Summary
ショウジョウバエ幼生及び成体脳における細胞外酸性化と酸素消費量の測定のためのプロトコルを提案します。代謝のアナライザーは、適応し、最適化されたプロトコルで利用されています。マイクロ組織拘束このプロトコルの重要なコンポーネント設計し、特にこの分析での使用のために作成します。
Abstract
このプロトコルでは、ショウジョウバエの幼虫及び成虫の脳の代謝を測定する方法について説明します。全臓器の代謝を定量化初代培養細胞と細胞を分析する際にキャプチャできないエネルギー利用の組織レベルの理解を提供します。この分析は前のヴィヴォが、連携して 1 つの組織で機能を実行する特殊な細胞数から計測でき、体内臓器のモデルをより密接に。代謝リプログラミングは、腫瘍、神経変性疾患など、多くの神経疾患で観察されています。このプロトコルは、神経疾患モデルの市販代謝解析における代謝のキイロショウジョウバエのコミュニティの調査を支援するために開発されました。代謝のアナライザーで全体の脳代謝測定は脳のジオメトリのため困難です。このアナライザーは、96 ウェル プレートの底に残るためのサンプルを必要とします。携帯サンプルやティッシュ パンチはセル板の表面に付着または回転楕円体プレートをそれぞれ利用できます。しかし、キイロショウジョウバエの脳の三次元球面形状は、プレートに付着するから組織を防ぎます。このプロトコルでは、特別に設計され、製造されたマイクロ組織拘束まだアナライザーの 2 つの固体センサー プローブから代謝の測定を可能にしながら、脳の動きを防止することによりこの問題を回避する必要があります。酸素消費量と細胞外酸性化率、再現性と代謝阻害剤との処置に敏感。マイナーな最適化で、このプロトコルは、サンプル サイズが拘束によって生成される商工会議所を超えない、全体組織および/またはモデル システムで使用のために適応になります。基礎代謝測定とミトコンドリアの阻害剤との処置の後の分析はこのプロトコルで記述されている、エネルギー ソースの好みや飼育環境など、数え切れないほどの実験条件が尋問でした。
Introduction
代謝リプログラミングが膠芽腫多形 (GBM)、ハンチントン病、および主要な憂鬱無秩序 (MDD) の1,2,3を含む多くの神経疾患に発見されました。代謝治療戦略の焦点となる、基本的な代謝研究のためのツールを持って進んでいます。ただし、これらのメソッドのほとんどは、細胞と細胞を研究するまたはより大きいティッシュ ポスト固定または凍結を分析する設計されました。いくつかのアプローチは、単純ながら他の人は同じ目的のための質量分析法4との組み合わせでクロマトグラフィーを利用したより高価で複雑な分析を利用して特定の代謝物を測定するキットに頼ってきました。大規模プロテオームやゲノム研究を補完する大きな代謝風景を理解するには、メタボリック ・ プロファイリング5,6と代謝フラックス解析 (MFA)7も浮上しました。プロファイリングは、時間の経過とともにラベル付けされた代謝物の追跡を許可することでこの時に MFA を拡充時間で細胞や 1 つの点で組織における代謝物の定量的表現で提供されます。後者は、明らかにエネルギー源が異なる細胞や疾患の状態8で組織で利用されている方法で有用されています。ただし、これらのメソッドでは、全体的な代謝率の測定は含まれません。
クラーク電極9と間接熱量計10などの伝統的な方法の酸素消費量を測定するために使用または停止流れ呼吸をするように構成スモール モデル システムの全体的な代謝の状態を調査するには酸素と二酸化炭素の濃度をそれぞれ測定します。これらの技術は、正確に生物レベルで代謝リプログラミングの読み出しに洞察力を提供しながらの制限があります。クラーク電極の使用は技術的に困難なことができ、スループットの高い研究には向いていません。細胞や組織を試金する必要な感度で停止流量計は機能できません。数年前、具体的にはこれらの小さいアプリケーションの11の新しい技術が開発されました。これらの楽器はもともと細胞および 24 ウェルまたは 96 形式で初代培養細胞の細胞の酸性化と酸素消費量を測定するために設計されたもの。セットアップとデータ出力のシンプルさは、従来のアプローチの代わりにこのメソッドを設立しました。この方法はセルのための強力なツール、ティッシュ パンチ12,13,14の測定の最近の進歩を許可しています。ただし、これらのアッセイに利用方法は小さなモデル システムから全臓器の計測はできません。
