Summary
선물이 산소 소비와 초파리 melanogaster 애벌레와 성인 두뇌에 있는 세포 외 산성화를 측정 하기 위한 프로토콜. 신진 대사 분석기는 적응 하 고 최적화 된 프로토콜 활용 됩니다. 마이크로 조직 억제는이 프로토콜의 중요 한 구성 요소 설계 하 고이 분석에 그들의 사용을 위해 특히 창조 되었다.
Abstract
이 프로토콜 초파리 melanogaster 애벌레와 성인 두뇌에서 대사를 측정 하는 방법을 설명 합니다. 전체 기관에 대사를 측정 기본 세포와 세포를 분석할 때 생포 되지 않을 에너지 사용률의 조직 수준의 이해를 제공 합니다. 이 분석은 비보 전, 함께 하나의 조직에서 기능을 수행 하기 위해 노력 하는 전문된 셀 수에서 측정 가능 하 고 더 밀접 하 게 비보에 기관 모델. 대사 프로그래밍은 많은 신경 질환, 신 생물, 및 신경 퇴행 성 질환 등에서 관찰 되었습니다. 이 프로토콜은 상용 대사 분석기를 사용 하 여 신경 질환 모델에서 대사의 D. melanogaster 커뮤니티의 조사를 돕기 위해 개발 되었다. 전체 두뇌 대사 분석기에서의 대사를 측정은 두뇌의 형상 때문에 도전 이다. 이 분석기는 96 잘 접시의 하단에 남아 샘플을 요구 한다. 셀 샘플 및 조직 펀치 셀 플레이트의 표면에 고착 하거나 회전 타원 체 접시를 각각 활용 수 있습니다. 그러나, D. melanogaster 두뇌의 구형, 3 차원 모양 접시에 준수에서 조직을 방지 합니다. 이 프로토콜 분석기의 두 고체 센서 프로브에서 대사 측정 하면서 두뇌의 어떤 움직임을 방지 하 여이 문제를 circumvents 특별히 디자인 하 고 제조 마이크로 조직 자제를 요구 한다. 산소 소비와 세포 외 산성화 요금 재현 하 고 신진 대사 억제제로 치료에 민감한 있습니다. 표본 크기는 구속에 의해 생성 된 챔버를 초과 하지 않는 사소한 최적화이 프로토콜은 전체 조직 또는 모델 시스템으로 사용 하기 위해 적용할 수 있습니다. 기초 대사 측정 및 미토 콘 드리 아 억제제로 치료 후 분석이이 프로토콜에서 설명 하는 동안 에너지 소스 환경 설정 및 양육 환경 등 수많은 실험 조건, 심문 수 있습니다.
Introduction
신진 대사 프로그래밍 세포종 님 (GBM), 헌팅턴 병, 그리고 주요 우울한 무질서 (MDD)1,2,3를 포함 하 여 많은 신경 질환에서 발견 되었습니다. 마찬가지로 대사 치료 전략의 초점이 되 고, 기본적인 대사 연구를 위한 도구 고급. 그러나, 이러한 방법의 대부분 셀 라인 및 1 차 셀을 공부 하거나 분석 후 고정 또는-냉동 큰 조직 설계 되었습니다. 일부 접근 simplistically 다른 착 색 인쇄기 질량 분석4 같은 목표에 대 한와 함께에서 활용 하 여 더 많은 비용과 복잡 한 분석을 이용 하는 동안 특정 대사 산물을 측정 하는 장비에 의존 했습니다. 이해 하 고 더 큰 변화 프리,5,6 , 대사 플럭스 분석 프로 파일링 대사 (MFA)7 등장 대규모 proteomic 게놈 연구를 보완. 프로 파일링 MFA 시간이 지남에 레이블이 대사 산물의 추적을 허용 하 여이 따라 확장 하는 동안 시간에 셀 또는 한 지점에서 조직에 대사 산물의 양적 표현을 제공 합니다. 후자 되었습니다 에너지 소스가 다르게 셀 또는 질병 상태8에서 조직에 활용 됩니다 어떻게 공개 하는 데 유용. 그러나, 이러한 메서드는 전반적인 신진 대사 속도의 측정을 포함 하지 않습니다.
가 작은 모델 시스템의 전반적인 신진 대사 상태, 클라크 전극9 등 간접 열 량10, 전통적인 방법, 산소 소비를 측정 하는 데 사용 하거나 수 정지 흐름 respirometry에 대 한 구성 각각 산소 및 이산화탄소 농도 측정 합니다. 이러한 기술을 정확 하 게 판독 신진 대사 유기 체 수준에서 프로그래밍에 대 한 통찰력을 제공 하는 제한이 있습니다. 클라크 전극의 사용은 기술적으로 도전적 일 수 있다 하 고 높은 처리량 연구 설계 되지 않았습니다. 정지 흐름 respirometer 감도 시험의 세포 또는 조직 하는 데 필요한 작동 수 없습니다. 몇 년 전, 새로운 기술11이러한 작은 응용 프로그램 위해 특별히 개발 되었다. 이 악기 처음 산소 소비와 세포 선 및 24 또는 96 잘 형태로 1 차 셀의 세포 외 산성화를 측정 하도록 설계 되었습니다. 설정 및 데이터 출력의 단순 전통적인 접근 하는 대신이 메서드를 설립. 이 방법론 셀에 대 한 강력한 도구 이며, 최근 진보 조직 펀치12,,1314의 측정에 대 한 허용. 그러나, 이러한 분석에 활용 하는 방법 작은 모델 시스템에서 전체 장기의 측정에 대 한 허용 하지 않습니다.
질병 모델의 변화 분석은 종종 동일한 조직 내에서 거주 하는 전문된 기능의 세포 사이 상호 작용을 포함 한다. 예를 들어 glial 세포 신경 세포에 의해 이용 하는 대사 산물 생산. 이러한 상호 작용을 변화는 신경 생존15필요 합니다. 작은 모델 시스템은 이러한 질문을 조사를 위해 유리한. 세포 유형의 다양 한 포함 하는 전체 기관의 신진 대사를 측정 하는 연구는 에너지 사용률 비보의 이해에 추가 됩니다. 최근, 베 커 외. 전체 비행 머리16에서 산소 소비량을 측정 하는 방법 보고. 24 잘 셀 접시의 한 잘에서 함께 헤드의 수를 풀링 하 여 산소 소비 수치는 대사 분석기를 사용 하 여 얻은 했다. 대량이이 방법에 대 한 해 부 하기 때문에이 머리, 몸에서 쉽게 분리를 위해 잘 작동 하는 동안 그것 애벌레 머리 같은 기관에 대 한 사용 하기 훨씬 더 어려운입니다. 따라서, 산소 소비와 세포 외 산성화 판독의 감도 증가, 96-잘 셀 접시를 활용 하는 방법 단일 전체 애벌레 두뇌 분석 결과 개발 되었습니다.
이 연구에 사용 된 대사 분석기 96 잘 세포 격판덮개의 우물의 바닥에 남아 측정 되 고 샘플을 요구 한다. 세포와 조직에 상대적으로 평면, 이것은 도전; 그러나, D. melanogaster 애벌레와 성인 두뇌, 그것은 전통적인 플레이트 코팅 프로토콜을 사용 하 여입니다. 두뇌의 구형 3 차원 모양 접시 표면에 안정적으로 준수 하지 것입니다 그리고 않는 자주 우물에 제대로 배치 하는 동안 손상 된. 이 새로운 프로토콜의 중요 한 부분이입니다 설계 및 변화 측정을 방해 하지 않고에 거주 하는 두뇌에 대 한 작은 챔버를 제공 하는 마이크로 조직 억제17 의 개발. 생성 된 챔버는 약 높이 0.016 많은 D. melanogaster 두뇌를 쉽게 충분 한 공간을 제공 합니다. 속박 불활성 폴리머 링에 부착 된 나일론 메쉬의 구성 하 고 추가 논의 될 대표 결과에. 이 지지대를 사용 하 여 변화 측정에 대 한 해 부 머리를 준비 하는 데 필요한 시간을 최소화 합니다. 측정 절차를 최적화 안정, 재현성 산소 소비와 세포 외 산성화 요금 6 측정 주기 (25 분) 후 생성 합니다. 두뇌는 수 주사 치료제, 억제제, 또는 다른 치료 를 통해 대사 분석기 카트리지 마약 배달 포트 2 h의 최소이 조건 하에서 metabolically 활성 상태로 유지. 이 프로토콜은 쉽게 다른 조직 및 작은 모델 시스템18에 대 한 적응 될 수 있습니다.
아래 상세한 프로토콜 때 미토 콘 드리 아 스트레스와 도전을 전체 초파리 애벌레 두뇌에 산소 소비를 시험 하는 방법을 설명 합니다. 스트레스는 뇌, oligomycin ATP synthase19를 억제 하기 위해 추가 됩니다. 기저 수치에서 산소 소비량에서 감소 두뇌에 ATP 따라 호흡 량의 측정을 보여줍니다. 로 테 논20 와 antimycin21치료 후 산소 소비에 더 감소, 전자 전송 체인 단지의 억제제 I 및 III, 각각, 표시에서 미토 콘 드리 아 비 산소 소비 금액은 두뇌입니다. 이 분석 결과 비행 두뇌에서 어떻게 미토 콘 드리 아 호흡의 한 예로 비교 될 수 있습니다 및 신진 대사 변화 genotypes에 비교할이 프로토콜을 사용 하는 방법을 이다. 그러나,이 프로토콜은 단순히 기저 산소 소비와 세포 외 산성화 속도, 또한 특정 한 에너지 사용률 또는 기판 사용률 가설을 조사 하는 더 정교한 연구 디자인으로 측정 하 적응 될 수 있다.
Protocol
1. 시험 준비 (주 1)
- 인큐베이터 또는 11 ° c.에 설정 온도 제어 룸 에서도 대사 분석기 (자료 테이블)
참고: 분석 결과 실행 하는 동안 발생 하는 ~ 14 ° C 온도 변동에 대 한 허용이 온도 25 ° C에서 측정에 이상적입니다. 이것은 실행 하는 동안 악기에 의해 생성 된 열에 의해 발생 합니다. - 신진 대사 분석기에 연결 된 컴퓨터에 적절 한 소프트웨어를 엽니다. 화면 하단 왼쪽에 숫자 온도 클릭 하십시오. 새로운 창이 열리면에서 "에 히터" 명령 옆에 있는 상자에 클릭 하 고 확인 표시가 나타납니다 확인 하십시오. 25 ° C에 온도 조정 하 고 화살표를 사용 하 여 0.2 ° C를 허용 범위를 조정 합니다.
참고: 몇 시간 안정적인 온도 달성 하기 위해 필요 합니다. - 카트리지 컨테이너 (자료 테이블) 열고 프로브를 건드리지 않고 유틸리티 접시에서 카트리지를 제거 합니다.
참고: 유틸리티 접시 카트리지 교정 중 사용 하 고 신진 대사 시험을 실행 하는 동안 사용 되지 않습니다. - 유틸리티 접시와 센서를 rehydrate 유틸리티 접시 위에 다시 카트리지는 카트리지의 조사 장소에 calibrant 솔루션 (자료 테이블)의 200 μ를 추가 합니다. 프로브를 터치 고 빛에서 그들을 보호 하지.
