خريطة لوحة" في شريط الأدوات أعلى لعرض تصميم لوحة فحص الخلية.
    ملاحظة: لوحة المقايسة خلية تحتوي على عينات المخ وسوف يتم ازدواج مع الخرطوشة قبل بداية الفحص الأيضي تشغيل.
  5. انقر فوق إضافة مجموعات زر 3 x.
    1. انقر نقراً مزدوجاً فوق التسمية "مجموعة 1" وإعادة تسميته إلى "التجريبية".
      ملاحظة: سوف تحتوي هذه المجموعة على المخ يطير وضبط النفس الصغيرة-الأنسجة تعامل مع المخدرات.
    2. انقر نقراً مزدوجاً فوق التسمية "مجموعة 2" وإعادة تسميته إلى "السيطرة".
      ملاحظة: سوف تحتوي هذه المجموعة على المخ يطير والأنسجة الدقيقة ضبط النفس مع لا العلاج من تعاطي المخدرات.
    3. انقر نقراً مزدوجاً فوق "مجموعة 3" تسمية وإعادة تسميته إلى "النفس فقط".
      ملاحظة: تحتوي هذه المجموعة على ضبط النفس الأنسجة الدقيقة دون أي العقول أو العلاج من تعاطي المخدرات.
  6. تعيين الآبار لكل مجموعة استناداً إلى حيث يراد بها توضع العينات في لوحة الخلية.
    1. انقر فوق التسمية "التجريبي" وثم تسليط الضوء على الآبار B2-B8 على خريطة اللوحة.
    2. انقر فوق التسمية "السيطرة" وثم تسليط الضوء على الآبار C2-C8 على خريطة اللوحة.
    3. انقر فوق "تسمية فقط'' ضبط النفس، ومن ثم تسليط الضوء على الآبار D2-D8 على خريطة لوحة.
    4. تحقق من أن كافة الزوايا الأربعة (A1 و A12، H1 و H12) تم تعيينها كخلفية.
      ملاحظة: لا تستخدم الآبار على طول محيط اللوحة للحد من أي تأثيرات الحافة. هذا إعداد افتراضي في البرنامج.
  7. انقر فوق الزر "البروتوكول" في شريط الأدوات أعلى لإعداد البروتوكول.
    1. انقر فوق تفاصيل القياس "تحرير" في مربع قياس خط الأساس.
    2. ضبط الوقت أن محلل الأيضية سيتم قياس الدماغ عن طريق تغيير التدبير القاعدية دورة الوقت إلى "03:00" بواسطة النقر فوق الأعلى وأسفل السهام.
    3. ضبط الوقت الذي سوف ننتظر محلل الأيضية بين القياسات الدماغ عن طريق تغيير الانتظار القاعدية دورة الوقت إلى "0:00" بواسطة النقر فوق الأعلى وأسفل السهام.
    4. ضبط الوقت الذي سوف مزيج محلل الأيضية وسائل الإعلام قبل قياس الدماغ عن طريق تغيير القاعدية مزيج دورة الوقت إلى "01:00" بواسطة النقر فوق الأعلى وأسفل السهام.
    5. ضبط إجمالي عدد دورات القاعدية، الذي يشمل التدبير، والانتظار، ودورات ميكس، إلى "7" بواسطة النقر فوق الأعلى وأسفل السهام.
      ملاحظة: يتم الحصول على قياسات "معدل استهلاك الأوكسجين" مستقرة بعد ~ 25 دقيقة من بداية المقايسة.
    6. انقر فوق الزر "إضافة حقن"، الموجود في شريط الأدوات الأيسر العلوي.
    7. انقر على "تسمية حقن" وتغييره إلى "أوليجوميسين".
    8. ضبط قياس حقن والانتظار، وأوقات المزيج بحيث تتطابق مع تلك المتعلقة القاعدية.
    9. ضبط إجمالي عدد دورات الحقن إلى "6" عن طريق النقر فوق الأعلى وأسفل السهام.
    10. كرر الخطوات 3.7.6-3.7.8 ولكن تغيير التسمية إلى "تعفن/AA" وضبط إجمالي عدد دورات الحقن إلى 7 بواسطة النقر فوق الأعلى وأسفل السهام.
    11. انقر فوق الزر "تشغيل فحص" في شريط الأدوات أعلى.
    12. "حفظ" المقايسة والبدء في إعداد المقايسة خرطوشة (جدول المواد).

4-إعداد الخرطوشة للمعايرة (اليوم 2)