疾患モデルの代謝解析はしばしば、同じ組織内に存在する特殊な関数のセル間の相互作用を伴います。たとえば、グリア細胞は神経細胞によって利用される代謝産物を生産します。これらの代謝相互作用ニューロン生存15必要です。小さなモデル システムは、これらの質問を調査するため有利であります。様々 な種類の細胞を含む、全臓器の代謝を測定する研究は、エネルギー利用の vivoの理解に追加されます。最近、ベッカーらは、全く飛ぶヘッド16の酸素消費量を測定する方法を報告しました。24 ウェルの細胞板の 1 つも一緒にヘッド数をプールすることによって、代謝アナライザーを使用して酸素消費量の測定値が得られました。これは簡単に本体から分離、頭に適している間大量このメソッドを解剖する必要があるため幼虫の脳などの臓器に使用するはるかに困難です。したがって、酸素消費量と細胞外酸性化測定の感受性が増加、96 ウェルのセルプレートを利用する方法は、単一全幼虫の脳を試金するために開発されました。
本研究で使用される新陳代謝のアナライザーには、96 ウェルの細胞板の井戸の底で推移する測定対象サンプルが必要です。セルと比較的フラット組織は、これはない挑戦です。ただし、キイロショウジョウバエ幼虫と大人の脳は、伝統的なプレート コーティング プロトコルを使用して可能な限りはないです。脳の球面三次元形状は板表面に確実に付着しないとこれらのことが多くの場合井戸に正しく配置する際に、破損しています。この新しいプロトコルの重要な部分は、設計と代謝の測定と干渉せずに存在する脳の小部屋を提供するマイクロ組織拘束17の開発です。生成された商工会議所は約高さで 0.016 し多くショージョーバエ ・脳を簡単に保持するために十分なスペースを提供します。拘束不活性ポリマー リングにアタッチされたナイロン メッシュで構成され、さらに議論が代表の結果に。これらの拘束を使用して解剖脳代謝測定準備に必要な時間を最小限に抑えます。測定手順の最適化 (25 分) の六つの測定サイクル後安定した、再現性のある酸素消費量と細胞外酸性化率を生成します。脳代謝により、注射治療、阻害剤、または他の治療を介して代謝アナライザー カートリッジ薬配信ポート 2 h の最小値のこれらの条件の下でアクティブのまま。このプロトコルは、他の組織の小さなモデル システム18容易に適応させることができます。
下記のプロトコルでは、全ショウジョウバエ幼虫脳ミトコンドリア ストレスに挑戦したときの酸素消費量を測定する方法について説明します。脳をストレス、19ATP 合成酵素を阻害するオリゴマイシンを追加します。基底の測定値から酸素消費量の減少は、脳内 ATP によって呼吸量の測定を示しています。I と III では, 非ミトコンドリアの酸素消費量を示すロテノン20と21アンチマイシン治療後の酸素消費量のさらなる減少、電子輸送鎖複合体の阻害剤、脳。この試金はハエの脳でどのようにミトコンドリア呼吸の一例に例えれば、このプロトコルを使用して、さまざまな遺伝子型の代謝を比較する方法。しかし、このプロトコルは単に基底酸素消費量と、同様特定のエネルギー使用率または基板使用率仮説を調査しより精巧な研究デザインに関して細胞の酸性化率を測定する合わせることができます。
Protocol
1. 分析の準備 (1 日目)
- インキュベーターや 11 ° c 設定温度制御ルームで代謝のアナライザー (資材表) を配置します。
注: この温度は 25 ° C での測定値に最適 〜 14 ° C 温度変動分析の実行中に発生することができます。これは、実行中に計測器によって発生する熱が原因です。 - 代謝・ アナライザーに接続されているコンピューターに適切なソフトウェアを開きます。画面の左下で数値の温度をクリックします。新しいウィンドウが開いたら、「加熱器」コマンド横ボックスをクリックし、チェック マークが表示されますを確認。25 ° C に温度を調整し、矢印を使用して 0.2 の ° C の許容範囲を調整します。
注: いくつかの時間は、一定の温度を達成するために必要があります。 - カートリッジの容器 (資材表) を開き、プローブに触れることがなくユーティリティ プレートからカートリッジを取り外します。
メモ: ユーティリティ プレート カートリッジの校正時に使用、代謝の測定が実行されていません。 - ユーティリティ プレートと場所センサーを水分補給をするユーティリティ板の上に戻ってカートリッジがカートリッジのプローブに calibrant ソリューション (材料表) の 200 μ L を追加します。プローブをタッチしないし、光から身を守る。