- 파라핀 필름 카트리지 봉인.
- 25 ° c.에 하룻밤 카트리지를 품 어
2. 분석 결과 미디어 준비 (주 2)
- 분석 결과 매체에 포도 당 10 m m와 10mm 나트륨 pyruvate를 추가 합니다.
- 액체는이 온도에 equilibrated까지 25 ° C에서 매체를 품 어.
- PH 미터를 사용 하 여 7.4에 pH를 조정 합니다.
3. 초파리 melanogaster 두뇌 (주 2)의 변화 분석에 대 한 소프트웨어의 설정
- 1.2 단계에서 사용 하는 대사 분석기에 대사 소프트웨어를 설정 합니다.
- 소프트웨어 홈 화면에 "서식 파일"을 선택 합니다.
- "빈" 새로운 분석 결과 디자인을 시작 하려면 두 번 클릭.
- 셀 분석 결과 플레이트의 디자인을 보려면 위쪽 도구 모음에서 "접시 지도" 버튼 클릭 합니다.
참고: 셀 시험 접시 뇌 샘플을 포함 합니다 하 고 신진 대사 시험 실행을 시작 하기 전에 카트리지와 결합 될 것 이다. -
추가 클릭 합니다 그룹 버튼 3 배.
- "그룹 1" 레이블을 두 번 클릭 하십시오 하 고 이름을 "실험"로.
참고:이 그룹 비행 두뇌와 마이크로 조직 억제 약물 치료 포함 됩니다. - "그룹 2" 레이블을 두 번 클릭 하십시오 하 고 "컨트롤"로 이름을 바꿉니다.
참고:이 그룹 비행 두뇌와 마이크로 조직 억제 약물 치료와 함께 포함 됩니다. - 두 번 클릭는 "그룹 3" 레이블 및에 그것의 이름을 "만 구속".
참고:이 그룹은 두뇌 나 약물 치료 없이 마이크로 조직 구속을 포함 됩니다.
- "그룹 1" 레이블을 두 번 클릭 하십시오 하 고 이름을 "실험"로.
-
우물 샘플 셀 접시에 배치 될 것입니다에 따라 각 그룹에 할당 합니다.
- "시험용" 라벨에 클릭 하 고 우물 B2-B8 접시에 강조.
- "제어" 라벨에 클릭 한 다음 접시에 웰 스 c 2-c 8을 강조 표시 합니다.
- 클릭은 "구속 유일한" 레이블 그리고 접시에 하이라이트 웰 스 D2 D8.
- 모든 4 개의 코너 (A1, A12, H1, H12) 배경으로 지정을 확인 하십시오.
참고: 웰 스 판의 경계를 따라 어떤 가장자리 효과 줄이기 위해 사용 하지 않습니다. 이 소프트웨어에는 기본 설정입니다.
-
프로토콜을 설정 하려면 위쪽 도구 모음에서 "프로토콜" 버튼 클릭 합니다.
- "편집 측정 정보는 기준선 측정 상자에서 클릭 합니다.
- 및 아래쪽 화살표를 위쪽을 클릭 하 여 대사 분석기는 "3 시" 기저 측정 주기 시간을 변경 하 여 두뇌를 측정 하는 시간을 조정 합니다.
- 신진 대사 분석기 기저 대기 시간을 변경 하 여 두뇌 측정 사이의 대기 시간을 조정 "0:00" 아래쪽 화살표 및 위쪽을 클릭 하 여.
- 신진 대사 분석기는 미디어 믹스 것입니다 시간 조정 변경에 기초 하 여 두뇌를 측정 하기 전에 혼합 사이클 시간 "1:00"을 및 아래쪽 화살표를 위쪽을 클릭 하 여.
- 측정, 대기, 및 혼합 사이클을 포함 하는 기저 사이클의 총 수를 조정 "7" 아래쪽 화살표 및 위쪽을 클릭 하 여.
참고: 안정 산소 소비 속도 측정 분석 결과의 시작부터 ~ 25 분 후 얻을 수 있습니다. - 상단 왼쪽된 도구 모음에 있는 "추가 주입" 단추를 클릭 합니다.
- 레이블에 "주입" 클릭 하 고 "Oligomycin"로 변경.
- 주입 측정, 대기, 및 혼합 시간에 기저에 대 한과 일치 하도록 조정 합니다.
- 및 아래쪽 화살표를 위쪽을 클릭 하 여 "6" 사출 사이클의 총 수를 조정 합니다.
- 단계 3.7.6-3.7.8 반복 하지만 "부패/AA" 레이블을 변경 하 고 아래쪽 화살표 및 위쪽을 클릭 하 여 주입 주기 7의 총 수를 조정.
- 위쪽 도구 모음에서 "분석 결과 실행" 버튼을 클릭 합니다.
- "" 분석 결과 저장 하 고 분석 결과 카트리지 (자료 테이블) 설정을 시작.
4. 카트리지 교정 (주 2)에 대 한 준비
-
25 ° C 배양 기에서 카트리지를 제거 하 고 커버를 벗어.
- 100 μ M oligomycin의 20 μ 작은 상단 왼쪽된 원형 사출 포트, 포트 A, 셀 접시에 모든 해당 실험 웰 스에 대 한 카트리지를 추가 하 고 제어 및 배경 웰 스를 포함 한 다른 모든 웰 스에서 포트 a 분석 결과 미디어의 20 μ를 추가.
참고: 카트리지 각각 무슨 샘플을 포함 됩니다 해당 셀 접시 하 96 웰 스의 4 포트 (A-D)를 포함 합니다. 이 단계는 샘플을 추가 하기 전에 수행 됩니다. 약물 대사 분석기로 주입 되 면 잘 100 μ M oligomycin 결과의 20 μ 셀 접시에 10 μ M의 최종 oligomycin 농도에 추가. Oligomycin은 ATP synthase의 억제제입니다. 결과 산소 소비 값 두뇌에 ATP 연결 호흡의 양을 반영 합니다. 제대로 지정 된 우물에 약물을 주입, 순서 동일한 편지의 모든 포트를 동일한 볼륨의 액체, 심지어 아니라면 사용에서으로 채워져야 합니다. - 작은 상단 오른쪽 원형 포트 50 μ M로 테 논/antimycin A의 22 μ를 추가 하 고 셀 접시에 모든 해당 실험 우물 카트리지에서 B, 포트 제어 및 배경 웰 스를 포함 한 다른 모든 웰 스의 포트 B 분석 결과 미디어의 22 μ를 추가.
참고: 약물 대사 분석기로 주입 되 면 잘이 마지막로 테 논/Antimycin 셀 접시에 5 μ M의 농도에서 발생 합니다. 로 테 논 및 antimycin A 억제제 전자 전송의 사슬 복합물 I 및 III, 각각 있습니다. 결과 산소 소비 값 비-미토 콘 드리 아 호흡 두뇌에 반영 됩니다. - "시작 실행"을"클릭 왼쪽된 상단에 배치 하는 컴퓨터의 오른쪽에서 확장 판 로더와 함께 악기를 직면 했을 때 잘 a 1으로 대사 분석기에 유틸리티 접시와 함께 로드 된 카트리지를.
- 100 μ M oligomycin의 20 μ 작은 상단 왼쪽된 원형 사출 포트, 포트 A, 셀 접시에 모든 해당 실험 웰 스에 대 한 카트리지를 추가 하 고 제어 및 배경 웰 스를 포함 한 다른 모든 웰 스에서 포트 a 분석 결과 미디어의 20 μ를 추가.
- "나 준비" 재래식 및 샘플 포함 된 셀 접시와 함께 신진 대사 시험을 시작 하기 전에 카트리지의 교정 하려면 소프트웨어를 선택 합니다.
참고: 프로그램 파일을 저장 하 고 다음 시작을 물어볼 것입니다 평형 및 보정. 이 단계는 최대 1 h. 단계 5-8 평형 및 교정 시간 동안 실시 하는 걸릴 수 있습니다.
5. 마이크로 조직 억제 (주 2)의 준비
- 스토리지 컨테이너 (포함 70% 에탄올)에서 구속 전용 컨트롤 1 마이크로 조직 감 측정 되는 뇌 당 플러스 사용 하기 위해 적어도 3를 선택 합니다.
- 신선한 70% 에탄올과 지지대를 헹 구 고 이온된 수 3와 함께 그들을 씻어 2 분 각, 메쉬 바구니와 6 잘 플레이트 (테이블의 재료)를 사용 하 여 x. 추가 물 세척 속박 여전히 알코올 냄새를 발산 하는 경우 추가 합니다.
- 분석 결과 미디어에서 마이크로 조직 억제를 세척 하 고이 솔루션에 사용 하기 위해 준비가 될 때까지 그들을 두고.
6. 초파리 melanogaster 애벌레 두뇌 (주 2)의 해 부
- 5 (0.10 x 0.06 m m2) 핀셋 스타일, 높은 정밀도 사용 하 여 양식 오 레 곤-R 의 유리병에서 늦게 (방황) 세 번째 탈피 애벌레를 선택 합니다.
- 깨끗 한 해 자리 접시 (테이블의 자료) 1 x PBS의 500 μ를 포함 하의 우물에 유 충을 놓습니다.
참고: 별색 플레이트는 불경기, 작은 조직 및 유기 체를 해 부하는 데 사용 되는 유리 접시. - 핀셋을 사용 하 여 부드럽게에 잘 떨고 하 여 유 충을 씻어.
- 유 충 1 x PBS의 500 μ를 포함 하는 자리 접시의 깨끗 한 잘 이동 합니다.
- 해 현미경 자리 접시를 놓습니다.
- 핀셋의 두 번째 쌍 눈 고리를 잡고 족집게, 한 쌍의 중앙부에서 유 충을 파악.
- 부드럽고 매끄럽게 핀셋의 두 세트를 사용 하 여 반대 방향에서 유 충을 당겨.
- 일반적으로 숙박 눈 고리에 연결 하 고 것입니다 일반적으로 눈 더듬이 디스크 그것에 연결 된 뇌를 시각화 합니다.
- 조심 스럽게 눈 후크 사용 하 여 뇌에에서는 뇌에서 추가 조직 제거. 마지막으로, 뇌에서 눈 고리를 구분 합니다.
- 핀셋을 사용 하 여 새로운 잘 자리 플레이트 1 x PBS를 포함 해 부 두뇌 이동.
- 14 두뇌를 해 부는 때까지 단계 6.1-6.10을 반복 합니다.
참고: 분석 결과 실행을 해 부의 시작에서 전체 시간 30 분 넘지 말아야 한다.
7. 96 잘 변화 분석 결과 셀 접시 (주 2)를 해 부 두뇌의 추가
- 실험, 실험을 포함 하 여, 제어, 구속 전용 및 배경 웰 스에서 사용 되 고 96 잘 변화 분석 결과 플레이트 (자료 테이블)의 우물에 분석 결과 미디어의 50 μ를 추가 합니다.
- 신중 하 게 a 2-a 8를 b 2-b 8 셀 판의 핀셋, 주걱, 또는 한 피 펫을 사용 하 여 각 잘에서 한 뇌를 배치 합니다.
참고:이 해 현미경에서 수행할 수 있습니다. - 해 부 현미경 아래 우물의 바닥에 침 몰 하는 두뇌를 구부러진된 바늘 마이크로 프로브를 사용 합니다.
- 부드럽게 프로브를 사용 하 여 세 가지 제기 분야 중간 뇌 위치.
8. 96 잘 변화 분석 결과 셀 접시 (주 2) 마이크로 조직 억제의 추가
- 핀셋을 사용 하 여, 마이크로 조직 감 분석 결과 접시의 가장자리에, 놓고 그것 아래로 플라스틱 반지와 상단에 메쉬 중심은 검사를 현미경을 사용 하 여.
- 현미경 아래에서 접시를 제거 하 고 양쪽에 지지대를 파악 하 고 부드럽게 잘으로 드롭 하는 핀셋을 사용.
- 구부러진된 바늘 마이크로 프로브를 사용 하 여 우물에는 구속을 밀어.
- 현미경 조직 구속을 통해 뇌를 볼 수 있다 중심에 잘 확인 합니다.
- 반복 단계는 분석 결과에 있을 것입니다 모든 우물 8.1-8.4-A2-A8, B2-B8, 및 c 2-c 8.
- 신중 하 게 각 실험의 분석 결과 미디어의 130 μ, 제어 및 구속 전용 우물을 추가 합니다.
- 두뇌와 마이크로 조직 억제 현미경 그들을 시각화 하 여 미디어를 추가 하는 동안 이동 하지 않았습니다 확인 하십시오.
- 배경 컨트롤으로 사용 하기 위해 4 개의 코너 웰 스 분석 결과 미디어의 180 μ를 추가 합니다.
9. 대사 분석기 및 분석 결과 (주 2)의 시작 셀 플레이트 추가
- 확인 평형 및 교정 완료 샘플 포함 된 셀 플레이트에 대 한 메시지를 표시 하는 소프트웨어에 대 한 대기 합니다.
- "트레이 열기"를 선택 하 고 추출 유틸리티 접시를 악기에 대 한 기다립니다.
- 유틸리티 플레이트를 제거 하 고 동일한 방향에서 셀 접시를 뚜껑 없이 추가.
- "로드 셀 플레이트" 악기에 대 한 셀 접시에는 트레이 닫습니다을 선택한 다음 시작 분석 결과.
- 측정에 보기 소프트웨어를 실행 하는 컴퓨터 화면에 오차 막대와 실시간.
- 분석 결과 완료 되 면 꺼낸된 셀 접시와 카트리지를 제거 합니다.
참고: 짝된 카트리지 및 셀 접시 수 재사용된 5 x.
10. 사후 측정 분석 (주 2)
- 해 현미경을 사용 하 여 그 두뇌와 마이크로 조직 억제는 여전히 제대로 위치에 잘 분석 결과 완료 된 후 확인. 모든 우물 이상으로 분석에서 제외 합니다.
- 산소 소비 속도 (OCR) 및 추가 분석을 위해 세포 외 산성화 속도 (ECAR) 데이터를 내보냅니다.
Representative Results
여기에 제시 된 프로토콜 마이크로 조직 억제 아래에 설명 된 사양에 맞는 사용을 해야 합니다. 사용 하 여 다른 방법 96-잘 셀 접시의 바닥에 그 자리에 두뇌 실패 했다 (그림 2A 와 2B). 첫째, 다양 한 에이전트 접시에 조직 부착을 증가를 테스트 했다. 상업적으로 이용 가능한 조직 접착제 (자료 테이블) 각각 셀과 셀 플레이트 및 회전 타원 체 격판덮개, organoids의 사용에 대 한 좋습니다. 머리 잘 표면;에 등장 하는 처음, 그러나, 산소 소비 (OCR) 판독 했다 낮은, 그리고 두뇌 (그림 2A) 잘 표면에 더 이상 연결 된 공개 분석 결과 후 우물을 관찰. 슈퍼 접착제 (그림 2A)와 동일한 결과가 발생 했습니다. 다음, 우물의 바닥에 작은 챔버 내 두뇌 시도를 작은 화면을 제조 (그림 2B).
금속 스크린으로 폴리머 링 (그림 2B) 장소에 화면을 들고 스크린을 금속 않았다 혼자 높은 OCR 판독 생산. 플라스틱 메쉬 그물 같은 폴리머 반지와 함께 사용 되었다. 이 장치는 얻을 수 부정적인 OCR 읽기를 발생 합니다. 마지막으로, 마이크로 조직 억제, 0.0125의 두께에 0.1335의 내부 직경과 0.016에 (자료 테이블)의 높이에서 0.146의 외부 직경을 측정 하는 반지에 대 한 비활성 폴리머를 사용 하 여 설계 되었습니다. 슈퍼 접착제 (자료 테이블) 직경 (자료 테이블)에서 0.0039의 특정 기 공 크기와 나일론 메쉬 반지를 연결할 사용 되었다. 기 공 크기는 중요 한, 그것은 공기 방울의 형성 없이 미디어와 대사 산물을 교환할 수 있도록 아직 여전히 두뇌에 장벽 역할. 이러한 억제 혼자 읽기, 약간 더 OCR 결과 고 두뇌, 함께 사용 하면 재현할 수 신호 (그림 2A 와 2B) 허용 합니다. 확인 후 분석 결과 두뇌 우물에 제대로 위치 아직도 있었다 보였다. 이러한 조직 억제는 현재 상업적으로 사용할 수 없습니다 하지만 위의 사양에 따라 제조 될 수 있다. 하지만이 정확한 제조, 대부분 기계 상점이이 자제 위 참조 자료를 사용 하 여 재현할 수 됩니다.
프로토콜 분석 결과 미디어, 분석 결과 실행 하기 전에 허용 되는 시간 및 온도 (그림 3)에 대 한 계정에 더 최적화 되었다. 처음에, 분석 설정 했다 슈나이더 매체에 애벌레 vivo에서 환경을 모델링 하. 그러나, pH는 ECAR 측정 하는 데 사용은 사용 하는 미디어 버퍼링 에이전트를 포함할 수 없습니다. 이 미디어 따라서, 수 있다 사용자 정의 만든, 비용이 많이 드는입니다. 최적화 하려면이, 대사 분석 (자료 테이블)을 위한 상업적으로 이용 가능한 분석 결과 미디어 슈나이더 미디어 대신 사용 되었다. OCR 수준 약간 모델 분석 결과 미디어 조건 (그림 3A)에 포도 당 수준을 증가 하는 경우에 변경 되지 않았습니다. 이 시점에서 모든 분석 실험 분석 결과 매체에서 실시 되었다. 언론에 보충 산소 소비와 세포 외 산성화 요금 보였다 알려진된 미토 콘 드리 아 억제제로 치료 하면 응답 여부를 관찰 하 여 최적화 했다. 다음에 해와 분석 결과 실행 사이의 대기 시간 분석 했다. 3 h의 부 화는 크게 OCR 수준 (그림 3B) 떨어졌다. 그림 3D 성인 및 애벌레 두뇌에 대 한 OCR 및 ECAR 수준 안정화 때 6 시간 지점에서 차이 보여 줍니다. 따라서, 프로토콜 실험 온도 평형, 30 분 미만 대 한 보육의 경우 제안 필요 하지 않는 한 바로 다음 해, 분석 결과 시작을 나타냅니다. 신진 대사 분석기 분석 결과 전체 25 ° C 온도 대 한 있도록 11 ° C로 설정 하는 인큐베이터에 저장 됩니다. 온도 주위 온도와 악기 작업 경우, 감소 된 OCR 수준 (그림 3C) 관찰 된다. 이 조직의 죽음 때문에 가설입니다.
애벌레와 성인 분석 실험 결과 약간은 안정에서 150 pmol/min을 초과 하는 OCR의 판독에 두뇌 최적화 조건 뒤에 때 6 시간 점, 분석 결과 (그림 4B)로 25 분. 적어도 30 분 (그림 4A)과 최대 2 h (데이터 표시 되지 않음)이이 유지 됩니다. ECAR 약간 낮은 6 시간 시점 (그림 4D) 애벌레 두뇌에 보다 성인 두뇌에서 이며 (그림 4C) 적어도 30 분 동안 유지 됩니다. 이 이는 성장을 지원 하기 위해 애벌레 단계 동안 분해 증가에 해당 합니다. Oligomycin, 같은 미토 콘 드 리아 억제제와 주사 ATP 의존 호흡 공개 및 추가 치료로 테 논 및 antimycin A 낮춘 다 비-미토 콘 드 리아 산소 소비 (그림 5A 공개 OCR OCR 판독을 낮춘 다. ). 이 데이터에는 이러한 억제제 뇌 조직에 침투 수 있으며 다양 한 genotypes의 두뇌에서 미토 콘 드리 아 호흡 비교를 사용할 수 있는 방법을 보여 줍니다. 이 분석 결과, 믹스, 잠깐, 그리고 측정 시간 산소 수준, 아니라 소비 속도 관찰 하 고 혼합 후 되도록 최적화 됐다, 산소 수준 측정 이전 수준으로 돌아왔다.
그림 1: 대사 분석기에서 애벌레 뇌 OCR 및 ECAR 측정 회로도. 카트리지는 분석 결과 실행 하기 전에 하루를 준비 하 고 있습니다. 다음 날, 마약 카트리지의 주입 포트에 추가 됩니다. D. melanogaster 애벌레 머리는 해 부, 및 마이크로 조직 억제 우물의 바닥에 두뇌를 확보 하기 위해 추가 됩니다. 두뇌와 셀 판 대사 분석기에서 분석 하 고 데이터를 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 마이크로 조직 억제 metabolically 비활성와 접시의 하단에 챔버에 뇌를 잘 개최. 오 레 곤-R D. melanogaster 애벌레 머리의 (A)는 OCR 조직 접착제 (자료 테이블) 또는 두뇌는 슈퍼 우물의 바닥에 붙어 코팅 우물에서 측정 됩니다. 결과는 마이크로 조직 지지대 사용 하 우물의 하단에 위치 하는 두뇌의 비교 됩니다. (B)는 OCR 분석 결과 미디어와 금속, 폴리머 링, 플라스틱 메쉬 그물 및 폴리머 링 또는 마이크로 조직 억제와 금속을 포함 하는 우물에서 측정 됩니다. p-값 < 0.05, * * p-값 < 0.01, * * * p-값 < 0.001, * * * p-값 < 0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 미디어 부 화 시간과 온도 최적화. (A)는 OCR은 오 레 곤-R D. melanogaster 측정 애벌레 두뇌 나트륨 pyruvate와 슈나이더 미디어 (S2)를 사용 하 여 추가, 포도 당 S2 및 나트륨 pyruvate, 추가 및 추가 하는 포도 당, 나트륨 pyruvate와 미디어 분석 결과. 분석 결과, 이전 외피의 3 h 후 또는 분석 결과 이전 외피의 30 분 후 (B)는 OCR 애벌레 두뇌에서 측정 됩니다. (C)는 OCR 애벌레 두뇌 분석 결과 실행 33 ° C와 25 ° C의 온도에서 측정 6 시간 포인트 그래프입니다. 분석 결과, 이전 외피의 3 h 후 또는 분석 결과 이전 외피의 30 분 후 (D)는 OCR 애벌레 두뇌에서 측정 됩니다. 데이터는 6 시간 지점에 보고 됩니다. p-값 < 0.05, * * p-값 < 0.01, * * * p-값 < 0.001, * * * p-값 < 0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: OCR 및 ECAR reproducibly로 측정 된다 성인 및 애벌레 D. melanogaster 두뇌. (A)는 OCR 패널 A 에서 6 시간 포인트의 30 분 (B)는 OCR 데이터 그래프에 대 한 오 레 곤-R D. melanogaster 성인 및 애벌레 두뇌에서 측정 됩니다. OCR 판독 안정화 시간 지점입니다. (C)는 ECAR D. melanogaster 성인 및 애벌레 두뇌는 패널에서 6 시간 포인트의 30 분 (D)는 ECAR 데이터 그래프에 대 한 측정 됩니다. ECAR 수치 안정화 시간 지점입니다. p-값 < 0.05, * * p-값 < 0.01, * * * p-값 < 0.001, * * * p-값 < 0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: Oligomycin ATP 의존 호흡 공개 D. melanogaster 애벌레 두뇌 OCR 레벨 낮춥니다 그리고로 테 논/antimycin 더 낮추고 비-미토 콘 드 리아 산소 소비량을 OCR. (A)는 OCR 20 µ M oligomycin와 5 µ M로 테 논/antimycin A 혼합 치료 후 오 레 곤으로 melanogaster 애벌레 두뇌에서 측정 됩니다. 제어 및 구속 전용 웰 스 분석 결과 미디어와 함께 주입 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
여기, D. melanogaster 애벌레와 성인 두뇌 ex vivo의 변화 분석에 대 한 새로운 방법을 설명 합니다. 기저 상태에서 산소 소비와 세포 외 산성화 요금 나타내고 어떻게 metabolically 활성 두뇌는 여부는 조직 glycolytic 호흡 미토 콘 드리 아 대 에 더 의존 되고있다 확인할 수 있습니다. 각각11.
억제제 또는 치료 마약 두뇌 치료 제공할 수 있습니다 추가 조직의 대사 상태에 대 한 정보. 신진 대사 기판 바르 부르 크 효과22 또는 글루타민 glutaminolysis23조사에 대 한 테스트를 포도 당 같은 특정 대사 산물에 대 한 종속성을 확인 하기 위해 추가할 수 있습니다-모두 공통 대사 프로그래밍에. 장기 연구에 대 한 애벌레 나 파리 수 또한 먹이 주입 포트를 사용 하는 대신 약물 그리고 두뇌 간격 또는 실험 설계에 따라 끝점에서 분석 될 수 있습니다. 이 메서드는 다양 한 응용 프로그램에 대 한 최적화할 수 있습니다.
이 방법은 두뇌에 대 한 최적화 된 하지만 다른 애벌레18 과 성인 조직 분석을 사용할 수 있습니다. 또한, 다른 작은 모델 시스템 측정 전체 유기 체18 또는 조직에이 방법을 사용할 수 있습니다. 이 방법은 다른 시스템에 대 한 최적화 유일한 제한은 기관, 조직, 또는 유기 체의 크기입니다. 마이크로-조직 감으로 만든 챔버는 분석 결과 실행 크기 장벽이 다. 뇌 또는 테스트 되 고, 조직에 대 한 너무 낮은 대사 출력 샘플 크기 제약 조건이 없는 경우 샘플 풀링 분석 결과 측정 및 감도 높이기 위해 사용할 수 있습니다. 다른 응용 프로그램에 대 한이 프로토콜을 수정 해야만 요구 1) 선택 적절 한 측정 등 사소한 최적화 하 고 섞어 주기 번호 및 타이밍, 2)는 조직에 대 한 효과적인 치료 농도 결정. 혼합 시간과 측정 각 주기 동안 대사 분석기에 의해 측정 모니터링 산소 농도 의해 결정 했다. 이것은 실행이 완료 된 후에 개요 창에서 Y2 축 버튼에 O2 를 선택 하 여 볼 수 있습니다. 각 주기 동안 드롭 산소 농도 조직의 산소 소비량 측정된 시간 동안 믹싱 사이클 중 초기 산소 농도에 반환 하 여 다음을 반영 해야 합니다. 이 패턴은 관찰 될 때까지 측정 및 혼합 시간을 테스트 해야 합니다. 이 메서드를 사용 하 여 다른 곤충 두뇌 연구 되었습니다. 이러한 두뇌 여기 사용 하지만 여전히 챔버 내에 조직 억제에 의해 생성 된 맞는 비행 두뇌 보다는 더 컸다. 이 두뇌에서 OCR 판독 했다 높은 400 pmol/min (데이터 표시 되지 않음). 이러한 연구로 OCR 속도 측정 전체 비행 산소 소비18,24, 다른 연구와 일치 하는 결과 D. melanogaster 두뇌 산소 제한 되지 않은 것이 좋습니다. D. melanogaster 두뇌와 다른 유기 체에서 조직에이 방법을 적용 4 개의 중요 한 단계에 특별 한 관심을 요구 한다.
성공적으로 달성 하기 위해 재현 하 고 생물학으로 관련 측정, 준수 해야 하는 프로토콜의 중요 한 단계가 있습니다. 첫째, 마이크로 조직 억제의 사용이이 방법에 대 한 필요 합니다. 이러한 억제 사양 및 나열 된 재료를 사용 하 여 제조 하는 것은 필수적 이다. 자료는 불활성 화학 성분 및 기포의 생성 없이 혼합 단계 동안 적절 한 미디어 교환 수 있도록 그들의 능력 선정 됐다. 둘째, 적시 해 부와 접시 준비 조직의 대사 출력을 극대화 하기 위해 필요 합니다. 짧은 해 부 번 뇌를 크게 저하 하지 해야. 다른 연구는 비행 두뇌 보관 하실 수 있습니다 일 시간 동안 살아 후 해 부를 관류에 제대로 저장 챔버25나타났습니다. 그러나,에서 보듯이 그림 3B 와 3D, 두뇌 분석 결과 이전에 오랜 기간에 대 한 분석 결과 미디어에 앉아 남아 있는 경우, 산소 소비율 감소. 분석 결과, 동안 샘플 모든 주기 동안 혼합 단계를 거칩니다. 이 혼합 화합물의 주사와 에이즈 뿐만 아니라 또한 recirculate 미디어와 산소를 제공 하는 역할. 두뇌 벤치 위에 미디어에서 배양 될 것 보다 이러한 측정 혼합 사이클 동안 오랜 동안 metabolically 활성 수 있습니다. 따라서,이 분석 결과를 설정 하려면 시작 하기 전에 애벌레 두뇌의 해 부를 마스터 해야 합니다. 이 분석 결과 설정 두뇌의 수를 최소화 하기 위해 한 번에 적은 수의 genotypes 분석할 때 필요 하 고 활용 하는 우물. 이 해 부와 분석 결과 측정 사이의 지연 되지 것입니다. 셋째, 안정적인 온도 유지 필요 순수 관련 조건에서 신진 대사 속도 분석 합니다. 증가 분석 결과 온도 조직의 죽음, 낮은 산소 소비 속도 (그림 3C)에 의해 관찰 될 수 있습니다. 파리는 실험적인 목적을 위한 다른 온도에 reared, 측정 또한이 온도에서 수행 해야 합니다. 분석 결과 다른 온도에서 실시 됩니다 경우에 대부분 해 실 온에서 수행 됩니다, 하는 동안 도금 고 절제 된 두뇌 분석 결과 실행 하기 전에 15 분 동안 필요한 온도에서 incubated 한다. 마지막으로, 웰 스 사후 분석 결과 중요 한 영향을 받는지 여부가 조직 위치 측정 관찰. 때때로, 1 국외 자 잘 해 현미경 접시를 관찰 후 삭제 될 수 있다 조직의 어느 손실 또는 mispositioning, 데이터 분석에서 두뇌는 우물의 센터 미 끄 러 하 고는, 그 있을 것입니다. 아래는 구속의 폴리머 링. 조직 감 잘 제대로 장악 하지 믹싱 사이클 동안 교란 되었다 경우 손실 될 수 있습니다. 이러한 이벤트의 자주 일어나는, 그들은 분석에서 제외 되지 않습니다 경우, 하는 동안 그들은 실질적으로 속도 값을 낮출 것 이다.
모니터링 산소 소비와 세포 외 산성화에 의해 전체 조직 대사 플럭스 측정 유전 가로 또는 다른 실험 조건에 의해 신진 대사를 변경 하는 방법을 이해 하기 위한 생물학적으로 관련 방법을 제공 한다. 이 메서드는 충분히 하나의 신진 대사 변화를 탐지 불가능 정지 흐름 respirometry 또는 간접 열 량을 사용 하 여 D. melanogaster 두뇌. 그것은 또한 보다 적게 기술적으로 도전 이다 산소 소비를 측정 하는 클라크 전극을 사용 하 여 보다. 이 프로토콜의 추가적인 이점은 잘 당 하나의 뇌를 분석 하는 기능입니다. 더 민감한 판독, 96-잘 포맷 가능 하며 개 이상의 유전자 형 분석 결과 필요한 샘플의 더 작은 수 때문에 한 번에 분석 하는 수 있습니다 따라서. 동안 조직 물질 대사를 측정은 여전히 도전 하며 신중 하 게 양육 하 고 동기화 된 동물,이 프로토콜 빠르고, 비교적 단순한 방법에 설명 합니다 디에서 수많은 대사 센스를 분석 하는 melanogaster 애벌레와 성인 두뇌.
Disclosures
M. 팁이 프로토콜17에서 설명 하는 마이크로 조직 억제에 대 한 임시 특허를 보유 하고있다.
Acknowledgments
블루밍턴 초파리 재고 센터 (NIH P40OD018637)에서 취득 하는 주식은이 연구에 사용 되었다. 이 간행물에서 보고 된 연구는 생물 의학 연구 우수 국립 과학 연구소에서의 일반 의료는 건강의 국가 학회 교부 금 번호의 제도적 개발 상 (아이디어) 네트워크에 의해 지원 되었다 P20GM103430, 그리고 로드 아일랜드 재단. 저자 제이 바다와 피 Snodgrass 벨트이 프로토콜을 개발에 그들의 지원에 대 한 감사.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Assay medium | Agilent | 102365-100 | |
| Calibrant solution | Agilent | 100840-000 | |
| Corning Cell-Tak Cell Tissue Adhesive | Sigma Aldrich | DLW354240 | |
| delrin | Grainger | 2XMK6 | |
| Drosophila Schneider Media | Thermo Fisher | 21720-024 | |
| Dumont High Precision Tweezers (style 5) | Ted Pella | 5622 | |
| Loctite 409 | Amazon | ||
| Mitostress kit | Agilent | 103015-100 | oligomycin, rotenone, and antimycin A included |
| Netwell inserts (6-well) | VWR | 29442-136 | |
| nylon mesh | Component Supply | U-CMN-64 | |
| Parafilm M wrapping film | Fisher Scientific | S37440 | |
| PYREX spot plate | Fisher Scientific | 13-748B | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | ||
| Wave v2.4 XFe96 analyzer software | Agilent | https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/software-download-for-wave-desktop | free download to mac or windows |
| XFe96 catridge and cell plates | Agilent | 102416-100 |
References
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