Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Metaboliske analyse af Drosophila melanogaster Larval og voksen hjerne

Published: August 7, 2018 doi: 10.3791/58007
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biology, Providence College

Summary

Vi præsenterer en protokol til måling af forbrug af ilt og ekstracellulære forsuring i Drosophila melanogaster larve og voksen hjerner. En metabolisk analyzer er udnyttet med en tilpasset og optimeret protokol. Mikro-væv begrænsninger var er et afgørende element i denne protokol og designet og skabt specielt til deres brug i denne analyse.

Abstract

Denne protokol beskriver en metode til at måle stofskiftet i Drosophila melanogaster larve og voksen hjerner. Kvantificere stofskifte i hele organer giver en væv-niveau forståelse af energi-udnyttelse, der ikke kan hentes, når du analyserer primærelementer og cellelinjer. Mens denne analyse er ex vivo, det giver mulighed for måling af en række specialiserede celler arbejder sammen for at udføre en funktion i et væv og modeller tættere i vivo orgel. Metaboliske omprogrammering er blevet observeret i mange neurologiske sygdomme, herunder neoplasi, og neurodegenerative sygdomme. Denne protokol blev udviklet for at bistå Fællesskabets D. melanogaster undersøgelse af stofskiftet i Neurologiske sygdomsmodeller ved hjælp af en kommercielt tilgængelig metaboliske analyzer. Måling af metabolisme af hele hjerner i den metaboliske analyzer er en udfordring på grund af geometrien af hjernen. Denne analyzer kræver prøver at forblive i bunden af en 96-brønd plade. Celle prøver og væv slag kan holde sig på overfladen af cellen plade eller udnytte klumpformet plader, henholdsvis. Kugleformet, tre-dimensionelle form af D. melanogaster hjerner forhindrer imidlertid væv fra fastholdelsen af pladen. Denne protokol kræver et specielt designet og produceret mikro-væv tilbageholdenhed, der omgår dette problem ved at forhindre enhver bevægelse af hjernen, mens det stadig tillader metaboliske målinger fra de analyzer to solid-state sensor sonder. Forbrug af ilt og ekstracellulære forsuring er reproducerbare og følsom over for en behandling med metaboliske hæmmere. Med en mindre optimering, kan denne protokol være tilpasset til brug med enhver hele væv og/eller modelsystem, forudsat at prøvestørrelse ikke overstiger salen genereret af tilbageholdenhed. Mens basal metaboliske målinger og analyse efter en behandling med mitokondrie-hæmmere er beskrevet i denne protokol, kunne utallige forsøgsbetingelser, som energi kilde præference og opdræt miljø, blive afhørt.

Introduction

Metaboliske omprogrammering er blevet identificeret i mange neurologiske sygdomme, herunder glioblastom Multiforme (GBM), Huntingtons sygdom og større depressiv lidelse (MDD)1,2,3. Som stofskifte bliver fokus for terapeutiske strategier, har værktøjer til metaboliske grundforskning avanceret. Men de fleste af disse metoder var designet til at studere cellelinjer og primærelementer eller analysere større væv efter fiksering eller -frysning. Nogle metoder har påberåbt sig kits til simplistisk måle specifikke metabolitter, mens andre har udnyttet mere kostbare og komplekse analyser udnytte kromatografi i kombination med massespektrometri4 for det samme mål. For at forstå det større metaboliske landskab, metabolisk profilering5,6 og metaboliske flux analyse (MFA)7 opstået for at supplere de større proteom og genomisk undersøgelser. Profilering giver en kvantitativ repræsentation af metabolitter i en celle eller væv på et tidspunkt i tid, mens MFA udvider på dette ved at tillade sporing af mærket metabolitter over tid. Sidstnævnte har været nyttig i afslører hvordan energikilder udnyttes forskelligt i en celle eller væv i en sygdom stat8. Disse metoder omfatter dog ikke måling af det samlede stofskifte.

For at afhøre de lille modelsystemer samlede metabolisk tilstand, kan traditionelle metoder, såsom Clark elektrode9 og indirekte kalorimetri10, bruges til at måle iltforbrug eller konfigureret til stop flow respirometri, til måle ilt og CO2-koncentration, henholdsvis. Disse teknikker, har mens præcist giver indsigt i udlæsning af metaboliske omprogrammering på niveauet organisme begrænsninger. Brugen af Clark elektrode kan være teknisk udfordrende og er ikke beregnet til høj overførselshastighed undersøgelser. Stop strømmen respirometer kan ikke fungere med følsomhed skal assay celler eller væv. Flere år siden, blev ny teknologi udviklet specielt til disse små programmer11. Disse instrumenter var oprindeligt designet til at måle iltforbruget og ekstracellulære forsuring af cellelinjer og primærelementer i en 24 - eller 96-brønds format. Enkelheden i opsætning og data outputtet etableret denne metode som et alternativ til de traditionelle metoder. Denne metode er et kraftfuldt værktøj til celler, og de seneste fremskridt har tilladt for måling af væv slag12,13,14. De metoder, der anvendes i disse assays tillader ikke for måling af hele organer fra små modelsystemer.

