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Behavior

자동화, Alzheimer의 질병, IntelliCage를 사용 하 여 여러 유전자 모델에서 인지 기능에 대 한 장기적인 행동 분석 결과

doi: 10.3791/58009 Published: August 4, 2018

Summary

이 논문 조작 조화 자동 높은 처리량의 행동 모니터링 시스템 IntelliCage 시스템을 사용 하 여 Alzheimer의 질병의 유전자 모델 인지 평가 대 한 프로토콜을 설명 합니다.

Abstract

다중 요소-노화, 유전자 등-자주 관련 인지 감소 된. 유전자 변형된 마우스 모델 인지 감소, Alzheimer의 질병 (광고) 등의 유망한 도구를 기본 메커니즘을 명료 하 고 치료 발전 추진 되고있다. 중요 한 단계 유효성 검사 및 예상된 행동 이상이 광고, 인지 감소의 경우 모델의 특성입니다. 연구원에서 수요가 상당한 노력을 노화의 효과 연구 하는 실험실 동물의 장기 행동 조사. IntelliCage 시스템은 매일 인간 취급에 대 한 필요성을 제거 하는 마우스에 대 한 높은 처리량 및 비용 효율적인 테스트 배터리 이다. 여기, 우리가 설명 어떻게 시스템 장기 형질 유전 알츠하이머병 모델의 활용은 특히 인지 기능에 초점을 맞추고. 실험 공간 학습 및 집행 기능을 평가 하는 테스트의 반복 된 배터리를 사용 합니다. 비용 효율적인 연령에 따라 형질이 다양 한 인지 측면에 유전자의 일시적 또는 영구적인 효과 확인할 수 있습니다.

Introduction

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지난 10 년간 신경 질환 동물 모델의 개발 그들의 기초의 치료 발전1,2,3를 홍보 하기 위해 기계적 이해를 제공 했다. 높은 처리량 행동 테스트 배터리 유전 동물 모델에서의 응용 프로그램 인간의 질병의 근본적인 메커니즘 및 약물 요법의 신분 조사를 추론 연구 도구입니다. 연구 테스트 배터리 노후화의 장기 관찰에 대 한 적응 및 치 매 모델 전문된 인력 및 시간의 큰 금액을 소비 하는 실험실을 강제 전통적으로 있다. 그것은 인 간에 의해 행동 관찰의 비용을 줄일 것 이라고 가정 케이지 모니터링 시스템 비용 효율적인 전략 있을 것 이다. 일부 연구 팀은 작은 홈 케이지4,,56에 한 개인의 행동 형질을 지원 자동화 비전 기반 도구를 개발 했습니다. 그러나, 이러한 방법을 사회적 상호 작용, 테스트 환경의 크기와 인지 기능을 포함 하는 행동 조치의 다양 한 제한 한다. IntelliCage 사회 가정에 다양 한 인지 작업을 수행 하도록 설계 된 2 세대 가정 케이지 모니터링 시스템입니다. 중요 한 것은,이 방법은 매일 인지 기능의 평가와 장기적인 행동 모니터링을 수행 하는 수 처리 제거할 수 있습니다 및 전문된 실무 처리에 대 한 요구 사항을 제거 하 고 높은 재현할 수 있도록 수 있습니다. 데이터 수집7. 여기, 우리는 장기적인 설명 형질 및 유효성 검사는 Alzheimer의 질병 (광고)의 유전 마우스 모델에서 최근8,,910 자동 홈 케이지 모니터링을 사용 하 여 생성 시스템입니다. 포함 공간 학습 및 집행 기능 평가, 테스트 배터리 (9-12 및 14-17 개월) 다 나 포인트에서 반복적으로 수행 되었다. 연령에 따라 형질이를 사용 하 여 다양 한 인지 측면에 유전자의 일시적 또는 영구적인 효과 확인할 수 있었습니다. 우리는 일부 광고 모델 자동된 집-새 장 모니터링 시스템10를 사용 하 여 장기 분석에서 테스트 하는 여러 가지 인지 측면의 임시 및 영구 고기 보여주 발견. 따라서, 홈-케이지 모니터링 시스템을 사용 하 여 자동화 연구는 유익 하 고 장기적인 행동 형질 및 인지 기능 장애의 다양 한 모델에서 유효성 검사에 대 한 비용.

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Protocol

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절차는 기관 동물에 의해 승인 되었다 모든 관심과 위원회, 사용 그리고 그들은 동물 실험을 위해 RIKEN 뇌 과학 연구소의 지침에 따라 실시 했다.

1. 설정 장치

참고: 자동된 집-새 장 모니터링 시스템에 대 한 개요는 그림 1에 표시 됩니다. 각 시스템 (39 cm x 58 cm x 21 cm) 하나의 마이크로프로세서 및 4 개의 코너 챔버, 각각 두 개의 물병과 동물 (그림 1A)에 이식 하는 트랜스폰더의 무선 주파수 식별을 탐지 하기 위한 링 안테나는 포함 되어 있습니다. 마이크로프로세서의 식별 번호는 로타리 선택기 (하드웨어 주소)에 의해 정의 됩니다 (그림 1B). 마이크로프로세서의 식별 번호 중복 하지 해야 합니다. 각 모서리에 2 개의 문은 조작 컨디셔닝 (그림 1C)에 사용 되는 컴퓨터에 의해 제어 됩니다. 일반적으로, 각 케이지 (그룹 주택의 예로 그림 2 를 참조) 최대 12 마우스를 평가할 수 있습니다. 쥐의 많은 수를 사용 하 여 허용 됩니다. 그러나, 하나는 마우스 지나치게 싸움 하지 않습니다 그리고 그들은 강력 하 게 경쟁력 있는 작업을 수행할 때 콩나물 하지는 확인 해야 합니다.

  1. 새 장을 직렬 수 케이블을 통해 컴퓨터에 연결 합니다.
  2. 배터리 케이블 (전원 on) 마이크로프로세서에 플러그에 연결 합니다. 있으 나 모든 Led 몇 초 동안 다음 전환 될 해야 하 고 모든 문을 이동 합니다. Led 전환 하지 않는 경우 또는 문을 이동 하지 않을 경우, 분리 하 고 전원 코드를 뽑고 (나쁜 전기 연결 발생할 수 있습니다 부적 절 한 작동).
  3. 슬라이딩 도어 개폐 올바르게 확인 합니다. 문을 제대로 이동 하지 않을 경우 검은색 팔에 부착 된 작은 자석 확인 합니다. 이 문제가 자주 발생 하는 경우에 팔에 자석 붙이기 하는 것이 좋습니다.
  4. 계속 실험 (적어도 하루에 한 번)에 걸쳐 문의 조건을 확인 합니다.
  5. PC를 켭니다.

2입니다. 소프트웨어

참고: 자동된 집-새 장 모니터링 시스템에 대 한 소프트웨어 ("디자이너", "컨트롤러" 및 "분석기")의 모든 세 가지 구성 요소는 그래픽 사용자 인터페이스 (그림 3)으로 설계 되었습니다. 사용자가 쉽게 제어 하거나 실험 기간 동안 다양 한 기능을 추가할 수 있습니다.

  1. "디자이너"를 사용 하 여 만들기 실험 파일
    참고: "디자이너" 생성 하 고 실험 파일 (시스템 프로그램) 다양 한 실험 프로토콜을 수행 하 고 시스템 (그림 3A)의 상태를 테스트 하기 위해 사용 됩니다. 한 실험 파일 동물 목록, 하드웨어 설정, 그리고 여러 실험적인 프로토콜을 포함합니다. 사용자가 저자에 연락 하 여 출판된 저널 프로토콜을 얻을 수도 있습니다.
    1. 동물 목록 만들기
      1. 조건을 정의 합니다. 다음 매개 변수를 포함 하는 실험적인 그랜드 디자인 구축: 1) 주제 마우스, 2) 유전 선 (또는 치료 그룹), 수 수 3) 섹스 (남성 동물, 여성 동물 또는 둘 다)와 4) 장의 수 사용할.
      2. 중앙 도구 모음에서 적절 한 트랜스폰더 유형 (DataMars 또는 Trovan)를 선택 합니다.
      3. "그룹"를 설정 합니다. "그룹" 패널에서 추가 하거나 제거 하는 실험 그룹 (., genotypes 또는 치료) 각각 "녹색 더하기 (+)" 또는 "그룹" 창에서 "레드 크로스 (x)" 버튼을 누르면.
      4. "클러스터"를 설정 합니다. "클러스터" 함수를 사용 하 여 정확 하 고, 잘못 된 고 중립 코너와 측면을 정의 하 여 하위 그룹을 동등 하 게 작동.
        참고: 방문, nosepoke, 및 핥 이벤트, 행동 모든 작업에 대 한 기본 데이터 정의와 모두 연결 됩니다. 이 설정은 공간 학습 작업에 필요 합니다. 각 동물에 대 한 정의 된 클러스터 실험 내내 동일 남아 있습니다. 예를 들어 장소 특혜 (PP) 작업 또는 기본 설정 반전 (PPR)에 대 한 하나의 클러스터에 한 코너 (물 이용) 올바른 정의 되 고 3 개의 모서리 (물 액세스할 수) 잘못 된 정의 됩니다. 또한, "링크" 기능을 사용 하 여 다른 한 클러스터를 연결할 수 있습니다.
      5. "이름", "태그" (트랜스폰더 ID), "섹스", "그룹" 및 "클러스터"를 포함 하 여 변수를 할당 합니다.
      6. 저장 하 고 복제할 다른 실험 동물 목록 "파일" 메뉴 막대에서... "내보내기" 동물... 동물과 "가져오기"를 선택 하 여 동물 목록을 붙여 넣습니다.
    2. "설정" 탭 해당 주소의 실제 수에 "디자이너" 섹션에서 주소의 수에에서 그들의 해당 ID 번호 (하드웨어 주소)를 사용 하 여 모든 시스템을 "설정" 탭 설정에서에서 하드웨어를 설정 합니다.
    3. "IntelliCage" 탭에서 실험 프로토콜을 구축
      1. 다음 머리와 열 등 한 탭 ("모듈" 및 "옵션" 탭)를 사용 하 여 "IntelliCage" 탭에서 실험 프로토콜을 구축 합니다.
      2. "모듈" 탭 (그림 3A)를 클릭 하 여 "모듈 공간"에서 실험적인 구조를 디자인 합니다. 새 모듈을 추가 하려면 "Add" (그린 플러스 "모듈" 탭에 있는 버튼)을 누릅니다.
        참고: 구성 요소, 즉 "작업", "유틸리티", "기자", 및 "이벤트"의 4 개의 종류 있다. 일반적으로, 실험 트리거 이벤트, 즉 "방문", "Nosepoke", 또는 "마시는"로 시작합니다. 트리거 이벤트를 선택 하려면 시작 기호를 정의 하는 이벤트 섹션에서 해당 장치를 끕니다. 그 후, 특정 액추에이터 (예: 문 시작)에 대 한 출력을 설정 하려면 "작업" 섹션에서 단위를 끕니다 (., "문", "지도", 및 "공기").
      3. 단위, "모듈 공간"으로 "장치" 부분에 표시를 끕니다.
        참고: 다시, 사용자가 얻을 게시 프로토콜 (실험 파일) 저자에서를 가져와 새로운 동물 목록 파일을 다시 사용 됩니다. 사용자가 모든 모듈을 만들 필요가 없습니다.
      4. Nosepoke 적응 (경찰청) 모듈 (그림 6A)을 하려면 "모듈 공간"으로, "유틸리티" 섹션에서 "게이트"와 "타이머" 단위 및 "이벤트" 섹션에서 "방문" 및 "Nosepke" 단위 "작업" 섹션에서 "문" 단위를 끕니다.
      5. 문 단위 Nosepoke 단위에 ""의 "에" 라인에 "어떤" 링크. "게이트" 단위에서 "닫기" "밖 으로" 링크. "타이머" 단위에서 "활성화"로 "문"에서 "밖 으로" 링크. 링크를 "밖 으로" "문" 단위로 오픈 게이트. "문" 단위에서 "닫기"를 "타이머" 단위에서 "밖 으로" 링크. 타이머 섹션에서 5000 (ms)으로 "기간"을 설정 합니다.
        참고: "게이트" 단위는 입력 시퀀스의 출력을 제어 하는 데 사용 됩니다. "열기" 상태 (기본 상태), "출력"에 연결 하는 시퀀스 운영 될 것입니다. 대조적으로, "닫기" 상태에서 출력에 연결 하는 시퀀스를 중지 됩니다. 오프닝 속도의 확률 수 지정 (그림 6A, 그림 8A, 그리고 그림 9A). "모듈 선택"는 동일한 실험 기간 동안 무작위로 또는 특정 순서로 모듈을 변경 하는 데 사용 됩니다. 직렬 반응 시간 (SRT) 작업에 예를 들어 (가변 지연 길이)의 모듈은 무작위로 전환 "방문" 단위 (그림 8A 의 줄 "끝"에 링크 된 모듈 선택기 (세트 "RandomExcludeDefault" 모드)를 사용 하 여 방문의 각 끝에 ). "분할" 단위 코너의 지정된 면에는 입력된 신호를 직접 사용 됩니다. 이 특정 측면의 운영을 요구 하는 SRT 또는 지연 할인 (DD) 작업에 사용 된 그들과 같은 더 복잡 한 모듈 필요 합니다. 예를 들어 DD 작업 (청량된 면) 한쪽만 지연 (그림 9A) 열립니다.
      6. PP 또는 PPR 작업에 대 한 전형적인 초기 상태로 비 마시는 세션에 닫혀 모든 문을 지정 "옵션" 탭에 새 장에 문의 초기 상태를 정의 합니다.
      7. "옵션" 탭에서 시간 일정을 설정 합니다. 모듈은 특정 시간 지점에서 변경 되 고 "하루 패턴" 창에 정의 된 작업 실시.
        참고: 실험 시간 창을 설정 하는 "하루 패턴" 부분을 사용할 수 있습니다. 일반적으로, 밤 시간, 쥐의 활성 단계 인지 작업에 동작을 평가 하기 위해 사용 됩니다. 그것은 그 작업의 기간 영향을 미칠 수 물 섭취의 양을 발견 한다. 기간은 상대적으로 쉬운 작업에서 시간-창 끝에서 성능 만족 때문 줄일 수 있습니다. 따라서, 시간 창은 신중 하 게 설정 해야 합니다.
  2. "컨트롤러"를 사용 하 여 실험을 실행
    1. 실험 파일을 로드 하는 "실험"을 눌러 "컨트롤러"에서 "설정" 섹션에서 단추.
    2. "컨트롤러" (센터 오른쪽 부분)의 "시작" 버튼을 누르면 실험을 실행 합니다.
    3. 모니터링 하 고 시스템 및 쥐의 현재 상태를 시각화.
      참고: 행동 이벤트는 다음과 같이 설명: 방문, 코너 (열 센서에 의해 감지);를 입력 nosepoke, 모서리 (적외선 빔에 의해 감지 하 고 왼쪽 및 오른쪽 nosepoke로 분할 될 수 있다); 내부 구멍에 코를 퍼 팅 핥 아, 기회가 lickometer (접촉 시간 및 주파수로 계산)에 의해 감지.
    4. 신중 하 게 주의에 특히 관심을 지불 하는 시스템의 상태를 확인 합니다.
      주의: 잘못 된 동물 태그 (트랜스폰더 번호) 오류 보고 로그에 실제 태그 번호가 올바른 경우에 (., "태그 등록 * * *", "안테나 등록 없이 존재 신호", .). 이 만료 하는 트랜스폰더를 사용 하 여 원인일 수 있습니다. 그러나,이 오류는 심각한 문제가 아니다. 이 경우에, 하나는 메시지에서 확인 된 동물 검출 될 수 있다 다시 한다. 방문 또는 음료 없이 오랜 기간 오류로 표시 됩니다, 예를 들어, "* * * (동물 ID) 마지막 720 분 동안 어떤 방문을 하지 않았다" (그림 3B). 신중 하 게 이러한 오류가 발생할 수 있는 여러 가능성을 확인 합니다. 가장 심각한 경우 동물은 이미 죽은 것입니다. 두 번째 가장 심각한 가능성 (는 트랜스폰더 작동 하지 않거나 밖으로 떨어진) 동물에 대 한 검출 시스템 문제입니다. 세 번째 가능성은 동물이 아닌 활성. 동물에는 전체 24 시간 기간에 대 한 모든 방문을 하지 않습니다는 실험 동물의 건강 상태로 인해 케이지에서 제거를 고려해 야 합니다. 오류 표시 되어 있지 않은 심각한 문제 (거의 항상 때문에 문에 자석으로 문제)을 문의 실패 이다. 부적 절 한 음주 모서리의 생성 결과. 이 문제를 확인 하려면 모든 문 조건 비 마시는 세션 하루에 적어도 한 번 하는 동안 검사 되어야 한다. 이 문제가 있으면 인수 데이터 PP, PPR, SRT 또는 DD 작업의 분석을 위해 사용할 수 없습니다.
    5. "컨트롤러" (그림 3B)에 "정지" 버튼을 누르면 시간, 동물 정보에 대 한 태그와 함께 모든 행동 이벤트를 출력 합니다.
  3. "분석기"를 사용 하 여 데이터 처리
    1. "분석기"를 사용 하 여 분석 하 고 데이터를 시각화.
    2. Excel 파일 (그림 3C) 시간 범주화 데이터를 내보냅니다. 그래픽 결과 "차트" 탭에 표시 된 데이터의 이해를 용이 하 게 수 있습니다. "데이터" 탭에서 데이터는 필터링 매개 변수를 사용 하 고 정렬할 수 있습니다 여러 열에 정렬 됩니다.

3. 동물 준비

  1. 동물 이상의 15 g (세 2 개월 이상)를 사용 합니다.
    참고: 동물 15 g 보다 작은 경우 여러 쥐 방문할 수 코너 동시에, 데이터 수집에서 실패에 지도. 세 동물 모서리에 약하고 피더 올라갈 수 있도록 신중 하 게 모니터링 해야 합니다. 그들은 물 또는 음식 액세스할 수 없으므로 일부 이전 마우스 또는 마우스 모터 장애를 전시 하는 유전자 돌연변이와 죽을 수도 있습니다.
  2. 침략의 잠재적인 위험을 줄일 수 있습니다.
    참고: 여성 쥐를 사용 하는 경우에 낫다 실험을 시작 하기 전에 (, 1 개월의 나이에)는 젊은 나이에 장에 함께 모든 쥐를 주택 시작. 적극성에 관하여 특히 마우스 선의 프로 파일 남성 쥐 감 금 소에 사용 하는 경우 얻을 수 해야 합니다.
  3. Isoflurane 흡입 마 취 (그림 4) dorso-자 궁 경부 지역에서 마우스에 알코올 식별 트랜스폰더 (소독된, 바늘 포함)을 피하 이식.
    1. 마 취 유도 실에서 마우스를 놓습니다.
    2. 0.8 2.0 2.5 %1.5 L/min와 isoflurane 기화 하 게 산소 유량을 조정 합니다.
    3. 호흡 속도 느린 후 유도 상공에서 마우스를 놓습니다 (약 5% 하락).
    4. 얼굴 마스크와 함께 마 취를 유지 합니다.
    5. 눈 건조 방지 하기 위해 눈에 안과 연 고를 적용 합니다.
    6. 꼬 집 고 주머니를 만드는 견의 후부 부분 주위 피부.
    7. 피하 공간으로 머리의 도입을 최소화 하기 위해 70% 에탄올 주사 사이트 불. 그런 다음 척추에 평행 하 게 피부를 통해 주사 바늘을 삽입 합니다.
    8. 피하는 마이크로칩을 꺼냅니다.
    9. 견 갑 골 간 공간을 유지 하는 피부를 통해 마이크로칩을 꼬집어.
    10. 천천히 바늘을 철회 한다. 꼬집어 hemostasis 제공 하는 몇 초 동안 영역을 계속 합니다.
    11. 사후 관리 통증 완화를 사용 하 여 바늘이 제대로 삽입 하는 경우.
    12. 마 취에서 마우스를 놓습니다.
    13. 복구에 마우스를 놓고 그들은 일어나 고 이동할 때까지 그것을 모니터링 합니다. 마우스를 무인 떠날 하지 마십시오.
    14. 완전히 보 행 되 면 홈 케이지를 마우스를 반환 합니다.
    15. 적어도 1 주 동안 이식된 트랜스폰더는 트랜스폰더 리더를 확인 합니다.
      주의: 이식된 트랜스폰더의 위치 식별을 위해 절대적으로 중요 하다 ( 그림 2참조). 목에는 트랜스폰더를 수직으로 삽입 하지 마십시오 이 발생할 수 있습니다, 그리고 동물 동물의 척수의 심각한 상해를 받을. 트랜스폰더는 때로는 몇 시간 또는 며칠 후 빠지게. 트랜스폰더는 트랜스폰더 리더를 사용 하 여 작동 하는지 확인 하십시오. 선택, 임 플 란 트 트랜스폰더 다시 경우; 그러나, 반복 재 이식 인공 행동 변화를 일으킬 수 있습니다. 만료 날짜를 확인 하십시오. 만료 된 트랜스폰더는 자주 그 결과 데이터의 누락에 잘못 된 신호를 전송 합니다.
  4. 으로 동물을 소개 하 고 트랜스폰더 독자를 사용 하 여 마우스에 이식 하는 트랜스폰더를 확인 합니다. 트랜스폰더는 검색 되지 않습니다 경우 쥐를 제거 합니다.

4. 실행 실험

참고: 마우스는 표준 마우스 차 우 광고 libitum 고 작업 일정에 따라 1 또는 2 주마다 변경 합성 침구와 유지. 특히 초기 1-2 일 공간 학습 작업 중 침구를 변경 하지 마십시오. 빛 08시 ~ 20시 사이 있습니다. 실험 모듈 과학적인 질문에 따라 순차적으로 수행 됩니다. 실험 일정은 그림 5에 나와 있습니다.

  1. 일반 활동
    참고: 마우스는 순차적으로 3 개의 실험 조건을 사용 하 여 새에서 환경에 적응: 동물 액세스할 수 있는 항상 모서리에 물병 자유롭게 자유로운 적응 (habituation의 1 주 1 일 일반적으로 여겨진다 적절 한); 경찰청, 쥐 5 물병을 액세스할 수 있는 모든 nosepoke 모서리 1 주 요법이 니 일반적으로 적절 한 것으로 간주 (3 일간); 문 앞 구멍으로 후 s 그리고 마시는 세션 적응, 쥐 하루 중 특정 시간에는 물병을 액세스할 수 있습니다.
    1. FA, 경찰청, 및 DSA 작업에 대 한 실험 파일을 준비 합니다.
    2. "컨트롤러" FA 작업을 실행 합니다.
    3. 방문, nosepokes 사슬 에피소드 매일 또는 circadian 활동 정기적으로 일반적인 활동의 인덱스의 수를 측정 합니다.
    4. "컨트롤러" 경찰청 작업을 실행 합니다.
    5. "컨트롤러"에 DSA 작업을 실행 합니다.
      참고: 많은 학습 패러다임 마시는 세션에 대 한 적응이 필요합니다. DSA에 대 한 시간 일정을 설정 하려면 두 개의 서로 다른 실험 모듈: (물 부족)에 대 한 기본 세션, 그리고 마시는 세션. 아무것도 기본 모듈에 nosepoke 후 발생 하기 때문에 생쥐는 물병을 액세스할 수 없습니다. 마시는 세션은 경찰청 모듈을 동일 합니다. "디자이너"에서 "옵션" 탭에 정의 된 시간 일정 다음 다른 모듈에 의해 정의 된 비 마시는 세션에 이동할 수 있다.
  2. 공간 학습 및 메모리 작업
    참고: PP 작업 공간 학습 (일반적으로 5-7 일)을 평가 하기 위해 사용 됩니다. PP 작업에 쥐 3 네 모서리 (하나의 올바른 코너와 3 개의 잘못 된 모서리)에 물에 대 한 액세스를 제한 했다. 따라서, 동물 물 마시는 세션 동안 마시는 특정 코너를 방문 해야 합니다. PPR 작업 유연성 또는 compulsivity (일반적으로 5-7 일) 유창 하 게 동작을 변경 하는 능력을 평가 하는 데 사용 됩니다. PPR 작업에서 생쥐는 PP 작업에 올바른 코너로 사용 반대 모서리에 물만 액세스할 수 있습니다.
    1. PP 및 PPR 작업에 대 한 실험 파일을 준비 합니다. "디자이너"의 "동물" 탭에서 "클러스터" (일반적으로 1-4 코너 각)을 설정 하 여 쥐에 대 한 올바른 모서리를 정의 ( 그림 6A참조, 밑에). 한쪽 코너에 교통 체증을 방지 하려면 할당 네 모퉁이 모든 쥐를 균일 하 게 합니다.
    2. 컨트롤러에서 PP 작업을 실행 합니다.
    3. 시간 과정, 숫자, 및 정확한 nosepokes의 비율에서 공간 학습 성능을 평가 합니다.
      참고: PP 작업의 현재 버전을 맞추고 더 보다 공간 적인 메모리, 학습 공간 작업 다른 시도 사이의 시간 간격을 필요로 하지 않습니다. 공간 메모리를 더 많은 초점을 장소 회피 (PA) 작업 또는 재판 사이 특정 시간 간격을 이용 하는 공간 작업의 정의 되지 않은 새로운 버전을 사용 하는 것이 좋습니다.
    4. "컨트롤러" PPR 작업을 실행 합니다.
    5. 유연성 또는 compulsivity 시간 코스, 수, 및 올바른 nosepokes의 비율에 따라 평가 합니다.
      참고: PPR 데이터의 해석 몇 주의 판단을 요구 한다. PPR 작업의 초기 성능을 강력 하 게 PP 작업에서 성능에 따라 달라 집니다. PPR 작업 간섭이 나 동작을 변경 하는 필요성에 의존 하는 때문입니다. 따라서, PP 작업의 성능을 100% 정확한 경우는 PPR의 성능 특히 가난한 수 있습니다. 유연성 집행 기능11,,1213중 하나 간주 될 수 있습니다.
    6. 실바에서 공간 공포 메모리 평가
      참고: PA 작업 4 연속 세션으로 구성 됩니다: 습관 들 임 (1 일); 컨디셔닝 (미리 정의 된 코너 [잘못 된 nosepoke]의 모든 측면에서 nospoke 후에 어 퍼프 도입 주 2); 24 시간 휴식 외부 테스트 케이지 (생쥐는 그들의 정상적인 가정-감 금 소, day3에 다시 배치 됩니다); 에 어 퍼프 (일 4-10) 없이 테스트 케이지에 다시 마우스를 배치.
      1. 아빠에 대 한 실험 파일 준비
      2. 습관 들 임 (주 1)을 실행 합니다.
      3. 컨디셔닝 (주 2)를 실행 합니다.
      4. 일반 홈 연습장에 쥐 고 24 h (day3)에 대 한 유지.
      5. 테스트 새 장에 다시 쥐를가지고 고 실행 테스트 프로토콜 (하루 4-10).
      6. 컨디셔닝 하루 (주 2)에 잘못 된 nosepokes의 비율에 따라 혐오 공간 학습, 혐오 공간 메모리 테스트 케이지 (3 일)에 반환의 날에 그 기반을 평가 하 고 멸종 학습 일 4-10에 기반.
  3. 집행 기능 (Impulsivity, 주의 및 Compulsivity)의 평가
    1. SRT 작업
      참고:이 절차 더 자세히10,14에 기술 이전 되었다. 이 일련의 작업에서 모서리 4 개가 모두 동일한 방식으로, 하루 24 시간 운영 한다. SRT는 2 개의 교육 세션의 구성 (SRT 훈련 1 및 2) 및 2 개의 테스트 세션 (SRT-테스트 1과 2). 첫 번째 훈련 세션 (SRT 훈련 1)에서 동물 노란색 LED 라이트는 nosepoke에 대 한 시작 신호는 배우고 훈련 된다. LED 빛은 항상 초기 nosepoke 직후 플래시 (지연 0으로 설정 됩니다 s).
      두 번째 훈련 세션 (SRT-교육 2)에서 지연 0.5, 1.0, 2.0, 및 4.0 중 무작위로 변화할 준비가 되어 s. 이 기간 동안 조 응답 결과 (사전 교육) 있다. 지연 기간 동안 어떤 nosepoke 문을 열 때 첫 번째 nosepoke 동안 조 응답으로 간주 됩니다 (5 s) 올바른 응답으로 간주 됩니다. 첫 번째 테스트 세션 (SRT-검정 1, 충 동성을 평가 하는 데 사용)에서 첫 번째 nosepoke 올바른 측면을 정의 하 고 지연 기간 시작 (0.5-4.0 작업 단계에 따라 s), 후는 노란색 Led는 특정 기간 동안 (자극 기간 = 2.0 s 작업 단계에 따라). 문은 다음 열립니다. 첫 번째 nosepoke 지연 기간 문 열리면 (5 s) 동안 지연 기간 동안 어떤 nosepoke 조 nosepoke 간주 됩니다 올바른 nosepoke로 계산. 두 번째 테스트 세션 (SRT-검정 2, 주의 평가 하는 데 사용)에 몇 가지 수정이 있다. 자극을 시작 후 (0.2-1.0 s, 첫 번째 테스트 보다 약간 짧은), 쥐 기간 동안 nosepokes 사용할 수 있습니다 함께 제공 됩니다 (제한 보유, 일반적으로 2 s). 문 열기 (5 s) 올바른 nosepoke 후에 제한 된 보류 하는 동안 첫 번째 nosepoke입니다. Nosepokes 제한 된 보류로 간주 됩니다 후 nosepoke를 생략 하 고 결과에 어떤 변경으로 이어질 하지 않습니다. 오류는 세 가지 유형으로 분할 된다: 조 nosepoke, 생략된 nosepoke, 및 생략 (첫 번째 nosepoke에만). 주의 시험 (제한 된 보존 기간에 의해 정의 되는) 온건 하 게 빠른 응답으로 LED 플래시 (자극 기간의 기간에 의해 정의 된) 수를 필요 합니다. 재판의 시간 과정은 그림 7에 나와 있습니다.
      1. SRT 작업에 대 한 실험 파일을 준비 합니다.
      2. 3 일에 대 한 SRT 훈련 1를 실행 합니다.
      3. 7 일에 대 한 SRT-교육 2를 실행 합니다.
      4. 7 일에 대 한 SRT-테스트 1 (충 동성)를 실행 합니다. Impulsivity 다음 수식에 따라 계산 합니다.
        Equation 1
        여기서 P는 조 nosepoke 시험 수 (또는 잘못 된 nosepoke의 수), 고 T는 총 실험 (첫 번째 nosepoke의 수)의 수 있습니다.
      5. 7 일에 대 한 SRT-테스트 2 (주의)를 실행 합니다. 계산 정확도 (여겨지는 관심에 대 한 성과 지표)는 다음 수식을 사용 하 여:
        Equation 2
        여기서 C는 올바른 nosepoke 시험 (올바른 두 번째 nosepokes의 수)의 수, T 횟수가 총 (첫 번째 nosepokes 수), O 누락 재판 (재판 없는 두 번째 nosepoke의 수), 수 이며 P는 조 수 nosepoke 시험 (또는 제한 된 보류 하기 전에 두 번째 잘못 된 nosepoke의 수).
    2. DD 작업
      참고: 이것은 간단한 선택 작업 동물 지연 (남서, 사 카린 0.5% 또는 10% 자당) 청량 음료수를 기다려야 하거나 지연 없이 일반 물을 마시는 것을 선택 하는 곳. 선택한 쪽에 문 반대편에 문 닫힌 동안 열립니다. 정상적인 물과 동일 하 게 모든 모서리의 오른쪽 또는 왼쪽 면에 할당 됩니다. DD 작업 일정에는 교육 및 테스트 세션 포함 되어 있습니다. 훈련 세션에서 쥐 소프트웨어와 물 대기 시간 없이 액세스할 수 있습니다. 따라서, 생쥐 남서 측에 그들의 특혜를 개발할 것입니다. 테스트 세션 대기 시간 매일 증가 (., 0, 1, 2,..., 8 s). 지연은 다른 지연 길이 전시 하는 여러 개의 모듈을 제작 하 여 순차적으로 매일 증가 (0, 1, 2,..., 8 s) "모듈" 및 "옵션" 지역 (일 본)에서 "링크"를 설정. 이 작업에서 모서리 4 개가 모두 동일한 방식으로, 하루 24 시간 작동합니다.
      1. DD 작업에 대 한 실험 파일을 준비 합니다.
      2. SW (모든 모서리에 오른쪽 또는 왼쪽 측면)의 측면을 정의 합니다.
      3. 포함 된 병 정의 측면에서 물병을 바꿉니다 남서
      4. 5-7 일에 대 한 지연 시간 없이 정의 측면에서 SW 마실 동물을 훈련 교육 세션을 실행 합니다.
      5. 사슬 또는 기회가 또는 nosepokes의 총 수에 SW의 옆에 nosepoking의 비로 정의 되는 기본 인덱스를 계산 합니다. 포함 된 SW로 계산 따라서 측면에 대 한 기본 인덱스:
        Equation 3
        또는
        Equation 4
        이전 인덱스는 후자에 초점 더 선택 행동 하면서 행동 결과에 더 집중 한다.
        참고: 대부분의 마우스 우선적으로 SW와 측면을 선택 확인 (> 빠는 데 숫자 기반 인덱스에 대 한 90% > 첫 번째 nosepoke 기반 인덱스에 대 한 80%)는 훈련의 끝에.
      6. 그 후, 9 일 (지연 0 ~ 8 s)에 대 한 DD 작업의 테스트 세션을 실행 합니다.
      7. 평가 compulsivity SW 측면으로 기본 설정의 변화 시간 과정을 평가 합니다.
  4. 데이터 분석
    1. "분석기"를 사용 하 여 아카이브를 열고 Excel 파일에 모든 데이터를 내보냅니다. 데이터를 필터링 하는 데이터의 양이 매우 큰 경우 (., 공간 작업에 대 한 마시는 세션을 추출 하 고 추출 SRT 작업에 대 한 첫 번째 및 두 번째 nosepokes).

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Representative Results

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우리의 이전 연구에서 광고 모델의 연령에 따라 인지 적자 자동된 집-새 장 모니터링 시스템10를 사용 하 여 실험에 의해 감지 했다. PP에 광고 모델의 그들의 실적은 그대로 젊은 성인과 더 오래 된 주제; 그러나, PPR에 성능 되었고 크게 점차적으로 손상 (그림 6). 그것은 또한 같은 특성 인식15영향을 미칠 수 있기 때문에 일반적인 동작이 나 불안 적응 단계에서 관찰 하는 것이 중요. 광고 모델 FA, NP, 및 DSA 세션에 방문, nosepoke, 및 사슬 숫자에 어떤 심한 이상이 표시 하지 않았습니다. 따라서, 광고 모델은 낮은 유연성을 있을 수 있습니다.

집행 기능 평가, SRT와 DD 행동 성능을 기록 했다. 이전 광고 모델 (NL-G-F) SRT (SRT-검정 2) (그림 8)의 마지막 단계에서 정확도 부족. 촉진된 compulsivity 젊은 성인과 NL-G-F 마우스의 오래 된 주제에서 관찰 되었다 (그림 9B, 상단). 흥미롭게도, 나이에 젊은 성인, 있던 NL F 쥐의 compulsivity에 증가 했다, 하지만 그것은 야생-타입 마우스 (그림 9B, 아래)의 비교 되었다. 이것은 NL F 돌연변이의 변이 형의 예이다입니다.

Figure 1
그림 1: 자동된 집-새 장 모니터링 시스템의 구성 요소. (A)는 시스템의 개요. (B) 커넥터의 위치입니다. (C) 코너 작동 도어 챔버. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 연구에 대 한 그룹의 예. 일반적으로, 감 금 소 당 12 마우스 사용 됩니다. 4 개의 그룹 (3 개의 유전자 모델 및 한 야생-타입)을 사용 하 여의 IntelliCage 당 그룹 당 3 쥐 적절 한 간주 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 시스템 소프트웨어. (A) "디자이너" 실험 파일 사용 됩니다. 왼쪽: 동물 목록 부분에 동물 및 그룹 정의의 정보가 포함 됩니다. 오른쪽: 모듈 공간은 실험적인 작업을 정의 하는 데 사용 됩니다. (B)는 "컨트롤러"는 실행, 모니터, 및 기록 실험에 사용할 수 있습니다. 왼쪽: 감 금 소 동물의 방문, nosepoke, 표시 및 네 모서리에 핥는 중의 상태입니다. 오른쪽: 경보 windows 몇 가지 문제가 발생 하는 경우 나타납니다. (C) 분석기를 처리 하는 컨트롤러에 의해 수집 된 데이터를 내보낼 사용할 수 있습니다. 왼쪽: 모든 데이터는 시간과 케이지, 내부 환경, 동물의 정보로 태그가 없습니다. 필터링 도움이 됩니다 추가 Excel 또는 다른 분석 소프트웨어에서 분석. 오른쪽의 타임 라인 (또한 nosepoke 또는 기회가) 방문 수 표시 개별적으로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 트랜스폰더 이식. 트랜스폰더 (DataMars)의 (A) 마이크로 칩. (B) 측면 트랜스폰더 이식 (transpondering)의 볼. 척수에 원인 상해를 하지 마십시오. (C)는 트랜스폰더의 최고 볼 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: 자동 집-새 장 모니터링 시스템 인지 평가 대 한 실험의 시간 선. 인지 평가 위한 테스트 배터리 두 번 수행 (1 세트, 9-12 개월 이상; 2 세트, 14-17 개월) 결국에서 일반 활동을 평가 하기 위한 실험 뒤 (3 세트 [18 개월]). 이 배터리 여러 인지 도메인을 평가 하기 위한 지정 되었다 (색상으로 표시-레드: 일반적인 활동; 블루: 공간 학습 및 메모리; 녹색: 집행 기능), 유효성 검사 및 예상된 인식 적자의 장점이 그. 아버지: 자유로운 적응; 경찰청: Nosepoke 적응; DSA: 마시는 세션 적응; PP: 장소 특혜; PPR: 장소 특혜 역 분개; SRT: 직렬 반응 시간 (충 동성 및 주의); PA: 장소 회피; DD: 지연 나요입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6: 실험 설계 및 PP 및 PPR 작업의 대표적인 결과. (A) 탑, PP 또는 PPR 예제 모듈 디자인. 하단, 올바른 코너 설정 PPR에 반대 측으로 변경 됩니다. (B) (NL-G-F)로 오래 된 나이에 elicited 광고 모델에 학습 공간 반전에 적자. 데이터는 평균 ± 표준 오차 (SEM)의 표현 됩니다. ∗p < 0.05; ∗∗p < 0.01. 색상 비교의 그룹을 나타냅니다: 블루: NL 대 WT; 레드: NL-F vs WT; 녹색: NL-G-F 대 WT. 이 그림은 참조10에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 7
그림 7: SRT 작업의 재판 흐름. 왼쪽: SRT (꼬마 도깨비)의 재판 흐름. 첫 번째 nosepoke 올바른 측면을 정의 하 고 지연 기간 시작 (0.5-4.0 s), 황색 Led는 켜져 후. 문은 다음 열립니다. 오른쪽: SRT (att)의 재판 흐름. 첫 번째 nosepoke 올바른 측면을 정의 하 고 지연 기간 시작 (2.0 s) 후, 짧은 시간에 노란색 led가 켜져 있는 (0.2-1.0 s). 쥐 기간 동안 nosepokes 사용할 수 있습니다 함께 제공 됩니다 (제한 된 개최, 2 s). 문 열기 (5 s) 올바른 nosepoke 후에 제한 된 보류 하는 동안 첫 번째 nosepoke입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 8
그림 8: 실험 설계 및 SRT 작업의 대표적인 결과. (A) SRT에 대 한 예제 모듈 디자인. (B) 주의 오래 된 나이에 해당 하는 광고 모델에 거절. 데이터 평균 ± SEM. ∗p 로 표현 됩니다 < 0.05; ∗∗p < 0.01. 색상 비교의 그룹을 나타냅니다: 블루: NL 대 WT; 레드: NL-F vs WT; 녹색: NL-G-F 대 WT. 이 그림은 참조10에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 9
그림 9: 실험 설계 및 DD 작업의 대표적인 결과. (A) DD 작업에 대 한 모듈의 예. (B) 두 젊은이 노인 연령대에서 광고 모델 (NL-G-F) compulsivity 촉진. 이 형의 예입니다. 다른 한편으로, compulsivity 뚜렷이 다른 광고 모델 (NL-F)에 증가 되었다. 데이터 평균 ± SEM. ∗p 로 표현 됩니다 < 0.05; ∗∗p < 0.01. 색상 비교의 그룹을 나타냅니다: 블루: NL 대 WT; 레드: NL-F vs WT; 녹색: NL-G-F 대 WT. 이 그림은 이전 작업10에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

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이 문서에서는 유전자 변형된 광고 모델에 장기 인지 및 행동 분석을 위한 자동된 집-새 장 모니터링 시스템을 사용 하 여 메서드를 설명 합니다. 가장 중요 한 단계는 적절 한 위치에 트랜스폰더의 이식입니다. 주입을 수행 하기 전에 확인 하는 트랜스폰더의 만료 날짜를 통과 하지 않았습니다. 두 번째 중요 한 점은 확인 매일, 시스템의 기능 특히 사소한 문제 이후에 연구 기간 동안 더 심각한 것이 될 수 있습니다 (즉,., 한 문, 떨어진 아웃 트랜스폰더, 나쁜 전기 연결, 을 쌓아 .). 셋째, 실험 일정 내내 많은 문제가 발생할 수 있습니다 때문에 문제가 쏠 수 있을 것이 필수적입니다.

이 종이 인지 평가 대 한 작업의 기본 패키지를 도입 했다. 이러한 작업은 기존의 행동 테스트를 참조 하 여 생성 했다 하지만 그들은 완벽 하 게 기존의 테스트를 모방 수 없습니다. 예를 들어 SRT 작업 선택 모드를 설정 하지 마십시오. 5 선택 직렬 선택 작업 (5CSRTT), SRT 작업의 모델은 일반적으로 정확도16,17를 측정 하는 nosepoke에 대 한 9, 5 또는 3 구멍 챔버에 실시 됩니다. 우리 팀은 이전 SRT의 선택 버전을 구현 하려고 하지만 쥐 비교적 긴 시간 (2 주 이상) 내 규칙을 배울 하지 못했습니다. 이 시스템의 사용자는 차이의 인식 하 고 데이터를 신중 하 게 토론 한다.

반복된 측정에 대 한 제한에 대 한 또 다른 문제가입니다. 이전 연구18에서 설명 했 듯이, 첫 번째는 반복된 실험은 단순히 나이의 효과 비교할 수 없습니다. 우리는 두 번째 PA 테스트에서 데이터 광고 모델10메모리 장애를 복제 하지 못했습니다 관찰. 모든 유전자의 성능 파의 첫 번째 테스트의 그것 보다 훨씬 더 이었다. 이 차이 혐오 자극 (이전 PA 작업의 경험)에 나이 차이가 또는 요법이 니에서 올 수 있습니다. 경험 반복 효과 생각 하 고 작업의 순서를 고려 해야 합니다. 극복 하기 위해 두 번째 PA 테스트에서 혐오 자극의 습관 들 임, 더 강한에 어 퍼프 자극을 사용 하 여 또는 추가 침구의 다른 유형과 같은 몇 가지 새로운 환경 자극을 수 있습니다 또는19.

다양 한 연구 개발 하 고 새로운 방법 및 프로토콜 자동 홈 케이지 모니터링 연구20,21,22,23,,2425, 대 한 26및 지원 소프트웨어를 오픈 소스 라이브러리27을 사용 하 여. 따라서, 시스템의 가능성 확장 되었습니다. 마지막으로, 시스템 자동된 높은 처리량 행동 심사를 형질 및 질병 모델 유효성 검사에 도움이 광범위 한 인지 기능을 연구 하는 데 사용 되는 장기 분석을 제공 합니다.

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Disclosures

관심 없음 충돌 선언.

Acknowledgments

촬영 자료에 그녀의 도움에 감사 레이코 안도 하 고. 이 연구는 탐색적 연구에 대 한 특정에 의해 지원 되었다 (JSP KAKENHI 부여 번호 16 K 15196).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IntelliCage TSE Systems - Parchased in 2011 or later
PC Dell Inspiron 580s -
Display Dell SI75T-WL -
ALPHA-dri Shepherd Specialty Papers - Standard bedding
Aron Alpha (Krasy Glue) 2 g Toagosei (Krasy Glue) #04612 Cyanoacrylates for gluing magnet and blak arm
Handheld Transponder Reader BTS-ID R-560 Transponder reader, which reads both Trovan and DataMars
Transponder DataMars T-VA, T-VAS, or another series Basic package of transponders and implanters
Diamond Grip Plus Ansel Microflex DGP-INT-M Experimental glove
Isoflurane Pfizer 1119701G1092 -
Vaporizer for small animals DS Pharma Biomedical SF-B01 Facemask included
Neo-Medrol Pfizer 006472-001 Eye ointment
Ethanol (70%) - - -
Excel Microsoft 00202-51382-15524-AA928 For data analysis

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References

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자동화, Alzheimer의 질병, IntelliCage를 사용 하 여 여러 유전자 모델에서 인지 기능에 대 한 장기적인 행동 분석 결과
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Masuda, A., Kobayashi, Y., Itohara, S. Automated, Long-term Behavioral Assay for Cognitive Functions in Multiple Genetic Models of Alzheimer's Disease, Using IntelliCage. J. Vis. Exp. (138), e58009, doi:10.3791/58009 (2018).More

Masuda, A., Kobayashi, Y., Itohara, S. Automated, Long-term Behavioral Assay for Cognitive Functions in Multiple Genetic Models of Alzheimer's Disease, Using IntelliCage. J. Vis. Exp. (138), e58009, doi:10.3791/58009 (2018).

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