  1. إزالة الخرطوشة من حاضنة 25 درجة مئوية وخلع الغطاء.
    1. إضافة 20 ميكروليتر من 100 ميكرومتر أوليجوميسين إلى ميناء صغير حقن دائرية الأيسر العلوي، المنفذ A، في الخرطوشة لآبار تجريبية كل المقابلة على لوحة الخلية وإضافة 20 ميكروليتر من مقايسة وسائط الإعلام إلى المنفذ A في جميع الآبار الأخرى، بما في ذلك الآبار الخلفية والتحكم.
      ملاحظة: يحتوي على الخرطوشة 4 منافذ (ألف – دال) لكل من الآبار 96 المقابلة للوحة الخلية ما سوف تحتوي على العينات. يتم إجراء هذه الخطوة قبل إضافة العينات. إضافة 20 ميكروليتر من 100 ميكرومتر أوليجوميسين النتائج في تركيز أوليجوميسين نهائية 10 ميكرومترات في لوحة الخلية كذلك حالما يتم حقن المخدرات واسطة محلل الأيضية. أوليجوميسين مثبطات سينثاز ATP. سوف تعكس قيمة استهلاك الأوكسجين الناتج كمية ATP المرتبطة التنفس في الدماغ. من أجل حقن المخدرات بشكل صحيح في الآبار المحدد، يجب ملء كافة المنافذ لنفس الرسالة مع نفس الحجم من السائل، حتى أن لم يكن في الاستخدام.
    2. إضافة ميكروليتر 22 من 50 ميكرومتر والروتينون/أنتيميسين A إلى المنفذ حق التعميم العلوية الصغيرة والميناء ب، في الخرطوشة لآبار تجريبية كل المقابلة على لوحة الخلية وإضافة ميكروليتر 22 مقايسة وسائط الإعلام إلى المنفذ B لجميع الآبار الأخرى، بما في ذلك الآبار الخلفية والتحكم.
      ملاحظة: هذه النتائج في نهائي والروتينون/أنتيميسين بتركيز من 5 ميكرومترات في لوحة الخلية كذلك حالما يتم حقن المخدرات واسطة محلل الأيضية. والروتينون وأنتيميسين أ مثبطات للإلكترون النقل سلسلة مجمعات الأول والثالث، على التوالي. سوف تعكس قيمة استهلاك الأوكسجين الناتج غير المتقدرية التنفس في الدماغ.
    3. انقر فوق "بدء التشغيل" لوضع خرطوشة المحملة مع لوحة الأداة المساعدة إلى محلل الأيضية مع A1 جيدا المتمركزة في الزاوية العلوية اليسرى عندما تواجه الصك، مع لوحة محمل تمتد من الجانب الأيمن من الجهاز.
  2. حدد "أنا جاهزة" في البرنامج للبدء في الموازنة ومعايرة الخرطوشة قبل بداية الفحص الأيضي مع لوحة الخلية التي تحتوي على العينات.
    ملاحظة: سيطلب البرنامج حفظ الملف ومن ثم تبدأ اكويليبراتينج ومعايرة. يمكن أن تتخذ هذه الخطوات تصل إلى 1 حاء الخطوات 5 – 8 تجري خلال فترة الموازنة والمعايرة.

5-إعداد قيود مايكرو-الأنسجة (اليوم 2)

  1. حدد 1 من ضبط النفس الأنسجة الدقيقة في الدماغ الذي يتم قياسه، بالإضافة إلى 3 على الأقل لاستخدامها كعناصر تحكم ضبط النفس فقط، من حاوية التخزين (يحتوي على الإيثانول 70%).
  2. شطف لقيود مع الطازجة 70% إيثانول وغسلها بالمياه 3 x ل 2 دقيقة بكل منها، باستخدام شبكة سلة ولوحة 6-جيدا (جدول المواد). إضافة كميات إضافية من الماء يغسل إذا كانت القيود التي لا تزال تعطي قبالة رائحة الكحول.
  3. أغسل قيود الأنسجة الدقيقة في مقايسة وسائط الإعلام وتترك لهم في هذا الحل حتى تكون جاهزة للاستخدام.

6-تشريح المورفولوجية melanogaster "العقول اليرقات" (2 يوم)

  1. حدد يرقات الطور الثالث (تجول) أواخر من قنينة من مثقف أوريغون-R الذباب باستخدام الدقة العالية، ونمط ملاقط (0.10 × 0.06 مم2) 5.
  2. ضع اليرقة في البئر لوح بقعة تشريح نظيفة (جدول المواد) التي تحتوي على 500 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني 1 x.
    ملاحظة: صفيحة بقعة صفيحة زجاج مع المنخفضات، تستخدم لتشريح الأنسجة الصغيرة والكائنات الحية.
  3. أغسل اليرقة بلطف تهتز لها بشكل جيد، باستخدام الملقط.
  4. نقل اليرقة إلى البئر نظيفة من صفيحة الموضعية التي تحتوي على 500 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني 1 x.
  5. ضع لوحة بقعة تحت مجهر تشريح.
  6. فهم اليرقة في القسم الوسطى، مع زوج واحد من ملاقط، بينما تتشبث خطاف العين مع زوج ثاني من الملقط.
  7. سحب بلطف وسلاسة اليرقة في اتجاهين معاكسين باستخدام المجموعتين من الملقط.
  8. تصور الدماغ، والتي عادة ما يبقى تعلق على خطاطيف العين وسوف عادة يكون أقراص العين باللوامس مرفقة به.
  9. بعناية إزالة أنسجة إضافية من الدماغ، واستخدام خطاف العين بعقد الدماغ في المكان. وأخيراً، فصل هوكس العين من الدماغ.
  10. استخدام الملقط لنقل تشريح الدماغ إلى بئر جديدة في لوحة موضعية التي تحتوي على برنامج تلفزيوني x 1.
  11. كرر الخطوات 6، 1 – 6، 10 حتى يتم تشريح أدمغة 14.
    ملاحظة: لا يزيد إجمالي الوقت من بداية التشريح لتشغيل الفحص 30 دقيقة.