Den metaboliske analyse af sygdomsmodeller indebærer ofte samspillet mellem celler af specialiserede funktion har bopæl inden for den samme væv. For eksempel producerer glial celler metabolitter udnyttet af neuroner. Disse metaboliske interaktioner er nødvendige for neuronal overlevelse15. Lille modelsystemer er fordelagtige for at undersøge spørgsmål som disse. Undersøgelser for at måle stofskiftet i en hele orglet, der indeholder en lang række celletyper, vil tilføje til forståelsen af energi udnyttelse in vivo. For nylig, Becker et al. rapporterede en metode til måling af iltforbrug i hele flyve hoveder16. Ved at samle en række hoveder sammen i et godt af en 24-godt celle plade, er ilt forbrug aflæsninger fremstillet ved hjælp af en metabolisk analyzer. Mens dette virker godt for hoveder, som er let adskilt fra kroppen, er det meget sværere at bruge for organer såsom larve hjerner, fordi en stor mængde skal være dissekeret for denne metode. Derfor blev en metode udnytter en 96-brønd celle plade, hvilket øger følsomheden af iltforbrug og ekstracellulære forsuring aflæsninger, udviklet for at analysen en enkelt hele larve hjerne.

Den metaboliske analyzer anvendes i denne undersøgelse kræver prøven bliver målt til at forblive i bunden af brønden af en 96-brønd celle plade. For celler og forholdsvis flad væv er dette ikke en udfordring; men for D. melanogaster larve og voksen hjerne, det er ikke muligt ved hjælp af traditionelle plade belægning protokoller. De tre-dimensionelle kugleform af hjerner vil pålideligt ikke overholder plade overflade, og dem, der er ofte beskadiget under forsøget på at placere dem korrekt i brønden. En vigtig del af denne nye protokol er design og udvikling af mikro-væv begrænsninger17 der giver et lille kammer til hjernen til at opholde sig i uden at forstyrre de metaboliske målinger. Salen genereret er ca 0.016 i højde og indeholder nok plads til at nemt holde mange D. melanogaster hjerner. Begrænsninger består af nylon mesh knyttet til et inaktivt polymer ring og vil blive diskuteret yderligere i Repræsentative resultater. Ved hjælp af disse begrænsninger minimerer tidsforbruget til at forberede den metaboliske måling dissekeret hjerner. Optimere den måling procedure genererer støt, reproducerbare iltforbrug og ekstracellulære forsuring satser efter seks måling cyklusser (af 25 min). Hjerner stadig metabolisk aktive under disse betingelser for et minimum af 2 h, som gør det muligt for injektioner af therapeutics, hæmmere eller andre behandlinger via metaboliske analyzer patron drug delivery havne. Denne protokol kan også være let tilpasses til andre væv og lille model systemer18.

Protokollen nedenfor beskriver, hvordan assay iltforbrug i en hele Drosophila larve hjernen når udfordret med mitokondrie stress. For at understrege hjernen, er oligomycinets tilføjet til at hæmme ATP syntase19. Nedgangen i forbrug af ilt fra basal aflæsninger viser en måling af mængden af ATP-afhængigt af respiration i hjernen. Yderligere fald i iltforbrug efter behandlinger med rotenon20 og antimycin en21, hæmmere af elektron transport kæde komplekser I og III, henholdsvis, angive mængden af ikke-mitokondrie iltforbrug i den hjernen. Denne analyse er et eksempel på hvordan mitokondrie respiration i en flyve hjerne kan sammenlignes og hvordan denne protokol kan bruges til at sammenligne metabolisme i varierende genotyper. Men denne protokol kan tilpasses for at måle blot basal iltforbrug og ekstracellulære forsuring priser, samt at designe mere omfattende studier undersøger særlige energi udnyttelse eller substrat udnyttelse hypoteser.

Protocol

1. analysen forberedelse (dag 1)

  1. Placer den metaboliske analyzer (Table of Materials) i en inkubator eller et temperatur-kontrolleret rum til 11 ° C.
    Bemærk: Denne temperatur er ideel til målinger ved 25 ° C, da det giver mulighed for ~ 14 ° C temperaturudsving, der opstår, mens du kører analysen. Dette er forårsaget af varmen genereret af instrumentet under flugt.
  2. Åbn den relevante software på den computer, der er knyttet til den metaboliske analyzer. Klik på den numeriske temperatur i den nederste venstre side af skærmen. I det nye vindue, der åbnes, klik på afkrydsningsfeltet ved siden af kommandoen "Varmer på" og sikre vises en markering. Justere temperatur til 25 ° C og justere toleranceområde til 0,2 ° C ved hjælp af pilene.
    Bemærk: Flere timer er forpligtet til at opnå stabile temperaturer.
  3. Åbne patron container (Table of Materials) og Fjern blækpatronen fra nytte plade uden at røre sonderne.
    Bemærk: Nytte plade bruges under kalibrering af patronen og anvendes ikke mens den metaboliske assay drives.
  4. Tilføje 200 μl af en kalibratoren løsning (Table of Materials) til nytte plade og sted patron tilbage oven på den nytte plade at rehydrere sensoren sonder på patronen. Ikke røre sonderne og beskytte dem mod lys.
  5. Forsegle patron med paraffin film.
  6. Inkuber patron overnatning på 25 ° C.

2. analysen Media forberedelse (dag 2)

  1. Tilføje 10 mM glukose og 10 mM natrium pyruvat til assay medium.
  2. Inkuber medium ved 25 ° C, indtil væsken har ekvilibreres til denne temperatur.
  3. PH indstilles til 7.4 ved hjælp af et pH-meter.

