Summary
Este papel describe un protocolo para la evaluación cognitiva de modelos genéticos de la enfermedad de Alzheimer utilizando el sistema IntelliCage, que es un sistema de monitoreo conductual alto rendimiento automatizado con condicionamiento operante.
Abstract
Múltiples factores, como el envejecimiento y los genes, están frecuentemente asociados con deterioro cognitivo. Modelos de ratón modificados genéticamente de deterioro cognitivo, como la enfermedad de Alzheimer (AD), se han convertido en una herramienta prometedora para dilucidar los mecanismos subyacentes y promover los avances terapéuticos. Un paso importante es la validación y caracterización de la anormalidad del comportamiento esperado en los modelos, en el caso de AD, deterioro cognitivo. Las investigaciones conductuales a largo plazo de animales de laboratorio para estudiar el efecto de envejecimiento esfuerzos substanciales de la demanda de los investigadores. El sistema de IntelliCage es una batería de pruebas de alto rendimiento y rentable para los ratones que elimina la necesidad de dirección humana diaria. Aquí, describimos cómo el sistema se utiliza en el fenotipo a largo plazo de un modelo de la enfermedad de Alzheimer genética, centrándose específicamente en las funciones cognitivas. El experimento emplea repetida batería de pruebas que evalúan funciones ejecutivas y aprendizaje espacial. Este rentable phenotyping dependiente de la edad nos permite identificar los efectos transitorios o permanentes de los genes en diversos aspectos cognitivos.
Introduction
El desarrollo de modelos animales para enfermedades neuronales durante la última década ha proporcionado una comprensión mecanicista de su base y con el fin de promover los avances terapéuticos1,2,3. Aplicación de una batería de pruebas de comportamiento de alto rendimiento en modelos animales genéticos es una herramienta de investigación heurístico para investigar los mecanismos subyacentes de las enfermedades humanas y la identificación de los tratamientos farmacológicos. Baterías de pruebas de investigación adaptaron para la observación a largo plazo del envejecimiento y/o modelos de demencia han obligado tradicionalmente a laboratorios para consumir grandes cantidades de mano de obra especializada y el tiempo. Un sistema de vigilancia hogar-jaula sería una estrategia rentable pues reduciría el costo de observación conductual de los seres humanos. Algunos equipos de investigación han desarrollado herramientas automatizadas basadas en la visión que asistencia fenotipado comportamental de un individuo en una pequeña jaula casa4,5,6. Sin embargo, tales métodos limitan la interacción social, el tamaño de entornos de prueba y la variedad de medidas conductuales que incluyen las funciones cognitivas. El IntelliCage es un sistema de vigilancia hogar-jaula segunda generación diseñado para realizar diferentes tareas cognitivas en una jaula casa social. Lo importante, este método puede eliminar diariamente manejo que permite realizar monitoreo conductual a largo plazo con evaluación de las funciones cognitivas, y puede eliminar los requisitos para el manejo de práctica especializada y permiten altamente reproducible de adquisición de datos7. Aquí, describimos a largo plazo phenotyping y validación de modelos de ratón genético de la enfermedad de Alzheimer (AD) que ha generaban recientemente8,9,10 usando el monitoreo automatizado de jaula casa sistema. Una batería de pruebas, que incluye las evaluaciones de aprendizaje espacial y funciones ejecutivas, se realizó varias veces en varios puntos de la edad (9 a 12 y 14-17 meses). Este fenotipo depende de la edad nos permitió identificar los efectos transitorios o permanentes de los genes en diversos aspectos cognitivos. Encontramos que algunos modelos AD mostraron fenotipos transitorios y permanentes de varios aspectos cognitivos en el análisis a largo plazo utilizando el automatizado home-jaula Monitoreo sistema10. Así, el estudio automatizado con sistema de vigilancia hogar-jaula es beneficioso y rentable para fenotipo de comportamiento a largo plazo y validación en varios modelos de disfunción cognitiva.
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Protocol
Todos los procedimientos fueron aprobados por el animal institucional cuidan y usan de Comité, y se realizaron según las pautas del Instituto de Ciencias del cerebro de RIKEN para experimentación animal.
1. ajuste aparato
Nota: Un resumen del sistema de monitoreo automatizado de casa jaula se muestra en la figura 1. Cada sistema (39 x 58 cm x 21 cm) contiene un microprocesador y cuatro salas de esquina, que tiene dos botellas de agua y una antena de anillo para la detección de identificación de frecuencia de radio de los transpondores implantados en los animales (figura 1A). Los números de identificación del microprocesador se definen mediante el selector rotativo (direcciones de hardware) (figura 1B). Los números de identificación del microprocesador no deben superponerse. Dos puertas en cada esquina son controladas por computadoras, que se utilizan para el condicionamiento operante (figura 1). Por lo general, cada jaula puede evaluar hasta 12 ratones (véase la figura 2 como ejemplo de alojamiento en grupo). Utilizando un mayor número de ratones es aceptable. Sin embargo, uno debe asegurarse de que los ratones no lucha demasiado y que no están superpobladas cuando realizan tareas fuertemente competitivas.
- Conecte las jaulas a una computadora en serie mediante cables de poder.
- Conecte los cables de la batería a los enchufes en el microprocesador (encendido). Todos los LEDs entonces deben encender durante unos segundos y se deben mover todas las puertas. Si los LEDs no desactive o si las puertas no se mueven, desconecte y vuelva a conectar el cable de alimentación (conexiones eléctricas en mal estado pueden llevar a un mal funcionamiento).
- Asegúrese de que las puertas correderas se abren y cierran correctamente. Si las puertas no se mueven correctamente, compruebe los pequeños imanes en el brazo negro. Si este problema se produce con frecuencia, considere la posibilidad de pegar el imán en el brazo.
- Seguir comprobar las condiciones de las puertas a lo largo de los experimentos (por lo menos una vez al día).
- Encienda la PC.
2. el software
Nota: Los tres componentes de software ("Diseñador", "Controlador" y "Analizador") para el sistema automatizado de monitoreo de hogar jaula han sido diseñados como interfaces gráficas de usuario (figura 3). Los usuarios pueden fácilmente controlar o añadir varias funciones durante el experimento.
- Hacer experimento de archivos mediante el "diseñador"
Nota: El "diseñador" se utiliza para generar y editar archivos experimentales (programas en el sistema) para realizar diversos protocolos experimentales y probar el estado del sistema (Figura 3A). Un archivo experimental incorpora la lista de animales, configuración de hardware y protocolos experimentales múltiples. Los usuarios también pueden obtener protocolos publicados diario poniéndose en contacto con los autores.- Crear la lista de animales
- Definir las condiciones. Construir el gran diseño experimental, que incluye los siguientes parámetros: 1) el número de ratones de tema, 2) el número de líneas genéticas (o grupos de tratamiento), 3) sexo (machos, hembras o ambos) y 4) el número de la jaula para ser utilizado.
- Seleccione el tipo de transpondedor apropiado (DataMars o Trovan) en la barra de herramientas central.
- Establecer "Grupos". En el panel "Grupos", añadir o eliminar los grupos experimentales (es decir., genotipos o tratamientos) pulsando el "verde más (+)" o "la Cruz Roja (x)" botón en la ventana de «Grupos», respectivamente.
- Conjunto de "Clusters". Utilice la función de "Cluster" para operar igualmente subgrupos mediante la definición de lados y las esquinas correctas, incorrectas y neutrales.
Nota: La visita, nosepoke y lamer los eventos, los datos principales de las tareas conductuales, están todos asociados con la definición. Este ajuste es necesario para las tareas de aprendizaje espacial. Los grupos definidos para cada animal siguen siendo los mismos durante todo el experimento. Por ejemplo, en un clúster de lugar preferencia (PP) tarea o lugar preferencia reposición (PPR), una de las esquinas se define como correcta (agua accesible) y tres esquinas están definidas como incorrecto (agua inaccesible). Además, los racimos pueden vincularse a otro usando la función "Enlace". - Asignar variables como "Nombre", "Tag" (transponder ID), "Sexo", "Grupo" y "Cluster".
- Guardar y pegar las listas de animales mediante la selección de "Exportación de los animales"... y "importación"... en la barra de menú '' archivo '' para replicar las listas de animales para otro experimento.
- Configurar el hardware en la ficha "Configuración" Set encima de todos los sistemas con sus correspondientes números de ID (dirección de hardware) en la ficha "Configuración" corresponden el número de direcciones en la sección de "diseñador" para el número de direcciones.
- Construir los protocolos experimentales en la pestaña de "IntelliCage"
- Construir los protocolos experimentales en la pestaña de "IntelliCage" con la siguiente cabeza y pestañas inferiores (fichas "Módulo" y "Opción").
- Diseñar las estructuras experimentales en el "espacio del módulo" haciendo clic en la pestaña "Módulo" (Figura 3A). Para agregar nuevos módulos, pulse "Añadir" (verde y botón en la pestaña "Módulo").
Nota: Hay cuatro tipos diferentes de componentes, a saber, "Tareas", "Utils", "Periodistas" y "Eventos". Por lo general, un experimento comienza con un acontecimiento del disparador, es decir, "La visita", "Nosepoke" o "Potable". Para seleccionar el evento disparador, arrastre la unidad correspondiente de la sección de eventos para definir la señal de partida. Posteriormente, para establecer la salida para ciertos actuadores (como la abertura de la puerta), arrastre las unidades de la sección "Tareas" (por ejemplo., "La puerta", "LED" y "Aire"). - Arrastre de las unidades, que se muestra en la parte de "Unidades", en el "módulo espacial".
Nota: Una vez más, los usuarios pueden obtener protocolos publicados (archivos experimentales) de los autores y reutilizar los archivos de importando nueva lista de animales. Los usuarios no tiene que hacer todos los módulos. - Para hacer un módulo de adaptación (PNA) nosepoke (figura 6A), arrastre la unidad de la "Puerta" de la sección de "Tareas", "Puerta" y "Timer" unidades de la sección de "Utils" y las unidades de "Visita" y "Nosepke" de la sección de "Eventos" en el "módulo espacial".
- Enlace "Cualquiera" en la línea "ON" de la unidad de Nosepoke a "In" en la unidad de la puerta. Enlace "A" a "Cerrar" en la unidad de la "Puerta". Enlace "A" en la "puerta" a "Activate" en la unidad de "Timer". Enlace "A" en la puerta abierta en la unidad de la "Puerta". Enlace "A" en la unidad de "Timer" para "Cerrar" en la unidad de la "Puerta". Establecer «Período» como 5.000 (ms) en la sección de contador.
Nota: La unidad de la "Puerta" se utiliza para controlar la entrada y salida de la secuencia. En el estado "Abierto" (el estado predeterminado), la secuencia de conectar a la "salida" será operada. En cambio, en el estado de "Cerrar", se detendrá la secuencia conectada a la salida. La probabilidad de que la tasa de apertura puede ser especificado (figura 6A figura 8Ay 9A de la figura). El "módulo Selector" se utiliza para cambiar los módulos al azar o en una cierta secuencia en el mismo período experimental. En la tarea de tiempo de reacción Serial (SRT), por ejemplo, los módulos (de longitudes de retardo variable) al azar se cambian en cada extremo de la visita utilizando el módulo Selector (modo de ajuste de "RandomExcludeDefault") vinculado a la línea de "Fin" de la unidad de "Visita" (figura 8A ). Se utilizará la unidad de "Divisor" para dirigir una señal de entrada a un determinado lado de la esquina. Esto es necesario para los módulos más complicados como los utilizados en la tarea SRT o retraso descuento (DD), que requieren de un lado específico. Por ejemplo, en la tarea DD, solamente una parte azucarada se abrirá con un retardo (Figura 9A). - Definir el estado inicial de las puertas en jaulas en la ficha "Opciones" especificar todas las puertas para ser cerrado en la sesión no potables como el estado inicial típica para tareas de PP o PPR.
- Establecer los horarios en la pestaña "Opciones". Los módulos se cambian en ciertos puntos del tiempo, y se realiza la acción definida en la ventana de "Patrones de día".
Nota: La parte de "Patrones de día" se puede utilizar para configurar la ventana de tiempo experimental. Normalmente, el tiempo de la noche, fase activa de los ratones, se utiliza para evaluar el comportamiento en las tareas cognitivas. Debe ser notado que la duración de la tarea pueden afectar la cantidad de ingesta de agua. Si la duración es larga en tareas relativamente fáciles, puede disminuir el rendimiento en el final de la ventana de tiempo debido a la satisfacción. Por lo tanto, la ventana de tiempo es necesaria fijarse cuidadosamente.
- Crear la lista de animales
- Ejecutar el experimento el "Controller"
- Carga el archivo experimental presionando el "experimento"... botón en la sección de "Ajuste" en el "controlador".
- Ejecutar el experimento pulsando el botón "Inicio" del "Control" (parte derecha del centro).
- Controlar y visualizar el estado actual del sistema y los ratones.
Nota: Los eventos conductuales se explican como sigue: visita, entrar en una esquina (detectada por el sensor termal); nosepoke, poner la nariz en el agujero dentro de la esquina (detectado por rayos infrarrojos y puede dividirse en nosepoke izquierdo y derecho); lame, lame detectado por lickometer (contado como tiempo de contacto y frecuencia). - Revise cuidadosamente el estado del sistema, prestando especialmente atención a las precauciones.
PRECAUCIÓN: Errores debidos a una incorrecta etiqueta animal (número de transponder) se informará en el registro incluso si el número real de la etiqueta es correcto (es decir., "no registrado etiqueta ***", "Señal de la presencia sin registro de antena", etcetera.). Esto puede ser debido al uso de un transpondedor que está a punto de caducar. Sin embargo, este error no es un problema grave. En este caso, uno debe comprobar de nuevo que el animal identificado en el mensaje puede ser detectado. Errores debidos a largos períodos sin una visita o bebida se mostrará como, por ejemplo, "*** (animal ID) no hizo ninguna visita durante los últimos minutos 720" (figura 3B). Revise cuidadosamente las varias posibilidades que pueden llevar a este tipo de errores. El caso más grave es que el animal ya está muerto. La posibilidad de la segunda más grave es que hay un problema con el sistema de detección para el animal (el transponder no funciona, o ha caído hacia fuera). La tercera posibilidad es que el animal no está activo. Si el animal no tiene ningún visitas durante un período de 24 h todo, el experimentador debe considerar retirar el animal de la jaula debido a su condición de salud. Un problema grave que no tiene indicación del error es la falta de la puerta para cerrar (casi siempre debido a los problemas con los imanes en la puerta). Esto resulta en la creación de un rincón de consumo inadecuado. Para comprobar este problema, deben comprobar las condiciones de todas las puertas durante una sesión de no beber por lo menos una vez al día. Los datos obtenidos cuando este problema está presente no pueden utilizarse para el análisis de tareas PP, PPR, SRT o DD. - Salida de todos los eventos conductuales con la etiqueta para el tiempo y el animal información pulsando el botón "Stop" en el "controlador" (figura 3B).
- Manejo de datos usando el "analizador"
- Utilizando el "analizador", analizar y visualizar los datos.
- Exportar los datos de tiempo desechado como archivos de Excel (figura 3). Los resultados gráficos que se muestra en la pestaña "Tablas" pueden facilitar la comprensión de los datos. En la ficha "Datos", los datos están dispuestos en varias columnas y se pueden clasificar y filtran utilizando cualquiera de los parámetros.
3. animal preparación
- Usar animales sobre 15 g (de 2 meses de edad o mayores).
Nota: Si los animales son más pequeños que 15 g, múltiples ratones pueden visitar una esquina al mismo tiempo, llevando a la insuficiencia en la recolección de datos. De los animales deben ser supervisados cuidadosamente para asegurarse de que son capaces de saltar en las esquinas y subir el alimentador. Algunos más viejos ratones o ratones con mutaciones genéticas exhibe deficiencias motoras pueden morir porque no puede acceder al agua o los alimentos. - Reducir el riesgo potencial de agresión.
Nota: Incluso cuando se utiliza ratones femeninos, es mejor comenzar la vivienda todos los ratones juntos en una jaula en una edad joven (es decir, a la edad de 1 mes) antes de comenzar el experimento. Debe obtenerse un perfil de la línea de ratón, especialmente con respecto a la agresividad, al usar ratones machos en la jaula. -
Implantamos los transpondedores de identificación por radiofrecuencia (esterilizada, aguja incluida) por vía subcutánea en los ratones en la región dorso-cervical bajo anestesia de inhalación isoflurano (figura 4).
- Coloque el ratón en la cámara para la inducción de la anestesia.
- Ajustar el flujómetro de oxígeno de 0.8 a 1.5 L/min e isoflurano vaporizador de 2.0 a 2.5%.
- Suelte el ratón de la cámara de inducción después de la frecuencia respiratoria a ser lento (cerca de 5% de caída).
- Mantener la anestesia con mascarilla.
- Aplique ungüento oftálmico para ojos para prevenir la resequedad del ojo.
- Pellizcar y levantar la piel alrededor de la parte posterior de la escápula para crear un bolsillo.
- Moje el sitio de la inyección con etanol al 70% para minimizar la introducción de pelo en el espacio subcutáneo. Luego, inserte la aguja de inyección a través de la piel paralela a la columna vertebral.
- Expulsar el microchip subcutáneo.
- Pellizcar el microchip a través de la piel que le espacio inter-escapular.
- Retire la aguja lentamente. Seguir a pellizcar la zona durante unos segundos proporcionar hemostasia.
- Uso de alivio del dolor después de la administración si la aguja está mal introducida.
- Suelte el ratón de la anestesia.
- Coloque el ratón en una jaula de recuperación y vigilar hasta que despierten y moverse. Evite dejar desatendido el ratón.
- Volver el ratón a la jaula del hogar una vez que se ha convertido en totalmente ambulatoria.
- Compruebe el transpondedor implantado con un lector de transponder para por lo menos 1 semana.
PRECAUCIÓN: La posición de los transpondores implantados es absolutamente crítica para la identificación (ver figura 2). No inserte el transpondedor verticalmente en el cuello; Esto puede causar, animales recibieron lesiones de la médula espinal del animal. Transpondedores a veces caen hacia fuera después de algunas horas o días. Compruebe si el transponder está trabajando mediante el uso de un lector de transponder. En opcional, implantes transponder otra vez si se cae; sin embargo, el nuevo implante repetido puede provocar cambios de comportamiento artificiales. Compruebe la fecha de caducidad. Vencidos los transpondores con frecuencia transmite señales incorrectas que resulten de la falta de datos.
- Introducir los animales en la jaula y comprobar los transpondedores en los ratones con los lectores de transponder. Eliminar los ratones si no se detectan los transpondedores.
4. funcionamiento experimentos
Nota: Ratones alimentados ad libitum con chow de ratón estándar y mantenidos con sintético de cama que se cambia cada 1 o 2 semanas dependiendo del horario de trabajo. Evitar cambiar ropa de cama durante la tarea de aprendizaje espacial especialmente iniciales 1 a 2 días. Luces están encendidas entre 8:00 y 20:00. Los módulos experimentales se realizan secuencialmente según las preguntas científicas. El programa experimental se ilustra en la figura 5.
- Actividad general
Nota: Los ratones son secuencialmente adaptados al entorno en la jaula con tres condiciones experimentales: la adaptación libre, donde los animales siempre pueden acceder a las botellas de agua en las esquinas liberalmente (un día a 1 semana de habituación es típicamente considerado adecuada); NPA, donde los ratones pueden acceder a las botellas de agua de 5 s después de cada nosepoke en los agujeros frente a las puertas en las esquinas (3 días a 1 semana habituación por lo general se considera adecuada); y la adaptación de sesión beber, donde los ratones pueden acceder a las botellas de agua en un momento específico del día.- Prepare los archivos de experimento para las tareas FA, NPA y DSA.
- Ejecutar la tarea de FA en el "controlador".
- Medir el número de visitas, nosepokes o lamedura episodios diarios o circadianos actividad periódicamente un índice de actividad en general.
- Ejecutar la tarea NPA en el "controlador".
- Ejecutar la tarea DSA en el "controlador".
Nota: Muchos paradigmas de aprendizaje requieren adaptación para la sesión de bebida. Para establecer el calendario de la DSA, utilice dos módulos experimentales diferentes: la sesión por defecto (de privación de agua) y beber de la sesión. Los ratones no pueden acceder a las botellas de agua porque no pasa nada después de un nosepoke en el módulo por defecto. La sesión beber es idéntica al módulo de NPA. El calendario definido en la ficha "Opciones" en el "diseñador" puede luego cambiar a la sesión no consumo definida por otro módulo.
- Tareas de memoria y aprendizaje espacial
Nota: La tarea PP se utiliza para evaluar el aprendizaje espacial (típicamente 5-7 días). En la tarea PP, los ratones tienen un acceso limitado al agua en tres de las cuatro curvas (una esquina correcta y tres incorrectas). Así, los animales tendrían que visitar una cierta esquina para beber agua durante las sesiones de bebida. La tarea PPR se utiliza para evaluar la flexibilidad o compulsividad y la capacidad para cambiar el comportamiento del fluido (normalmente 5-7 días). En la tarea de la PPR, los ratones sólo pueden acceder a agua en los rincones opuestos utilizado como la esquina correcta en la tarea PP.- Preparar los archivos de experimento para las tareas de PP y el PPR. Definir los ángulos correctos para los ratones mediante el establecimiento de "Clusters" (típicamente 1-4 esquinas de cada) en la pestaña de "Animal" del "Diseñador" (ver figura 6A, inferior). Para evitar el tráfico pesado en una esquina, asignar las cuatro esquinas a todos los ratones uniformemente.
- Ejecutar la tarea PP en el controlador.
- Evaluar el desempeño de aprendizaje espacial en el curso del tiempo, el número y el porcentaje de nosepokes correcta.
Nota: La versión actual de la tarea PP se centra más en espacial aprendizaje en lugar de, memoria espacial, como la tarea no requiere un espacio de tiempo entre los diferentes ensayos. Para centrarse más en la memoria espacial, considere el uso de la tarea de evitación (PA) de lugar o una nueva versión indefinida de la tarea espacial que utiliza espacios de tiempo entre ensayos. - Ejecutar la tarea de la PPR en el "controlador".
- Evaluar la flexibilidad o compulsión basada en el curso del tiempo, el número y el porcentaje de la nosepokes correcta.
Nota: La interpretación de los datos de la PPR requiere varios juicios cuidadosos. Rendimiento inicial de la tarea PPR es fuertemente dependiente sobre el rendimiento en la tarea PP. Esto es porque la tarea PPR se basa en la interferencia o la necesidad de alterar el comportamiento. Por lo tanto, el rendimiento de la PPR puede ser especialmente pobre si el desempeño de la tarea PP es cercana al 100% correcta. Flexibilidad puede ser considerada una de las funciones ejecutivas11,12,13. - Evaluar memoria del temor espacial en PA.
Nota: La tarea PA consta de 4 sesiones continuas: habituación (día 1); acondicionado (soplo de aire es introducido después de nospoke en los lados de una esquina previamente definido [nosepoke incorrecto], día 2); 24 h de descanso fuera de la jaula de pruebas (los ratones se colocan en sus jaulas hogar normales, day3); colocación de ratones en la jaula de pruebas sin aire-puff (días 4-10).- Prepare los archivos de experimento para Pensilvania
- Ejecute la habituación (día 1).
- Ejecutar el acondicionamiento (día 2).
- Tomar los ratones en jaulas Inicio normales y mantener durante 24 h (day3).
- Llevar el ratón a la jaula prueba y ejecutar el protocolo de prueba (día 4-10).
- Evaluar el aversivo aprendizaje espacial basado en la relación de nosepokes incorrecto en el día de acondicionado (día 2), aversiva memoria espacial basado en en el día de regreso a la jaula de la prueba (día 3), y aprendizaje de extinción basado en en los días 4-10.
- Evaluación de la función ejecutiva (impulsividad, atención y compulsividad)
- Tareas SRT
Nota: Este procedimiento fue descrito en más detalle10,14. En este conjunto de tareas, las cuatro esquinas se funcionan de la misma manera, 24 horas por día. La SRT consiste en dos sesiones de entrenamiento (SRT-entrenamiento 1 y 2) y dos sesiones de pruebas (SRT-Test 1 y 2). En la primera sesión de entrenamiento (entrenamiento de SRT 1), los animales están capacitados para saber que la luz amarilla es una señal de arranque para un nosepoke. Las luces LED flash siempre inmediatamente después de la nosepoke inicial (retraso se establece en 0 s).
En la segunda sesión de entrenamiento (SRT-entrenamiento 2), el retraso se establece en variar aleatoriamente entre 0.5, 1.0, 2.0 y 4.0 s. Durante este período, las respuestas prematuras no tienen ninguna consecuencia (formación previa). Cualquier nosepoke durante el período de demora se considera una respuesta prematura, mientras que la primera nosepoke cuando se abre la puerta (5 s) se considera una respuesta correcta. En la primera sesión de test (SRT-prueba 1, utilizado para evaluar impulsividad), el primer nosepoke define el lado correcto e inicia un periodo de espera (0.5-4.0 s, dependiendo de la fase de tarea), después que LED amarillos se enciende para un período específico de tiempo (duración del estímulo = 2.0 s, dependiendo de la fase de tarea). Entonces se abre la puerta. La primera nosepoke después de que el período de demora abre la puerta (5 s) y se cuenta como un nosepoke correcto, mientras que cualquier nosepoke durante el período de demora se considera prematuro nosepoke. Hay varias modificaciones en la segunda sesión de la prueba (SRT-prueba 2, utilizado para evaluar atención). Después a partir de un estímulo (0.2 – 1.0 s, algo más corta que la primera prueba), los ratones cuentan con un período de tiempo durante el cual se permite nosepokes (sostener la limitada, típicamente 2 s). Puertas abiertas (5 s) solamente después de una correcta nosepoke, que es el primer nosepoke durante la espera limitada. Nosepokes después la bodega limitada se consideran como omite nosepoke y no conducen a cambios en el resultado. Los errores se dividen en tres tipos: nosepoke precoz, nosepoke omitido y omisión (sólo primer nosepoke). La prueba de atención exige capacidad de aviso LED flash (definido por la duración de la duración del estímulo) así como moderadamente rápida respuesta (definido por la duración de espera limitado). El curso del tiempo de la prueba se ilustra en la figura 7.- Prepare los archivos de experimento para las tareas de la SRT.
- Ejecute el SRT-entrenamiento 1 por 3 días.
- Ejecute el 2 entrenamiento de SRT por 7 días.
- Ejecute la prueba de la SRT 1 (impulsividad) durante 7 días. Calcular la impulsividad partiendo de la siguiente fórmula:
donde P es el número de ensayos nosepoke prematuro (o el número de nosepoke incorrecta), y T es el número de ensayos totales (el número de la primera nosepoke). - Ejecute el SRT-Test 2 (atención) durante 7 días. Calcular la exactitud (que se considera un indicador de rendimiento para atención) utilizando la siguiente fórmula:
donde C es el número de ensayos de nosepoke correcto (número de nosepokes segundo correcto), T es el número de ensayos totales (el número de la primera nosepokes), O es el número de los ensayos de omisión (número de juicio falta una nosepoke de segundo), y P es el número de prematuros ensayos de nosepoke (o el número de segundo nosepoke incorrecta antes de la bodega limitada).
-
Tarea DD
Nota: Esta es una tarea de elección simple, donde los animales elegir entre esperar a beber agua azucarada (SW, sacarina de 0.5% o 10% de sacarosa) con un retardo o beber agua normal sin un retraso. Permaneciendo cerrada la puerta en el lado opuesto, se abre la puerta del lado elegido. El SW y el agua normal se asignan en los lados derecho o izquierdos de todas las esquinas idénticamente. El horario de trabajo DD incluye las sesiones de entrenamiento y prueba. En la sesión de entrenamiento, los ratones se pueden acceder a agua sin un tiempo de espera y SW. Así, los ratones desarrollan su preferencia hacia el SW. En las sesiones de prueba, el tiempo de espera aumenta todos los días (es decir., 0, 1, 2,..., 8 s). Los retrasos aumentan secuencialmente a diario haciendo varios módulos exhibir longitud de retraso diferentes (0, 1, 2,..., 8 s) y "Enlace" en el "Módulo" y "Opciones" (patrones de día). En esta tarea, las cuatro esquinas funcionan de la misma manera, 24 horas por día.- Preparar el archivo experimental para tarea DD.
- Defina el lado del SW (lados derecho o izquierdos en todos los rincones).
- Reemplazar las botellas de agua a los lados definidos con las botellas que contienen SW.
- Ejecutar la sesión de entrenamiento para entrenar a los animales a beber SW en los lados definidos con ningún retraso durante 5 – 7 días.
- Calcular el índice de preferencia, que se define como la relación de lamedura o nosepoking en el lado del SW para el número total de lame o nosepokes. El índice de preferencia por el lado que SW que contiene por lo tanto se calcula como:
o
El índice anterior se centra más en los resultados de la acción, mientras que el último se centra más en el comportamiento de elección.
Nota: Asegúrese de que la mayoría de ratones preferentemente elegir los lados con el SW (> 90% para el índice basado en el número de licking, > 80% para el primer índice de nosepoke) al final del entrenamiento. - Posteriormente, ejecutar la sesión de prueba de tarea DD por 9 días (retardo de 0 a 8 s).
- Evaluar el curso del tiempo del cambio en la preferencia hacia el lado con SW para evaluar la compulsión.
- Tareas SRT
- Análisis de datos
- Abra el archivo utilizando el "analizador" y exportar todos los datos a archivos de Excel. Si la cantidad de cantidad de datos es bastante grande, es mejor filtrar los datos (es decir., extracto de la sesión beber para las tareas espaciales y extraer la primera y la segunda nosepokes para las tareas de la SRT).
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Representative Results
En nuestro estudio anterior, los déficits cognitivos dependientes de la edad en los modelos de AD fueron detectados por los experimentos utilizando el automatizado home-jaula Monitoreo sistema10. Su rendimiento de los modelos de AD en el PP estaba intacta en adultos jóvenes y más viejos temas; sin embargo, el rendimiento en PPR fue significativamente y progresivamente deteriorada (figura 6). También es importante observar el comportamiento general o ansiedad en la fase de adaptación, dado que tales características pueden afectar la cognición15. Los modelos AD no mostró ninguna anormalidades gruesas en la visita, nosepoke y lamiendo los números en las sesiones de FA, PN y DSA. Así, los modelos de AD pueden tener menor flexibilidad.
Para evaluar las funciones ejecutivas, se registró el rendimiento conductual en SRT y DD. Más viejos modelos del anuncio (NL-G-F) carecieron de precisión en la última etapa de SRT (SRT-Test 2) (figura 8). Compulsividad facilitado se observó en los adultos jóvenes y viejos temas de los ratones de NL-G-F (figura 9B, parte superior). Curiosamente, aunque hubo un aumento en la compulsión de los ratones de NL-F que eran adultos jóvenes, en edad avanzada, llegó a ser comparable a la de los ratones de tipo salvaje (figura 9B, parte inferior). Este es un ejemplo del fenotipo de la mutación de NL-F transitorio.
Figura 1: componentes del sistema automatizado de monitoreo de jaula casa. (A) Descripción del sistema. (B) Ubicación de los conectores. (C) esquina del compartimiento con la puerta operante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: ejemplo de la caja del grupo para el estudio. Normalmente, se utilizan 12 ratones por jaula. En caso de utilizar cuatro grupos (tres modelos genéticos y uno de tipo salvaje), tres ratones por grupo por IntelliCage se consideran adecuados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Software para el sistema. (A) el "diseñador" se utiliza para generar archivos de experimentales. Izquierda: La parte Animal de la lista incluye la información de las definiciones de animales y de grupo. Derecha: El espacio del módulo se utiliza para definir las operaciones experimentales. (B) el "regulador" puede utilizarse para ejecutar, monitor y registro experimentos. Izquierda: El estado de uno de la jaula con mostrando la visita de los animales, nosepoke y lamer en las cuatro esquinas. Derecha: Ventanas de alarma aparecerá si ocurren algunos problemas. (C) el analizador se puede utilizar para manejar y exportar datos adquiridos por el regulador. Izquierda: Todos los datos son etiquetados con información del animal, el medio ambiente dentro de la jaula y el tiempo. Filtrado ayudará a más análisis en Excel u otro software de analítica. Derecha: La línea de tiempo de las visitas (también nosepoke o lame) pueden mostrarse individualmente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: implantación del transpondedor. (A) Microchip transponder (DataMars). Lado (B) vista de la implantación del transpondedor (transpondering). No causa lesiones en la médula espinal. (C) vista superior de transponder. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: línea de tiempo de los experimentos para la evaluación cognitiva con el sistema automatizado de monitoreo de jaula casa. Una batería de pruebas para la evaluación cognitiva se realizó dos veces (set 1, 9-12 meses edad; y 2 º establece, 14-17 meses) seguido por los experimentos para evaluar la actividad general en el final (3er set [18 meses]). Esta batería fue designada para evaluar múltiples dominios cognitivos (indicada por colores — rojo: actividad general; Azul: aprendizaje espacial y memoria. Verde: función ejecutiva), que tiene ventajas en validación y caracterización de los déficits cognitivos esperados. FA: Adaptación libre; NPA: Nosepoke adaptación; DSA: Beber adaptación del período de sesiones; PP: Preferencia de lugar; PPR: Revocación de preferencia de lugar; SRT: Tiempo de reacción Serial (para la impulsividad y la atención); PA: Lugar evitación; DD: Descuento de la demora. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: diseño Experimental y resultados representativos de las tareas de PP y el PPR. (A) arriba, un diseño de módulo de ejemplo para el PP o PPR. Parte inferior, el correcto ajuste de esquina se cambia al lado opuesto en PPR. (B) déficit en inversión espacial de aprendizaje en un modelo de anuncio (NL-G-F) sacado a edad avanzada. Datos se expresan como media ± error estándar de la media (SEM). ∗p < 0.05; Departamentop < 0.01. Los colores indican los grupos de comparación: azul: vs NL WT; Rojo: NL-F vs WT; Verde: NL-G-F vs peso. Esta figura se ha modificado de la referencia10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: flujo de ensayo de las tareas de la SRT. Izquierda: el flujo de prueba de la SRT (imp). El primer nosepoke define el lado correcto e inicia un periodo de espera (0.5-4.0 s), después de que LED amarillo se enciende. Entonces se abre la puerta. Derecha: el flujo de prueba de la SRT (att). El primer nosepoke define el lado correcto e inicia un periodo de espera (2.0 s), después que los LEDs amarillos se encienden en un tiempo más corto (0.2 – 1.0 s). Los ratones disponen de un período de tiempo durante el cual se permite nosepokes (sostener la limited, 2 s). Puertas abiertas (5 s) solamente después de una correcta nosepoke, que es el primer nosepoke durante la espera limitada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: diseño Experimental y resultados representativos de las tareas de la SRT. (A) un diseño de módulo de ejemplo para los SRT. (B) atención disminuyen en un modelo de anuncio específico para a edad avanzada. Los datos se expresan como media ± SEM. ∗p < 0.05; Departamentop < 0.01. Los colores indican los grupos de comparación: azul: vs NL WT; Rojo: NL-F vs WT; Verde: NL-G-F vs peso. Esta figura se ha modificado de la referencia10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9: diseño Experimental y resultados representativos de tarea DD. (A) un ejemplo del módulo para la tarea DD. (B) facilitó la compulsividad en el modelo AD (NL-G-F) en los jóvenes y la edad antigua. Este es un ejemplo de fenotipo. Por otro lado, compulsividad aumentó transitoriamente en otro modelo de anuncio (NL-F). Los datos se expresan como media ± SEM. ∗p < 0.05; Departamentop < 0.01. Los colores indican los grupos de comparación: azul: vs NL WT; Rojo: NL-F vs WT; Verde: NL-G-F vs peso. Esta figura ha sido modificada desde el anterior trabajo10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este papel describe el método utilizando el sistema automatizado de monitoreo de hogar-jaula para ensayos cognitivos y conductuales a largo plazo en modelos transgénicos de AD. El paso más crítico es la implantación de los transpondedores en la posición adecuada. Antes de realizar la implantación, asegúrese de que no ha pasado la fecha de vencimiento de lo transponder. El segundo punto importante es comprobar el funcionamiento del sistema, especialmente como un problema menor puede convertirse posteriormente en uno más grave durante el estudio (es decir., una apilada de la puerta, transpondedor fuera caído, malas conexiones eléctricas, etcetera .). En tercer lugar, es esencial para poder disparar problemas porque pueden producirse muchos problemas a lo largo de la programación experimental.
Este papel introdujo un paquete básico de las tareas de evaluación cognitiva. Estas tareas fueron producidas haciendo referencia a las pruebas convencionales de comportamiento, pero no imitan perfectamente las pruebas convencionales. Por ejemplo, tareas SRT no establezca la opción modo. Cinco tareas opción de elección serial (5CSRTT), un modelo de tareas de la SRT, se lleva a cabo normalmente en una cámara con 9, 5 ó 3 agujeros para el nosepoke medir la precisión16,17. Nuestro equipo previamente intentó implementar una versión opción de SRT, pero los ratones se ha podido aprender la regla dentro de un tiempo relativamente largo (2 semanas o más). El usuario de este sistema debe ser consciente de la diferencia y discutir datos cuidadosamente.
Otra cuestión es acerca de las limitaciones de la medida repetida. Como se mencionó en el anterior estudio18, la primera es que los experimentos repetidos simplemente no pueden comparar el efecto de la edad. Observamos que los datos de la segunda prueba de PA no reproducir el deterioro de la memoria en anuncio modelos10. El rendimiento del genotipo todo fue mucho peor que el de la primera prueba de PA. Esta diferencia puede provenir de la diferencia de edad o la habituación al estímulo aversivo (experiencia de tarea PA anterior). Los experimentadores deben mente el efecto repetición y considerar el orden de las tareas. Para superar la habituación del estímulo aversivo en la segunda prueba de PA, sería mejor utilizar estímulos de soplo de aire más fuerte o añadir algún nuevo estímulo ambiental como diferentes tipos de ropa de cama o19.
Varios investigadores han desarrollado nuevos métodos y protocolos para el seguimiento automatizado de casa jaula estudios20,21,22,23,24,25, 26y soporte software con código abierto biblioteca27. Por lo tanto, se ha ampliado la posibilidad del sistema. Por último, el sistema proporciona proyección comportamiento automatizado de alto rendimiento para ensayos a largo plazo que se utilizan para estudiar una amplia gama de funciones cognoscitivas, que es beneficiosa en fenotipado y validación de modelos de la enfermedad.
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Disclosures
No hay conflicto de interés declarado.
Acknowledgments
Damos las gracias por su ayuda en materiales de fotografías Reiko Ando. Esta investigación fue apoyada por subvenciones para la investigación exploratoria (JSP KAKENHI número 16K 15196).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IntelliCage | TSE Systems | - | Parchased in 2011 or later |
| PC | Dell | Inspiron 580s | - |
| Display | Dell | SI75T-WL | - |
| ALPHA-dri | Shepherd Specialty Papers | - | Standard bedding |
| Aron Alpha (Krasy Glue) 2 g | Toagosei (Krasy Glue) | #04612 | Cyanoacrylates for gluing magnet and blak arm |
| Handheld Transponder Reader | BTS-ID | R-560 | Transponder reader, which reads both Trovan and DataMars |
| Transponder | DataMars | T-VA, T-VAS, or another series | Basic package of transponders and implanters |
| Diamond Grip Plus | Ansel Microflex | DGP-INT-M | Experimental glove |
| Isoflurane | Pfizer | 1119701G1092 | - |
| Vaporizer for small animals | DS Pharma Biomedical | SF-B01 | Facemask included |
| Neo-Medrol | Pfizer | 006472-001 | Eye ointment |
| Ethanol (70%) | - | - | - |
| Excel | Microsoft | 00202-51382-15524-AA928 | For data analysis |
References
- Bryan, K. J., Lee, H., Perry, G., Smith, M. A., Casadesus, G. Transgenic Mouse Models of Alzheimer's Disease: Behavioral Testing and Considerations. Methods of Behavior Analysis in Neuroscience. , CRC Press/Taylor & Francis. (2009).
- Nestler, E. J., Hyman, S. E. Animal models of neuropsychiatric disorders. Nature Neuroscience. 13 (10), 1161-1169 (2010).
- Crawley, J. N. Behavioral Phenotyping Strategies for Mutant Mice. Neuron. 57 (6), 809-818 (2008).
- Zarringhalam, K., Ka, M., et al. An open system for automatic home-cage behavioral analysis and its application to male and female mouse models of Huntington's disease. Behavioural Brain Research. 229 (1), 216-225 (2012).
- Prusiner, S. B., Jackson, W. S., King, O. D., Lindquist, S. The power of automated high-resolution behavior analysis revealed by its application to mouse models of Huntington's and prion diseases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (23), 13363-13383 (1998).
- Jhuang, H., Garrote, E., et al. Automated home-cage behavioural phenotyping of mice. Nature Communications. 1 (6), 1-9 (2010).
- Krackow, S., Vannoni, E., et al. Consistent behavioral phenotype differences between inbred mouse strains in the IntelliCage. Genes, brain, and behavior. 9 (7), 722-731 (2010).
- Nilsson, P., Saito, T., Saido, T. C. New mouse model of Alzheimer's. ACS chemical. 5 (7), 499-502 (2014).
- Saito, T., Matsuba, Y., et al. Single App knock-in mouse models of Alzheimer's disease. Nat Neurosci. 17 (5), 661-663 (2014).
- Masuda, A., Kobayashi, Y., Kogo, N., Saito, T., Saido, T. C., Itohara, S. Cognitive deficits in single App knock-in mouse models. Neurobiology of Learning and Memory. , (2016).
- Chan, R. C. K., Shum, D., Toulopoulou, T., Chen, E. Y. H. Assessment of executive functions: Review of instruments and identification of critical issues. Archives of Clinical Neuropsychology. 23 (2), 201-216 (2008).
- Jurado, M. B., Rosselli, M. The Elusive Nature of Executive Functions: A Review of our Current Understanding. Neuropsychology Review. 17 (3), 213-233 (2007).
- Diamond, A. Executive Functions. Annual Review of Psychology. 64 (1), 135-168 (2013).
- Kobayashi, Y., Sano, Y., et al. Genetic dissection of medial habenula-interpeduncular nucleus pathway function in mice. Frontiers in behavioral neuroscience. 7, 17 (2013).
- Robinson, O. J., Vytal, K., Cornwell, B. R., Grillon, C. The impact of anxiety upon cognition: perspectives from human threat of shock studies. Frontiers in human neuroscience. 7, 203 (2013).
- Robbins, T. The 5-choice serial reaction time task: behavioural pharmacology and functional neurochemistry. Psychopharmacology. (3-4), 362-380 (2002).
- Asinof, S. K., Paine, T. A. The 5-Choice Serial Reaction Time Task: A Task of Attention and Impulse Control for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (90), e51574 (2014).
- Codita, A., Gumucio, A., et al. Impaired behavior of female tg-ArcSwe APP mice in the IntelliCage: A longitudinal study. Behavioural brain research. 215 (1), 83-94 (2010).
- Blumstein, D. T. Habituation and sensitization: new thoughts about old ideas. Animal Behaviour. 120, 255-262 (2016).
- Endo, T., Maekawa, F., et al. Automated test of behavioral flexibility in mice using a behavioral sequencing task in IntelliCage. Behavioural brain research. 221 (1), 172-181 (2011).
- Voikar, V., Colacicco, G., Gruber, O., Vannoni, E., Lipp, H. -P., Wolfer, D. P. Conditioned response suppression in the IntelliCage: assessment of mouse strain differences and effects of hippocampal and striatal lesions on acquisition and retention of memory. Behavioural brain research. 213 (2), 304-312 (2010).
- Puścian, A., Łęski, S., Górkiewicz, T., Meyza, K., Lipp, H. -P., Knapska, E. A novel automated behavioral test battery assessing cognitive rigidity in two genetic mouse models of autism. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 140 (2014).
- Voikar, V., Colacicco, G., Gruber, O., Vannoni, E., Lipp, H. -P., Wolfer, D. P. Conditioned response suppression in the IntelliCage: assessment of mouse strain differences and effects of hippocampal and striatal lesions on acquisition and retention of memory. Behavioural brain research. 213 (2), 304-312 (2010).
- Harda, Z., Dzik, J. M., et al. Autophosphorylation of αCaMKII affects social interactions in mice. Genes, Brain and Behavior. , e12457 (2018).
- Aarts, E., Maroteaux, G., et al. The light spot test: Measuring anxiety in mice in an automated home-cage environment. Behavioural Brain Research. 294, 123-130 (2015).
- Safi, K., Neuhäusser-Wespy, F., et al. Mouse anxiety models and an example of an experimental setup using unconditioned avoidance in an automated system -IntelliCage. Cognition Brain & Behavior. 10 (4), 475-488 (2006).
- Dzik, J. M., Puścian, A., Mijakowska, Z., Radwanska, K., Łęski, S. PyMICE: APython library for analysis of IntelliCage data. Behavior Research Methods. 50 (2), 804-815 (2018).