- パラフィン フィルム カートリッジをシールします。
- 25 ° C で一晩カートリッジを孵化させなさい
2. アッセイ メディア準備 (2 日目)
- アッセイ培地に 10 mM グルコースと 10 mM ピルビン酸ナトリウムを追加します。
- 液体はこの温度を平衡となるまでは、25 ° C で媒体を孵化させなさい。
- 7.4 pH メーターを使用するために pH を調整します。
3.ショウジョウバエ脳 (日 2) の代謝解析のためのソフトウェアの設定
- ステップ 1.2 で使用される代謝・ アナライザーの代謝のソフトウェアを設定します。
- ソフトウェアのホーム画面で「テンプレート」を選択します。
- 「空白」の新しい試金のデザインを開始するをダブルクリックします。
- 細胞アッセイ プレートのデザインを表示するのには上部のツールバーの「プレート マップ」ボタンをクリックします。
注: セル アッセイ プレート脳サンプルを含み、代謝アッセイの実行を開始する前に、カートリッジとペアになります。 -
追加をクリックしてグループ ボタン 3 x。
- 「グループ 1」ラベルをダブルクリックし、、「実験的」に名前を変更。
注: このグループは、ハエの脳と薬で治療マイクロ組織拘束を含まれます。 - 「グループ 2」ラベルをダブルクリックし、、名前を"コントロール"。
注: このグループは、ハエの脳とミクロ組織拘束ない薬物治療に含まれます。 - ダブルクリックして、"グループ 3"ラベルし、する名前を変更"拘束のみ"。
注: このグループは脳や薬物治療なしマイクロ組織拘束を含めます。
- 「グループ 1」ラベルをダブルクリックし、、「実験的」に名前を変更。
-
井戸を配置するセル板のサンプルをに基づいて各グループに割り当てます。
- 「実験」のラベルをクリックし、井戸 B2 - プレート マップ上の B8 を強調表示。
- 「コントロール」のラベルをクリックし、井戸 C2 C8 プレート マップ上を強調表示。
- クリックして、「拘束のみ"ラベルをクリックし、ハイライト井戸 D2 D8 プレート マップ上。
- すべての 4 つのコーナー (A1、A12、H1、H12) が背景として指定されることを確認します。
注: プレートの境界に沿って井戸はすべてのエッジ効果を減らすためには使用されません。これは、ソフトウェアの既定の設定です。
-
プロトコルを設定するのには上部のツールバーの「プロトコル」ボタンをクリックしてします。
- ベースライン測定ボックスの「編集測定詳細」をクリックします。
- 上下の矢印をクリックして、代謝のアナライザーが「3:00」に基底のメジャー サイクル タイムを変更することによって、脳を測定する時間を調整します。
- 基底の待機にサイクル タイムを変更することによって脳測定値間代謝アナライザーが待機する時間を調整する"0:00"と下向きの矢印をクリックしています。
- 代謝のアナライザーは、メディアを混合する時間を調整する基底の変更によって脳を測定する前に「1:00」までのサイクル タイムを上下の矢印をクリックしてミックスします。
- メジャー、待機、およびミックスのサイクルが含まれます基底サイクルの総数を調整"7"をクリックして、下向きの矢印ボタン。
注: 安定した酸素消費量測定アッセイのスタートから 〜 25 分後で得られます。 - 上の左側のツールバーにある、「注射を追加」ボタンをクリックしてします。
- 「注射ラベル」をクリックしてし「オリゴマイシン」に変更。
- 注入測定、待機、および基底のと一致するミックス時刻を調整します。
- 上下の矢印をクリックして、「6」の注入回数の合計を調整します。
- 手順 3.7.6 - 3.7.8 がラベルを「腐敗/AA」に変更し、、上下の矢印をクリックしてして 7 注入サイクルの合計数を調整します。
- 上部のツールバーに「試金の実行」ボタンをクリックします。
- "Save"アッセイとアッセイ カートリッジ (材料表) の設定を開始します。
4. 校正 (2 日目) のカートリッジの準備
-
25 の ° C の定温器からカートリッジを取り外し、カバーを取る。
- 小さな上部左循環注入ポート、ポート A、セル板に対応するすべての実験井カートリッジに 100 μ M のオリゴマイシンの 20 μ L を追加し、コントロールと背景の井戸を含む他のすべての井戸のポート A にアッセイ メディアの 20 μ L を追加します。
注: カートリッジには、各サンプルの内容が細胞板に対応する 96 ウェルの 4 ポート (A ~ D) が含まれています。この手順は、サンプルを追加する前に行われます。薬物を注射して代謝アナライザーによって一度も携帯板で 10 μ M の最終のオリゴマイシン濃度 100 μ M のオリゴマイシン結果の 20 μ L を追加します。オリゴマイシンは ATP 合成酵素の阻害剤です。結果として得られる酸素消費値の脳内 ATP リンク呼吸量が反映されます。正しく指定されたウェルに薬を挿入、するためには、使用中ではない液体にも同じボリュームで同じ文字のすべてのポートする必要があります。 - 上部右方向に円形の小さな港に 50 μ M ロテノン/アンチマイシン A の 22 μ L を追加、セル板に対応するすべての実験井カートリッジ B、ポート、コントロールと背景の井戸を含む他のすべての井戸のポート B にアッセイ メディアの 22 μ L を追加します。
注: これは最終的なロテノン/アンチマイシン セル板の 5 μ M の濃度で代謝アナライザーによって薬剤を注入したらよく結果します。ロテノン、アンチマイシン A は電子輸送の阻害剤が鎖と複合体 I と III、それぞれです。結果酸素消費値は、脳の非ミトコンドリア呼吸が反映されます。 - 「実行開始」をクリックしてマシンの右側から伸びるプレート ローダーを使用して、計測器に直面しているときに左上隅の配置も A1 をメタボリック アナライザーにユーティリティ プレート ロードされたカートリッジを配置します。
- 小さな上部左循環注入ポート、ポート A、セル板に対応するすべての実験井カートリッジに 100 μ M のオリゴマイシンの 20 μ L を追加し、コントロールと背景の井戸を含む他のすべての井戸のポート A にアッセイ メディアの 20 μ L を追加します。
- "私は準備ができてで平衡とサンプルを含むセル板と代謝の測定を開始する前にカートリッジの調整を開始するソフトウェアを選択します。
メモ: プログラムは、ファイルを保存し、開始要求されます, と調整。これらの手順は、まで 1 h. 平衡とキャリブレーションの時間の間に 5-8 実施の手順を取ることができます。
5. マイクロ組織拘束 (2 日目) の準備
- (70% エタノールを含んでいる) 貯蔵容器から、拘束専用コントロールとして測定されている脳あたり 1 マイクロ組織拘束に加えて使用するため少なくとも 3 を選択します。
- 新鮮な 70% エタノールで拘束 3 の脱イオン水で洗ってすすいでメッシュ バスケットと 6 ウェル プレート (資材表) を使用して 2 分ごとに、x。追加の水洗浄、拘束はまだアルコール臭を放つ場合に追加します。
- アッセイ メディア マイクロ組織拘束を洗浄し、使用する準備ができるまで、このソリューションでそれらを残します。
6.ショウジョウバエキイロショウジョウバエ幼虫の脳 (日 2) 郭清
- スタイル 5 (0.10 × 0.06 mm2) ピンセット、高精度を使用して培養のオレゴン州 Rハエのバイアルから後半の 3 齢幼虫 (放浪) を選択します。
- きれいな解離性スポット プレート (材料表) 1 × PBS の 500 μ L を含むの井戸に幼虫を配置します。
注: スポット プレートはガラス板が、小さな組織や生物を分析するために使用です。 - ピンセットを使用して井戸に軽く振ることによって幼虫を洗います。
- 1 × PBS の 500 μ L を含むスポット プレートのきれいな井戸の中に幼虫を移動します。
- 解剖顕微鏡の下でスポット プレートを配置します。
- ピンセットの 1 つのペアとその中央部で幼虫を持ちながら、ピンセットの 2 番目のペアで目のフックを把握します。
- ゆっくりとスムーズにピンセットの 2 つのセットを使用して反対の方向で幼虫をプルします。
- 滞在は通常目のフックに接続されて脳を視覚化し、目触角ディスクが添付にしているが一般的です。
- 慎重に場所で脳を保持する目のフックを使用して、脳から追加の組織を削除します。最後に、脳から目フックを区切ります。
- 1x PBS を含むスポット プレートの新しい井戸に切り裂かれた脳を移動するのにピンセットを使用します。
- 14 脳を解剖まで、手順 6.1-6.10.