3. opsætning af softwaren til metaboliske analyse af Drosophila melanogaster hjerner (dag 2)

  1. Oprettet den metaboliske software på den metaboliske analyzer bruges i trin 1.2.
  2. Vælg "Skabelon" på software-startskærmen.
  3. Dobbeltklik på "Blank" til at starte et nyt assay design.
  4. Klik på knappen "Plade kort" i den øverste værktøjslinje til Se udformningen af celle assay plade.
    Bemærk: Celle assay plade vil indeholde hjernen prøver og vil blive parret med patronen før du begynder den metaboliske assay køre.
  5. Klik på Tilføj grupper knap 3 x.
    1. Dobbeltklik på etiketten "Gruppe 1" og omdøbe den til "Experimental".
      Bemærk: Denne gruppe vil indeholde en flyve hjerne og en mikro-væv tilbageholdenhed i behandling med medicin.
    2. Dobbeltklik på etiketten "Gruppe 2" og omdøbe den til "Kontrol".
      Bemærk: Denne gruppe vil indeholde en flyve hjerne og en mikro-væv tilbageholdenhed med ingen behandling.
    3. Dobbeltklik på den "gruppe 3" etiket og omdøbe den til "tilbageholdenhed kun".
      Bemærk: Denne gruppe vil indeholde en mikro-væv tilbageholdenhed uden hjerne eller narkotikabehandling.
  6. Tildele brøndene til hver gruppe, baseret på hvor prøver i celle pladen er beregnet til at blive placeret.
    1. Klik på etiketten, "Experimental" og derefter fremhæve wells B2 - B8 på plade kort.
    2. Klik på etiketten, "Kontrol" og derefter fremhæve wells C2-C8 på plade kort.
    3. Klik på den "tilbageholdenhed kun" etiket og derefter fremhæve wells D2-D8 på plade kort.
    4. Kontroller, at alle fire hjørner (A1, A12, H1 og H12) er udpeget som baggrund.
      Bemærk: Wells langs kanten af pladen er ikke bruges til at reducere enhver kant effekter. Dette er en standardindstilling i softwaren.
  7. Klik på knappen "Protokollen" i den øverste værktøjslinje til opsætning af protokollen.
    1. Klik på "Rediger måling detaljer" i boksen baseline måling.
    2. Juster den tid, at den metaboliske analyzer vil måle hjernen ved at ændre de basale foranstaltning procestid til "3:00", ved at klikke på op- og nedpilene.
    3. Justere den tid, den metaboliske analyzer vil vente mellem hjernen målinger ved at ændre den basale vent procestid til "0:00" ved at klikke på op- og nedpilene.
    4. Justere den tid, den metaboliske analyzer vil blande medierne før måling hjernen ved at ændre de basale Bland procestid til "1:00" ved at klikke på op- og nedpilene.
    5. Justere det samlede antal basal cyklusser, som omfatter foranstaltning, vente og mix cyklusser, til "7" ved at klikke på op- og nedpilene.
      Bemærk: Stabile ilt forbrugssats målinger er fremstillet efter ~ 25 min fra starten af analysen.
    6. Klik på knappen "Tilføj injektion", beliggende i den øverste venstre værktøjslinje.
    7. Klik på etiketten"indsprøjtning" og ændre det til "Oligomycinets".
    8. Justere injektion foranstaltning, vente og mix gange så den svarer til den basale.
    9. Justere det samlede antal injektion cykler til "6", ved at klikke på op- og nedpilene.
    10. Gentag trin 3.7.6 - 3.7.8 men ændre etiketten til "Rot/AA" og justere det samlede antal injektion cykler til 7, ved at klikke på op- og nedpilene.
    11. Klik på knappen "Kører analyse" i den øverste værktøjslinje.
    12. "Gemme" analysen og begynde at oprette assay patron (Tabel af materialer).

4. forberedelse af patronen for kalibrering (dag 2)

  1. Fjern blækpatronen fra 25 ° C inkubator og tag dækslet.
    1. Tilføje 20 μL 100 μM oligomycinets til små øverste venstre cirkulære injektion port, port A, patron for alle tilsvarende eksperimentel brønde på celle plade og tilføje 20 μL af assay medier til port A i alle andre brønde, herunder kontrol og baggrunden brøndene.
      Bemærk: Patronen indeholder 4 porte (A-D) for hver af de 96 brønde svarende til celle pladen hvad vil indeholde prøverne. Dette trin er gjort før tilføjelse af prøverne. Tilføje 20 μL 100 μM oligomycinets resultater i en endelige oligomycinets Fusion 10 μm i celle pladen godt når medicinen sprøjtes af den metaboliske analyzer. Oligomycinets er en hæmmer af ATPsyntase. Den resulterende ilt forbrug værdi vil afspejle størrelsen af ATP-linked respiration i hjernen. For at korrekt injicerer narkotika i de angivne brønde, skal alle havne i samme brev udfyldes med den samme mængde væske, selv hvis ikke i brug.
    2. Tilføje 22 μL af 50 μM rotenon/antimycin A til de små øverste højre cirkulære port, port B, patron for alle tilsvarende eksperimentel brønde på celle plade og tilføje 22 μL af assay medier til havn B i alle andre brønde, herunder kontrol og baggrunden brøndene.
      Bemærk: Dette resulterer i en endelige rotenon/Antimycin en koncentration på 5 μM i celle pladen godt når medicinen sprøjtes af den metaboliske analyzer. Rotenon og antimycin A er hæmmere af elektron transport kæde komplekser I og III, henholdsvis. Den resulterende ilt forbrug værdi vil afspejle ikke-mitokondrie respiration i hjernen.
    3. Klik på "Start køre" til at placere den indlæste patron med nytte plade i den metaboliske analyzer med godt A1 placeret i øverste venstre hjørne, når de står instrument, med plade loader strækker sig fra den højre side af maskinen.
  2. Vælg "Jeg er klar" i softwaren til at begynde ækvilibrering og kalibrering af patron forud for begyndelsen af metaboliske assay med celle pladen med prøverne.
    Bemærk: Programmet vil bede om at gemme filen og derefter starte equilibrating og kalibrering. Disse trin kan tage op til 1 h. trin 5-8 er udført i løbet af ækvilibrering og kalibrering tid.

