Summary
Dette dokumentet beskriver en protokoll for kognitive vurderinger for genetisk modeller av Alzheimers bruker IntelliCage systemet, som er en høy gjennomstrømning automatisert atferdsmessige overvåkingssystem med kan opereres forfatning.
Abstract
Flere faktorer — som aldring og gener-er ofte knyttet til kognitiv svikt. Genmodifiserte musen modeller av kognitiv svikt, som Alzheimers sykdom (AD), har blitt en lovende verktøyet å belyse de underliggende mekanismene og fremme de terapeutiske fremskrittene. Et viktig skritt er validering og karakterisering av forventet atferd abnormitet i modellene, i Annonsen, kognitiv svikt. De langsiktige atferdsmessige undersøkelsene av forsøksdyr å studere effekten av aldring etterspørselen betydelig innsats fra forskere. IntelliCage systemet er en høy gjennomstrømming og kostnadseffektiv testbatteri for mus som eliminerer behovet for daglige menneskelig handling. Her beskriver vi hvordan systemet benyttes i den langsiktige phenotyping av en genetisk Alzheimers sykdom modell, spesielt med fokus på kognitive funksjoner. Eksperimentet sysselsetter gjentatte batteri av tester som vurderer romlige læring og utøvende funksjoner. Denne kostnadseffektive alder-avhengige phenotyping tillater oss å identifisere forbigående og/eller permanent effekten av gener på ulike kognitive aspekter.
Introduction
Utvikling av dyr modeller for neuronal sykdom det siste tiåret har gitt en mekanistisk forståelse av deres basis og for å fremme den terapeutiske fremskritt1,2,3. Anvendelsen av en høy gjennomstrømming atferdsmessige testbatteri i genetisk dyremodeller er en heuristisk forskning for å undersøke de underliggende mekanismene menneskelige sykdommer og identifikasjon av stoffet terapi. Forskning test batterier tilrettelagt for langsiktig observasjon av aldring og/eller demens modeller har tradisjonelt tvunget laboratorier å konsumere store mengder spesialiserte arbeidskraft og tid. Et hjem-buret overvåkingssystem ville være en kosteffektiv strategi som det vil redusere kostnadene for atferdsdata observasjon av mennesker. Noen forskergrupper har utviklet automatisert visjon-basert verktøy som hjelper atferdsmessige phenotyping av en enkelt person i et lite hjem bur4,5,6. Men begrense slike metoder sosiale samspillet og størrelsen på testmiljøer rekke atferdsmessige tiltak med kognitive funksjoner. IntelliCage er en andregenerasjons hjem-buret overvåkingssystem som er utformet for å utføre ulike kognitive oppgaver i sosiale hjem bur. Viktigst, denne metoden kan eliminere daglig håndtering som muliggjør oss å utføre langsiktige atferdsmessige overvåking med vurdering av kognitive funksjoner, og det kan eliminere kravene for spesialiserte praktisk håndtering, og aktiverer svært reproduserbare data oppkjøpet7. Her beskriver vi de langsiktige phenotyping og validering i genetisk musen modeller av Alzheimers (AD) som er generert nylig8,9,10 bruker automatiserte hjem-buret overvåking system. Et testbatteri, som inkluderte vurderinger av romlige læring og utøvende funksjoner, ble gjentatte ganger utført med flere alder poeng (9-12 og 14-17 måneder gammel). Denne alder-avhengige phenotyping tillatt oss å identifisere forbigående og/eller permanent effekten av gener på ulike kognitive aspekter. Vi fant at noen AD-modeller viste både midlertidig og permanent fenotyper i flere kognitive aspekter testet i langsiktig analysen ved hjelp av automatiserte hjem-buret overvåking system10. Dermed er automatiserte studien bruker hjem-buret overvåkingssystem fordelaktig og kostnadseffektiv for langsiktig atferdsmessige phenotyping og validering i ulike modeller av kognitiv dysfunksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer ble godkjent av de institusjonelle dyr omsorg og bruk komiteen, og de ble utført etter RIKEN hjernen vitenskap instituttets retningslinjer for dyr eksperimentering.
1. innstillingen apparater
Merk: En oversikt over automatisert hjem-buret overvåkingssystemet er vist i figur 1. Hvert system (39 cm x 58 cm x 21 cm) inneholder en mikroprosessor og fire hjørne chambers, hver har to vannflasker og en ring antenne for å oppdage radiofrekvens identifisering av energi implantert i dyr (figur 1A). Identifikasjonsnummer av mikroprosessoren defineres av roterende velgeren (maskinvareadresser) (figur 1B). Identifikasjonsnummer av mikroprosessoren må ikke overlappe hverandre. To dører i hvert hjørne kontrolleres av datamaskiner, som brukes for operant condition (figur 1 c). Vanligvis kan hver bur vurdere opptil 12 mus (se figur 2 som eksempel på gruppe bolig). Det er akseptabelt å bruke et større antall mus. Imidlertid bør en sikre at mus ikke kjempe overdrevet, og at de ikke er overbefolket når de utfører sterkt konkurransedyktige oppgaver.
- Koble merdene til datamaskinen serielt via kan kabler.
- Koble batteriledningene til pluggene i mikroprosessoren (strøm på). Alle lysene skal deretter slås på i noen sekunder og alle dørene skal flytte. Hvis lampene ikke slå av eller dørene ikke flytte, koble og plugg inn strømkabelen (dårlig elektriske forbindelser kan føre til upassende fungerer).
- Kontroller at skyvedører åpnes og lukkes korrekt. Hvis dørene ikke flytte riktig, kan du se små magneter knyttet til svart armen. Hvis dette skjer ofte, kan du vurdere å lime magneten til armen.
- Fortsett å kontrollere forholdene i dørene gjennom eksperimenter (minst en gang per dag).
- Slå på PCen.
2. programvare
Merk: Alle tre deler av programvaren ("Designer", "Controller" og "Analyzer") for automatisert hjem-buret overvåking systemet er utformet som grafiske brukergrensesnitt (Figur 3). Brukere kan enkelt kontrollere eller legge ulike funksjoner under eksperimentet.
- Gjør eksperimenter filer ved hjelp av "Designer"
Merk: "Designer" brukes til å generere og redigere eksperimentelle filer (programmer på systemet) for å utføre ulike eksperimentelle protokoller og testing status for systemet (figur 3A). En eksperimentell fil bygger inn listen dyr maskinvare innstillingen og flere eksperimentelle protokoller. Brukere kan også få publiserte journal protokoller ved å kontakte forfatterne.- Opprette listen dyr
- Definere betingelsene. Bygge eksperimentelle grand design, som inkluderer følgende parametere: 1) antallet emnet mus, 2) antall genetisk linjer (eller behandlingsgrupper), 3) sex (mannlig dyr, kvinner dyrene eller begge), og 4) antallet buret skal brukes.
- Velg passende transponder (DataMars eller Trovan) på sentrale verktøylinjen.
- Angi "Grupper". I "Grupper" panel, legge til eller fjerne eksperimentelle gruppene (dvs., genotyper eller behandlinger) ved å trykke på "grønne pluss (+)" eller "røde kors (x)"-knappen i vinduet "Grupper" henholdsvis.
- Angi "Klynger". Bruke funksjonen "Klynger" for å operere undergrupper like ved å definere riktig, feil og nøytrale hjørnene og sidene.
NOTE Det besøk, nosepoke og slikke hendelsene, de viktigste dataene for eventuelle atferdsmessige aktiviteter, er alle knyttet til definisjonen. Denne innstillingen kreves for romlig læring aktiviteter. Den definerte klynger for hvert dyr forblir den samme gjennom hele eksperimentet. For eksempel i en klynge for sted preferanse (PP) aktivitet eller sted preferanse tilbakeføring (PPR), et hjørne defineres som riktig (vann-tilgjengelig) og tre hjørner er definert som feil (vann-utilgjengelig). I tillegg kan klynger kobles til en annen funksjonen "Link". - Tilordne variabler inkludert "Navn", "Tag" (transponder ID), "Sex", "Group" og "Klynger".
- Lagre og lim listene dyr ved å velge "Eksporter dyr"... og "Import dyr"... i menylinjen "Fil" å gjenskape dyr listene for et annet eksperiment.
- Konfigurere maskinvaren i "Setup" tab. Sett opp alle systemer med tilhørende ID-numre (maskinvareadressen) i kategorien "Setup" korresponderer antallet adresser i avsnittet "designer" å det faktiske antallet adresser.
- Bygge eksperimentelle protokoller i kategorien "IntelliCage"
- Bygge eksperimentelle protokoller i kategorien "IntelliCage" ved hjelp av følgende hodet og mindreverdig faner ("Modul" og "Alternativet" tabs).
- Utforme eksperimentelle strukturer i "Modul rommet" ved å klikke kategorien "Modul" (figur 3A). For å legge til nye moduler, trykk "Legg til" (grønne pluss -knappen i kategorien "Modul").
Merk: Det finnes fire typer komponenter, nemlig "Oppgaver", "Utils", "Journalister" og "Begivenheter". Et eksperiment begynner vanligvis med en utløsende hendelse, nemlig "Besøk", "Nosepoke" eller "Drikke". For å velge hendelsen utløser, dra tilsvarende enheten fra inndelingen til å definere det første tegnet. Deretter sette arbeidsytelsen for visse aktuatorer (for eksempel døren åpning), dra enhetene fra delen "Oppgaver" (f.eks., "Dør", "LEDEDE" og "Air"). - Dra de enhetene, vises i "Enheter" del, i "Modul rommet".
Merk: Igjen, brukere kan få publisert protokoller (som eksperimentelle filer) fra forfatterne og bruke filene ved å importere nye dyr liste. Brukere trenger ikke å gjøre alle moduler. - For å gjøre en nosepoke tilpasning (NPA) modul (figur 6A), drar du "Dør" enheten fra delen "Oppgaver", "Gate" og "Timer" enheter fra delen "Utils" og "Besøk" og "Nosepke" enhetene fra delen "Hendelser" til "Modul rommet".
- Koble "Noen" på "ON" linjen av Nosepoke til "I" i Gate enheten. Koble "Ut" til "Close" i "Gate" enhet. Koble "Ut" i "Gate" til "Aktiver" i enheten "Timer". Koble "Ut" i porten til Open i "Dør" enhet. Koble "Ut" i "Timer" enheten "Close" i "Dør" enhet. Angi "Periode" som 5000 (ms) i delen Timer.
Merk: "Gate" enheten brukes til å kontrollere input og produksjon av sekvensen. I "Åpen" staten (standardmodus), vil rekkefølgen koblet til "Output" bli operert. Derimot i "Close" staten, vil rekkefølgen koblet til resultatet bli stoppet. Sannsynligheten for åpning hastigheten kan være angitt (figur 6A, figur 8Aog figur 9A). "Modul velgeren" brukes til å endre modulene tilfeldig eller i en bestemt rekkefølge i samme eksperimentelle periode. I aktiviteten føljetong reaksjonstid (SRT), for eksempel slås moduler (av variabel forsinkelse lengder) tilfeldig på hver ende av besøket bruker modulen velgeren (angi "RandomExcludeDefault" modus) knyttet til "ENDEN" linjen av "Besøk" (figur 8A ). "Up" enheten brukes til å dirigere et inngangssignal til en angitt side til hjørne. Dette er nødvendig for mer komplisert moduler som brukes i aktiviteten SRT eller forsinkelse diskontere (DD), som krever bruk av en bestemt side. For eksempel i aktiviteten DD åpnes bare én side (søtet siden) med en forsinkelse (figur 9A). - Definere første statusen dørene i bur i kategorien "Alternativer" Angi alle dører lukkes i den ikke-drikking økten som den typiske første statusen for PP eller PPR aktiviteter.
- Angi tidsplanene i "Alternativer"-kategorien. Modulene er endret på bestemte tidspunkt, og handlingen angitt i vinduet "Dag mønstre" er utført.
Merk: Den "Dag mønstre" delen kan brukes til å angi eksperimentelle tidsvinduet. Vanligvis brukes om natten, aktiv fase av mus, til å vurdere atferden i kognitiv oppgaver. Det burde være bemerket at varigheten av aktiviteten kan påvirke mengden vanninntak. Hvis varigheten er lenge i relativt enkle oppgaver, reduseres ytelsen i slutten av tidsvinduet-på grunn av tilfredshet. Dermed kreves tidsvinduet angis nøye.
- Opprette listen dyr
- Kjører ved å bruke "Controller"
- Åpne eksperimentelle filen ved å trykke "Eksperimentet"...-knappen i avsnittet "Setting" i "Controller".
- Utføre eksperimentet ved å trykke knappen "Start" av "Controller" (midten høyre del).
- Dataskjerm og synlig status for systemet og mus.
Merk: Atferdsmessige hendelsene er forklart som følger: besøk, inn til et hjørne (oppdaget av termisk sensor); nosepoke, sette nesen til hullet i hjørnet (oppdaget av infrarøde strålen, og kan deles inn i venstre og høyre nosepoke); slikke, licks oppdaget av lickometer (regnet som kontakt tid og frekvens). - Nøye sjekke status for systemet, legge spesielt merke til forsiktighetsregler.
FORSIKTIG: Feil på grunn av en feil dyr kode (transponder nummer) rapporteres i loggen selv om faktiske brikkenummer er riktig (dvs., "uregistrerte tag ***", "Tilstedeværelse signal uten antenne registrering", osv.). Dette kan skyldes bruk av en transponder som er ferd med å utløpe. Denne feilen er imidlertid ikke et alvorlig problem. I dette tilfellet bør en Kontroller at dyret i meldingen kan oppdages. Feil på grunn av lange perioder uten besøk eller drikke vises som for eksempel "*** (dyr ID) ikke gjorde noen besøk under siste 720 minuttene" (figur 3B). Nøye sjekke flere muligheter som kan føre til slike feil. Det alvorligste tilfellet er at dyret er allerede døde. Den nest mest alvorlige muligheten er at det er et problem med oppdagelsen system for dyret (transponderen fungerer ikke eller har falt). Tredje er at dyret er bare ikke aktiv. Hvis dyret ikke gir noen besøk for en hel 24-timers periode, bør eksperimentator fjerne dyret fra buret på grunn av sin helsetilstand. Et alvorlig problem som ikke har en feilindikasjon er svikt av døren lukkes (nesten alltid på grunn av problemer med magneter på døren). Dette resulterer i etableringen av en upassende drikking hjørne. For å kontrollere dette problemet, bør betingelsene for alle dører kontrolleres under en ikke-drikking økt minst en gang om dagen. Data ervervet når problemet kan ikke brukes for analyse av PP, PPR, SRT eller DD oppgaver. - Utgang alle opptreden hendelser med koden for tid og dyr informasjon ved å trykke på "Stop"-knappen på "Controller" (figur 3B).
- Håndtering ved hjelp av "Analyzer"
- Bruke "Analyzer", analysere og visualisere data.
- Eksport tid-binned dataene som Excel-filer (Figur 3 c). Grafisk resultatene vises i kategorien "Diagrammer" kan lette forståelsen av dataene. I kategorien "Data" dataene ordnes i flere kolonner og kan bli sortert og filtrert bruke parametere.
3. dyr forberedelse
- Bruk dyr over 15 g (alderen 2 måneder eller eldre).
Merk: Hvis dyrene er mindre enn 15 g, flere mus kan besøke et hjørne samtidig, fører til svikt i datainnsamlingen. Alderen dyr bør overvåkes nøye for å sikre at de kunne gå inn i hjørnene og klatre materen. Noen eldre mus eller mus med genetiske mutasjoner viser motor impairments kan dø fordi de ikke får tilgang til vann eller mat. - Redusere den potensielle risikoen for aggresjon.
Merk: Selv når bruker kvinnelige mus, er det bedre å begynne boliger alle mus sammen i et bur i ung alder (dvs.i en alder av 1 måned) før du starter eksperimentet. En profil av musen linjen, spesielt med hensyn til aggressivitet, skal oppnås ved mannlige mus i buret. -
Implantatet radiofrekvens identifisering energi (sterilisert, nål inkludert) subcutaneously i mus i regionen dorso-cervical under isoflurane innånding anestesi (Figur 4).
- Plass musen i kammeret for anestesi induksjon.
- Justere oksygen flowmeter til 0,8 1,5 L/min og isoflurane vaporizer å 2.0 til 2,5%.
- Slipp museknappen fra induksjon kammeret etter respirasjonsfrekvens blitt treg (ca 5% nedgang).
- Opprettholde anestesi med en ansiktsmaske.
- Bruke ophthalmica sårsalve til øynene til unngå øye tørking.
- Knip og løft huden rundt den bakre delen av scapulae å danne en lomme.
- Slukke injeksjonsstedet med 70% etanol å minimere innføring av håret inn i subcutaneous plass. Sett deretter inn sprøytebruk nålen gjennom huden parallell med ryggraden.
- Løse ut microchip subcutaneously.
- Knip microchip gjennom huden å oppbevare det Inter oversiden plassen.
- Trekke nålen sakte. Fortsette å klype området for et par sekunder å gi hemostasen.
- Bruk etter administrasjon smertelindring hvis nålen settes feil.
- Slipp museknappen bedøvelsen.
- Plasser musen i utvinning bur og overvåke den før de våkner opp og flytte rundt. Unngå å la musen uovervåket.
- Tilbake musen til hjem buret når det har blitt fullt ambulerende.
- Sjekk den implanterte transponderen med en transponder leser i minst 1 uke.
FORSIKTIG: Plasseringen av implantert energi er helt avgjørende for identifikasjon (se figur 2). Ikke sett transponderen loddrett i halsen, Dette kan føre til dyrene få alvorlige skader av dyrets ryggmargen. Energi faller noen ganger ut etter noen timer eller dager. Sjekk om transponderen fungerer ved hjelp av en transponder leser. I valgfri implantatet transponder igjen hvis det faller ut. men kan det gjentatte re-implantat forårsake kunstig atferdsendringer. Kontroller utløpsdatoen. Utløpte energi sender ofte feil signaler som resulterer i manglende data.
- Innføre dyrene i buret og sjekk energi implantert i mus med transponder leserne. Fjern mus hvis energi ikke gjenkjennes.
4. kjører eksperimenter
Merk: Mus er matet annonsen libitum med standardmus chow og vedlikeholdes med syntetisk sengetøy som endres hver 1 eller 2 uker avhengig av oppgaveplanleggingen. Unngå å endre sengetøy under romlige læring oppgaven spesielt første 1-2 dager. Lysene er på mellom 08.00 og 20.00. Eksperimentell modulene utføres sekvensielt etter vitenskapelige spørsmålene. Eksperimentell tidsplanen er illustrert i figur 5.
- Generelle virksomhet
Merk: Mus er sekvensielt tilpasset miljøet i buret med tre eksperimentelle forhold: gratis filmatiseringen, hvor dyrene har alltid tilgang vannflasker i hjørnene rikelig (en dag til en uke med habituering er vanligvis betraktet som tilstrekkelig); NPA, hvor musene får vann flaskene for 5 s etter hver nosepoke inn i hullene foran dørene i hjørnene (3 dag til 1 uke habituering anses vanligvis tilstrekkelig); og drikke økt filmatiseringen, der mus kan få tilgang til vannflasker på et bestemt tidspunkt på dagen.- Klargjøre eksperimentet filene for FA, NPA og DSA aktivitetene.
- Kjøre oppgaven FA i "Controller".
- Måle antall besøk, nosepokes og/eller licking episoder daglig eller circadian aktivitet regelmessig som en indeks av generelle virksomhet.
- Kjøre NPA oppgaven i "Controller".
- Kjøre DSA oppgaven i "Controller".
Merk: Mange læring paradigmer krever tilpasning for drikking. Bruk to annerledes eksperimentell moduler for å angi timeplan for DSA: standard (for vann savn) økten, og drikker økten. Mus tilgang ikke til vannflasker fordi ingenting skjer etter en nosepoke i standard modul. Drikking økten er identisk med NPA modulen. Tidsplan som er definert i kategorien "Alternativer" i "Designer" kan deretter gå til ikke-drikking økten definert av en annen modul.
- Romlig læring og hukommelse oppgaver
Merk: PP oppgaven brukes til å vurdere romlige læring (vanligvis 5-7 dager). I aktiviteten PP, har mus begrenset tilgang til vann i tre av fire hjørner (en riktig hjørne og tre feil hjørner). Dermed måtte dyrene besøke et bestemt hjørne for å drikke vann under drikking øktene. Aktiviteten PPR brukes til å vurdere fleksibilitet eller compulsivity og muligheten til å endre virkemåten flytende (vanligvis 5-7 dager). I aktiviteten PPR tilgang mus bare vann i de motsatte hjørnene som riktig hjørne i PP oppgaven.- Klargjøre eksperimentet filene for PP og PPR aktivitetene. Definere riktig hjørnene for mus ved å angi "Klynger" (vanligvis 1-4 hjørner hver) i kategorien "Dyr" av "Designer" (se figur 6A, bunn). For å unngå trafikk i et hjørne, reserver fire hjørner for alle mus jevnt.
- Kjøre PP oppgaven i kontrolleren.
- Evaluere romlige læring ytelsen på time course, tallene og prosentandelen av riktig nosepokes.
Merk: Gjeldende versjon av aktiviteten PP fokuserer mer på romlige læring heller enn, romlige hukommelse, som oppgaven ikke krever en tidsforskjell mellom de forskjellige forsøkene. For å fokusere mer på romlige hukommelse, vurdere å bruke stedet unngåelse (PA) aktiviteten eller en udefinert ny versjon av romlige oppgaven som benytter bestemt gapene mellom forsøkene. - Kjøre PPR oppgaven i "Controller".
- Vurdere fleksibilitet eller compulsivity basert på time course, antallet og prosentandelen av riktig nosepokes.
Merk: Tolkning av PPR dataene krever flere forsiktig dommer. Første ytelse av aktiviteten PPR er sterkt avhengig av ytelse i aktiviteten PP. Dette er fordi PPR aktiviteten er avhengig av forstyrrelser eller nødvendigheten av å endre atferd. Derfor kan ytelsen til PPR være spesielt dårlig hvis ytelsen til aktiviteten PP ligger 100% korrekt. Fleksibilitet kan anses en av de utøvende funksjoner11,12,13. - Vurdere romlige frykt minne i PA.
Merk: PA aktiviteten består av 4 kontinuerlig økter: habituering (dag 1); condition (luft blåse er introdusert etter nospoke på alle sider av et forhåndsdefinert hjørne [feil nosepoke], dag 2); 24 h pause utenfor testing buret (mus plasseres tilbake til sine normale hjem-bur, day3); plassere mus tilbake i den tester bur uten air blåse (dager 4-10).- Forberede eksperiment filene PA.
- Kjør habituering (dag 1).
- Kjør condition (dag 2).
- Ta musene i normal hjem bur og holde 24 h (day3).
- Ta musene tilbake til testing buret og kjøre testprotokollen (dag 4-10).
- Evaluere aversive romlige læring basert på forholdet mellom feil nosepokes condition dag (dag 2), aversive romlig minne basert på dagen tilbake til testing buret (dag 3) og utryddelse læring basert på på dager 4-10.
- Vurdering av Executive-funksjonen (impulsivitet, oppmerksomhet og Compulsivity)
- SRT oppgaver
Merk: Denne prosedyren ble tidligere beskrevet i mer detalj10,14. I dette settet med aktiviteter, er alle fire hjørnene operert på samme måte, 24 timer per dag. SRT består av to treningsøkter (SRT-trening 1 og 2) og to testing økter (SRT-Test 1 og 2). I den første treningsøkten (SRT-trening 1), er dyrene opplært til å lære at gule LED-lys er en start signal for en nosepoke. LED-lampen alltid flash umiddelbart etter den første nosepoke (forsinkelsen er satt til 0 s).
Andre treningsøkten (SRT-trening-2), forsinkelsen er satt til variere tilfeldig 0.5, 1.0, 2.0 og 4.0 s. I denne perioden har tidlig svar ingen konsekvens (pre-trening). Noen nosepoke under forsinkelsesperioden anses en tidlig svar, mens det første nosepoke når døren åpnes (5 s) regnes som et korrekt svar. I den første test økten (SRT-Test 1, brukes til å vurdere impulsivitet), den første nosepoke definerer riktig side, og starter en forsinkelsesperioden (0,5-4.0 s, avhengig av aktiviteten fasen), etter som gule LED aktiveres for en bestemt tidsperiode (stimulans varighet = 2.0 s, avhengig av aktiviteten fasen). Døren åpnes. Den første nosepoke etter forsinkelsesperioden åpner døren (5 s) og regnes som en korrekt nosepoke mens en nosepoke under forsinkelsesperioden regnes tidlig nosepoke. Det er flere endringer i den andre test økten (SRT-Test 2, brukes til å vurdere oppmerksomhet). Når du starter en stimulans (0,2 til 1,0 s, noe kortere enn den første testen), mus er utstyrt med en tidsperiode der nosepokes er tillatt (limited holder, vanligvis 2 s). Dørene åpne (5 s) etter en riktig nosepoke, som er den første nosepoke i løpet av begrenset hold. Nosepokes etter begrenset hold regnes som utelot nosepoke og føre ikke til endringer i utfallet. Feilene er delt inn i tre typer: tidlig nosepoke, utelates nosepoke og unnlatelse (første nosepoke bare). Oppmerksomhet testen krever evne til å merke LED-blits (definert av varigheten av stimulans varighet) samt moderat rask respons (definert av varigheten av begrenset tak). Gang løpet av rettssaken er illustrert i figur 7.- Klargjøre eksperimentet filene for SRT aktiviteter.
- Kjøre SRT-trening-1 i 3 dager.
- Kjøre SRT-trening-2 i 7 dager.
- Kjør SRT-Test 1 (impulsivitet) i 7 dager. Beregne impulsivitet basert på følgende formel:
hvor P er tidlig nosepoke forsøk (eller antall feil nosepoke), og T er totalt forsøk (antall første nosepoke). - Kjør SRT-Test 2 (Attention) i 7 dager. Beregne nøyaktigheten (som regnes som en performance indicator for oppmerksomhet) bruker følgende formel:
der C er riktig nosepoke forsøk (antall riktige andre nosepokes), er totalt forsøk (antall første nosepokes), O er unnlatelse forsøk (antall prøve mangler en andre nosepoke) og P er antall tidlig nosepoke studier (eller antall andre feil nosepoke før begrenset hold).
-
DD oppgave
Merk: Dette er en enkel valget aktivitet, hvor dyrene velge vente å drikke sukret vann (SW, 0,5% sakkarin eller 10% sukrose) med en forsinkelse eller drikke vanlig vann uten en forsinkelse. Døren på den valgte siden åpner mens åpn opp døren på motsatt side. Den SW og vanlig vann er tildelt i høyre eller venstre side av alle hjørner identisk. DD oppgaveplanleggingen inkluderer trening og test økter. I treningsøkten tilgang musene både SW og vann uten en ventetid. Dermed vil musene utvikle deres preferanse til SW side. I treningene, ventetiden øker daglig (dvs., 0, 1, 2,..., 8 s). Forsinkelser sekvensielt øke daglig ved å gjøre flere moduler som viser forskjellige forsinkelse lengde (0, 1, 2,..., 8 s) og sette "Link" i "Modul" og "Alternativer" (dag mønstre). I denne oppgaven fungerer alle fire hjørnene på samme måte, 24 timer per dag.- Forberede eksperimentelle filen for DD aktivitet.
- Definere siden av SW (høyre eller venstre side i alle hjørnene).
- Erstatte vannflasker på definerte sidene med flaskene inneholder SW.
- Kjør treningsøkten å trene dyrene å drikke SW på definerte sidene med nei forsinkelsen for 5-7 dager.
- Beregne preferanse indeksen, som er definert som forholdet mellom licking eller nosepoking på siden av SW til antall licks eller nosepokes. Preferanse indeksen for siden som inneholder SW beregnes slik som:
eller
Tidligere indeksen fokuserer mer på handling utfall, mens den sistnevnte fokuserer mer på valg atferd.
Merk: Pass på at de fleste mus fortrinnsvis velger sidene med SW (> 90% for licking tallbasert indeksen, > 80% for den første nosepoke-baserte indeksen) på slutten av opplæringen. - Deretter kjøre testen økt av DD oppgave for 9 dager (forsinkelse 0 til 8 s).
- Vurdere tid selvfølgelig endring i preferanse mot siden med SW evaluere compulsivity.
- SRT oppgaver
- Dataanalyse
- Åpne arkivene bruker "Analyzer" og eksportere alle dataene til Excel-filer. Hvis mengden data beløpet er ganske stor, er det bedre å filtrere dataene (dvs., ekstra drikking økten for romlig aktivitetene, og pakke ut den første og andre nosepokes for SRT aktiviteter).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I vår forrige undersøkelse, ble alder avhengig av kognitiv underskudd i AD modeller oppdaget av eksperimenter ved hjelp av automatiserte hjem-buret overvåking system10. Deres Annonsen modeller i PP var intakt både unge voksne og eldre temaer; men ytelsen i PPR var betydelig og gradvis svekket (figur 6). Det er også viktig å observere hvordan eller angst i tilpasning fase fordi slike egenskaper kan påvirke kognisjon15. AD-modeller viste ikke noe brutto unormalt i besøk, nosepoke og slikker tall i FA og NP DSA sesjoner. Dermed kan AD modellene ha lavere fleksibilitet.
For å vurdere de utøvende funksjonene, ble atferdsmessige ytelsen i SRT og DD registrert. Eldre AD modeller (NL-G-F) manglet nøyaktighet i den siste fasen av SRT (SRT-Test 2) (Figur 8). Tilrettelagt compulsivity ble observert i unge voksne og gamle fag NL-G-F-mus (figur 9B, topp). Interessant, selv om det var en økning i compulsivity av NL-F mus som var unge voksne, i gamle dager, ble det sammenlignes med vill-type mus (figur 9B, bunnen). Dette er et eksempel på forbigående fenotypen av NL-F mutasjon.
Figur 1: komponenter av automatiserte hjem-buret overvåkingssystemet. (A) oversikt over systemet. (B) plassering av koblinger. (C) hjørne kammer med operant dør. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: eksempel på gruppe bolig for studien. Det brukes vanligvis 12 mus per bur. Ved hjelp av fire grupper (tre genetisk modeller og en vill-type), anses tre mus per gruppe per IntelliCage tilstrekkelig. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: programvare for systemet. (A) "Designer" brukes til å bygge eksperimentelle filer. Venstre: Delen dyr liste inneholder informasjon om dyr og gruppe definisjonene. Høyre: Modul plassen brukes til å definere eksperimentelle operasjoner. (B) "Controller" kan brukes til å kjøre, overvåke og registrere eksperimenter. Venstre: Statusen for en av byrået arbeider med vise dyrene besøk, nosepoke, og slikker i de fire hjørnene. Høyre: Alarm windows vises hvis noen problemer. (C) The Analyzer kan brukes til å håndtere og eksportere data ervervet av kontrolleren. Venstre: Alle data er kodet med informasjon om dyret, miljø inne i buret, og tid. Filtrering vil hjelpe videre analyse i Excel eller andre analytisk programvare. Høyre: Det tid-line av besøk (også nosepoke eller licks) kan vises enkeltvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Transponder implantasjon. (A) Microchip av transponder (DataMars). (B) Side visning av transponder implantation (transpondering). Unngå å forårsake skade på ryggmargen. (C) ovenifra transponderen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: tidsplan av eksperimenter for kognitive vurderingen med automatisert hjem-buret overvåkingssystemet. Et testbatteri kognitive vurdering ble utført to ganger (1 sett, 9-12 måneder gammel, og 2 setter, 14-17 måneder gammel) etterfulgt av eksperimenter for å vurdere generelle virksomhet til slutt (3 sett [18 måneder gammel]). Dette batteriet ble utpekt for å vurdere flere kognitive domener (angitt av farger-rødt: generelle virksomhet; Blå: romlige læring og hukommelse; Grønn: executive funksjonen), som har fordeler i validering og karakterisering av forventet kognitiv underskudd. FA: Gratis tilpasning; NPA: Nosepoke tilpasning; DSA: Drikke økt tilpasning; PP: Sted preferanser; PPR: Sted preferanse reversering; SRT: Føljetong reaksjonstid (for impulsivitet og oppmerksomhet); PA: Sted unngå; DD: Forsinkelse diskontere. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: eksperimentell design og representant resultater av PP og PPR. (A) topp, et eksempel modulen design for PP eller PPR. Bunnen, riktig hjørne innstillingen endres til motsatt side i PPR. (B) underskudd i romlig reversering læring i en annonse modell (NL-G-F) skapte i eldre alder. Data uttrykkes som gjennomsnittlig ± standard feil av gjsnitt (SEM). ∗p < 0,05; ∗∗p < 0,01. Fargene angir grupper sammenligning: blå: NL vs WT; Rød: NL-F vs WT; Grønn: NL-G-F vs WT. Dette tallet er endret fra referanse10. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: prøve flyten av SRT oppgaver. Venstre: prøve flyten av SRT (imp). Den første nosepoke definerer riktig side, og starter en forsinkelsesperioden (0,5-4.0 s), etter som gule LED er aktivert. Døren åpnes. Høyre: prøve flyten av SRT (att). Den første nosepoke definerer riktig side, og starter en forsinkelsesperioden (2.0 s), etter som gule LED er slått på i kortere tid (0,2 til 1,0 s). Mus er utstyrt med en tidsperiode der nosepokes er tillatt (limited holder, 2 s). Dørene åpne (5 s) etter en riktig nosepoke, som er den første nosepoke i løpet av begrenset hold. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8: eksperimentell design og representant resultatene av SRT oppgaver. (A) et eksempel modulen design for SRT. (B) oppmerksomhet nedgang i en annonse modell gjelder på eldre alder. Data uttrykkes som gjennomsnittlig ± SEM. ∗p < 0,05; ∗∗p < 0,01. Fargene angir grupper sammenligning: blå: NL vs WT; Rød: NL-F vs WT; Grønn: NL-G-F vs WT. Dette tallet er endret fra referanse10. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9: eksperimentell design og representant resultatene av DD oppgave. (A) et eksempel på modulen for DD aktiviteten. (B) tilrettelagt compulsivity i Annonsen modellen (NL-G-F) både unge og gamle aldre. Dette er et eksempel på fenotypen. På den annen side, ble compulsivity transiently økt i en annen annonse modell (NL-F). Data uttrykkes som gjennomsnittlig ± SEM. ∗p < 0,05; ∗∗p < 0,01. Fargene angir grupper sammenligning: blå: NL vs WT; Rød: NL-F vs WT; Grønn: NL-G-F vs WT. Dette tallet er endret fra tidligere arbeid10. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette dokumentet beskriver metoden bruker automatiserte hjem-buret overvåkingssystemet for langsiktig kognitive og atferdsmessige analyser i genmodifiserte AD modeller. Det viktigste trinnet er implantering av transponder riktig plassering. Før du utfører implantation, sikre at utløpsdatoen for transponderen ikke har bestått. Det andre viktige er å sjekke fungerer systemet daglig, spesielt som et mindre problem kan senere bli en mer alvorlig under studien (dvs., et stablet døren, falt ut transponder, dårlig elektriske forbindelser, etc .). For det tredje er det viktig å kunne problemer skyte, fordi mange problemer oppstå gjennom eksperimentell tidsplanen.
Dette papiret introdusert en grunnleggende pakke med oppgaver for kognitive vurdering. Disse oppgavene ble produsert ved å henvise til de konvensjonelle atferdsmessige testene, men de kan ikke perfekt etterligner de konvensjonelle testene. For eksempel sett SRT oppgaver ikke valg-modus. Fem valg føljetong valget aktivitet (5CSRTT), en modell av SRT oppgaver, er vanligvis utført i et kammer med 9, 5 eller 3 hull for nosepoke å måle nøyaktighet16,17. Vårt team tidligere forsøkt å implementere en valg versjon av SRT, men musene kunne lære regelen i relativt lang tid (2 uker eller mer). Brukeren av dette systemet bør være klar over forskjellen, og diskutere data nøye.
Et annet problem er om begrensningene for gjentatte måling. Som nevnt i forrige studie18, er den første at den gjentatte eksperimenter kan bare sammenligne effekten av alder. Vi observerte at dataene fra den andre PA testen mislyktes å gjenskape minne svekkelse i AD modeller10. Ytelsen til alle genotype var mye verre enn den første PA testen. Denne forskjellen kan komme fra aldersforskjellen eller habituering til aversive stimulans (opplevelse av forrige PA aktivitet). Eksperimentelle bør tankene gjenta effekten og vurdere rekkefølgen på aktiviteter. For å overvinne habituering av aversive stimulans i andre PA test, kan det være bedre bruk sterkere luft blåse stimulans eller legge til noen romanen miljømessige stimulans som ulike typer senger eller lyd-19.
Ulike forskere har utviklet nye metoder og protokoller for automatisert hjem-buret overvåking studier20,21,22,23,24,25, 26, og tilhørende programvare med åpen kildekode bibliotek27. Dermed har at systemet blitt utvidet. Til slutt, gir systemet automatisert høy gjennomstrømming atferdsmessige screening for langsiktige analyser som brukes til å studere en rekke kognitive funksjoner, som er nyttig i phenotyping og validere sykdom modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi takker Reiko Ando for henne hjelp i fotografering materialer. Denne forskningen ble støttet av Grant-in-Aid for utforskende forskning (Javaserver KAKENHI bevilgning nummer 16K 15196).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IntelliCage | TSE Systems | - | Parchased in 2011 or later |
| PC | Dell | Inspiron 580s | - |
| Display | Dell | SI75T-WL | - |
| ALPHA-dri | Shepherd Specialty Papers | - | Standard bedding |
| Aron Alpha (Krasy Glue) 2 g | Toagosei (Krasy Glue) | #04612 | Cyanoacrylates for gluing magnet and blak arm |
| Handheld Transponder Reader | BTS-ID | R-560 | Transponder reader, which reads both Trovan and DataMars |
| Transponder | DataMars | T-VA, T-VAS, or another series | Basic package of transponders and implanters |
| Diamond Grip Plus | Ansel Microflex | DGP-INT-M | Experimental glove |
| Isoflurane | Pfizer | 1119701G1092 | - |
| Vaporizer for small animals | DS Pharma Biomedical | SF-B01 | Facemask included |
| Neo-Medrol | Pfizer | 006472-001 | Eye ointment |
| Ethanol (70%) | - | - | - |
| Excel | Microsoft | 00202-51382-15524-AA928 | For data analysis |
References
- Bryan, K. J., Lee, H., Perry, G., Smith, M. A., Casadesus, G. Transgenic Mouse Models of Alzheimer's Disease: Behavioral Testing and Considerations. Methods of Behavior Analysis in Neuroscience. , CRC Press/Taylor & Francis. (2009).
- Nestler, E. J., Hyman, S. E. Animal models of neuropsychiatric disorders. Nature Neuroscience. 13 (10), 1161-1169 (2010).
- Crawley, J. N. Behavioral Phenotyping Strategies for Mutant Mice. Neuron. 57 (6), 809-818 (2008).
- Zarringhalam, K., Ka, M., et al. An open system for automatic home-cage behavioral analysis and its application to male and female mouse models of Huntington's disease. Behavioural Brain Research. 229 (1), 216-225 (2012).
- Prusiner, S. B., Jackson, W. S., King, O. D., Lindquist, S. The power of automated high-resolution behavior analysis revealed by its application to mouse models of Huntington's and prion diseases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (23), 13363-13383 (1998).
- Jhuang, H., Garrote, E., et al. Automated home-cage behavioural phenotyping of mice. Nature Communications. 1 (6), 1-9 (2010).
- Krackow, S., Vannoni, E., et al. Consistent behavioral phenotype differences between inbred mouse strains in the IntelliCage. Genes, brain, and behavior. 9 (7), 722-731 (2010).
- Nilsson, P., Saito, T., Saido, T. C. New mouse model of Alzheimer's. ACS chemical. 5 (7), 499-502 (2014).
- Saito, T., Matsuba, Y., et al. Single App knock-in mouse models of Alzheimer's disease. Nat Neurosci. 17 (5), 661-663 (2014).
- Masuda, A., Kobayashi, Y., Kogo, N., Saito, T., Saido, T. C., Itohara, S. Cognitive deficits in single App knock-in mouse models. Neurobiology of Learning and Memory. , (2016).
- Chan, R. C. K., Shum, D., Toulopoulou, T., Chen, E. Y. H. Assessment of executive functions: Review of instruments and identification of critical issues. Archives of Clinical Neuropsychology. 23 (2), 201-216 (2008).
- Jurado, M. B., Rosselli, M. The Elusive Nature of Executive Functions: A Review of our Current Understanding. Neuropsychology Review. 17 (3), 213-233 (2007).
- Diamond, A. Executive Functions. Annual Review of Psychology. 64 (1), 135-168 (2013).
- Kobayashi, Y., Sano, Y., et al. Genetic dissection of medial habenula-interpeduncular nucleus pathway function in mice. Frontiers in behavioral neuroscience. 7, 17 (2013).
- Robinson, O. J., Vytal, K., Cornwell, B. R., Grillon, C. The impact of anxiety upon cognition: perspectives from human threat of shock studies. Frontiers in human neuroscience. 7, 203 (2013).
- Robbins, T. The 5-choice serial reaction time task: behavioural pharmacology and functional neurochemistry. Psychopharmacology. (3-4), 362-380 (2002).
- Asinof, S. K., Paine, T. A. The 5-Choice Serial Reaction Time Task: A Task of Attention and Impulse Control for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (90), e51574 (2014).
- Codita, A., Gumucio, A., et al. Impaired behavior of female tg-ArcSwe APP mice in the IntelliCage: A longitudinal study. Behavioural brain research. 215 (1), 83-94 (2010).
- Blumstein, D. T. Habituation and sensitization: new thoughts about old ideas. Animal Behaviour. 120, 255-262 (2016).
- Endo, T., Maekawa, F., et al. Automated test of behavioral flexibility in mice using a behavioral sequencing task in IntelliCage. Behavioural brain research. 221 (1), 172-181 (2011).
- Voikar, V., Colacicco, G., Gruber, O., Vannoni, E., Lipp, H. -P., Wolfer, D. P. Conditioned response suppression in the IntelliCage: assessment of mouse strain differences and effects of hippocampal and striatal lesions on acquisition and retention of memory. Behavioural brain research. 213 (2), 304-312 (2010).
- Puścian, A., Łęski, S., Górkiewicz, T., Meyza, K., Lipp, H. -P., Knapska, E. A novel automated behavioral test battery assessing cognitive rigidity in two genetic mouse models of autism. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 140 (2014).
- Voikar, V., Colacicco, G., Gruber, O., Vannoni, E., Lipp, H. -P., Wolfer, D. P. Conditioned response suppression in the IntelliCage: assessment of mouse strain differences and effects of hippocampal and striatal lesions on acquisition and retention of memory. Behavioural brain research. 213 (2), 304-312 (2010).
- Harda, Z., Dzik, J. M., et al. Autophosphorylation of αCaMKII affects social interactions in mice. Genes, Brain and Behavior. , e12457 (2018).
- Aarts, E., Maroteaux, G., et al. The light spot test: Measuring anxiety in mice in an automated home-cage environment. Behavioural Brain Research. 294, 123-130 (2015).
- Safi, K., Neuhäusser-Wespy, F., et al. Mouse anxiety models and an example of an experimental setup using unconditioned avoidance in an automated system -IntelliCage. Cognition Brain & Behavior. 10 (4), 475-488 (2006).
- Dzik, J. M., Puścian, A., Mijakowska, Z., Radwanska, K., Łęski, S. PyMICE: APython library for analysis of IntelliCage data. Behavior Research Methods. 50 (2), 804-815 (2018).