注: 試金実行する解剖の開始からの合計時間が 30 分を超えない。
7. 解剖脳 96 ウェル代謝アッセイ細胞板 (2 日目) を添加
- 実験、実験など、制御、拘束専用、および背景の井戸で使用されている 96 ウェル代謝アッセイ プレート (材料表) の井戸にアッセイ メディアの 50 μ L を追加します。
- 一つの脳が、A2 A8 から B2-B8 セル板のピンセット、へら、またはピペットを使用しても慎重にします。
メモ: これは解剖顕微鏡から実行することがあります。 - 解剖顕微鏡の下で井戸の底に脳をシンクするのに曲がった針マイクロ プローブを使用します。
- 優しく、プローブを用いた 3 つの上げられた球の真ん中に脳を配置します。
8. 96 ウェル代謝アッセイ セル板 (2 日目) にマイクロ組織拘束の付加
- ピンセットを使用すると、よく、アッセイ プレートの端に微小組織拘束を配置し、顕微鏡を使用して検査を下向きにプラスチック製のリングと上メッシュ指向です。
- 顕微鏡の下からプレートを削除し、ピンセットを使用して、双方の拘束を把握し、優しく、よく落ちる。
- 井戸の中に拘束をプッシュ ダウンするのに曲がった針マイクロ プローブを使用します。
- 顕微鏡下組織拘束を通じて脳を見ることができるし、井戸に中央揃えされているを確認します。
- 手順アッセイになりますすべての井戸の 8.1-8.4-C2 C8 ・ B2 B8、A2 A8。
- アッセイ実験の各メディアの 130 μ L、制御、および拘束専用井戸を慎重に追加します。
- 脳とミクロ組織拘束が顕微鏡下で可視化してプレゼンテーション メディアを追加しながら移動していないことを確認します。
- コントロールの背景として使用するための 4 つのコーナー井戸にアッセイ メディアの 180 μ L を追加します。
9. 代謝アナライザー、アッセイ (2 日目) の開始セル板の追加
- 平衡とキャリブレーションがサンプルを含む細胞の版を要求するソフトウェアを待っていることによって完了しているを確認します。
- トレイを開く] を選択し、ユーティリティ プレートを取り出す装置を待ちます。
- ユーティリティ プレートを削除し、同じ方向に、ふたなしのセル板を追加します。
- セル板を取り出して、トレイを閉じる楽器「負荷セル プレート」を選択し、、分析を開始。
- 測定値を表示リアルタイム ソフトウェアを実行してコンピューターの画面上の誤差範囲。
- 分析が完了すると排出セル板とカートリッジを取り外します。
注: 対カートリッジとセル板ことができます再利用 5 x。
10. 後測定分析 (2 日目)
- 解剖顕微鏡を使用して、脳とミクロ組織拘束がまだ正しく配置されて井戸の分析が完了した後を確認します。異常と任意の井戸を分析から除外します。
- 酸素消費率 (OCR) とさらに詳しい分析細胞の酸性化率 ecar (と) データをエクスポートします。
Representative Results
ここで提示されたプロトコルには、以下の仕様を満たすマイクロ組織拘束が必要です。96 ウェルの細胞板の下部に場所の脳が成功しなかったを保持するために他の方法を使用して (図 2 aおよび2 b)。まず、プレートに組織の密着を高める様々 なエージェントがテストされました。市販の組織接着剤 (材料表) がそれぞれセルとセル板と回転楕円体プレート オルガノイドの使用推奨します。よく表面に付着する脳が登場した当初は、酸素消費量 (OCR) の測定値は低かったし、脳が (図 2 a) よく表面にもはや接続したことを明らかにしたアッセイ後井戸を観察します。同じ結果は、スーパー接着剤 (図 2 a) で発生しました。次に、(図 2 b) 井戸の底の小さなチャンバー内で脳が試行されましたを保持する小さな画面を製造します。
金属スクリーンは生産高 OCR 朗読だけで、(図 2 b) の場所に画面を保持高分子リング画面を金属でした。プラスチック製のメッシュ網は、同じ高分子リングで使用されました。このデバイスは、得られる否定的な OCR 読み取りを引き起こされます。最後に、ミクロ組織拘束は 0.146、0.0125 の厚さで 0.1335 の内径と 0.016 に (材料表) の高さでの外径を測定リングの不活性ポリマーを使用して設計されていた。スーパー接着剤 (材料表) は、直径 (材料表) の 0.0039 の特定の孔径のナイロン メッシュにリングを付ける使用されました。ポアサイズは重要、それは空気の泡の形成を伴わないメディアと代謝物の交換を許可まだまだ脳へのバリアとして機能します。これらの拘束だけで読書は、ほとんどない OCR の結果し、再現性のある測定値 (図 2 aおよび2 b) を可能にする脳を使用します。アッセイは、井戸に脳が正しく配置されてまだことを示した後の検証。これらの組織拘束は市販されていない現在が、上記の仕様に従うことによって製造することができます。これは、精密加工が必要ですが、ほとんどのマシン ショップは上記材料を用いたこの拘束を再現できます。
プロトコルは試金メディア、アッセイを実行、する前に、時間および温度 (図 3) のアカウントにさらに最適化されていました。当初は、試金で設定されたシュナイダー中幼虫体内環境をモデル化します。ただし、pH を使用、ecar とを測定しているので、使用メディアは緩衝剤を含めることはできません。このメディア、したがっては、カスタムする、高価であります。これを最適化するには、代謝解析 (材料表) 用に設計された市販のアッセイ メディアがシュナイダー メディアの代わりに使用されました。モデル分析メディア条件 (図 3 a) わずかに血糖レベルを上げるときにも OCR のレベルは変更された、.この時点からすべてのアッセイは、アッセイ培地で実施されました。酸素消費量と細胞外酸性化率を示した応答知られているミトコンドリア阻害剤で処理するかどうか、観察することによって、メディアにサプリメントが最適化されました。次に、待っている間、解剖および分析の実行を行った。OCR のレベル (図 3 b) 3 h のインキュベーションの大幅減。図 3 Dは、成虫および幼虫の脳の OCR と ecar とレベルを安定させるときは、第 6 回の時点で違いを示します。したがって、プロトコルは実験ケース未満で 30 分間インキュベーションが示唆された温度平衡を必要としない限りすぐに次の解剖、分析を開始することを示します。代謝のアナライザーは、11 ° C に設定するアッセイ中 25 ° C の温度では、インキュベータに格納されます。周囲温度と機器操作のため、温度が上昇している場合、(図 3) OCR レベルの低下が観察されます。これは、組織の死に起因すると仮定されます。
幼虫及び成虫とアッセイ脳朗読の中で安定した 150 pmol/分をわずかに上回る OCR の結果を最適条件に従っている場合 6 回ポイント、アッセイ (図 4 b) に ~ 25 分。このレートは、少なくとも 30 分 (図 4 a) と 2 h (データは示されていない) まで維持されます。Ecar とは 6 時間時点 (図 4) で幼虫の脳の脳よりも若干低いが、(図 4) で、少なくとも 30 分間保持されます。この発見は、成長をサポートする幼虫の段階で解糖作用の増加に対応しています。オリゴマイシンなど、ミトコンドリア阻害剤と注射を下げる ATP 依存性呼吸を明らかにし、さらにロテノン、アンチマイシン A 下げる治療非ミトコンドリアの酸素消費量 (図 5 a を明らかにする OCR OCR 朗読).このデータは、これらの阻害剤が脳組織に浸透することができ、さまざまな遺伝子型の脳でのミトコンドリアの呼吸を比較する使用ことができますを示しています。この試金、ミックス、待機、および消費率ではなく、酸素レベルを観察し、混合した後、測定時間を最適化した、酸素レベルは測定前の水準に戻った。
図 1: 代謝のアナライザーで幼虫の脳 OCR と ecar と測定の模式図.カートリッジは、分析を実行する前に日を用意しています。次の日薬は、カートリッジの注入ポートに追加されます。キイロショウジョウバエ幼虫の脳を解剖した、井戸の底には、脳を保護するミクロ組織拘束が追加されます。脳と細胞板は代謝のアナライザーで試金されるし、データを分析します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: マイクロ組織拘束は代謝活性であり、よくプレートの下部のチャンバーに脳を格納します。オレゴン州 R + キイロショウジョウバエ幼虫脳の (A)、OCR は組織接着剤 (材料表) または脳が超井戸の底に接着すると塗装の井戸で測定します。結果は、脳の微小組織の拘束を使用して井戸の底に位置しているのと比較されます。(B)、OCR は、アッセイのメディアと金属、高分子リング、プラスチック製のメッシュ網と高分子リングまたはマイクロ組織拘束で金属を含む井戸で測定されます。p-値 < 0.05 * * p-値 < 0.01 * * * p-値 < 0.001、* * * p-値 < 0.0001。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: メディア、インキュベーション時間と温度の最適化。(A)、OCR がオレゴン州 R + キイロショウジョウバエで測定幼虫脳ピルビン酸ナトリウムとシュナイダー メディア (S2) を使用して追加され、グルコースと S2、ピルビン酸ナトリウムを追加し、追加ブドウ糖とナトリウムのピルビン酸とメディアを分析します。(B)、OCR は、アッセイ前、3 時間後またはアッセイ前培養の 30 分後に幼虫の脳で測定されます。(C)、OCR は試金実行 33 ° C の 25 ° C の温度で幼虫の脳で測定します。6 番目の時間ポイントのグラフを示します。(D)、OCR は、アッセイ前、3 時間後またはアッセイ前培養の 30 分後に幼虫の脳で測定されます。6 の時点のデータが報告されます。p-値 < 0.05 * * p-値 < 0.01 * * * p-値 < 0.001、* * * p-値 < 0.0001。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: OCR と ecar とは大人の測定再現性をもってと脳を幼虫キイロショウジョウバエ。(A)、OCR パネルAから 6 時までの 30 分 (B)、OCR データはグラフ化オレゴン R + キイロショウジョウバエ成虫・幼虫の脳測定が。これは、OCR の測定値が安定化時間のポイントです。パネルから 6 番目の時間ポイントの 30 分 (D) は ecar とデータはグラフ化 (C) は ecar とキイロショウジョウバエの成虫・幼虫の脳測定が。これは、ecar と測定値が安定化時間のポイントです。p-値 < 0.05 * * p-値 < 0.01 * * * p-値 < 0.001、* * * p-値 < 0.0001。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: オリゴマイシンは ATP 依存性呼吸を明らかにするキイロショウジョウバエ幼虫脳 OCR レベルを下げるし、ロテノン/アンチマイシンさらに下げる非ミトコンドリアの酸素消費量を明らかにする OCR 。(A) の OCR は 20 μ M オリゴマイシンおよび 5 μ M ロテノン/アンチマイシン A 混合物による治療後オレゴン州路キイロショウジョウバエ幼虫脳で測定します。コントロールと拘束専用の井戸は、アッセイのメディアを注入しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
ここでは、キイロショウジョウバエ幼虫と大人の頭脳の前のヴィヴォ代謝解析手法を説明します。基底条件下で酸素消費量と細胞外酸性化率を示し、どのように代謝活性脳はティッシュをミトコンドリアと解糖系呼吸に依存になっているかどうかを決定することができます。それぞれ11。
阻害薬や治療薬で脳の治療さらに組織の新陳代謝の状態に関する情報を提供できます。ワールブルク効果22または23glutaminolysis を調査するグルタミンをテストするグルコースなどの特定の代謝物への依存関係を決定するため、代謝基質を追加もできます-代謝リプログラミングに共通な。長期的な研究は、幼虫やハエは薬の注入ポートを使用して代わりにも供給される可能性も、脳は、間隔または実験的なデザインによって、エンドポイントで試金することができます。このメソッドは、多数のアプリケーションの最適化することができます。
このメソッドは、脳に最適化されていますが、他の幼虫18および成体組織を分析する使用ことができます。また、他の小型のモデル システムは、全体の生物18または組織を測定するこのメソッドを利用できます。他のシステムに対してこのメソッドを最適化する唯一の制限は、臓器、組織、または有機体のサイズです。マイクロ組織拘束によって作成された商工会議所は、分析を実行するサイズ バリアです。脳またはテストされている組織の代謝の出力が小さすぎるとサンプル サイズは制約ではありません、サンプルをプーリングはアッセイの測定と感度を向上させる使用できます。他のアプリケーションのこのプロトコルの変更のみ 1) 適切な措置の選択を含むマイナーな最適化を必要とし、ミックス サイクル番号とタイミングと 2) ティッシュのための効果的な治療法の濃度を決定します。各サイクル中に代謝のアナライザーで測定する監視酸素濃度によりメジャーと混合時間を求めた。これは、実行が完了した後、概要ウィンドウの Y2 軸ボタンでO2を選択して表示できます。各サイクル中にドロップイン酸素混合サイクル中に初期酸素濃度へのリターンによって続いて測定時に、組織の酸素消費を反映する必要があります。このパターンが観測されるまで、メジャーとミックスの回をテスト必要があります。このメソッドを使用すると、他の昆虫の脳を研究されています。これらの脳は、ここで使用されるが、まだ組織拘束によって生成されたチャンバ内で適合飛ぶ脳よりも大きかった。これらの脳から OCR の測定値が高かったとして 400 pmol/分 (データは示されていない)。全体フライ酸素消費量18,24を測定する他の研究に揃えて OCR 率と同様に、これらの研究からの結果は、キイロショウジョウバエの脳が酸素限定でなかったことをお勧めします。ショージョーバエ ・脳と他の生物からの組織では、このメソッドを適用すると、4 つの重要な手順に特別な注意が必要です。
正常に再現性と生物学的関連性の測定を達成するために従う必要があるプロトコルの重要なステップがあります。まず、マイクロ組織拘束の使用は、このメソッドが必要です。製造仕様と記載されている教材を使用して、これらの制約は、不可欠です。材料は、不活性化学成分と空気の泡の作成せず混合手順中に使用する適切なメディア交換する彼らの能力のために選ばれました。第二に、組織の代謝の出力を最大にするタイムリーな郭清とプレートの準備が必要です。短い郭清度脳著しく損なわない必要があります。他の研究は、ハエ脳できます後保持するように時間日生きている郭清、灌流で正しく保存されている場合の部屋の25を示しています。しかし、脳は、アッセイの前に時間の長い期間のためのアッセイ メディアに座って残っている場合、図 3Bと3 Dを見て、酸素消費量が減少します。アッセイ中サンプルはサイクルごとにミキシング ステップを受けます。この混合だけでなく化学物質の注射でエイズ、またメディアを循環させるし、酸素を提供する行為。脳は代謝活性これらメジャー ミックス サイクル中に長期間の彼らのベンチ上のメディアで培養するだろうよりも滞在することがあります。そのため、幼虫の脳の解剖は、この試金を設定する開始する前に習得すべき。このアッセイのセットアップ時、脳の数を最小限に抑えるために遺伝子の数が少ないを分析するとき必要し、井戸を利用します。これは、解剖と試金の測定の間の遅延を防ぐ。第三に、安定した温度を維持する生理学的条件で代謝率を分析する必要があります。増加の測定温度は、低酸素消費量 (図 3) で観測された、組織死を引き起こすことができます。ハエは、実験目的のため異なる水温で飼育されている、もしこの温度で測定をまた実行してください。アッセイは、異なる温度で実施される場合、解剖は、室温で実行最も可能性の高い、メッキと拘束された脳が分析を実行する前に 15 分に必要な温度で培養する必要があります。最後に、観測井戸後アッセイは配置組織と測定値が影響を受けるかどうかを決めることが大事。時折、1 つ外れ値も除去しうる、解剖顕微鏡の下でプレートを観察した後組織のいずれかの損失または mispositioning のためのデータ解析から脳が井戸の中心が滑ってしまったし、立ち往生しているがあるでしょう[拘束の高分子リング。拘束された井戸に正しく固定されていないと混合サイクル中に邪魔された場合、組織が失われます。一方、彼らは分析から除外されていない場合、これらのイベントのどちらもは頻繁に起こる、彼らは大幅にレートの値を下げます。
監視の酸素消費量と細胞の酸性化による全体組織代謝流束の測定は、遺伝的風景や他の実験条件によって代謝を変更する方法を理解するための生物学的に関連するメソッドを提供します。このメソッドは単一の代謝の変化を検出する十分なキイロショウジョウバエ脳停止流れ呼吸または間接熱量測定法を使用して可能ではないです。またクラーク電極を使用して酸素消費量を測定するよりより少なく技術的に困難です。このプロトコルの追加の利点は、ウェルあたり 1 つの全脳を分析する機能です。96 ウェル フォーマットより敏感な測定値とアッセイごとに必要なサンプル数が小さいため一度にしたがって、1 つ以上の遺伝子型ができる試金されます。体内代謝測定はまだ挑戦し慎重に必要とする飼育し、同期された動物、このプロトコル高速で比較的単純な方法を記述するD の多数の代謝感度を分析する可能性があります。キイロショウジョウバエ幼生及び成体の脳。
Disclosures
M. チップは、このプロトコル17に記載されているマイクロ組織拘束のための仮のパテントを保持しています。
Acknowledgments
ブルーミントン ショウジョウバエ ストック センター (NIH P40OD018637) から取得した株式は、この研究で使用されました。この出版物で報告された研究医歯薬学研究エクセレンスから国立科学研究所の一般医療許可番号の下健康の国民の協会の制度開発賞 (アイデア) ネットワークに支えられP20GM103430、およびロードアイランドの基礎によって。著者は、このプロトコルの開発に彼らのサポートのウォーターズ J と p. Snodgrass ベルトをありがとうございます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Assay medium | Agilent | 102365-100 | |
| Calibrant solution | Agilent | 100840-000 | |
| Corning Cell-Tak Cell Tissue Adhesive | Sigma Aldrich | DLW354240 | |
| delrin | Grainger | 2XMK6 | |
| Drosophila Schneider Media | Thermo Fisher | 21720-024 | |
| Dumont High Precision Tweezers (style 5) | Ted Pella | 5622 | |
| Loctite 409 | Amazon | ||
| Mitostress kit | Agilent | 103015-100 | oligomycin, rotenone, and antimycin A included |
| Netwell inserts (6-well) | VWR | 29442-136 | |
| nylon mesh | Component Supply | U-CMN-64 | |
| Parafilm M wrapping film | Fisher Scientific | S37440 | |
| PYREX spot plate | Fisher Scientific | 13-748B | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | ||
| Wave v2.4 XFe96 analyzer software | Agilent | https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/software-download-for-wave-desktop | free download to mac or windows |
| XFe96 catridge and cell plates | Agilent | 102416-100 |
References
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