5. forberedelse af mikro-væv begrænsninger (dag 2)

  1. Vælg 1 mikro-væv tilbageholdenhed pr. hjerne, der måles, plus mindst 3 til brug som tilbageholdenhed-kun kontrolelementer fra storage container (indeholder 70% ethanol).
  2. Skyl begrænsninger med friske 70% ethanol og vaske dem med deioniseret vand 3 x i 2 min. hver, ved hjælp af en mesh kurv og 6-godt plade (Tabel af materialer). Tilsæt ekstra vand vasker hvis de stadig give off en alkohol lugt.
  3. Vask de mikro-væv begrænsninger i assay medier og forlade dem i denne løsning, indtil de er klar til brug.

6. dissektion af Drosophila melanogaster larve hjerner (dag 2)

  1. Vælg sent (vandrer) tredje instar larver fra et hætteglas med kulturperler Oregon-R fluer ved hjælp af høj præcision, stil 5 (0,10 x 0,06 mm2) pincet.
  2. Placer larve i godt af en ren dissekere spot plade (Table of Materials) indeholdende 500 μL 1 x PBS.
    Bemærk: En spot plade er en glasplade med depressioner, bruges til at dissekere lille væv og organismer.
  3. Vask larve ved forsigtigt at ryste det i brønden, ved hjælp af pincet.
  4. Flytte larve til den rene godt af en plet plade der indeholder 500 μL 1 x PBS.
  5. Placere spot pladen under dissekere mikroskop.
  6. Forstå larve på sin midsection med et par pincet, mens fatte øje kroge med et andet par pincet.
  7. Forsigtigt og jævnt træk larve i modsatte retninger ved hjælp af de to sæt pincet.
  8. Visualisere hjernen, som typisk forbliver knyttet til øjet kroge og vil almindeligvis have øje-antennal diske knyttet til den.
  9. Fjern forsigtigt yderligere væv fra hjernen, ved hjælp af øjet kroge til at holde hjernen på plads. Endelig, adskille øje kroge fra hjernen.
  10. Brug pincetter til at flytte dissekeret hjernen i en ny brønd på en spot plade indeholdende 1 x PBS.
  11. Gentag trin 6.1 – 6.10 indtil 14 hjerner er dissekeret.
    Bemærk: Den samlede tid fra starten af dissektion at assay run bør ikke overstige 30 min.

7. tilføjelse af dissekerede hjerner til 96-brønd metaboliske Assay celle plade (dag 2)

  1. Tilsættes 50 μL assay media brønde af 96-brønd metaboliske assay plade (Table of Materials) bliver brugt i eksperimentet, herunder den eksperimentelle, kontrol, tilbageholdenhed-only, og baggrunden brønde.
  2. Omhyggeligt placere en hjerne i hver brønd fra A2-A8 og B2-B8 af celle plade, pincet, en spatel eller en pipette.
    Bemærk: Dette kan gøres fra dissekere mikroskop.
  3. Mikroskopet dissektion kan bruge en bøjet nål mikro-sonde til at synke hjerner til bunden af brønden.
  4. Forsigtigt Placer hjernen i midten af de tre hævede kugler ved hjælp af sonden.

8. tilføjelse af mikro-væv begrænsninger på 96-brønd metaboliske Assay celle pladen (dag 2)

  1. Brug af pincet, placere den mikro-væv tilbageholdenhed i udkanten af assay pladen godt, og anvende mikroskopet til at inspicere, at det er orienteret med plastring vender nedad og mesh på toppen.
  2. Fjerne pladen fra under mikroskopet og bruge pincet til at forstå tilbageholdenhed på begge sider og slip det blidt i brønden.
  3. Bruge en bøjet nål mikro-sonde til at skubbe tilbageholdenhed i brønden.
  4. Under mikroskopet, kontrollere at hjernen kan ses gennem væv tilbageholdenhed og at det er centreret i brønden.
  5. Gentag trin 8.1-8.4 for alle de brønde, der vil være i analysen — A2-A8, B2-B8 og C2-C8.
  6. Forsigtigt tilføje 130 μL af assay medier til hver af de eksperimentelle, kontrol og tilbageholdenhed-only brønde.
  7. Kontroller, at hjerner og mikro-væv begrænsninger ikke har flyttet samtidig tilføjer medier ved at visualisere dem under mikroskop.
  8. Tilføj 180 μL af assay media fire hjørne brønde til brug som baggrund kontrol.

9. tilsætning af celle pladen til den metaboliske Analyzer og starten af Assay (dag 2)

  1. Kontrollere ækvilibrering og kalibreringen er fuldført ved at vente software til at bede om celle pladen som indeholder prøven.
  2. Vælg "Åben bakke" og vente på instrumentet til at skubbe den nytte plade.
  3. Fjerne nytte plade og tilføje celle pladen, uden låg, i den samme retning.
  4. Vælg "Load celle plade" redskab til at tage i celle plade og luk skuffen, og derefter begynde analysen.
  5. Se målinger i realtid med fejllinjer på computerskærmen kører softwaren.
  6. Fjerne skubbet celle plade og patron, når analysen er fuldført.
    Bemærk: Parret patroner og celle plader kan være genbruges 5 x.

10. efter måling analyse (dag 2)

  1. Brug et dissekere mikroskop til at kontrollere, at hjerner og mikro-væv begrænsninger er stadig placeret korrekt i brønden, når analysen er fuldført. Udelukke enhver brønde med afvigelser fra analysen.
  2. Eksportere ilt forbrug sats (OCR) og ekstracellulære forsuring sats (ECAR)-data for yderligere analyse.

Representative Results

Protokollen præsenteres her kræver brug af mikro-væv begrænsninger, som opfylder de specifikationer, der er beskrevet nedenfor. Ved hjælp af andre metoder til at holde hjernen på plads i bunden af 96-brønd celle plade var forgæves (figur 2A og 2B). Først, forskellige agenter til at øge overholdelsen af væv til pladen blev testet. Et kommercielt tilgængelige væv lim (Table of Materials) anbefales til brug af celler og organoids med celle plader og klumpformet plader, henholdsvis. I første omgang, hjerner viste sig at overholde den godt overflade; Men, ilt forbrug (OCR) aflæsninger var lav, og observere brøndene efter analysen viste, at hjernen ikke længere var tilknyttet godt overflade (figur 2A). Der opstod de samme resultater med super lim (figur 2A). Næste, fremstiller små skærme for at holde hjernen i et lille kammer i bunden af brønden var forsøgt (figur 2B).

Metal skærme produceret høj OCR aflæsninger alene, som metal skærme med en polymer ring holder skærmen på plads (figur 2B). Plast mesh netting blev brugt med det samme polymer ring. Denne enhed forårsaget en negativ OCR læsning skal indhentes. Endelig, mikro-væv begrænsninger var designet ved hjælp af et inaktivt polymer for ringen måling en ydre diameter på 0.146 i en indre diameter på 0.1335 i 0.0125 i tykkelse og en højde på 0,016 in (Tabel af materialer). Super lim (Table of Materials) blev brugt til at knytte ringen til en nylon mesh med en specifik porestørrelse af 0.0039 i diameter (Tabel af materialer). Porestørrelse er kritisk, da det giver mulighed for medier og metabolitten udveksling uden dannelsen af luftbobler, endnu stadig fungerer som en barriere for hjerner. Disse begrænsninger alene resultere i lidt at ingen OCR læsning, og når det bruges med hjerner, muliggøre reproducerbar aflæsninger (figur 2A og 2B). Kontrol efter analysen viste, at hjerner stadig var placeret korrekt i brøndene. Disse væv begrænsninger er i øjeblikket ikke kommercielt tilgængelige men kan fremstilles ved at følge den ovennævnte specifikation. Mens dette kræver præcis fremstilling, vil de fleste maskinværksteder kunne reproducere denne tilbageholdenhed ved hjælp af materialer, der henvises til ovenfor.

Protokollen blev yderligere optimeret til konto assay medier, frist inden analysen kører og temperatur (figur 3). I første omgang blev assays sat i Schneider medium model larve i vivo miljø. Men medierne bruges må ikke indeholde bufferkapacitet agenter da pH bruges til at måle ECAR. Dette medie har, således at være skræddersyet gjort, hvilket er dyrt. For at optimere dette, blev et kommercielt tilgængelige assay media designet til metaboliske analyse (Tabel af materialer) brugt i stedet for Schneider medier. OCR niveauer var uændret, selv når øger blodsukkerniveauet lidt til model assay media betingelser (figur 3A). Alle assays fra dette punkt på gennemførtes på assay medium. Kosttilskud til medierne var optimeret ved at observere om iltforbrug og de ekstracellulære forsuring priser viste et svar, når de behandles med kendte mitokondrie hæmmere. Næste, ventetid mellem dissektioner og assay løber blev analyseret. En inkubation af 3 h faldt betydeligt OCR niveauer (figur 3B). Figur 3D viser forskellen på det sjette tidspunkt,, som er når OCR og ECAR niveauer stabilisere for både voksne og larver hjerner. Således angiver protokollen for at begynde analysen umiddelbart efter dissektioner, medmindre forsøget kræver en temperatur ækvilibrering, i hvilket tilfælde en inkubation i mindre end 30 min foreslås. Den metaboliske analyzer er gemt i en inkubator, indstillet til 11 ° C for at give mulighed for en temperatur på 25 ° C under hele analysen. Hvis temperaturerne er forhøjet på grund af den omgivende temperatur og handlingen instrument, overholdes reduceret OCR niveauer (figur 3 c). Dette er hypotese for at være på grund af vævsdød.

Når de optimerede betingelser er fulgt, assays med larve og voksen hjerne resultat i aflæsninger af OCR på lidt over 150 pmol/min. ved den konstante sjette gang pege, ~ 25 min i analysen (figur 4B). Denne sats opretholdes i mindst 30 min (figur 4A) og op til 2 h (data ikke vist). ECAR er lidt lavere i voksen hjerne end i larve hjerner for den sjette tidspunkt (figur 4D) og opretholdes i mindst 30 min (figur 4 c). Dette resultat svarer til en stigning i glykolyse gennemførelsesstadier larve til at støtte vækst. En indsprøjtning med en mitokondrie inhibitor, såsom oligomycinets, sænker OCR aflæsninger afslører ATP-afhængige respiration, og yderligere behandling med rotenon og antimycin A sænker OCR for at afsløre ikke-mitokondrie iltforbrug (figur 5A ). Disse data viser, at disse inhibitorer er i stand til at trænge ind i hjernevæv og kan bruges til at sammenligne mitokondrie respiration i hjerner af varierende genotyper. For denne analyse, mix, vent, og foranstaltningen gange var optimeret ved at observere iltindhold, ikke forbrugshastigheden, og at sikre, at efter blanding, iltindholdet vendte tilbage til niveauet før måling.

Figure 1
Figur 1: en skematisk af larve hjernen OCR og ECAR målinger i den metaboliske analyzer. Patronen er udarbejdet en dag før kører analysen. Den næste dag, er narkotika tilføjet til injektion porte af patronen. D. melanogaster larve hjerner er dissekeret, og mikro-væv begrænsninger er føjet til sikre hjernen i bunden af brønden. Celle plade med hjerner er analyseret i den metaboliske analyzer og data er analyseret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Micro-væv begrænsninger ikke er metabolisk aktive og holde hjernen i et kammer i bunden af en tallerken godt. (A) den OCR af Oregon-R D. melanogaster larve hjerner er målt i wells belagt med væv lim (Table of Materials), eller når hjernen er super limet til bunden af brønden. Resultaterne sammenlignes til dem af hjernen placeret i bunden af brønden ved hjælp af mikro-væv begrænsninger. (B) den OCR er målt i wells indeholdende assay medier og metal, metal med en polymer ring, plast mesh netting og en polymer ring eller mikro-væv begrænsninger. p-værdien < 0,05, ** p-værdi < 0,01, *** p-værdi < 0,001, *** p-værdi < 0,0001. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: optimering af medierne, inkubation tid og temperatur. (A) den OCR er målt i Oregon-R D. melanogaster larve hjerner ved hjælp af Schneider medier (S2) med natrium pyruvat tilføjet, S2 med glucose og natrium pyruvat tilføjet, og assay medier med glucose og natrium pyruvat tilføjet. (B) den OCR er målt i larve hjerner efter 3 h inkubation før analysen eller 30 min inkubation inden analysen. (C) den OCR er målt i larve hjerner på assay køre temperaturer på 33 ° C og 25 ° C. Den sjette tidspunkt er grafen. (D) den OCR er målt i larve hjerner efter 3 h inkubation før analysen eller 30 min inkubation forud for analysen. Dataene rapporteres for den sjette tidspunkt. p-værdien < 0,05, ** p-værdi < 0,01, *** p-værdi < 0,001, *** p-værdi < 0,0001. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: OCR og ECAR måles reproducerbar i voksen og larver D. melanogaster brains. (A) den OCR er målt i Oregon-R D. melanogaster voksen og larver hjerner for 30 min. (B) den OCR data af den sjette tidspunkt fra panelet A er grafen. Dette er den tid hvor OCR aflæsninger stabilisere. (C) den ECAR er målt i D. melanogaster voksen og larver hjerner for 30 min. (D) de ECAR data af den sjette tidspunkt fra panelet om grafen. Dette er det tidspunkt, hvor ECAR aflæsninger stabilisere. p-værdien < 0,05, ** p-værdi < 0,01, *** p-værdi < 0,001, *** p-værdi < 0,0001. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Oligomycinets sænker D. melanogaster larve hjernen OCR niveauer til at afsløre ATP-afhængige respiration, og rotenon/antimycin yderligere sænker OCR at afsløre ikke-mitokondrie iltforbrug. (A) den OCR er målt i Oregon-RD. melanogaster larve hjerner efter en behandling med en 20 µM oligomycinets og 5 µM rotenon/antimycin A blanding. Kontrol og tilbageholdenhed-only wells blev sprøjtet med assay medier. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Her, er en roman metode til metaboliske analyse af D. melanogaster larve og voksen hjerne ex vivo beskrevet. Basal betingelser viser iltforbrug og ekstracellulære forsuring priser hvordan metabolisk aktive hjernen er og kan afgøre, om en væv er blevet mere afhængige af mitokondrie versus glycolytic respiration, henholdsvis11.

Behandling af hjerner med hæmmere eller terapeutiske lægemidler kan give yderligere oplysninger om den metaboliske status af væv. Metaboliske substrater kan også tilføjes for at bestemme afhængighederne på specifikke metabolitter, såsom glukose til at teste for Warburg virkning22 eller glutamin at undersøge glutaminolysis23— både fælles i metaboliske omprogrammering. Langtidsstudier, larver eller fluer kunne også fodres narkotika i stedet for ved hjælp af injektion havne og hjerner kunne analyseres med mellemrum eller på farveprøve, afhængigt af forsøgets udformning. Denne metode kan være optimeret til talrige applikationer.

Denne metode er blevet optimeret til hjerner, men kan bruges til at analysere andre larve18 og voksent væv. Derudover kan andre små modelsystemer udnytte denne metode til at måle hele organismer18 eller væv. Den eneste begrænsning til optimering af denne metode til andre systemer er størrelsen af orglet, væv eller organismer. Salen lavet af mikro-væv tilbageholdenhed er den størrelse hindring for kører analysen. Hvis den metaboliske output er for lav til hjernen eller væv bliver testet, og stikprøvestørrelse er ikke en betingelse, kan samle prøver bruges til at øge assay målinger og følsomhed. Ændre denne protokol for andre applikationer bør kun kræve mindre optimeringer, herunder 1) at vælge den relevante foranstaltning og bland cyklus numre og timing, og 2) bestemme effektiv behandling koncentrationer for væv. Foranstaltning og blande gange blev bestemt af overvågning iltkoncentrationen målt ved den metaboliske analyzer under hver cyklus. Dette kan ses ved at vælge O2 i knappen Y2 akse i oversigtsvinduet, når flugt er fuldført. I løbet af hver cyklus, bør der være en drop-in iltkoncentration afspejler det væv iltforbrug under den målte tid, efterfulgt af en tilbagevenden til den oprindelige iltkoncentrationen i løbet af blanding cyklus. Foranstaltning og mix gange bør testes, indtil dette mønster er observeret. Brug denne metode, er andre insekt hjerner blevet studeret. Disse hjerner var større end de flyve hjerner bruges her men stadig passer ind i kammeret genereret af væv tilbageholdenhed. OCR aflæsninger fra disse hjerner var så højt som 400 pmol/min (data ikke vist). Resultaterne fra disse undersøgelser samt OCR priser, der tilslutter med andre undersøgelser, måling af hele-fly ilt forbrug18,24, tyder på, at D. melanogaster hjerner ikke var ilt-limited. For både D. melanogaster hjerner og væv fra andre organismer kræver anvende denne metode særlig opmærksomhed på fire vigtige skridt.