7-إضافة للعقول تشريح للوحة خلية التحليل الأيضي 96-جيدا (2 يوم)

  1. إضافة 50 ميكروليتر مقايسة وسائط الإعلام إلى الآبار للوحة الفحص الأيضي 96-جيدا (جدول المواد) المستخدمة في التجربة، بما في ذلك التجريبية والتحكم، ضبط النفس فقط، والآبار الخلفية.
  2. بعناية وضع الدماغ واحدة في كل بئر من A2-A8 و B8 B2 من لوحة الخلية، باستخدام الملقط أو ملعقة أو ماصة.
    ملاحظة: قد يكون ذلك بعيداً عن مجهر تشريح.
  3. تحت مجهر التشريح، استخدام إبرة بنت صغيرة-تحقيقا لإغراق العقول إلى أسفل البئر.
  4. بلطف ضع الدماغ في منتصف ثلاثة مجالات التي آثارها استخدام المسبار.

8-إضافة قيود الأنسجة الدقيقة للوحة خلية التحليل الأيضي 96-جيدا (2 يوم)

  1. استخدام الملقط، وضع النفس الصغيرة-الأنسجة على حافة لوحة الفحص جيدا، واستخدام المجهر لفحص أن موجه مع الطوق البلاستيك إلى الأسفل وشبكة على أعلى.
  2. إزالة اللوحة من تحت المجهر واستخدام الملقط لفهم بضبط النفس من الجانبين وأسقطه برفق في البئر.
  3. استخدام إبرة بنت صغيرة-تحقيقا لدفع بضبط النفس إلى أسفل إلى البئر.
  4. تحت المجهر، تحقق من أن الدماغ يمكن أن يرى من خلال الأنسجة من ضبط للنفس وأن يتم توسيطه في البئر.
  5. كرر الخطوتين 8.1 – 8.4 لجميع الآبار التي ستكون في المقايسة-A2-A8 و B2 B8 و C2-C8.
  6. بعناية إضافة ميكروليتر 130 فحص وسائل الإعلام لكل من التجريبية ومراقبة وآبار النفس فقط.
  7. تحقق من أن العقول والقيود الأنسجة الدقيقة لم تتحرك أثناء إضافة وسائط الإعلام التي تصور لهم تحت المجهر.
  8. إضافة ميكروليتر 180 مقايسة وسائط الإعلام إلى الآبار الزوايا الأربع لاستخدامها كخلفية عنصر التحكم.

9-إضافة لوحة الخلية محلل الأيضية وبدء الفحص (اليوم 2)

  1. تحقق من أن الموازنة والمعايرة كاملة بانتظار البرنامج للمطالبة بلوحة الخلية التي تحتوي على النموذج.
  2. حدد "فتح علبة" وانتظر الصك لإخراج لوحة الأداة المساعدة.
  3. إزالة لوحة الأداة وإضافة لوحة الخلية، دون الغطاء، في نفس الاتجاه.
  4. حدد "تحميل الخلية اللوح" للصك في لوحة الخلية وإغلاق علبة الورق ومن ثم البدء التحليل.
  5. عرض القياسات في الوقت الحقيقي مع أشرطة خطأ على شاشة الكمبيوتر بتشغيل البرنامج.
  6. إزالة خرطوشة وطرد الخليوي لوحة عند اكتمال المقايسة.
    ملاحظة: خراطيش المزدوجة وألواح الخلية يمكن إعادة استخدام 5 x.

10-قياس ما بعد التحليل (اليوم 2)

  1. استخدام مجهر تشريح للتحقق من أن العقول والقيود الصغرى-الأنسجة التي لا تزال متوضعة بشكل صحيح في البئر بعد اكتمال المقايسة. استبعاد أي الآبار بتشوهات من التحليل.
  2. تصدير بيانات معدل تحمض خارج الخلية (عكر) لمزيد من التحليل ومعدل استهلاك الأكسجين (OCR).

Representative Results

البروتوكول المعروضة هنا يتطلب استخدام القيود الصغرى-الأنسجة التي تفي بالمواصفات المبينة أدناه. استخدام أساليب أخرى لعقد العقول في مكان في الجزء السفلي من لوحة خلية 96-كذلك لم تكلل بالنجاح (الشكل 2 ألف و 2 باء). أولاً، تم اختبار عوامل شتى لزيادة الالتزام الأنسجة اللوحة. مادة لاصقة أنسجة متاحة تجارياً (جدول المواد) ينصح لاستخدام الخلايا وأورجانويدس مع الخلية لوحات ولوحات كروي، على التوالي. في البداية، ظهرت العقول على التمسك بالسطح جيدا؛ ومع ذلك، قراءات الاستهلاك (OCR) الأكسجين منخفضا، ومراقبة الآبار بعد الفحص كشف أن العقول لم يعد كانت تعلق على السطح جيدا (الشكل 2A). حدث نفس النتائج مع سوبر الغراء (الشكل 2A). التالي، تصنيع الشاشات الصغيرة بعقد تمت محاولة العقول داخل غرفة صغيرة في الجزء السفلي من البئر (الشكل 2).

شاشات المعادن المنتجة عالية القراءات التعرف الضوئي على الحروف وحدها، كما معدنية الشاشات مع عصابة بوليمر عقد الشاشة في مكان (الشكل 2). واستخدمت المعاوضة مش البلاستيك مع عصابة البوليمر نفسه. بسبب هذا الجهاز قراءة OCR سلبية يمكن الحصول عليها. وأخيراً، صممت القيود الصغرى-الأنسجة استخدام البوليمرات خاملة للحلبة قياس قطر خارجي ل 0.146 قطر داخلي ل 0.1335 في سمك 0.0125 في، وارتفاع في 0.016 (جدول المواد). سوبر الغراء (جدول المواد) كان يستخدم لإرفاق الدائري لشبكة نايلون مع حجم مسام محددة من 0.0039 في قطر (جدول المواد). حجم المسام أمر بالغ الأهمية، كما أنها تسمح بتبادل الوسائط والمستقلب دون تشكيل فقاعات الهواء، ولكن لا يزال يعمل كحاجز للعقول. هذه القيود وحدها ينتج شيئا يذكر للتعرف الضوئي على الحروف لا القراءة، وعند استخدامها مع العقول، والسماح لقراءات استنساخه (الشكل 2 ألف و 2 باء). التحقق بعد الفحص أظهر أن العقل المدبر ما زال المتمركزة بشكل صحيح في الآبار. هذه القيود الأنسجة غير متوفرة تجارياً حاليا ولكن يمكن تصنيعها باتباع المواصفات المذكورة أعلاه. في حين يتطلب هذا التصنيع الدقيق، معظم المحلات التجارية آلة سيكون قادراً على إعادة ضبط النفس هذا باستخدام المواد المشار إليها أعلاه.

كذلك البروتوكول الأمثل لحساب وسائل الإعلام المقايسة والوقت المسموح به قبل تشغيل الفحص درجة الحرارة (الشكل 3). في البداية، أقيمت فحوصات على المديين المتوسط وشنايدر نموذج البيئة اليرقات في فيفو . ومع ذلك، الوسائط المستخدمة لا تحتوي على وكلاء التخزين المؤقت حيث يتم استخدام الرقم الهيدروجيني لقياس في أكار. هذه الوسائط، وبالتالي، يجب أن تكون مخصصة، وهي مكلفة. واستخدمت وسائل الإعلام متاحة تجارياً مقايسة مصممة لتحليل الأيضية (جدول المواد) لتحسين هذا، بدلاً من وسائط الإعلام شنايدر. وكانت مستويات التعرف الضوئي على الحروف دون تغيير، حتى عند زيادة مستويات السكر قليلاً إلى نموذج المقايسة وسائل الإعلام الشروط (الشكل 3A). وأجريت فحوصات كل من هذه النقطة في الأجلين المتوسط والمقايسة. كانت الأمثل الملاحق لوسائل الإعلام بمراقبة ما إذا كان استهلاك الأوكسجين ومعدلات تحمض خارج الخلية وأظهرت استجابة عندما تعامل مع مثبطات الميتوكوندريا المعروفة. المقبل، وقد تم تحليل وقت الانتظار بين تشريح ويدير المقايسة. حضانة من ح 3 انخفض بشكل كبير على مستويات التعرف الضوئي على الحروف (الشكل 3B). الشكل 3D يوضح الفرق في الوقت النقطة السادسة، وعند استقرار مستويات التعرف الضوئي على الحروف واكار للعقول كل الكبار واليرقات. وهكذا، يشير إلى البروتوكول تبدأ الفحص مباشرة بعد تشريح، ما لم يتطلب التجربة الموازنة درجة حرارة، يقترح فيه القضية حضانة لمدة أقل من 30 دقيقة. يتم تخزين محلل الأيضي في حاضنة للسماح لدرجة حرارة 25 درجة مئوية في جميع أنحاء المقايسة تعيين إلى 11 درجة مئوية. إذا كانت درجات الحرارة مرتفعة بسبب درجة الحرارة المحيطة وتشغيل الأداة، يلاحظ انخفاض مستويات التعرف الضوئي على الحروف (الشكل 3). وهذا هو الافتراض بأن سبب موت الأنسجة.

عندما يتم اتباع الشروط الأمثل، معبراً باليرقات والكبار العقول النتيجة في القراءتين للتعرف الضوئي على الحروف قليلاً تتجاوز 150 pmol/دقيقة في استقر المرة السادسة أشر، ~ 25 دقيقة في الفحص (الشكل 4 باء). يتم الاحتفاظ بهذا المعدل لمدة 30 دقيقة على الأقل (الشكل 4 أ) وحتى 2 ح (البيانات لا تظهر). عكر هو أقل بشكل طفيف في أدمغة البالغين مما في أدمغة اليرقات في نقطة الساعة السادسة (الشكل 4) ويتم الاحتفاظ لمدة 30 دقيقة على الأقل (الشكل 4). يتوافق مع هذه النتيجة إلى زيادة في تحلل خلال مراحل اليرقات لدعم النمو. حقن مع مثبط المتقدرية، مثل أوليجوميسين، يخفض قراءات التعرف الضوئي على الحروف بالكشف عن التنفس تعتمد على ATP، وكذلك المعاملة مع أنتيميسين والروتينون، ويخفض بالتعرف الضوئي على الحروف لتكشف عن استهلاك الأوكسجين غير المتقدرية (الشكل 5A ). تبين هذه البيانات أن هذه الموانع هي قادرة على اختراق أنسجة المخ ويمكن استخدامه لمقارنة التنفس المتقدرية في العقول من الأنماط الجينية متفاوتة. لهذا التحليل، هذا المزيج، الانتظار، وكانت الأمثل مرات التدبير بمراقبة مستويات الأوكسجين، غير أن معدل الاستهلاك، وضمان بعد خلط، عاد مستوى الأكسجين إلى المستوى قبل القياس.

Figure 1
رقم 1: تخطيطي للقياسات التعرف الضوئي على الحروف وعكر الدماغ اليرقات في محلل الأيضية. الخرطوشة مستعدة يوم قبل أن يعمل في التحليل. في اليوم التالي، تتم إضافة المخدرات إلى موانئ حقن الخرطوشة. يتم تشريح أدمغة اليرقات melanogaster دال ، وتتم إضافة القيود الأنسجة الدقيقة لتأمين الدماغ إلى أسفل البئر. لوحة الخلية مع العقل المدبر هو جزيئي في محلل الأيضية ويتم تحليل البيانات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: القيود الأنسجة الدقيقة ليست أيضي نشطة وعقد الدماغ في غرفة في الجزء السفلي من لوحة جيدا. (A) "التعرف الضوئي على الحروف" للعقول اليرقات ميلانوجاستير دال (أوريغون)-R تقاس في الآبار المغلفة بمادة لاصقة الأنسجة (جدول المواد) أو عندما يتم لصق الأدمغة سوبر إلى أسفل البئر. تتم مقارنة النتائج تلك العقول المتمركزة في الجزء السفلي من البئر باستخدام القيود الصغرى-الأنسجة. (ب) "التعرف الضوئي على الحروف" يقاس في الآبار التي تحتوي على وسائط الإعلام المقايسة والمعادن والمعادن مع عصابة بوليمر المعاوضة مش البلاستيك وعصابة بوليمر أو القيود الصغرى-الأنسجة. فقيمه < 0.05، * * فقيمه < 0.01، * * * فقيمه < 0.001، * * * فقيمه < 0.0001. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: الاستغلال الأمثل لوسائل الإعلام، ووقت الحضانة ودرجة الحرارة- (أ) "التعرف الضوئي على الحروف" هو تقاس دال أوريغون-R melanogaster العقول اليرقات باستخدام وسائط شنايدر (S2) مع بيروفات صوديوم إضافة، S2 مع الجلوكوز وبيروفات صوديوم إضافة، والاعتداء على وسائل الإعلام مع بيروفات الجلوكوز والصوديوم المضافة. (ب) "التعرف الضوئي على الحروف" يقاس بالعقول اليرقات بعد 3 ح للحضانة قبل المقايسة، أو بعد 30 دقيقة من الحضانة قبل المقايسة. (ج) "التعرف الضوئي على الحروف" يقاس في أدمغة اليرقات في مقايسة تشغيل درجات الحرارة 33 درجة مئوية و 25 درجة مئوية. النقطة المرة السادسة هي رسوم بيانية. (د) "التعرف الضوئي على الحروف" يقاس بالعقول اليرقات بعد 3 ح للحضانة قبل المقايسة، أو بعد 30 دقيقة من الحضانة قبل المقايسة. ويقال للنقطة المرة السادسة البيانات. فقيمه < 0.05، * * فقيمه < 0.01، * * * فقيمه < 0.001، * * * فقيمه < 0.0001. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: التعرف الضوئي على الحروف وعكر تقاس تكاثر في تعليم الكبار والعقول اليرقات ميلانوجاستير د . (A) "التعرف الضوئي على الحروف" يقاس في أدمغة الكبار واليرقات ميلانوجاستير دال (أوريغون)-R للبيانات "التعرف الضوئي على الحروف" 30 دقيقة (ب) نقطة الساعة السادسة من لوحة A هو رسوم بيانية. وهذه هي النقطة الزمنية التي تستقر قراءات التعرف الضوئي على الحروف. عكر (ج) يقاس في أدمغة الكبار واليرقات ميلانوجاستير دال- لهي رسوم بيانية دقيقة 30 (د) "عكر" البيانات من النقطة السادسة من الفريق الوقت. وهذه هي النقطة الزمنية التي تستقر قراءات عكر. فقيمه < 0.05، * * فقيمه < 0.01، * * * فقيمه < 0.001، * * * فقيمه < 0.0001. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5: أوليجوميسين يخفض مستويات الدماغ اليرقات التعرف الضوئي على الحروف melanogaster دال- الكشف عن ATP-تعتمد على التنفس، ويخفض والروتينون/أنتيميسين أخرى التعرف الضوئي على الحروف لتكشف عن استهلاك الأوكسجين غير المتقدرية. (A) "التعرف الضوئي على الحروف" يقاس في أوريغون-ش melanogaster العقول اليرقات بعد علاج مع 20 ميكرون أوليجوميسين وخليط والروتينون/أنتيميسين A 5 ميكرومتر. تم حقن بمراقبة وضبط النفس فقط الآبار بمقايسة وسائط الإعلام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

وهنا يتم وصف طريقة جديدة لتحليل الأيض melanogaster دال العقول اليرقات والكبار السابقين فيفو . تحت ظروف القاعدية، واستهلاك الأوكسجين ومعدلات تحمض خارج الخلية تبين كيف أيضي نشطة الدماغ ويمكن تحديد ما إذا كانت أنسجة قد أصبحت أكثر اعتماداً على الميتوكوندريا مقابل glycolytic التنفس، على التوالي11.

علاج العقول مع مثبطات أو العقاقير العلاجية يمكن تقديم مزيد من المعلومات حول حالة التمثيل الغذائي للأنسجة. ويمكن أيضا إضافة ركائز الأيضية لتحديد التبعيات على نواتج الأيض محددة، مثل الجلوكوز لاختبار تأثير واربورغ22 أو الجلوتامين للتحقيق في جلوتامينوليسيس23-كلا المشتركة في إعادة برمجة التمثيل الغذائي. دراسات طويلة الأجل أو يرقات الذباب يمكن أيضا تغذية المخدرات بدلاً من استخدام منافذ الحقن، ويمكن جزيئي العقول وعلى فترات متقطعة أو في نقطة النهاية، تبعاً للتصميم التجريبي. هذا الأسلوب يمكن أن يكون الأمثل للعديد من التطبيقات.

هذا الأسلوب تم الأمثل للعقول ولكن يمكن استخدامها لتحليل الأنسجة الكبار و اليرقات18 أخرى. بالإضافة إلى ذلك، نظم نموذجية صغيرة أخرى يمكن الاستفادة من هذا الأسلوب لقياس الكائنات كلها18 أو الأنسجة. القيد الوحيد لتحسين هذا الأسلوب لأنظمة أخرى هو حجم الجهاز أو الأنسجة، أو الكائن الحي. الدائرة تم إنشاؤها بواسطة ضبط النفس الصغيرة-الأنسجة هو الحاجز الحجم لتشغيل المقايسة. إذا كان ناتج التمثيل الغذائي منخفضا جداً للدماغ أو الأنسجة التي يجري اختبارها، وحجم العينة ليس قيداً، تجميع عينات يمكن استخدامها لزيادة قياسات المقايسة وحساسية. تعديل هذا البروتوكول للتطبيقات الأخرى ينبغي إلا تتطلب تحسينات طفيفة، بما في ذلك 1) اختيار التدبير الملائم ومزيج دورة إعداد وتوقيت، و 2) تحديد تركيزات العلاج الفعال للأنسجة. التدبير ومرات خلط يحددها تركيز الأكسجين الرصد تقاس محلل الأيضية خلال كل دورة. وهذا يمكن عرضها بواسطة تحديد س2 في الزر المحور Y2 في إطار نظرة عامة بعد الانتهاء من التشغيل. خلال كل دورة، ينبغي أن يكون هناك تركيز أكسجين المقحمة يعكس استهلاك الأوكسجين للأنسجة زمن يقاس، متبوعاً بعودة إلى تركيز الأكسجين الأولية خلال دورة خلط. وينبغي اختبار مرات التدبير والمزيج حتى يتم ملاحظة هذا النمط. باستخدام هذا الأسلوب، وقد درست أدمغة الحشرات الأخرى. وكانت هذه العقول أكبر من أدمغة يطير المستخدمة هنا ولكن لا يزال يصلح داخل قاعة المتولدة عن النفس الأنسجة. وكانت قراءات التعرف الضوئي على الحروف من هذه العقول يصل إلى 400 pmol/دقيقة (البيانات لا تظهر). النتائج من هذه الدراسات، فضلا عن معدلات التعرف الضوئي على الحروف التي تتوافق مع دراسات أخرى قياس الأوكسجين كل ذبابة استهلاك18،24، تشير إلى أن العقول melanogaster دال- لم تكن الأكسجين محدودة. دال-melanogaster العقول والأنسجة من الكائنات الحية الأخرى، تطبيق هذا الأسلوب يتطلب اهتماما خاصا إلى أربع خطوات حاسمة.

لتحقيق النجاح القياسات البيولوجية ذات الصلة واستنساخه، هناك خطوات حاسمة للبروتوكول الذي يجب أن يتبع. أولاً، استخدام الأنسجة الدقيقة ضبط النفس المطلوب لهذا الأسلوب. من الضروري تصنيع هذه القيود باستخدام المواصفات والمواد المذكورة. وقد تم اختيار المواد نظراً لتركيبتها الكيميائية الخاملة، وقدرتها على السماح بتبادل الوسائط المناسبة خلال الخطوات خلط دون خلق فقاعات الهواء. ثانيا، مطلوب إعداد لوحة والتشريح في الوقت المناسب تحقيق أقصى قدر من الإخراج التمثيل الغذائي للأنسجة. مرات تشريح قصيرة ينبغي إلا تعوق إلى حد كبير في الدماغ. وأظهرت دراسات أخرى أن يطير العقول يمكن الاحتفاظ على قيد الحياة لساعات إلى أيام بعد تشريح إذا المخزنة بشكل صحيح في التروية الدائرة25. ومع ذلك، كما يتضح في الشكل 3B و 3D، إذا تركت العقول يجلس في فحص وسائل الإعلام لفترات طويلة من الزمن قبل المقايسة، انخفضت معدلات استهلاك الأوكسجين. أثناء الفحص، تخضع العينات خطوة خلط خلال كل دورة. هذا خلط لا الإيدز مع حقن المركبات الكيميائية بل يعمل أيضا لأوافيكم وسائل الإعلام وتوفير الأوكسجين. العقول قادرة على البقاء النشط أيضي لفترات أطول خلال هذه الدورات التدبير-مزيج من أنهم سوف تفرخ في وسائط الإعلام على أعلى مقاعد البدلاء. ولذلك، ينبغي أن يتقن تشريح أدمغة اليرقات قبل البدء في إعداد هذا التحليل. عند إعداد هذا التحليل، تحليل عدد صغير من الأنماط الجينية في وقت، للتقليل من عدد العقول اللازمة والاستفادة من الآبار. سيمنع هذا التأخير بين تشريح وقياسات المقايسة. ثالثا، الحفاظ على درجة حرارة مستقرة مطلوب لتحليل معدلات التمثيل الغذائي في الظروف ذات الصلة فسيولوجيا. والرزن زيادة درجات الحرارة يمكن أن يسبب موت الأنسجة، لاحظ انخفاض معدلات استهلاك الأوكسجين (الشكل 3). إذا كان الذباب تربى عند درجة حرارة مختلفة لأغراض تجريبية، ينبغي أيضا إجراء القياسات في درجة الحرارة هذه. في حين سيتم على الأرجح إجراء تشريح في درجة حرارة الغرفة، إذا كانت ستجري الفحص عند درجة حرارة مختلفة، ينبغي المحتضنة أدمغة مطلي وضبط النفس عند درجة الحرارة المطلوبة لمدة 15 دقيقة قبل أن يعمل في التحليل. وأخيراً، مراقبة الفحص بعد الآبار أمر حاسم لتحديد إذا كانت الأنسجة لتحديد المواقع المتضررة القياسات. في بعض الأحيان، سيكون هناك واحد الخارجة جيدا أنه، بعد أن لاحظت اللوحة تحت مجهر تشريح، يمكن القضاء عليها من تحليل البيانات بسبب أما فقدان الأنسجة أو ميسبوسيتيونينج، حيث الدماغ وقد خرجت من مركز البئر وعالق تحت الحلبة البوليمر لضبط النفس. الأنسجة يمكن أن تضيع إذا لم تؤمن بشكل صحيح إلى البئر بضبط النفس وانزعجت خلال دورتي خلط. بينما لم يكن أي من هذه الأحداث يحدث في كثير من الأحيان، إذا أنها لا تستبعد من التحليل، أنها ستكون أقل معدل القيم إلى حد كبير.

قياس الجريان كل الأنسجة الأيضية برصد استهلاك الأوكسجين وتحمض خارج الخلية يوفر أسلوباً بيولوجيا ذات صلة لفهم كيف يتم تبديل التمثيل الغذائي بالمناظر الطبيعية الوراثية أو غيرها من الشروط التجريبية. هذا الأسلوب حساسة بما يكفي للكشف عن التغيرات الاستقلابية في واحد melanogaster دال- الدماغ، والتي لا يمكن استخدام ريسبيروميتري وقف التدفق أو القياس غير المباشر. هو أيضا تحدي أقل من الناحية الفنية من استخدام قطب كلارك قياس استهلاك الأوكسجين. ميزة إضافية لهذا البروتوكول هو القدرة على تحليل الدماغ كله واحد كل بئر. شكل 96-جيدا يسمح لقراءات أكثر حساسية، وهكذا، يمكن جزيئي وراثي واحد أو أكثر في كل مرة نظراً لعدد أصغر من العينات اللازمة للفحص. بينما قياس التمثيل الغذائي في الأنسجة لا تزال تمثل تحديا ويتطلب عناية تربيتها والحيوانات متزامنة، وهذا البروتوكول وصف طريقة سريعة ومبسطة نسبيا، ولديه القدرة على تحليل الحساسيات الأيضية العديدة في دال ميلانوجاستير العقول اليرقات والكبار.

Disclosures

البقشيش م. يحمل براءة المؤقت للأنسجة الدقيقة القيود المبينة في هذا البروتوكول17.

Acknowledgments

الأرصدة التي تم الحصول عليها من مركز الأسهم المورفولوجية بلومينغتون (P40OD018637 المعاهد الوطنية للصحة) استخدمت في هذه الدراسة. وأيده البحث عنها في هذا المنشور الشبكة "جائزة التنمية المؤسسية" (فكرة) "التميز البحوث الطبية الحيوية" من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة "معاهد الصحة الوطنية" تحت رقم المنحة P20GM103430، ومؤسسة ولاية رود آيلاند. يشكر المؤلفون J. المياه وحزام سنودجراس ص لدعمها في تطوير هذا البروتوكول.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Assay medium Agilent 102365-100
Calibrant solution Agilent 100840-000
Corning Cell-Tak Cell Tissue Adhesive Sigma Aldrich DLW354240
delrin Grainger 2XMK6
Drosophila Schneider Media Thermo Fisher 21720-024
Dumont High Precision Tweezers (style 5) Ted Pella 5622
Loctite 409 Amazon
Mitostress kit  Agilent 103015-100 oligomycin, rotenone, and antimycin A included
Netwell inserts (6-well) VWR 29442-136
nylon mesh Component Supply U-CMN-64
Parafilm M wrapping film Fisher Scientific S37440
PYREX spot plate Fisher Scientific 13-748B
Seahorse XFe96 Analyzer Agilent
Wave v2.4 XFe96 analyzer software Agilent https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/software-download-for-wave-desktop free download to mac or windows
XFe96 catridge and cell plates Agilent 102416-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cai, H., et al. Metabolic dysfunction in Alzheimer's disease and related neurodegenerative disorders. Current Alzheimer Research. 9 (1), 5-17 (2012).
  2. Zhao, S., et al. Glioma-derived mutations in IDH1 dominantly inhibit IDH1 catalytic activity and induce HIF-1alpha. Science. 324 (5924), New York, NY. 261-265 (2009).
  3. Brody, A. L., et al. Brain metabolic changes in major depressive disorder from pre- to post-treatment with paroxetine. Psychiatry Research. 91 (3), 127-139 (1999).
  4. Nagana Gowda, G. A., Djukovic, D. Overview of mass spectrometry-based metabolomics: Opportunities and challenges. Methods in Molecular Biology. 1198, 3-12 (2014).
  5. Dona, A. C., et al. A guide to the identification of metabolites in NMR-based metabonomics/metabolomics experiments. Computational and Structural Biotechnology Journal. 14, 135-153 (2016).
  6. Yuan, M., Breitkopf, S. B., Yang, X., Asara, J. M. A positive/negative ion-switching, targeted mass spectrometry-based metabolomics platform for bodily fluids, cells, and fresh and fixed tissue. Nature Protocols. 7 (5), 872-881 (2012).
  7. Zamboni, N., Fendt, S. -M., Rühl, M., Sauer, U. 13C-based metabolic flux analysis. Nature Protocols. 4 (6), 878-892 (2009).
  8. Duckwall, C. S., Murphy, T. A., Young, J. D. Mapping cancer cell metabolism with(13)C flux analysis: Recent progress and future challenges. Journal of Carcinogenesis. 12, 13 (2013).
  9. Clark, L. C., et al. Continuous recording of blood oxygen tensions by polarography. Journal of Applied Physiology. 6 (3), 189-193 (1953).
  10. Lighton, J. R. B. Measuring Metabolic Rates. Spatial Epidemiology: Methods and Applications. , 87-103 (2000).
  11. Ferrick, D. A., Neilson, A., Beeson, C. Advances in measuring cellular bioenergetics using extracellular flux. Drug Discovery Today. 13 (5-6), 268-274 (2008).
  12. Dunham-Snary, K. J., Sandel, M. W., Westbrook, D. G., Ballinger, S. W. A method for assessing mitochondrial bioenergetics in whole white adipose tissues. Redox Biology. 2 (1), 656-660 (2014).
  13. Fan, Y. -Y., Davidson, L. A., Callaway, E. S., Wright, G. A., Safe, S., Chapkin, R. S. A bioassay to measure energy metabolism in mouse colonic crypts, organoids, and sorted stem cells. American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (1), G1-G9 (2015).
  14. Lee, H., et al. Increased mitochondrial activity in renal proximal tubule cells from young spontaneously hypertensive rats. Kidney International. 85 (3), 561-569 (2014).
  15. Volkenhoff, A., et al. Glial glycolysis is essential for neuronal survival in drosophila. Cell Metabolism. 22 (3), 437-447 (2015).
  16. Becker, L., Nogueira, M. S., Klima, C., De Angelis, M. H., Peleg, S. Rapid and transient oxygen consumption increase following acute HDAC/KDAC inhibition in Drosophila tissue. Scientific Reports. 8 (1), (2018).
  17. Method and device for restraining contents of a cell plate. United States patent. Tipping, M., Waters, J. , 62/491,431 (2017).
  18. Neville, K. E., et al. A novel ex vivo method for measuring whole brain metabolism in model systems. Journal of Neuroscience Methods. 296, 32-43 (2018).
  19. Lardy, H. A., Johnson, D., McMurray, W. C. Antibiotics as tools for metabolic studies. I. A survey of toxic antibiotics in respiratory, phosphorylative and glycolytic systems. Archives of Biochemistry and Biophysics. 78 (2), 587-597 (1958).
  20. Turrens, J. F., Boveris, A. Generation of superoxide anion by the NADH dehydrogenase of bovine heart mitochondria. Biochemical Journal. 191, 421-427 (1980).
  21. Potter, V. R., Reif, A. E. Inhibition of an electron transport component by antimycin A. The Journal of Biological Chemistry. 194 (1), 287-297 (1952).
  22. Warburg, O. On the Origin of Cancer Cells. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
  23. Yang, L., Venneti, S., Nagrath, D. Glutaminolysis: A Hallmark of Cancer Metabolism. Annual Review of Biomedical Engineering. 19 (1), 163-194 (2017).
  24. Van Voorhies, W. A. Metabolic function in Drosophila melanogaster in response to hypoxia and pure oxygen. The Journal of Experimental Biology. 212 (19), 3132-3141 (2009).
  25. Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (37), e1936 (2010).

Tags

علم الأعصاب، 138 قضية، استهلاك الأكسجين، وتحمض خارج الخلية، محلل الأيضية، والايض، السابقين فيفو، melanogaster المورفولوجية، إعادة برمجة التمثيل الغذائي
التحليل الأيضي اليرقات <em>melanogaster المورفولوجية</em> و "العقول الكبار"
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Neville, K. E., Bosse, T. L.,… More

Neville, K. E., Bosse, T. L., Klekos, M., Mills, J. F., Tipping, M. Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains. J. Vis. Exp. (138), e58007, doi:10.3791/58007 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter