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Behavior

Automatizzato, a lungo termine l'analisi comportamentale per funzioni Cognitive in più modelli di genetici del morbo di Alzheimer, utilizzando IntelliCage

doi: 10.3791/58009 Published: August 4, 2018

Summary

Questo articolo descrive un protocollo di valutazione cognitiva per i modelli genetici dell'Alzheimer utilizzando il sistema di IntelliCage, che è un sistema di monitoraggio del comportamento di elevato throughput automatizzato con condizionamento operante.

Abstract

I fattori multipli — quali invecchiamento e geni — sono associati frequentemente con il declino conoscitivo. Modelli murini geneticamente modificati del declino conoscitivo, come il morbo di Alzheimer (annuncio), sono diventati uno strumento promettente per delucidare i meccanismi di fondo e di promuovere i progressi terapeutici. Un passo importante è la validazione e la caratterizzazione di anomalia del comportamento previsto nei modelli, nel caso di annuncio, il declino conoscitivo. Le indagini a lungo termine del comportamento degli animali da laboratorio per studiare l'effetto di invecchiamento gli sforzi notevoli di domanda da parte di ricercatori. Il sistema di IntelliCage è una batteria di test ad alta velocità e costi contenuti per i topi che elimina la necessità di manipolazione umana quotidiana. Qui, descriviamo come il sistema è utilizzato nella fenotipizzazione a lungo termine di un modello di genetica del morbo di Alzheimer, occupandosi in particolare le funzioni cognitive. L'esperimento impiega ripetuta batteria di test che valutano l'apprendimento spaziale e delle funzioni esecutive. Questo conveniente fenotipizzazione di età-dipendente permette di identificare gli effetti transitori e/o permanenti dei geni su vari aspetti cognitivi.

Introduction

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Lo sviluppo di modelli animali per la malattia di un neurone nell'ultimo decennio ha fornito una comprensione meccanicistica della loro base e al fine di promuovere i progressi terapeutici1,2,3. Applicazione di una batteria di test comportamentali di alto-rendimento in modelli animali genetici è uno strumento di ricerca euristica di indagare i meccanismi delle malattie umane e l'identificazione di terapie farmacologiche. Le batterie di test di ricerca adattati per l'osservazione a lungo termine dell'invecchiamento e/o modelli di demenza hanno tradizionalmente costretto laboratori di consumare grandi quantità di manodopera specializzata e di tempo. Un sistema di monitoraggio casa-gabbia sarebbe una strategia economicamente conveniente come sarebbe ridurre il costo di osservazione del comportamento di esseri umani. Alcuni gruppi di ricerca hanno sviluppato strumenti automatizzati basati sulla visione che assistono fenotipizzazione del comportamento di un singolo individuo in una piccola gabbia a casa4,5,6. Tuttavia, tali metodi limitano l'interazione sociale, la dimensione di ambienti di test e la varietà delle misure comportamentali che includono funzioni cognitive. Il IntelliCage è un sistema di monitoraggio casa-gabbia seconda generazione progettato per eseguire vari compiti cognitivi in una gabbia a casa sociale. D'importanza, questo metodo può eliminare ogni giorno movimentazione che consente ci permette di effettuare il monitoraggio del comportamento a lungo termine con la valutazione delle funzioni cognitive, e può eliminare i requisiti per manipolazione pratica specializzata e abilitare altamente riproducibile acquisizione di dati7. Qui, descriviamo il lungo termine phenotyping e convalida in modelli genetici murini del morbo di Alzheimer (AD) che è stato recentemente generato8,9,10 utilizzando il monitoraggio automatizzato di casa-gabbia sistema. Una batteria di test, che comprendeva le valutazioni di apprendimento spaziale e delle funzioni esecutive, è stata ripetutamente eseguita in più punti di età (9 – 12 e 14 – 17 mesi). Questa età-dipendente che phenotyping ci ha permesso di identificare gli effetti transitori e/o permanenti dei geni su vari aspetti cognitivi. Abbiamo trovato che alcuni modelli di annuncio ha mostrato sia temporanei che permanenti fenotipi dei diversi aspetti cognitivi testati nell'analisi a lungo termine utilizzando il sistema monitoraggio di casa-gabbia automatizzati10. Così, lo studio automatizzato utilizzando il sistema di monitoraggio casa-gabbia è utile e conveniente per fenotipi comportamentali a lungo termine e la convalida in vari modelli di disfunzione conoscitiva.

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Protocol

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Tutte le procedure sono state approvate dall'animale istituzionale con cautela e Comitato, e sono stati effettuati secondo le linee guida dell'Istituto RIKEN Brain Science per la sperimentazione animale.

1. impostazione dell'apparecchio

Nota: Una panoramica del sistema di monitoraggio casa-gabbia automatizzato è illustrata nella Figura 1. Ogni sistema (39 x 58 cm x 21 cm) contiene un microprocessore e quattro camere d'angolo, ognuno dei quali ha due bottiglie d'acqua e un'antenna di anello per la rilevazione di identificazione a radiofrequenza dei transponder impiantato negli animali (Figura 1A). I numeri di identificazione del microprocessore sono definiti dal selettore rotativo (indirizzi hardware) (Figura 1B). I numeri di identificazione del microprocessore non devono sovrapporsi. Due porte in ogni angolo sono controllate da computer, che vengono utilizzati per il condizionamento operante (Figura 1). Ogni gabbia è in genere, in grado di valutare fino a 12 topi (vedere la Figura 2 come esempio di stabulazione in gruppo). L'utilizzo di un numero maggiore di topi è accettabile. Tuttavia, si dovrebbe garantire che i topi non combattono eccessivamente e che non sono sovraffollate quando eseguono attività fortemente competitiva.

  1. Collegare le gabbie a un computer in serie tramite cavi CAN.
  2. Collegare i cavi della batteria per le spine nel microprocessore (Power-on). Tutti i LED devono essere accesi quindi per pochi secondi e dovrebbero spostare tutte le porte. Se i LED non si spegne o se le porte non si muovono, scollegare e ricollegare il cavo di alimentazione (connessioni elettriche difettose possono condurre a cattivo funzionamento).
  3. Assicurarsi che le porte scorrevoli apra e chiuda correttamente. Se le porte non si muovono correttamente, controllare i piccoli magneti collegati al braccio nero. Se questo problema si verifica spesso, prendere in considerazione l'incollaggio il magnete al braccio.
  4. Continuare a controllare le condizioni delle porte in tutto gli esperimenti (almeno una volta al giorno).
  5. Accendere il PC.

2. software

Nota: Tutti i tre componenti del software ("Designer", "Controllore" e "Analizzatore") per il sistema automatizzato di monitoraggio casa-gabbia sono stati progettati come interfacce grafiche utente (Figura 3). Gli utenti possono facilmente controllare o aggiungere diverse funzioni durante l'esperimento.

  1. Fare sperimentare i file utilizzando il "Designer"
    Nota: Il "progettista" viene utilizzato per generare e modificare file sperimentali (programmi sul sistema) per l'esecuzione di vari protocolli sperimentali e per testare lo stato del sistema (Figura 3A). Un unico file sperimentale incorpora la lista degli animali, impostazione hardware e più protocolli sperimentali. Gli utenti possono anche ottenere pubblicato Gazzetta protocolli contattando gli autori.
    1. Creare l'elenco degli animali
      1. Definire le condizioni. Costruire il grande disegno sperimentale, che include i seguenti parametri: 1) il numero di topi di soggetto, 2) il numero di linee genetiche (o gruppi di trattamento), 3) sesso (maschi, femmine o entrambi) e 4) il numero della gabbia deve essere utilizzato.
      2. Selezionare il tipo di opportuni transponder (DataMars o Trovan) nella barra degli strumenti centrale.
      3. Impostare "Gruppi". Nel pannello "Gruppi", aggiungere o rimuovere i gruppi sperimentali (cioè., genotipi o trattamenti) premendo il tasto "croce rossa (x)" nella finestra "Gruppi", o "verde più (+)" rispettivamente.
      4. Impostare "Cluster". Utilizzare la funzione di "Cluster" per operare sottogruppi ugualmente definendo i lati e gli angoli corretti, errati e neutrali.
        Nota: La visita, nosepoke e leccare gli eventi, i principali dati per qualsiasi attività comportamentali, sono tutte associati con la definizione. Questa impostazione è necessaria per le attività di apprendimento spaziale. I cluster definiti per ciascun animale rimangono gli stessi in tutto l'esperimento. Ad esempio, in un cluster per l'inversione di posto preferenza (PP) attività o luogo preferenza (PPR), un angolo è definito come corretta (acqua-accessibile) e tre angoli sono definiti come non corretto (acqua-inaccessibile). Inoltre, i cluster possono essere collegati ad un altro utilizzando la funzione "Link".
      5. Assegnare le variabili tra cui "Nome", "Tag" (transponder ID), "Sesso", "Gruppo" e "Cluster".
      6. Salvare e incollare le liste animale selezionando "Importa animali" e "Esportare animali"...... nella barra dei menu "File" per replicare le liste di animale per un altro esperimento.
    2. Impostare l'hardware nella scheda "Setup" impostare su tutti i sistemi utilizzando i corrispondenti numeri di ID (indirizzo hardware) nella scheda "Setup" corrisponda il numero di indirizzi nella sezione "progettazione" per il numero effettivo di indirizzi.
    3. Costruire i protocolli sperimentali nella scheda "IntelliCage"
      1. Costruire i protocolli sperimentali nella scheda "IntelliCage" utilizzando il seguente testa e linguette inferiori (schede "Module" e "Opzione").
      2. Progettare le strutture sperimentali nello "Spazio modulo" facendo clic sulla scheda "Modulo" (Figura 3A). Per aggiungere nuovi moduli, premere "Aggiungi" (green plus pulsante nella scheda "Modulo").
        Nota: Ci sono quattro diversi tipi di componenti, vale a dire "Compiti", "Utils", "Reporter" ed "Eventi". In genere, un esperimento comincia con un evento di trigger, vale a dire "Visita", "Nosepoke" o "Potabile". Per selezionare l'evento di trigger, trascinare l'unità corrispondente dalla sezione eventi per definire il segno iniziale. Successivamente, per impostare l'output per determinati attuatori (come apertura porta), trascinare le unità dalla sezione "Compiti" (ad es., "Porta", "LED" e "Aria").
      3. Trascinare le unità, illustrate nella parte di "Unità", nello "Spazio modulo".
        Nota: Ancora una volta, gli utenti possono ottenere protocolli pubblicati (come file sperimentali) da parte degli autori e riutilizzare i file importando nuova lista degli animali. Gli utenti non devono fare tutti i moduli.
      4. Per fare un modulo di adattamento (NPA) nosepoke (Figura 6A), trascinare l'unità "Porta" dalla sezione "Attività", "Cancello" e "Timer" unità dalla sezione "Utils" e le unità "Visita" e "Nosepke" dalla sezione "Eventi" nello spazio"modulo".
      5. Link "Qualsiasi" sulla linea "ON" dell'unità Nosepoke per "A" nell'unità di Gate. Link "Out" a "Chiude" nell'unità "Gate". Link "Out" in "Porta" verso "Attiva" nell'unità "Timer". Link "Out" nel cancello a Open nell'unità "Porta". Collegare "Out" nell'unità "Timer" per "Chiudere" l'unità "Porta". Impostare "Periodo" come 5.000 (ms) nella sezione Timer.
        Nota: L'unità di "Gate" è utilizzato per controllare l'input e l'output della sequenza. Nello stato "Aperto" (stato predefinito), verrà operata la sequenza collegata al "Uscita". Al contrario, nello stato "Close", verrà interrotta la sequenza collegata all'uscita. La probabilità che il tasso di apertura può essere specificato (Figura 6A, Figura 8Ae 9A figura). Il "selettore di modulo" viene utilizzato per modificare i moduli in modo casuale o in una certa sequenza durante lo stesso periodo sperimentale. Nell'attività seriale tempo di reazione (SRT), ad esempio, i moduli (di lunghezze di ritardo variabile) sono commutati in modo casuale ad ogni estremità della visita utilizzando il selettore di modulo (impostare la modalità "RandomExcludeDefault") legato alla linea "Fine" dell'unità "Visita" (Figura 8A ). L'unità di "Splitter" verrà essere utilizzato per indirizzare un segnale in ingresso a un lato dell'angolo specificato. Ciò è necessario per i moduli più complicati come quelli utilizzati nell'attività di SRT o ritardo attualizzazione (DD), che richiedono il funzionamento di un lato specifico. Ad esempio, nell'attività di DD, un solo lato (zuccherato) si aprirà con un ritardo (Figura 9A).
      6. Definire lo stato iniziale delle porte in gabbie nella scheda "Opzioni" specificare tutte le porte per essere chiuso nella sessione non potabili come lo stato iniziale tipico per le attività PP o PPR.
      7. Impostare gli orari nella scheda "Opzioni". I moduli vengono modificati determinati intervalli di tempo, e viene eseguita l'azione definita nella finestra di "Modelli di giorno".
        Nota: La parte "Giorno Patterns" consente di impostare l'intervallo di tempo sperimentale. In genere, il tempo di notte, fase attiva dei topi, viene utilizzato per valutare il comportamento in compiti cognitivi. Dovrebbe essere notato che la durata dell'attività possono influenzare la quantità di assunzione di acqua. Se la durata è lungo in compiti relativamente semplici, potrebbero diminuire le prestazioni alla fine della finestra di tempo a causa di soddisfazione. Così, l'intervallo di tempo è necessario che sia impostata con attenzione.
  2. Esperimento in esecuzione utilizzando il "Controller"
    1. Caricare il file sperimentale premendo il "esperimento"... pulsante nella sezione "Impostazione" nel "Controller".
    2. Eseguire l'esperimento premendo il pulsante "Start" del "Controller" (parte di centro destra).
    3. Monitorare e visualizzare lo stato corrente del sistema e i topi.
      Nota: Gli eventi comportamentali sono spiegati come segue: visita, entrando in un angolo (rilevato dalla sonda termica); nosepoke, mettendo il naso per il foro all'interno dell'angolo (rilevato dal fascio infrarosso e può essere diviso in nosepoke destro e sinistro); lecca, lecca rilevato dal lickometer (considerato come tempo di contatto e frequenza).
    4. Controllare attentamente lo stato del sistema, prestando particolare attenzione alle cautele.
      Attenzione: Errori a causa di un tag errato degli animali (numero di transponder) verranno segnalati nel registro anche se il numero effettivo è corretto (i. e., "Unregistered tag * * *", "Segnale di presenza senza registrazione dell'antenna", ecc.). Questo può essere dovuto l'uso di un transponder che sta per scadere. Tuttavia, questo errore non è un problema serio. In questo caso, uno deve ricontrollare che l'animale identificato nel messaggio possa essere rilevato. Verranno visualizzati errori a causa di lunghi periodi senza una visita o un drink come, ad esempio, "* * * (animal ID) non ha fatto le visite negli ultimi 720 minuti" (Figura 3B). Controllare attentamente le diverse possibilità che possono portare a tali errori. Il caso più grave è che l'animale è già morto. La possibilità di secondo più grave è che c'è un problema con il sistema di rilevamento per l'animale (il transponder non funziona, o è caduto). La terza possibilità è che l'animale non è attivo. Se l'animale non fa alcun visite per un periodo di 24h intero, lo sperimentatore dovrebbe considerare rimuovendo l'animale dalla gabbia grazie alla sua condizione di salute. Un problema serio che non dispone di un'indicazione di errore è il fallimento della porta per chiudere (quasi sempre a causa dei problemi con i magneti sulla porta). Questo comporta la creazione di un angolo di bere inadeguato. Per verificare questo problema, le condizioni di tutte le porte devono essere controllate durante una sessione di non bere almeno una volta al giorno. I dati acquisiti quando questo problema è presente non possono essere utilizzati per l'analisi dei compiti PP, PPR, SRT o DD.
    5. Uscita tutti gli eventi comportamentali con l'etichetta per il tempo e l'animale informazioni premendo il tasto "Stop" sul "Controller" (Figura 3B).
  3. Gestione dei dati utilizzando il "analizzatore"
    1. Utilizzando "Analyzer", analizzare e visualizzare i dati.
    2. Esportare i dati di tempo-cestinate come file di Excel (Figura 3). Il grafico dei risultati mostrato nella scheda "Grafici" può facilitare la comprensione dei dati. Nella scheda "Dati", i dati sono disposti in più colonne e possono essere ordinati e filtrati utilizzando tutti i parametri.

3. animale preparazione

  1. Utilizzare animali oltre 15 g (di 2 mesi o più vecchi).
    Nota: Se gli animali sono inferiori a 15 g, più mouse possono visitare un angolo contemporaneamente, causando l'errore nella raccolta dei dati. Animali invecchiati devono essere attentamente monitorati per assicurare che siano in grado di saltare negli angoli e salire l'alimentatore. Alcuni vecchi topi o topi con mutazioni genetiche che esibiscono motorie possono morire perché non possono accedere l'acqua o il cibo.
  2. Ridurre il potenziale rischio di aggressione.
    Nota: Anche quando si utilizzano topi femmina, è meglio cominciare custodia tutti i topi insieme in una gabbia in giovane età (cioè, all'età di 1 mese) prima di iniziare l'esperimento. Un profilo della riga del mouse, soprattutto per quanto riguarda l'aggressività, dovrebbe essere ottenuto quando si utilizza il topo maschio nella gabbia.
  3. Impiantare i transponder di identificazione di radiofrequenza (ago sterilizzato, incluso) per via sottocutanea nei topi nella regione dorso-cervicale sotto anestesia inalazione isoflurane (Figura 4).
    1. Posizionare il mouse in aula per l'induzione dell'anestesia.
    2. Regolare il flussometro ossigeno a 0,8 a 1,5 L/min e isoflurano vaporizzatore a 2.0 al 2,5%.
    3. Rilasciare il mouse dalla camera di induzione dopo il ritmo respiratorio diventare lento (calo del 5% circa).
    4. Mantenere l'anestesia con una maschera.
    5. Applicare unguento oftalmico per occhi per prevenire la secchezza degli occhi.
    6. Stringere e sollevare la pelle intorno alla parte posteriore delle scapole per creare una tasca.
    7. Bagnate il sito di iniezione con etanolo al 70% per ridurre al minimo l'introduzione di capelli nello spazio sottocutaneo. Quindi, inserire l'ago d'iniezione attraverso la pelle parallela alla colonna vertebrale.
    8. Espellere il microchip per via sottocutanea.
    9. Pizzicare il microchip attraverso la pelle per mantenerla spazio inter-scapola.
    10. Ritirare l'ago lentamente. Continuare a pizzicare la zona per pochi secondi fornire l'emostasi.
    11. Se l'ago è inserito in modo non corretto, utilizzare sollievo dal dolore dopo la somministrazione.
    12. Rilasciare il mouse dall'anestesia.
    13. Posizionare il mouse in una gabbia di recupero e monitorarlo finché non si svegliano e muoversi. Evitare di lasciare incustodito il mouse.
    14. Tornare alla gabbia a casa il mouse una volta che è diventato completamente ambulatoria.
    15. Verifica il transponder impiantato con un lettore di transponder per almeno 1 settimana.
      Attenzione: La posizione dei transponder impiantato è assolutamente fondamentale per l'identificazione (Vedi Figura 2). Non inserire il transponder verticalmente nel collo; Ciò può causare, gli animali ricevono gravi lesioni del midollo spinale dell'animale. Transponder, a volte cadono dopo alcune ore o giorni. Controllare se il transponder funziona utilizzando un lettore di transponder. In optional, impianto nuovo transponder se cade fuori; Tuttavia, la ripetuta re-impianto può causare cambiamenti comportamentali artificiali. Controllare la data di scadenza. Scaduti i risponditori trasmetterà frequentemente non corretti segnali quello risultante in mancanza di dati.
  4. Introdurre gli animali in gabbia e controllare i transponder impiantati nei topi utilizzando i lettori transponder. Rimuovere i topi se il transponder non vengono rilevati.

4. esecuzione di esperimenti

Nota: Topi sono alimentati ad libitum con chow mouse standard e mantenuti con biancheria sintetica che viene modificato ogni 1 o 2 settimane a seconda del calendario di attività. Evitare di cambiare la biancheria da letto durante il compito d'apprendimento spaziale soprattutto iniziale 1 – 2 giorni. Luci sono accese tra 08:00 e 20:00. I moduli sperimentali vengono eseguiti in sequenza secondo le consuete domande scientifiche. Il programma sperimentale è illustrato nella Figura 5.

  1. Attività generali
    Nota: I topi sono in sequenza adattati all'ambiente nella gabbia utilizzando tre condizioni sperimentali: il libero adattamento, dove gli animali possono accedere sempre le bottiglie di acqua negli angoli, liberalmente (un giorno per 1 settimana di assuefazione è in genere considerato adeguata); NPA, dove i topi possono accedere le bottiglie di acqua per 5 s dopo ogni nosepoke nei fori davanti alle porte negli angoli (3 giorni a 1 settimana assuefazione è tipicamente considerata adeguata); e l'adattamento di sessione di bere, dove i topi possono accedere le bottiglie di acqua in un momento specifico del giorno.
    1. Preparare i file di esperimento per le attività FA, NPA e DSA.
    2. Eseguire l'attività FA nel "Controller".
    3. Misurare il numero di visite, a leccare episodi giornalieri o circadiano attività periodicamente come indice di attività generale e/o di nosepokes.
    4. Eseguire l'attività NPA nel "Controller".
    5. Eseguire l'operazione DSA in "Controller".
      Nota: Molti paradigmi di apprendimento richiedono adattamento per la sessione di bere. Per impostare la pianificazione temporale per il DSA, utilizzare due diversi moduli sperimentali: la sessione predefinita (per privazione di acqua) e la sessione di bere. I topi non possono accedere le bottiglie d'acqua perché non succede nulla dopo un nosepoke nel modulo predefinito. La sessione di bere è identica al modulo NPA. Il calendario definito nella scheda "Opzioni" nella finestra di "progettazione" può quindi spostare alla sessione non potabili definita da un altro modulo.
  2. Attività di memoria e apprendimento spaziale
    Nota: L'attività PP è utilizzata per valutare l'apprendimento spaziale (in genere 5-7 giorni). Nell'attività di PP, i topi hanno limitato accesso all'acqua in tre su quattro angoli (un angolo corretto e non corretti tre angoli). Così, gli animali avrebbe dovuto visitare un certo angolo per bere l'acqua durante le bevute. L'attività PPR è utilizzata per valutare la flessibilità o compulsività e la capacità di cambiare comportamento fluentemente (normalmente 5-7 giorni). Nell'attività di PPR, i topi possono accedere solo acqua negli angoli opposti usato come l'angolo corretto nell'attività PP.
    1. Preparare i file di esperimento per le attività di PP e PPR. Definire gli angoli corretti per i topi impostando i "cluster" (in genere 1-4 angoli ogni) nella scheda "Animal" di "Progettazione" (Vedi Figura 6A, in basso). Per evitare il traffico pesante in un angolo, allocare i quattro angoli uniformemente a tutti i topi.
    2. Eseguire l'attività PP nel controllore.
    3. Valutare le prestazioni di apprendimento spaziale il corso di tempo, i numeri e la percentuale di nosepokes corretto.
      Nota: La versione corrente dell'attività PP si concentra più su spaziale di apprendimento piuttosto che, memoria spaziale, come l'attività non richiede un intervallo di tempo tra le diverse prove. Per mettere a fuoco più sulla memoria spaziale, è consigliabile utilizzare l'attività di prevenzione (PA) posto o un'indefinito nuova versione dell'attività spaziale che utilizza intervalli di tempo specifici tra le prove.
    4. Eseguire l'attività PPR nel "Controller".
    5. Valutare flessibilità o compulsività basato sul corso di tempo, il numero e la percentuale della nosepokes corretta.
      Nota: Interpretazione dei dati PPR richiede varie sentenze attenta. Le prestazioni iniziali del compito PPR dipende fortemente dalle prestazioni nel compito PP. Infatti, il compito PPR si basa sull'interferenza o la necessità di modificare il comportamento. Di conseguenza, le prestazioni del PPR possono essere particolarmente povera se la prestazione dell'attività PP è vicino al 100% corretto. Flessibilità può essere considerato una delle funzioni esecutive11,12,13.
    6. Valutare la memoria spaziale paura a PA.
      Nota: L'operazione di PA consiste di 4 sessioni di continue: assuefazione (giorno 1); condizionata (aria-soffio è stato introdotto dopo nospoke a tutti i lati di un pre-definito angolo [errata nosepoke], giorno 2); 24 h pausa di fuori della gabbia test (i topi sono collocati nella loro normale casa-gabbie, giorno3); immissione topi nuovamente dentro la gabbia test senza aria-puff (giorni 4 – 10).
      1. Preparare i file di esperimento per PA.
      2. Eseguire l'assuefazione (giorno 1).
      3. Eseguire condizionata (giorno 2).
      4. Prendere i topi in casa normale gabbie e tenere per 24 h (3 ° giorno).
      5. Prendere i topi per la gabbia test ed eseguire il protocollo di test (giorno 4 – 10).
      6. Valuta l'apprendimento spaziale che ha avversione basato sul rapporto di nosepokes non corretto il giorno condizionata (giorno 2), che ha avversione memoria spaziale basato su quello il giorno del ritorno alla gabbia test (giorno 3) ed estinzione apprendimento basato su che nei giorni 4 – 10.
  3. Valutazione della funzione esecutiva (impulsività, attenzione e compulsività)
    1. Attività di SRT
      Nota: Questa procedura è stata precedentemente descritta in più dettaglio10,14. In questo insieme di attività, tutti e quattro gli angoli sono gestiti allo stesso modo, 24 h al giorno. La SRT è costituito da due sessioni di allenamento (SRT-formazione 1 e 2) e due sessioni di test (SRT-Test 1 e 2). Nella prima sessione di allenamento (SRT-formazione 1), gli animali sono addestrati per imparare che la luce LED gialla è un segnale di avvio per un nosepoke. Le luci LED flash sempre immediatamente dopo il nosepoke iniziale (ritardo è impostato a 0 s).
      Nella seconda sessione di allenamento (2 SRT-formazione), il ritardo è impostato a variare in modo casuale tra 0.5, 1.0, 2.0 e 4.0 s. Durante questo periodo, risposte premature non avere alcuna conseguenza (pre-allenamento). Qualsiasi nosepoke durante il periodo di ritardo è considerato una risposta precoce, mentre il primo nosepoke quando la porta è aperta (5 s) è considerata una risposta corretta. Nella prima sessione di test (SRT-Test 1, utilizzato per valutare impulsività), il primo nosepoke definisce il lato corretto e avvia un periodo di ritardo (0,5 – 4,0 s, a seconda della fase di attività), dopo che il LED giallo è acceso per un periodo di tempo specifico (durata dello stimolo = 2.0 s, a seconda della fase di attività). Poi si apre la porta. Il primo nosepoke dopo il periodo di ritardo apre la porta (5 s) e viene conteggiato come un nosepoke corretta, mentre qualsiasi nosepoke durante il periodo di ritardo è considerato prematuro nosepoke. Ci sono diverse modifiche nella seconda sessione di test (SRT-Test 2, utilizzati per valutare l'attenzione). Dopo l'avvio di uno stimolo (0.2 – 1.0 s, leggermente più corta rispetto al primo test), i topi sono forniti con un periodo di tempo durante il quale sono ammessi nosepokes (tenere premuto il limitato, in genere 2 s). Le porte si aprono (5 s) solo dopo un corretto nosepoke, che è il primo nosepoke durante l'attesa limitata. Nosepokes dopo la stiva limitata sono considerati come omesso nosepoke e non portano ad eventuali modifiche nel risultato. Gli errori sono divisi in tre tipi: nosepoke prematuro, omesso nosepoke e omissione (prima nosepoke solo). Il test di attenzione richiede capacità di notare flash LED (definito dalla durata della durata dello stimolo) come pure moderatamente rapida risposta (definito dalla durata limitata hold). Il corso di tempo della prova è illustrato nella Figura 7.
      1. Preparare i file di esperimento per attività di SRT.
      2. Eseguire il 1 SRT-formazione per 3 giorni.
      3. Eseguire il 2 SRT-formazione per 7 giorni.
      4. Eseguire il Test di SRT 1 (impulsività) per 7 giorni. Calcolare l'impulsività basato sulla seguente formula:
        Equation 1
        dove P è il numero di prove nosepoke prematuro (o il numero di nosepoke non corretto) e T è il numero di prove totali (il numero di prima nosepoke).
      5. Eseguire la SRT-Test 2 (attenzione) per 7 giorni. Calcolare la precisione (che è considerata un indicatore di prestazioni per attenzione) utilizzando la seguente formula:
        Equation 2
        dove C è il numero di prove corrette nosepoke (numero di corretta secondo nosepokes), T è il numero di prove totali (il numero del primo nosepokes), O è il numero di prove di omissione (numero di trial manca un nosepoke di secondo) e P è il numero di prematura prove di nosepoke (o il numero di secondo nosepoke non corretto prima di stiva limitata).
    2. Compito DD
      Nota: Questo è un compito semplice scelta, dove gli animali scegliere di bere l'acqua normale senza un ritardo oppure aspettare a bere acqua zuccherata (SW, saccarina 0,5% o 10% di saccarosio) con un ritardo. Mentre la porta sul lato opposto rimanere chiusa, si apre la porta sul lato scelto. Il SW e l'acqua normale vengono allocati in modo identico nei lati destro o sinistro di tutti gli angoli. La pianificazione di attività di DD include le sessioni di training e di test. Nella sessione di allenamento, i topi possono accedere sia SW e acqua senza un tempo di attesa. Così, i topi si svilupperanno la loro preferenza al lato SW. Nelle sessioni di test, il tempo di attesa aumenta ogni giorno (cioè., 0, 1, 2,..., 8 s). I ritardi in sequenza aumentano ogni giorno rendendo più moduli che esibiscono la lunghezza di ritardo diversi (0, 1, 2,..., 8 s) e l'impostazione "Link" nell'area "Module" e "Opzioni" (modelli di giorno). In questo compito, tutti e quattro gli angoli funzionano allo stesso modo, 24 h al giorno.
      1. Preparare il file sperimentale per attività DD.
      2. Definire il lato del SW (lati destro o sinistro a tutti gli angoli).
      3. Sostituire le bottiglie d'acqua ai lati definiti con le bottiglie contenenti SW.
      4. Eseguire la sessione di formazione per addestrare gli animali a bere SW ai lati definiti con nessun ritardo per 5 – 7 giorni.
      5. Calcolare l'indice di preferenza, che è definita come il rapporto di leccare o nosepoking a fianco del SW per il numero totale di lecca o nosepokes. L'indice di preferenza per il lato che SW contenente così è calcolato come:
        Equation 3
        o
        Equation 4
        L'indice ex si concentra più sui risultati di azione, mentre il secondo si concentra più sul comportamento di scelta.
        Nota: Assicurarsi che la maggior parte dei mouse scegliere preferenzialmente i lati con il SW (> 90% per l'indice basato sul numero di leccare, > 80% per il primo indice basato su nosepoke) alla fine della formazione.
      6. Successivamente, eseguire la sessione di test di attività DD per 9 giorni (ritardo da 0 a 8 s).
      7. Valutare il corso di tempo del cambiamento nella preferenza verso il lato con SW per valutare la compulsività.
  4. Analisi dei dati
    1. Aprire gli archivi utilizzando il "analizzatore" ed esportare tutti i dati in file di Excel. Se la quantità di dati quantità è abbastanza grande, è meglio filtrare i dati (i. e., estrarre la sessione di bere per le attività spaziali ed estrarre il primo e il secondo nosepokes per attività di SRT).

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Representative Results

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Nel nostro studio precedente, i deficit conoscitivi età-dipendente in modelli di AD sono stati rilevati dagli esperimenti utilizzando il sistema monitoraggio di casa-gabbia automatizzati10. Le prestazioni dei modelli di annuncio in PP erano intatta negli adulti giovani e nei soggetti più anziani; Tuttavia, le prestazioni in PPR è stato notevolmente e progressivamente alterato (Figura 6). È inoltre importante osservare il comportamento generale o ansia nella fase di adattamento, perché tali caratteristiche possono influenzare la cognizione15. I modelli di annuncio non hanno mostrato alcune anomalie lorda nella visita, nosepoke e leccare numeri nelle sessioni FA, NP e DSA. Quindi, i modelli di annuncio possono avere flessibilità inferiore.

Per valutare le funzioni esecutive, è stata registrata la prestazione comportamentistica in SRT e DD. Vecchi modelli di annuncio (NL-G-F) mancavano di precisione nell'ultima tappa della SRT (SRT-Test 2) (Figura 8). Compulsività agevolato è stata osservata in giovani adulti e soggetti anziani dei topi NL-G-F (figura 9B, parte superiore). È interessante notare che, anche se c'era un aumento nella compulsività dei topi NL-F che erano giovani adulti, in età avanzata, è diventato paragonabile a quella dei topi wild type (figura 9B, in basso). Questo è un esempio del fenotipo transitorio della mutazione NL-F.

Figure 1
Figura 1: componenti del sistema di monitoraggio casa-gabbia automatizzato. Panoramica di (A) del sistema. (B) posizione dei connettori. (C) angolo dell'alloggiamento con porta operante. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: esempio dell'alloggiamento del gruppo per lo studio. In genere, vengono utilizzati 12 topi per gabbia. Nel caso di utilizzo di quattro gruppi (tre modelli genetici e un selvaggio-tipo), tre topi per gruppo per IntelliCage sono considerati adeguati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Software per il sistema. (A), il "progettista" viene utilizzato per creare file di sperimentali. A sinistra: La parte animale elenco include le informazioni delle definizioni degli animali e di gruppo. A destra: Lo spazio del modulo viene utilizzato per definire operazioni sperimentali. (B), il "Controller" può essere utilizzato per eseguire, monitor e registrare esperimenti. A sinistra: La condizione di una della gabbia lavorando con visualizzazione visita degli animali, nosepoke e leccare ai quattro angoli. A destra: Allarme finestre appariranno se capita qualche problema. (C) The Analyzer può essere utilizzato per gestire ed esportare i dati acquisiti dal Controller. A sinistra: Tutti i dati sono contrassegnati con informazioni dell'animale, l'ambiente all'interno della gabbia e il tempo. Filtro aiuterà ulteriormente analisi in Excel o altri software di analisi. A destra: La linea del tempo di visite (anche nosepoke o lecca) possono essere visualizzate singolarmente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: impianto Transponder. (A) Microchip del transponder (DataMars). Lato (B) Mostra dell'impianto transponder (transpondering). Evitare di provocare lesioni sul midollo spinale. (C) vista dall'alto del transponder. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: linea del tempo degli esperimenti per la valutazione cognitiva con il sistema automatizzato di monitoraggio casa-gabbia. Una batteria di test per la valutazione conoscitiva è stata effettuata due volte (1 ° set, 9 – 12 mesi vecchi; e 2 ° set, 14 – 17 mesi) seguita da esperimenti per valutare attività generale alla fine (3rd set [18 mesi di età]). Questa batteria è stata designata per la valutazione più domini cognitivi (indicate da colori — rosso: attività generale; Blu: apprendimento spaziale e memoria; Verde: funzione esecutiva), che presenta vantaggi in validazione e la caratterizzazione dei deficit conoscitivi attesi. FA: Libero adattamento; NPA: Nosepoke adattamento; DSA: Bere sessione adattamento; PP: Preferenza di posto; PPR: Place Preference inversione; SRT: Tempo di reazione seriale (per impulsività e attenzione); PA: Posto elusione; DD: Ritardo attualizzazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: disegno sperimentale e risultati rappresentativi dei compiti PP e PPR. (A) piano, un progetto di modulo di esempio per PP o PPR. Fondo, corretta impostazione angolo è cambiato al lato opposto in PPR. (B) deficit in inversione spaziale di apprendimento in un modello di annuncio (NL-G-F) ha suscitato in età avanzata. I dati sono espressi come media ± errore standard della media (SEM). ∗p < 0,05; ∗p < 0.01. Colori indicano i gruppi di confronto: blu: NL vs WT; Rosso: NL-F vs WT; Verde: NL-G-F vs WT. Questa figura è stata modificata da riferimento10. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: flusso di prova delle attività SRT. A sinistra: il flusso di prova della SRT (imp). Il primo nosepoke definisce il lato corretto e avvia un periodo di ritardo (0,5 – 4,0 s), dopo che siano accesi i LED gialli. Poi si apre la porta. A destra: il flusso di prova della SRT (att). Il primo nosepoke definisce il lato corretto e avvia un periodo di ritardo (2.0 s), dopo che giallo LED sono accesi in tempo più breve (0.2 – 1.0 s). I topi sono forniti con un periodo di tempo durante il quale sono ammessi nosepokes (tenere premuto il limited, 2 s). Le porte si aprono (5 s) solo dopo un corretto nosepoke, che è il primo nosepoke durante l'attesa limitata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8: disegno sperimentale e risultati rappresentativi delle attività SRT. (A) un progetto di modulo di esempio per SRT. (B) attenzione declino in un modello di annunci specifico all'età avanzata. I dati sono espressi come media ± SEM. ∗p < 0,05; ∗p < 0.01. Colori indicano i gruppi di confronto: blu: NL vs WT; Rosso: NL-F vs WT; Verde: NL-G-F vs WT. Questa figura è stata modificata dal riferimento10. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 9
Figura 9: disegno sperimentale e risultati rappresentativi dell'attività DD. (A) un esempio di modulo per l'attività DD. (B) ha facilitato la compulsività nel modello di annuncio (NL-G-F) sia giovane e vecchia età. Questo è un esempio del fenotipo. D'altra parte, compulsività era aumentato transitoriamente nel modello AD un altro (NL-F). I dati sono espressi come media ± SEM. ∗p < 0,05; ∗p < 0.01. Colori indicano i gruppi di confronto: blu: NL vs WT; Rosso: NL-F vs WT; Verde: NL-G-F vs WT. Questa figura è stata modificata dal precedente lavoro10. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

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Questo articolo descrive il metodo utilizzando il sistema automatizzato di monitoraggio casa-gabbia per test cognitivi e comportamentali a lungo termine in modelli geneticamente modificati AD. Il punto più critico è l'impianto del transponder nella posizione appropriata. Prima di eseguire l'impianto, assicurarsi che non ha superato la data di scadenza del transponder. Il secondo punto importante è quello di controllare il funzionamento del sistema ogni giorno, soprattutto come un problema minore può diventare successivamente una più grave durante lo studio (i. e., un impilati porta, caduto-out transponder, cattive connessioni elettriche, ecc .). In terzo luogo, è essenziale essere in grado di sparare guai perché molti problemi possono verificarsi in tutto il piano sperimentale.

Questa carta ha introdotto un pacchetto di base delle operazioni per la valutazione cognitiva. Queste attività sono state prodotte facendo riferimento alle prove del comportamento convenzionale, ma non imitano perfettamente i test convenzionali. Ad esempio, attività di SRT non impostare modalità di scelta. Cinque attività di scelta scelta seriale (5CSRTT), un modello di attività di SRT, normalmente si svolge in una camera con 9, 5 o 3 fori per il nosepoke misurare la precisione16,17. Il nostro team in precedenza tentato di implementare una versione di scelta di SRT, ma i topi non è riuscito a imparare la regola all'interno di tempo relativamente lungo (2 settimane o più). L'utente di questo sistema dovrebbe essere consapevoli della differenza e discutere i dati con attenzione.

Un altro problema è sulle limitazioni per la misurazione ripetuta. Come accennato nel precedente studio18, il primo è che gli esperimenti ripetuti semplicemente non possono confrontare l'effetto dell'età. Abbiamo osservato che i dati della seconda prova di PA non è riuscito a replicare il danno di memoria in modelli AD10. Le prestazioni del genotipo tutti era molto peggio di quello della prima prova di PA. Questa differenza può venire dalla differenza di età o assuefazione allo stimolo avversivo (esperienza di attività di PA precedente). Gli sperimentatori devono mente l'effetto ripetizione e considerare l'ordine delle attività. Per superare l'assuefazione di stimolo avversivo nella seconda prova di PA, potrebbe essere meglio utilizzare più forte stimolo di aria-soffio o aggiungere qualche romanzo stimolo ambientale come i diversi tipi di biancheria da letto o suono19.

Vari ricercatori hanno sviluppato nuovi metodi e protocolli per il monitoraggio automatizzato di casa-gabbia studia20,21,22,23,24,25, 26e software di supporto utilizzando la libreria open-source27. Quindi, la possibilità del sistema è stata ampliata. Infine, il sistema fornisce screening comportamentale automatizzato ad alta produttività per le analisi a lungo termine che vengono utilizzati per studiare una vasta gamma di funzioni cognitive, che è vantaggioso in phenotyping e convalida di modelli di malattia.

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Disclosures

Conflitti di interesse non dichiarati.

Acknowledgments

Ringraziamo Reiko Ando per il suo aiuto in materiali che fotografare. Questa ricerca è stata sostenuta dalla sovvenzione per ricerca esplorativa (JSPS KAKENHI Grant numero 16K 15196).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IntelliCage TSE Systems - Parchased in 2011 or later
PC Dell Inspiron 580s -
Display Dell SI75T-WL -
ALPHA-dri Shepherd Specialty Papers - Standard bedding
Aron Alpha (Krasy Glue) 2 g Toagosei (Krasy Glue) #04612 Cyanoacrylates for gluing magnet and blak arm
Handheld Transponder Reader BTS-ID R-560 Transponder reader, which reads both Trovan and DataMars
Transponder DataMars T-VA, T-VAS, or another series Basic package of transponders and implanters
Diamond Grip Plus Ansel Microflex DGP-INT-M Experimental glove
Isoflurane Pfizer 1119701G1092 -
Vaporizer for small animals DS Pharma Biomedical SF-B01 Facemask included
Neo-Medrol Pfizer 006472-001 Eye ointment
Ethanol (70%) - - -
Excel Microsoft 00202-51382-15524-AA928 For data analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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  27. Dzik, J. M., Puścian, A., Mijakowska, Z., Radwanska, K., Łęski, S. PyMICE: APython library for analysis of IntelliCage data. Behavior Research Methods. 50, (2), 804-815 (2018).
Automatizzato, a lungo termine l'analisi comportamentale per funzioni Cognitive in più modelli di genetici del morbo di Alzheimer, utilizzando IntelliCage
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Masuda, A., Kobayashi, Y., Itohara, S. Automated, Long-term Behavioral Assay for Cognitive Functions in Multiple Genetic Models of Alzheimer's Disease, Using IntelliCage. J. Vis. Exp. (138), e58009, doi:10.3791/58009 (2018).More

Masuda, A., Kobayashi, Y., Itohara, S. Automated, Long-term Behavioral Assay for Cognitive Functions in Multiple Genetic Models of Alzheimer's Disease, Using IntelliCage. J. Vis. Exp. (138), e58009, doi:10.3791/58009 (2018).

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