For at kunne opnå reproducerbare og biologisk relevante målinger, er der kritiske trin af den protokol, der skal følges. Første er brug af en micro-væv tilbageholdenhed påkrævet for denne metode. Fremstiller disse begrænsninger ved hjælp af specifikationer og anførte materialer er afgørende. Materialerne blev valgt på grund af deres inert kemiske sammensætning, og deres evne til at give ordentlig medier udveksling under de blanding trin uden oprettelse af luftbobler. For det andet er en rettidig dissektion og plade forberedelse forpligtet til at maksimere den metaboliske output af væv. Korte dissektion gange bør ikke væsentligt ændrer hjernen. Andre undersøgelser har vist, at flyve hjerner kan holdes i live i timer til dage efter dissektion hvis korrekt opbevaret i en perfusion afdeling25. Men, som det ses i figur 3B og 3D, hvis hjerner er venstre sidder i assay medier i lang tid forud for analysen, ilt forbrug satser er faldet. Under analysen underkastes prøver en blanding skridt i løbet af hver cyklus. Denne blanding ikke kun støtte med injektioner af kemiske forbindelser, men også handlinger at recirkulere medierne og give ilt. Hjerner er købedygtig ophold metabolisk aktive i længere perioder under disse foranstaltning-mix cyklusser, end de ville inkubere i medierne på bænk toppen. Dissektion af larve hjerner bør derfor håndteres før du begynder at oprette dette assay. Når oprettelsen af denne analyse, analysere et lille antal genotyper på et tidspunkt, at minimere antallet af hjerner behov og brønde udnyttet. Dette forhindrer forsinkelser mellem at dissekere og assay målinger. For det tredje, opretholde en stabil temperatur er forpligtet til at analysere stofskifte i fysiologisk relevante betingelser. Øget assay temperaturer kan forårsage vævsdød, observeret af lavere ilt forbrug satser (figur 3 c). Hvis fluer er opdrættet på en anden temperatur til forsøgsformål, bør målingerne også udføres ved denne temperatur. Mens dissektioner vil sandsynligvis blive udført ved stuetemperatur, hvis analysen udføres ved en anden temperatur, forgyldt og behersket hjerner bør sættes i varmeskab ved den krævede temperatur i 15 min., inden du kører analysen. Endelig, observere brønde efter analysen er afgørende for at finde ud af hvis væv positionering påvirket målingerne. Lejlighedsvis, vil der være en outlier godt, efter at have observeret plade under dissekere mikroskop, kan være elimineret fra dataanalyse på grund af enten tab af væv eller mispositioning, hvor hjernen har gled ud af centrum af brønden og sidder fast under polymer ring af tilbageholdenhed. Væv kan gå tabt, hvis tilbageholdenhed ikke var sikret korrekt til brønden og blev forstyrret i de blanding cykler. Mens ingen af disse begivenheder sker ofte, hvis de ikke er undtaget fra analysen, vil de lavere sats værdierne betydeligt.

Måling af hele-væv metaboliske flux af overvågning forbrug af ilt og ekstracellulære forsuring giver en biologisk relevante metode for at forstå hvordan stofskiftet er ændret af den genetiske landskab eller øvrige eksperimentelle betingelser. Denne metode er følsom nok til at opdage metaboliske ændringer i en enkelt D. melanogaster hjernen, hvilket ikke er muligt ved hjælp af stop-flow respirometri eller indirekte kalorimetri. Det også mindre teknisk udfordrende end at bruge en Clark elektrode til at måle iltforbrug. En yderligere fordel ved denne protokol er evnen til at analysere en hele hjernen pr. brønd. 96-brønds format giver mulighed for mere følsomme aflæsninger, og således mere end én genotype kan analyseres på et tidspunkt på grund af det mindre antal prøver, der kræves pr. assay. Mens måling metabolisme i væv er stadig udfordrende og kræver omhyggeligt opdrættet og synkroniseret dyr, denne protokol beskriver en fast, forholdsvis simple metode, og har potentiale til at analysere mange metaboliske følsomheder i D. melanogaster larve og voksen hjerner.

