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Behavior

Automatisé, à long terme analyse comportementale pour les fonctions cognitives dans de multiples modèles génétiques de la maladie d’Alzheimer, à l’aide de IntelliCage

doi: 10.3791/58009 Published: August 4, 2018

Summary

Cet article décrit un protocole pour les évaluations cognitives pour modèles génétiques de la maladie d’Alzheimer à l’aide du système IntelliCage, qui est un système de surveillance comportementale haut débit automatisé avec conditionnement opérant.

Abstract

Plusieurs facteurs, tels que le vieillissement et les gènes — sont fréquemment associées à déclin cognitif. Modèles de souris génétiquement modifiées de déclin cognitif, comme la maladie d’Alzheimer (ma), sont devenus un outil prometteur pour élucider les mécanismes sous-jacents et de promouvoir les avancées thérapeutiques. Une étape importante est la validation et la caractérisation d’une anomalie comportementale attendue dans les modèles, dans le cas de l’AD, déclin cognitif. Les enquêtes comportementales à long terme des animaux de laboratoire pour étudier les effets du vieillissement des efforts considérables de la demande de chercheurs. Le système IntelliCage est une batterie de tests de haut-débit et rentable pour les souris qui élimine la nécessité d’une manipulation humaine quotidienne. Ici, nous décrivons comment le système est utilisé dans la détermination du phénotype à long terme d’un modèle génétique de la maladie d’Alzheimer, en se concentrant spécifiquement sur les fonctions cognitives. L’expérience emploie répétée batterie de tests permettant d’évaluer l’apprentissage spatial et les fonctions exécutives. Ce phénotypage rentable de fonction de l’âge nous permet d’identifier les effets transitoires ou permanents des gènes sur différents aspects cognitifs.

Introduction

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Le développement de modèles animaux pour la maladie neuronale au cours de la dernière décennie a fourni une interprétation mécaniste de leur base et afin de promouvoir les avancées thérapeutiques1,2,3. Application d’une batterie de tests comportementaux de haut débit dans des modèles animaux génétiques est un outil de recherche heuristique pour étudier les mécanismes sous-jacents des maladies humaines et l’identification des traitements médicamenteux. Batteries de test de recherche adaptées pour l’observation à long terme du vieillissement et/ou modèles de démence ont traditionnellement contraints laboratoires de consommer de grandes quantités de main-d'œuvre spécialisée et de temps. Un système de surveillance de domicile-cage serait une stratégie rentable car elle permettrait de réduire le coût de l’observation comportementale par les humains. Certaines équipes de recherche ont mis au point des outils automatisés visionique qui aident la détermination du phénotype comportemental d’un individu dans une petite cage maison4,5,6. Cependant, ces méthodes limitent l’interaction sociale, la taille des environnements de test et la variété des mesures comportementales qui incluent des fonctions cognitives. Le IntelliCage est un système de surveillance domicile-cage deuxième génération conçu pour effectuer diverses tâches cognitives dans une cage maison sociale. Ce qui est important, cette méthode permet d’éliminer tous les jours de manipulation qui permet d’effectuer la surveillance comportementale à long terme avec l’évaluation des fonctions cognitives, et il peut éliminer les exigences relatives à la gestion pratique spécialisée et activez hautement reproductible acquisition de données7. Nous décrivons ici le long terme phénotypage et validation de modèles murins génétique de la maladie d’Alzheimer (ma) qui a été généré récemment8,9,10 en utilisant le suivi automatisé de maison-cage système. Une batterie de tests, qui comprenait des quotes-parts de l’apprentissage spatial et les fonctions exécutives, s’est déroulée à plusieurs reprises avec plusieurs points d’âge (9 à 12 et 14 – 17 mois). Cette fonction de l’âge de phénotypage a permis d’identifier les effets transitoires ou permanents des gènes sur différents aspects cognitifs. Nous avons constaté que certains modèles AD a montré des phénotypes transitoires et permanents de plusieurs aspects cognitifs mis à l’essai dans l’analyse à long terme en utilisant le système surveillance domicile-cage automatisé10. Ainsi, l’étude automatisée à l’aide du système de surveillance de domicile-cage est bénéfique et rentable pour la détermination du phénotype comportemental à long terme et la validation dans différents modèles de dysfonctionnement cognitif.

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Protocol

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Toutes les procédures ont été approuvées par l’animal institutionnel soin et d’utilisent de Comité, et ils ont été effectués conformément aux directives de l’Institut RIKEN Brain Science à l’expérimentation animale.

1. dispositif de réglage

Remarque : Une vue d’ensemble du système automatisé de surveillance Accueil-cage est montré dans la Figure 1. Chaque système (39 cm x 58 cm x 21 cm) contient un microprocesseur et quatre chambres de coin, chacun ayant deux bouteilles d’eau et une antenne de la bague de détection d’identification par radiofréquence des transpondeurs implanté dans les animaux (Figure 1 a). Les numéros d’identification du microprocesseur sont définies par le sélecteur rotatif (adresses matérielles) (Figure 1 b). Les numéros d’identification du microprocesseur ne doivent pas se chevaucher. Deux portes dans chaque coin sont contrôlés par ordinateurs, qui sont utilisés pour le conditionnement opérant (Figure 1). En règle générale, chaque cage peut évaluer jusqu'à 12 souris (voir la Figure 2 exemple de logement de groupe). À l’aide d’un plus grand nombre de souris est acceptable. Cependant, il devrait s’assurer que les souris ne se battent pas trop et qu’ils ne sont pas surpeuplées lorsqu’ils effectuent des tâches fortement concurrentiels.

  1. Connecter les cages à un ordinateur en série par l’intermédiaire de câbles CAN.
  2. Reliez les câbles aux prises dans le microprocesseur (marche). Tous les voyants puis devraient être mis en marche pendant quelques secondes et toutes les portes doivent se déplacer. Si les LEDs n’éteint pas ou si les portes ne se déplacent pas, débranchez et rebranchez le cordon d’alimentation (mauvaises connexions électriques peuvent conduire à mauvais fonctionnement).
  3. Assurez-vous que les portes coulissantes ouvrir et fermer correctement. Si les portes ne se déplacent pas correctement, vérifiez les petits aimants fixés sur le bras noir. Si ce problème se produit fréquemment, envisager de coller l’aimant sur le bras.
  4. Continuer à contrôler l’état des portes au cours des expériences (au moins une fois par jour).
  5. Allumer le PC.

2. le logiciel

Remarque : Les trois composantes du logiciel (« Designer », « Contrôleur » et « Analyzer ») pour le système automatisé de surveillance domicile-cage ont été conçues comme des interfaces graphiques (Figure 3). Les utilisateurs peuvent facilement contrôler ou ajouter diverses fonctions au cours de l’expérience.

  1. Faire expérimenter des fichiers en utilisant le « Designer »
    NOTE : Le « Designer » est utilisé pour générer et modifier des fichiers expérimentales (programmes sur le système) pour l’exécution de divers protocoles expérimentaux et pour tester l’état du système (Figure 3 a). Un seul fichier expérimental intègre la liste des animale, l’établissement de matériel et plusieurs protocoles expérimentaux. Utilisateurs peuvent obtenir également des protocoles de journal publié en contactant les auteurs.
    1. Créer la liste des animale
      1. Définir les conditions. Construire le dispositif expérimental de grand, qui comprend les paramètres suivants : 1) le nombre de souris sujet, 2) le nombre de lignées génétiques (ou groupes), 3) sexe (mâles, femelles ou les deux) et 4) le nombre de la cage à utiliser.
      2. Sélectionnez le type de transpondeur approprié (DataMars ou Trovan) dans la barre d’outil central.
      3. La valeur « Groupes ». Dans le panneau de « Groupes », ajouter ou supprimer des groupes expérimentaux (i.e., génotypes ou traitements) en appuyant sur le « vert (+) » ou « croix rouge (x) » bouton dans la fenêtre de « Groupes », respectivement.
      4. La valeur « Clusters ». Utilisez la fonction « Cluster » pour l’exploitation des sous-groupes également en définissant les côtés et les angles corrects, incorrectes et neutres.
        Remarque : La visite, nosepoke et lécher des événements, les principales données pour toutes les tâches comportementales, sont tous associés à la définition. Ce paramètre est requis pour les tâches d’apprentissage spatial. Les groupes définis pour chaque animal restent les mêmes tout au long de l’expérience. Par exemple, dans un cluster pour place préférence (PP) tâche ou lieu préférence inversion (PPR), un coin est défini comme étant correcte (l’eau accessible) et les trois angles sont définis comme incorrect (eau-inaccessible). En outre, les clusters peuvent être liés à l’autre à l’aide de la fonction « Link ».
      5. Affecter des variables telles que « Nom », « Tag » (transpondeur ID), « Sex », « Groupe » et « Cluster ».
      6. Enregistrez et coller les animaux listes en sélectionnant « Exporter des animaux »... et « Importation animaux »... dans la barre de menu « Fichier » pour répliquer les listes d’animaux pour une autre expérience.
    2. Configurer le matériel dans l’onglet « Setup » Set up tous les systèmes à l’aide de leur numéro d’ID correspondant (adresse matérielle) dans l’onglet « Configuration » correspondent au nombre d’adresses dans la section « designer » au nombre réel d’adresses.
    3. Construire des protocoles expérimentaux dans l’onglet « IntelliCage »
      1. Construire des protocoles expérimentaux dans l’onglet « IntelliCage » en utilisant les onglets inférieurs (onglets « Module » et « Option ») et tête suivant.
      2. Concevoir des structures expérimentales dans le « espace de Module » en cliquant sur l’onglet « Module » (Figure 3 a). Pour ajouter de nouveaux modules, appuyez sur « Ajouter » (bouton dans l’onglet « Module » plus vert).
        Remarque : Il y a quatre types de composants, à savoir « Tâches », « Utils », « Reporters » et « Événements ». En règle générale, une expérience commence avec un événement de déclenchement, à savoir « Visite », « Nosepoke » ou « Potable ». Pour sélectionner l’événement déclencheur, faites glisser l’unité correspondante dans la section événements pour définir le signe de départ. Par la suite, pour définir la sortie pour certains actionneurs (tels que l’ouverture de la porte), faites glisser les unités de la section « Tâches » (p. ex.., « Porte », « LED » et « Air »).
      3. Faites glisser les unités, montrées dans la partie « Unités », dans l’espace « Module ».
        Remarque : Encore une fois, utilisateurs peuvent obtenir des protocoles publiés (sous forme de fichiers expérimental) auprès des auteurs et de réutiliser les fichiers en important la nouvelle liste d’animaux. Les utilisateurs n’ont pas à faire tous les modules.
      4. Pour faire un module d’adaptation (NPA) nosepoke (Figure 6 a), faites glisser l’unité de la « Porte » de la section « Tâches », « Porte » et « Timer » unités de la section « Utils » et les unités « Visite » et « Nosepke » de la section « Événements » dans le « espace de Module ».
      5. Lien « Any » sur la ligne « ON » de l’unité de Nosepoke pour le « In » dans l’unité de la porte. Lien « Out » pour « Fermer » dans l’unité « Gate ». Lier « Out » de la « porte » à « Activer » dans l’unité « Timer ». Lier « Out » de la porte ouverte dans l’unité de la « Porte ». Lien « Out » dans l’unité « Timer » pour « Fermer » dans l’unité de la « Porte ». Définir « Période » comme 5 000 (ms) dans la section de la minuterie.
        Remarque : L’unité de la « Porte » est utilisée pour contrôler l’entrée et la sortie de la séquence. En l’état « Ouvert » (l’État par défaut), la séquence reliée à la « sortie » sera exploitée. En revanche, dans l’État « Close », la séquence connectée à la sortie sera arrêtée. La probabilité que le taux d’ouverture peut être spécifié (Figure 6 a, Figure 8et Figure 9 a). Le « sélecteur de Module » sert à modifier les modules au hasard ou à une certaine séquence au cours de la même période expérimentale. Dans la tâche de la série temps de réaction (SRT), par exemple, les modules (de longueurs de retard variable) sont activés aléatoirement à chaque fin de la visite à l’aide du sélecteur de Module (mode « RandomExcludeDefault » set) reliée à la ligne « Fin » de l’unité de la « Visite » (Figure 8 a ). L’unité « Splitter » servira à diriger un signal d’entrée vers un côté spécifié du coin. Ceci est indispensable pour des modules plus compliqués comme celles utilisées dans la tâche SRT ou de retard d’escompte (DD), nécessitant une opération d’un côté spécifique. Par exemple, dans la tâche DD, qu’un seul côté (côté sucré) s’ouvre avec un retard (Figure 9 a).
      6. Définir l’état initial des portes dans des cages dans l’onglet « Options » spécifier toutes les portes à fermer dans la session non potable comme l’état initial typique pour les tâches PP ou de PPR.
      7. Définir les horaires dans l’onglet « Options ». Les Modules sont changés à certains moments, et l’action définie dans la fenêtre « Motifs de jour » est effectuée.
        Remarque : La partie « Motifs de jour » peut être utilisée pour définir la fenêtre de temps expérimental. En règle générale, la période nocturne, une phase active des souris, sert à évaluer le comportement dans les tâches cognitives. Il convient de noter que la durée de la tâche peut affecter le montant de l’apport d’eau. Si la durée est longue dans des tâches relativement faciles, les performances à la fin de la fenêtre de temps peuvent diminuer en raison de la satisfaction. Ainsi, la durée de validité est nécessaire pour être définie avec précaution.
  2. Expérience en cours d’exécution en utilisant le « contrôleur »
    1. Chargez le fichier expérimental en appuyant sur le « expérience »... bouton dans la section « Configuration » dans le « contrôleur ».
    2. Exécutez l’expérience en appuyant sur le bouton « Start » de la « Controller » (partie droite centre).
    3. Surveiller et de visualiser l’état actuel du système et des souris.
      Remarque : Les événements comportements sont expliqués comme suit : visite, entrant dans un coin (détecté par la sonde thermique) ; nosepoke, mettre le nez dans le trou à l’intérieur de l’angle (détectées par faisceau infrarouge et peut être divisée en nosepoke gauche et droit) ; lèche, lèche détecté par lickometer (comptée comme temps de contact et de la fréquence).
    4. Vérifier soigneusement l’état du système, particulièrement attentif à la mise en garde.
      ATTENTION : Erreur en raison d’une balise incorrecte animale (numéro de transpondeur) sera signalée dans le journal même si le nombre réel de balise est correct (i.e., « Unregistered tag *** », « Signal de présence sans inscription d’antenne », etc..). Cela peut être dû à l’utilisation d’un transpondeur qui est sur le point d’expirer. Toutefois, cette erreur n’est pas un problème grave. Dans ce cas, on doit revérifier que l’animal identifié dans le message peut être détectée. Erreurs dues à longues périodes sans visite ni boisson seront affichées comme, par exemple, « *** (animal ID) n’a pas fait les visites au cours des dernières minutes 720 » (Figure 3 b). Vérifiez attentivement plusieurs possibilités qui peuvent conduire à de telles erreurs. Le cas le plus grave est que l’animal est déjà mort. La deuxième plus sérieuse possibilité est qu’il y a un problème avec le système de détection pour l’animal (le transpondeur ne fonctionne pas, ou est tombée). La troisième possibilité est que l’animal n’est pas active. Si l’animal ne fait pas de visites pendant une période de 24h ensemble, l’expérimentateur doit envisager de retirer la cage en raison de son état de santé de l’animal. Un grave problème qui n’est pas une indication d’erreur est l’échec de la porte de fermer (presque toujours en raison de problèmes avec les aimants sur la porte). Cela se traduit par la création d’un coin de consommation inappropriée. Pour vérifier ce problème, les conditions de toutes les portes doivent être vérifiées lors d’une session non-boire au moins une fois par jour. Les données acquises lors de ce problème est présent ne peut pas être utilisées pour l’analyse des tâches PP, PPR, SRT ou DD.
    5. Tous les événements comportements avec la balise de sortie pour le temps et l’information animale en appuyant sur le bouton « Stop » sur le « contrôleur » (Figure 3 b).
  3. Gestion de données à l’aide de le « analyseur »
    1. À l’aide de le « analyseur », analyser et visualiser les données.
    2. Exporter les données de temps expulsé sous forme de fichiers Excel (Figure 3). Les résultats graphiques affichées dans l’onglet « Charts » peuvent faciliter la compréhension des données. Dans l’onglet « Données », les données sont disposées en plusieurs colonnes et peuvent être triées et filtrés à l’aide de paramètres.

3. animale préparation

  1. Utiliser des animaux de plus de 15 g (âgé de 2 mois ou PLU).
    Remarque : Si les animaux sont plus petits que 15 g, plusieurs souris peuvent visiter un coin simultanément, conduisant à l’échec dans la collecte de données. Animaux âgés doit être soigneusement surveillés pour s’assurer qu’ils sont capables de sauter dans les coins et monter le chargeur. Certains plus âgés souris ou souris porteuses de mutations génétiques présentant des handicaps moteurs peuvent mourir parce qu’ils ne peuvent pas accéder à l’eau ou la nourriture.
  2. Réduire le risque potentiel d’agression.
    Remarque : Lorsqu’on utilise des souris femelles, il est préférable de commencer toutes les souris ensemble dans une cage de logement à un jeune âge (c'est-à-dire, à l’âge de 1 mois) avant de commencer l’expérience. Un profil de la ligne de la souris, en particulier en ce qui concerne l’agressivité, doit être obtenu lors de l’utilisation de souris mâles dans la cage.
  3. Implanter les transpondeurs d’identification par radiofréquence (aiguille stérilisée, inclus) par voie sous-cutanée dans les souris dans la région dorso-cervical sous l’anesthésie par inhalation isoflurane (Figure 4).
    1. Placez votre souris dans la chambre pour l’induction de l’anesthésie.
    2. Ajuster le débitmètre oxygène de 0,8 à 1,5 L/min et isoflurane vaporisateur de 2,0 à 2,5 %.
    3. Relâcher la souris de la chambre de l’induction au bout de la fréquence respiratoire devient lent (baisse de 5 % environ).
    4. Maintenir l’anesthésie avec un masque facial.
    5. Appliquer pommade ophtalmique pour les yeux pour éviter le dessèchement des yeux.
    6. Pincez et soulever la peau autour de la partie postérieure de l’omoplates pour créer une poche.
    7. Éteindre le site d’injection avec 70 % d’éthanol pour réduire au minimum l’introduction de cheveux dans l’espace sous-cutané. Ensuite, insérez l’aiguille d’injection à travers la peau en parallèle à la colonne vertébrale.
    8. Éjectez la micro-puce sous-cutanée.
    9. Pincez la puce à travers la peau pour garder l’espace inter scapulaire.
    10. Retirer l’aiguille lentement. Continuer à pincer la zone pendant quelques secondes d’hémostase.
    11. Utiliser le soulagement de la douleur après l’administration si l’aiguille est mal insérée.
    12. Relâchez le bouton de la souris de l’anesthésie.
    13. Placez la souris dans une cage de récupération et surveiller jusqu'à ce qu’ils réveillent et se déplacent. Évitez de laisser la souris sans surveillance.
    14. Retourner la souris à la cage une fois qu’il est devenu totalement ambulatoire.
    15. Vérifiez sur le transpondeur implanté avec un lecteur de transpondeur pour au moins 1 semaine.
      ATTENTION : La position des transpondeurs implantés est absolument essentielle pour l’identification (voir Figure 2). Ne pas insérer le transpondeur verticalement dans le cou ; Cela peut provoquer, les animaux reçoit des blessures graves de la moelle épinière de l’animal. Transpondeurs parfois tombent après quelques heures ou quelques jours. Contrôle si le transpondeur fonctionne en utilisant un lecteur de transpondeur. En option, implant transpondeur à nouveau si elle tombe ; Toutefois, le re-implant répétée peut provoquer des changements de comportement artificiels. Vérifiez la date d’expiration. Transpondeurs expirés émettront fréquemment des signaux incorrects celle qui en résulte dans le manque de données.
  4. Introduire les animaux dans la cage et vérifier les transpondeurs implantés chez les souris en utilisant le lecteur de transpondeur. Retirer les souris si les transpondeurs ne sont pas détectées.

4. déroulement des expériences

NOTE : Les souris sont nourris ad libitum avec chow de souris standard et maintenus avec literie synthétique qui est changé toutes les semaines 1 ou 2 selon la planification de la tâche. Éviter de changer de literie au cours de la tâche d’apprentissage spatial particulier initiales 1 à 2 jours. Voyants sont allumés entre 08:00 et 20:00. Les modules expérimentaux sont exécutées séquentiellement selon les questions scientifiques. La planification expérimentale est illustrée à la Figure 5.

  1. Activité générale
    Remarque : Les souris sont séquentiellement adaptés à l’environnement dans la cage à l’aide de trois conditions expérimentales : l’Adaptation libre, où les animaux peuvent toujours accéder les bouteilles d’eau dans les coins généreusement (une journée à 1 semaine d’accoutumance est généralement considéré comme adéquat) ; NPA, où les souris peuvent accéder les bouteilles d’eau pendant 5 s après chaque nosepoke dans les trous en face des portes dans les coins (3 jours à 1 semaine accoutumance est généralement considérée comme suffisante) ; et l’Adaptation de Session boire, où les souris peuvent accéder les bouteilles d’eau à un moment précis de la journée.
    1. Préparer les fichiers de l’expérience pour les tâches de la FA, IR et DSA.
    2. Exécutez la tâche de FA dans le « contrôleur ».
    3. Mesurer le nombre de visites, de nosepokes ou de lécher épisodes quotidiens ou rythme circadien activité périodiquement comme indice de l’activité générale.
    4. Exécutez la tâche de l’IR dans le « contrôleur ».
    5. Exécutez la tâche DSA dans le « contrôleur ».
      Remarque : De nombreux paradigmes d’apprentissage nécessitent une adaptation pour la session de boire. Pour définir le calendrier de l’ASD, utilisez deux modules expérimentaux différents : la session par défaut (pour privation d’eau) et boire session. Les souris ne peut pas accéder les bouteilles d’eau, parce que rien ne se passe après un nosepoke dans le module par défaut. La session boire est identique au module IR. Le calendrier défini dans l’onglet « Options » dans le « Designer » puisse ensuite passer à la session non potable définie par un autre module.
  2. Apprentissage spatial et les tâches de mémoire
    Remarque : La tâche PP est utilisée pour évaluer l’apprentissage spatial (généralement de 5 à 7 jours). Dans la tâche PP, les souris ont un accès limité à l’eau dans trois des quatre coins (un angle correct et trois angles incorrects). Ainsi, les animaux devront visiter un certain angle pour boire de l’eau au cours des sessions de boire. La tâche PPR est utilisée pour évaluer la souplesse ou compulsivité et la possibilité de changer de comportement couramment (normalement 5-7 jours). Dans la tâche de la PPR, les souris ne peuvent accéder l’eau dans les coins opposés utilisé comme l’angle correct dans la tâche PP.
    1. Préparer les fichiers de l’expérience pour les tâches PP et PPR. Définir les angles corrects pour les souris en définissant les « Clusters » (généralement 1-4 coins de chaque) dans l’onglet « Animal » de la « Designer » (voir Figure 6 a, en bas). Pour éviter une circulation intense dans un coin, répartir uniformément aux quatre coins pour toutes les souris.
    2. Exécutez la tâche PP dans le contrôleur.
    3. Évaluer les performances d’apprentissage spatial sur le décours temporel, le nombre et le pourcentage de nosepokes correcte.
      Remarque : La version actuelle de la tâche PP se concentre davantage sur spatiale d’apprentissage plutôt que, mémoire spatiale, car la tâche ne nécessite pas un écart de temps entre les différents essais. Pour se concentrer davantage sur la mémoire spatiale, envisagez d’utiliser la tâche d’évitement (PA) de lieu ou une nouvelle version indéfinie de la tâche spatiale qui utilise les écarts entre les essais spécifiques.
    4. Exécutez la tâche PPR dans le « contrôleur ».
    5. Évaluer la flexibilité ou compulsivité basé sur le cours du temps, le nombre et le pourcentage de le nosepokes correct.
      Remarque : Interprétation des données PPR nécessite plusieurs arrêts prudents. Les performances initiales de la tâche PPR sont fortement tributaire de la performance dans la tâche PP. C’est parce que la tâche PPR s’appuie sur l’ingérence ou la nécessité de modifier le comportement. La performance de la PPR peut donc s’avérer particulièrement pauvre si l’exécution de la tâche PP est proche de 100 % de réponses correctes. Flexibilité peut être considérée comme l’une des fonctions exécutives11,12,13.
    6. Évaluer la mémoire spatiale peur à PA.
      Remarque : La tâche de PA se compose de 4 séances continues : accoutumance (jour 1) ; climatisation (air-puff est introduit après nospoke des côtés d’un angle prédéfini [nosepoke incorrect], jour 2) ; pause de 24h à l’extérieur de la cage de test (les souris sont placés dans leurs maison normales-cages, jour 3) ; Placer la souris dans la test cage sans air-pouf (4 à 10 jours).
      1. Préparer les fichiers de l’expérience pour PA
      2. Exécutez l’accoutumance (jour 1).
      3. Exécutez le conditionnement (jour 2).
      4. Tenir les souris normales cages maison et garder pendant 24 h (jour 3).
      5. Reprendre les souris à l’armature de test et exécutez le protocole d’essai (4 à 10 jours).
      6. Évaluer l’aversion apprentissage spatial basé sur le rapport de nosepokes incorrect sur le conditionnement (jour 2), aversif mémoire spatiale basée sur celle du jour de retour à la cage de test (jour 3), et apprentissage de l’extinction sur cette base les jours 4 – 10.
  3. Évaluation de la fonction exécutive (impulsivité, l’Attention et compulsivité)
    1. Tâches SRT
      Remarque : Cette procédure a été précédemment décrit en plus détail10,14. Dans cet ensemble de tâches, les quatre coins sont exploités de la même façon, 24h par jour. Le SRT est composé de deux sessions de formation (SRT-formation 1 et 2) et deux séances d’essai (SRT-Test 1 et 2). Dans la première session de formation (SRT-formation 1), les animaux sont entraînés d’apprendre que le voyant jaune est un signal de départ pour un nosepoke. Les DEL clignotent toujours immédiatement après la nosepoke initiale (délai est défini sur 0 s).
      À la deuxième session de formation (SRT-formation 2), le délai est défini varie aléatoirement entre 0.5, 1.0, 2.0 et 4.0 s. Durant cette période, les réponses prématurées ont aucune conséquence (préformation). Tout nosepoke au cours de la période d’attente est considéré comme une réponse prématurée, alors que le premier nosepoke lorsque la porte est ouverte (5 s) est considéré comme une bonne réponse. Dans la première séance d’essais (SRT-Test 1, utilisé pour évaluer l’impulsivité), la première nosepoke définit le bon côté et initie une période d’attente (0,5 à 4,0 s, selon la phase de travail), après laquelle LEDs jaunes sont allumées pour une période de temps donnée (durée de stimulation = 2.0 s, selon la phase de travail). La porte est alors ouverte. La première nosepoke après la période d’attente s’ouvre la porte (5 s) et est compté comme un nosepoke correct alors que tout nosepoke au cours de la période d’attente est considéré comme prématuré nosepoke. Il y a plusieurs modifications dans la deuxième séance d’essais (SRT-Test 2, utilisé pour évaluer l’attention). Après avoir démarré un stimulus (0,2 à 1,0 s, légèrement plus court que le premier test), les souris sont fournis avec une période de temps pendant laquelle les nosepokes sont autorisés (la limited détiennent, typiquement 2 s). Les portes ouvertes (5 s) qu’après une bonne nosepoke, qui est le premier nosepoke au cours de la cale limitée. Nosepokes après la cale limitée sont considérée comme omise nosepoke et ne conduisent pas à des changements dans les résultats. Les erreurs sont divisés en trois types : prématurée nosepoke nosepoke omis et omission (première nosepoke seulement). Le test d’attention requiert capacité d’avis flash LED (définie par la durée de la durée de la stimulation), ainsi que modérément rapide réponse (définie par la durée d’attente limitée). Le déroulement du procès est illustré à la Figure 7.
      1. Préparer les fichiers de l’expérience pour les tâches de la SRT.
      2. Exécutez le SRT-formation 1 pendant 3 jours.
      3. Exécutez le SRT-entraînement 2 pendant 7 jours.
      4. Exécutez le SRT-Test 1 (impulsivité) pendant 7 jours. Calculer l’impulsivité, selon la formule suivante :
        Equation 1
        où P est le nombre d’essais de nosepoke prématuré (ou le nombre de nosepoke incorrect), et T est le nombre d’essais totales (nombre de premier nosepoke).
      5. Exécutez le SRT-Test 2 (Attention) pendant 7 jours. Calculer la précision (ce qui est considéré comme un indicateur de performance pour attirer l’attention) à l’aide de la formule suivante :
        Equation 2
        où C représente le nombre d’essais nosepoke correct (nombre de nosepokes deuxième correct), T est le nombre d’essais totales (le nombre de premiers nosepokes), O est le nombre d’essais d’omission (nombre de procès manquant une deuxième nosepoke) et P est le nombre de prématurés essais de nosepoke (ou le nombre de seconde nosepoke incorrecte avant de la cale limitée).
    2. Tâche DD
      NOTE : Ceci est une tâche simple choix, où les animaux choisissent à attendre pour boire de l’eau sucrée (SW, saccharine de 0,5 % ou 10 % de saccharose) avec un retard ou à boire de l’eau sans un délai normal. La porte du côté choisi s’ouvre alors que la porte du côté opposé restent fermés. Le SW et l’eau normale sont allouées dans les côtés droite ou gauche de tous les coins identique. La planification de tâche DD inclut des sessions de formation et de test. Dans la séance d’entraînement, les souris peuvent accéder SW et l’eau sans un temps d’attente. Ainsi, les souris vont développer leur préférence sur le côté sud-ouest. Dans les séances d’essais, le temps d’attente augmente tous les jours (i.e., 0, 1, 2,..., 8 s). Les retards augmentent séquentiellement chaque jour en faisant plusieurs modules présentant la longueur des délais différents (0, 1, 2,..., 8 s) et en définissant le « Lien » dans les zones « Module » et « Options » (modèles de jour). Dans cette tâche, quatre coins fonctionnent de la même façon, 24h par jour.
      1. Préparer le fichier expérimental pour tâche DD.
      2. Définir le côté du SW (côtés droite ou gauche à tous les coins).
      3. Remplacer les bouteilles d’eau sur les côtés définies avec les bouteilles contenant SW.
      4. Lance la session de formation pour former les animaux boire SW sur les côtés définies sans retard pour 5 à 7 jours.
      5. Calculer l’indice de préférence, qui est défini comme le rapport de léchage ou nosepoking sur le côté de la SW et le nombre total de lèche ou nosepokes. L’indice de préférence pour le côté que contenant SW est donc calculé comme :
        Equation 3
        ou
        Equation 4
        L’ancien index met davantage l’accent sur les résultats de l’action, tandis que le second met l’accent plus sur le comportement de choix.
        Remarque : Veillez à ce que la plupart des souris choisissent préférentiellement les côtés avec le SW (> 90 % pour l’indice de base nombre de léchage, > 80 % pour le premier nosepoke-indice) à la fin de la formation.
      6. Par la suite, lance la session de test de tâche DD pendant 9 jours (délai de 0 à 8 s).
      7. Évaluer l’évolution temporelle de la variation de la mettant l’accent sur le côté avec SW pour évaluer la compulsivité.
  4. Analyse des données
    1. Ouvrir les archives à l’aide de le « analyseur » et exporter toutes les données de fichiers Excel. Si la quantité de données est assez grande, il est préférable de filtrer les données (i.e., extraire la session boire pour les missions spatiales et extraire la première et la deuxième nosepokes pour des tâches SRT).

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Representative Results

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Dans notre étude précédente, les fonction de l’âge des déficits cognitifs dans les modèles AD ont été détectés par les expériences utilisant le système surveillance domicile-cage automatisé10. Leur performance des modèles AD en PP était intacte dans les jeunes adultes et les sujets âgés ; Cependant, la performance de PPR a été sensiblement et progressivement réduite (Figure 6). Il est également important d’observer le comportement général ou l’anxiété dans la phase d’adaptation, parce que ces traits peuvent influer sur la cognition15. Les modèles AD ne montrent pas toute anomalie de brut dans la visite, nosepoke et les numéros de lécher les sessions FA, NP et DSA. Ainsi, les modèles AD peut-être plus faible flexibilité.

Afin d’évaluer les fonctions exécutives, la performance comportementale en SRT et DD a été enregistrée. Les modèles plus anciens d’AD (NL-G-F) manquaient de précision dans la dernière étape de la TRR (SRT-Test 2) (Figure 8). Compulsivité facilitée a été observée chez les adultes jeunes et anciens sujets des souris NL-G-F (Figure 9 b, haut). Fait intéressant, bien qu’il y avait une augmentation de la compulsivité des souris NL-F qui étaient de jeunes adultes, personnes âgées, il est devenu comparable à celui des souris de type sauvage (Figure 9 b, en bas). Il s’agit d’un exemple du phénotype transitoire de la mutation NL-F.

Figure 1
Figure 1 : composants du système automatisé de surveillance Accueil-cage. (A) vue d’ensemble du système. (B) l’emplacement des connecteurs. (C) coin chambre avec porte opérante. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : exemple du boîtier du groupe pour l’étude de. En général, 12 souris par cage sont utilisés. Dans le cas à l’aide de quatre groupes (trois modèles génétiques et un type sauvage), trois souris par groupe et par IntelliCage sont jugées adéquates. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : logiciel pour système. (A), le « Designer » est utilisé pour créer des fichiers expérimentales. A gauche : La partie de la liste des animaux inclut les informations des définitions animales ou en groupe. À droite : L’espace de Module est utilisé pour définir des opérations expérimentales. (B), le « contrôleur » peut servir à exécuter, le moniteur et expériences Records. A gauche : Le statut d’un de la cage en collaboration avec affichage visite des animaux, nosepoke et lécher dans les quatre coins. A droite : Windows alarme seront affiche si des problèmes se produisent. (C) l’analyseur peut servir à gérer et exporter les données acquises par le contrôleur. A gauche : Toutes les données sont balisées avec des informations de l’animal, l’environnement à l’intérieur de la cage et l’heure. Filtrage aidera davantage l’analyse dans Excel ou tout autre logiciel analytique. À droite : La ligne de temps de visites (aussi nosepoke ou lèche) peuvent montrer individuellement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : implantation de transpondeur. (A) la puce du transpondeur (DataMars). Côté (B) vue de l’implantation de transpondeur (transpondering). Éviter toute blessure de cause sur la moelle épinière. (C) vue de dessus du transpondeur. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : chronologie des expériences pour l’évaluation cognitive avec le système automatisé de surveillance domicile-cage. Une batterie de tests d’évaluation cognitive a été réalisée deux fois (1er set, 9 à 12 mois ; et 2ème définit, âgés de 14 à 17 mois) suivie d’expériences pour évaluer l’activité générale en fin de compte (3ème série [âgés de 18 mois]). Cette batterie a été désignée pour évaluer les multiples domaines cognitifs (indiquées par des couleurs – rouge : l’activité générale ; Bleu : apprentissage spatial et mémoire ; Vert : fonction exécutive), qui a des avantages dans la validation et la caractérisation des déficits cognitifs attendus. FA : Adaptation libre ; IR : Nosepoke Adaptation ; DSA : Boire Session Adaptation ; PP : Placez de préférence ; PPR : Inversion de préférence de Place ; SRT : Série des temps de réaction (pour l’impulsivité et l’attention) ; PA : Évitement de Place ; DD : Retard d’escompte. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : protocole expérimental et les résultats représentatifs des tâches PP et PPR. Haut (A), une conception du module d’exemple pour les PP ou PPR. Bas, bon coin paramètre passe à côté opposé au PPR. (B) les déficits en inversion spatiale d’apprentissage dans un modèle publicitaire (NL-G-F) a suscité plus âgés. Données sont exprimées en moyenne ± écart-type de la moyenne (SEM). ∗p < 0,05 ; ∗∗p < 0,01. Couleurs indiquent les groupes de comparaison : bleu : NL vs WT ; Rouge : NL-F vs WT ; Vert : NL-G-F vs WT. Ce chiffre a été modifié par référence10. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : flux du procès des tâches SRT. A gauche : le flux du procès de la TRR (imp). Le premier nosepoke définit le bon côté et initie une période d’attente (0,5 à 4,0 s), après laquelle LEDs jaunes sont allumées. La porte est alors ouverte. A droite : le flux du procès de la TRR (att). Le premier nosepoke définit le bon côté et initie une période d’attente (2.0 s), après laquelle LEDs jaunes sont allumées en moins de temps (0,2 à 1,0 s). Les souris sont fournis avec une période de temps pendant laquelle les nosepokes sont autorisés (tenez la limited, 2 s). Les portes ouvertes (5 s) qu’après une bonne nosepoke, qui est le premier nosepoke au cours de la cale limitée. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : protocole expérimental et les résultats représentatifs des tâches SRT. (A) une conception du module d’exemple pour la SRT. (B) Attention décliner un modèle publicitaire spécifique aux plus âgés. Données sont exprimées en moyenne ± SEM. ∗p < 0,05 ; ∗∗p < 0,01. Couleurs indiquent les groupes de comparaison : bleu : NL vs WT ; Rouge : NL-F vs WT ; Vert : NL-G-F vs WT. De la référence10, ce chiffre a été modifié. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 9
Figure 9 : protocole expérimental et les résultats représentatifs du travail DD. (A) un exemple du module pour la tâche DD. (B) a facilité la compulsivité dans le modèle AD (NL-G-F) à la fois jeunes et vieux âges. Il s’agit d’un exemple de phénotype. En revanche, compulsivité a été augmentée transitoirement dans un autre modèle AD (NL-F). Données sont exprimées en moyenne ± SEM. ∗p < 0,05 ; ∗∗p < 0,01. Couleurs indiquent les groupes de comparaison : bleu : NL vs WT ; Rouge : NL-F vs WT ; Vert : NL-G-F vs WT. Ce chiffre a été modifié par le précédent travail10. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

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Cet article décrit la méthode utilisant le système automatisé de surveillance domicile-cage pour les essais à long terme de troubles cognitifs et comportements dans les modèles AD génétiquement modifiés. L’étape la plus critique est l’implantation du transpondeur dans la position appropriée. Avant de procéder à l’implantation, s’assurer que la date de péremption du transpondeur n’a pas passé. Le deuxième point important est de vérifier le fonctionnement du système tous les jours, autant qu’un problème mineur peut devenir par la suite une plus grave durant l’étude (i.e., a empilé porte, tombé à transpondeur, mauvais branchements électriques, etc. .). En troisième lieu, il est essentiel pour pouvoir tirer d’ennui parce que de nombreux problèmes peuvent se produire tout au long de la planification expérimentale.

Cet article présente un ensemble de tâches d’évaluation cognitive de base. Ces tâches ont été produites en se référant aux tests comportements classiques, mais ils ne peuvent pas imiter parfaitement les tests classiques. Par exemple, les tâches SRT ne définissez pas de choix mode. Tâche de cinq choix série de choix (5CSRTT), un modèle de tâches SRT, est normalement effectuée dans une chambre de 9, 5 ou 3 trous pour la nosepoke mesurer la précision16,17. Notre équipe a déjà essayé d’implémenter une version de choix de la TRR, mais les souris n’a pas pu apprendre la règle dans un temps relativement long (2 semaines ou plus). L’utilisateur de ce système doit être conscient de la différence et examiner soigneusement les données.

Une autre question est sur les limites de la mesure répétée. Comme mentionné dans une précédente étude18, la première est que les expériences répétées ne peuvent pas il suffit de comparer l’effet de l’âge. Nous avons observé que les données du deuxième test PA n’a pas pu répliquer les troubles de la mémoire dans AD modèles10. La performance du génotype de tous était bien pire que celle de la première épreuve de la PA. Cette différence peut provenir de la différence d’âge ou accoutumance au stimulus aversif (expérience de la tâche précédente de PA). Les expérimentateurs devraient l’esprit de l’effet de répétition et tenir compte de l’ordre des tâches. Pour surmonter l’accoutumance du stimulus aversif lors du deuxième test PA, il serait peut-être préférable d’utiliser la plus forte relance air-pouf ou ajouter favorise une certaine stimulation environnementale roman tels que différents types de literie ou sonore19.

Divers chercheurs ont mis au point de nouvelles méthodes et protocoles pour la surveillance automatisée de maison-cage études20,21,22,23,24,25, 26et logiciel à l’aide de la bibliothèque open-source,27. Par conséquent, la possibilité du système a été élargie. Enfin, le système fournit criblage comportemental automatisé à haut débit pour des essais à long terme qui servent à étudier un large éventail de fonctions cognitives, qui est bénéfique dans la détermination du phénotype et validation de modèles de la maladie.

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Disclosures

Aucun conflit d’intérêts ne déclarés.

Acknowledgments

Nous remercions Reiko Ando pour son aide dans la photographie de matériaux. Cette recherche a été financée par la subvention pour la recherche exploratoire (JSPS KAKENHI Grant Number 16K 15196).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IntelliCage TSE Systems - Parchased in 2011 or later
PC Dell Inspiron 580s -
Display Dell SI75T-WL -
ALPHA-dri Shepherd Specialty Papers - Standard bedding
Aron Alpha (Krasy Glue) 2 g Toagosei (Krasy Glue) #04612 Cyanoacrylates for gluing magnet and blak arm
Handheld Transponder Reader BTS-ID R-560 Transponder reader, which reads both Trovan and DataMars
Transponder DataMars T-VA, T-VAS, or another series Basic package of transponders and implanters
Diamond Grip Plus Ansel Microflex DGP-INT-M Experimental glove
Isoflurane Pfizer 1119701G1092 -
Vaporizer for small animals DS Pharma Biomedical SF-B01 Facemask included
Neo-Medrol Pfizer 006472-001 Eye ointment
Ethanol (70%) - - -
Excel Microsoft 00202-51382-15524-AA928 For data analysis

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References

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Automatisé, à long terme analyse comportementale pour les fonctions cognitives dans de multiples modèles génétiques de la maladie d’Alzheimer, à l’aide de IntelliCage
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Masuda, A., Kobayashi, Y., Itohara, S. Automated, Long-term Behavioral Assay for Cognitive Functions in Multiple Genetic Models of Alzheimer's Disease, Using IntelliCage. J. Vis. Exp. (138), e58009, doi:10.3791/58009 (2018).More

Masuda, A., Kobayashi, Y., Itohara, S. Automated, Long-term Behavioral Assay for Cognitive Functions in Multiple Genetic Models of Alzheimer's Disease, Using IntelliCage. J. Vis. Exp. (138), e58009, doi:10.3791/58009 (2018).

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