Disclosures

M. Tipping holder en foreløbig patent for mikro-væv begrænsninger beskrevet i denne protokol17.

Acknowledgments

Lagre fra Bloomington Drosophila Stock Center (NIH P40OD018637) blev brugt i denne undersøgelse. Forskningen rapporteret i denne publikation blev støttet af den institutionelle udvikling Award (idé) netværk for biomedicinsk forskning Excellence fra National Institute of General Medical Sciences af National Institutes of Health under grant nummer P20GM103430, og af Rhode Island Foundation. Forfattere takke J. farvande og P. Snodgrass-bælte for deres støtte i udviklingen af denne protokol.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Assay medium Agilent 102365-100
Calibrant solution Agilent 100840-000
Corning Cell-Tak Cell Tissue Adhesive Sigma Aldrich DLW354240
delrin Grainger 2XMK6
Drosophila Schneider Media Thermo Fisher 21720-024
Dumont High Precision Tweezers (style 5) Ted Pella 5622
Loctite 409 Amazon
Mitostress kit  Agilent 103015-100 oligomycin, rotenone, and antimycin A included
Netwell inserts (6-well) VWR 29442-136
nylon mesh Component Supply U-CMN-64
Parafilm M wrapping film Fisher Scientific S37440
PYREX spot plate Fisher Scientific 13-748B
Seahorse XFe96 Analyzer Agilent
Wave v2.4 XFe96 analyzer software Agilent https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/software-download-for-wave-desktop free download to mac or windows
XFe96 catridge and cell plates Agilent 102416-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cai, H., et al. Metabolic dysfunction in Alzheimer's disease and related neurodegenerative disorders. Current Alzheimer Research. 9 (1), 5-17 (2012).
  2. Zhao, S., et al. Glioma-derived mutations in IDH1 dominantly inhibit IDH1 catalytic activity and induce HIF-1alpha. Science. 324 (5924), New York, NY. 261-265 (2009).
  3. Brody, A. L., et al. Brain metabolic changes in major depressive disorder from pre- to post-treatment with paroxetine. Psychiatry Research. 91 (3), 127-139 (1999).
  4. Nagana Gowda, G. A., Djukovic, D. Overview of mass spectrometry-based metabolomics: Opportunities and challenges. Methods in Molecular Biology. 1198, 3-12 (2014).
  5. Dona, A. C., et al. A guide to the identification of metabolites in NMR-based metabonomics/metabolomics experiments. Computational and Structural Biotechnology Journal. 14, 135-153 (2016).
  6. Yuan, M., Breitkopf, S. B., Yang, X., Asara, J. M. A positive/negative ion-switching, targeted mass spectrometry-based metabolomics platform for bodily fluids, cells, and fresh and fixed tissue. Nature Protocols. 7 (5), 872-881 (2012).
  7. Zamboni, N., Fendt, S. -M., Rühl, M., Sauer, U. 13C-based metabolic flux analysis. Nature Protocols. 4 (6), 878-892 (2009).
  8. Duckwall, C. S., Murphy, T. A., Young, J. D. Mapping cancer cell metabolism with(13)C flux analysis: Recent progress and future challenges. Journal of Carcinogenesis. 12, 13 (2013).
  9. Clark, L. C., et al. Continuous recording of blood oxygen tensions by polarography. Journal of Applied Physiology. 6 (3), 189-193 (1953).
  10. Lighton, J. R. B. Measuring Metabolic Rates. Spatial Epidemiology: Methods and Applications. , 87-103 (2000).
  11. Ferrick, D. A., Neilson, A., Beeson, C. Advances in measuring cellular bioenergetics using extracellular flux. Drug Discovery Today. 13 (5-6), 268-274 (2008).
  12. Dunham-Snary, K. J., Sandel, M. W., Westbrook, D. G., Ballinger, S. W. A method for assessing mitochondrial bioenergetics in whole white adipose tissues. Redox Biology. 2 (1), 656-660 (2014).
  13. Fan, Y. -Y., Davidson, L. A., Callaway, E. S., Wright, G. A., Safe, S., Chapkin, R. S. A bioassay to measure energy metabolism in mouse colonic crypts, organoids, and sorted stem cells. American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (1), G1-G9 (2015).
  14. Lee, H., et al. Increased mitochondrial activity in renal proximal tubule cells from young spontaneously hypertensive rats. Kidney International. 85 (3), 561-569 (2014).
  15. Volkenhoff, A., et al. Glial glycolysis is essential for neuronal survival in drosophila. Cell Metabolism. 22 (3), 437-447 (2015).
  16. Becker, L., Nogueira, M. S., Klima, C., De Angelis, M. H., Peleg, S. Rapid and transient oxygen consumption increase following acute HDAC/KDAC inhibition in Drosophila tissue. Scientific Reports. 8 (1), (2018).
  17. Method and device for restraining contents of a cell plate. United States patent. Tipping, M., Waters, J. , 62/491,431 (2017).
  18. Neville, K. E., et al. A novel ex vivo method for measuring whole brain metabolism in model systems. Journal of Neuroscience Methods. 296, 32-43 (2018).
  19. Lardy, H. A., Johnson, D., McMurray, W. C. Antibiotics as tools for metabolic studies. I. A survey of toxic antibiotics in respiratory, phosphorylative and glycolytic systems. Archives of Biochemistry and Biophysics. 78 (2), 587-597 (1958).
  20. Turrens, J. F., Boveris, A. Generation of superoxide anion by the NADH dehydrogenase of bovine heart mitochondria. Biochemical Journal. 191, 421-427 (1980).
  21. Potter, V. R., Reif, A. E. Inhibition of an electron transport component by antimycin A. The Journal of Biological Chemistry. 194 (1), 287-297 (1952).
  22. Warburg, O. On the Origin of Cancer Cells. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
  23. Yang, L., Venneti, S., Nagrath, D. Glutaminolysis: A Hallmark of Cancer Metabolism. Annual Review of Biomedical Engineering. 19 (1), 163-194 (2017).
  24. Van Voorhies, W. A. Metabolic function in Drosophila melanogaster in response to hypoxia and pure oxygen. The Journal of Experimental Biology. 212 (19), 3132-3141 (2009).
  25. Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (37), e1936 (2010).

Tags

Neurovidenskab spørgsmålet 138 iltforbrug ekstracellulære forsuring metabolisk analyzer metabolisme ex vivo Drosophila melanogaster metabolisk omprogrammering
Metaboliske analyse af <em>Drosophila melanogaster</em> Larval og voksen hjerne
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Neville, K. E., Bosse, T. L.,… More

Neville, K. E., Bosse, T. L., Klekos, M., Mills, J. F., Tipping, M. Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains. J. Vis. Exp. (138), e58007, doi:10.3791/58007 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter