Summary
Detta dokument beskriver ett protokoll för kognitiva bedömningar för genetiska modeller av Alzheimers sjukdom med hjälp av det IntelliCage systemet, som är en hög genomströmning automatiserad beteendemässiga övervakningssystem med operant betingning.
Abstract
Flera faktorer — såsom åldrande och gener – är ofta förknippade med kognitiv försämring. Genetiskt modifierade musmodeller av kognitiv försämring, såsom Alzheimers sjukdom (AD), har blivit ett lovande verktyg för att kartlägga de bakomliggande mekanismerna och främja de terapeutiska framsteg. Ett viktigt steg är validering och karakterisering av förväntade beteende abnormitet i modellerna, i fallet AD, kognitiv försämring. De långsiktiga beteendemässiga utredningarna av försöksdjur att studera effekten av åldrande efterfrågan betydande ansträngningar från forskare. Systemets IntelliCage är en hög genomströmning och kostnadseffektiva test batteri för möss som eliminerar behovet av daglig human hantering. Här beskriver vi hur systemet utnyttjas i den långsiktiga fenotypning av genetiska Alzheimers sjukdom modell, speciellt med inriktning på kognitiva funktioner. Experimentet sysselsätter upprepade batteri av tester som utvärderar spatial inlärning och exekutiva funktioner. Denna kostnadseffektiva åldersberoende fenotypning tillåter oss att identifiera gener övergående eller permanenta effekter på olika kognitiva aspekter.
Introduction
Utvecklingen av djurmodeller för neuronal sjukdom under det senaste decenniet har gett en mekanistisk förståelse av sin grund och för att främja den terapeutiska framsteg1,2,3. Tillämpningen av ett högt dataflöde beteendemässiga test batteri i genetiska djurmodeller är en heuristisk forskningsverktyg för att undersöka de bakomliggande mekanismerna av mänskliga sjukdomar och identifiering av läkemedelsbehandlingar. Forskning test batterier anpassade för långsiktig observation av åldrande och/eller demens-modeller har traditionellt tvingat laboratorier att konsumera stora mängder specialiserad arbetskraft och tid. Ett hem-bur övervakningssystem skulle vara en kostnadseffektiv strategi eftersom det skulle minska kostnaden för beteendemässiga observationen av människor. Vissa forskargrupper har utvecklat automatiserade vision-baserat verktyg som hjälper behavioral fenotypning av en enskild individ i en liten hem bur4,5,6. Men begränsa sådana metoder social interaktion, storleken på testmiljöer och mängden beteendemässiga åtgärder som inkluderar kognitiva funktioner. IntelliCage är ett andra generationens hem-bur övervakningssystem som utformats för att utföra olika kognitiva uppgifter i en socialt buren. Viktigast av allt, denna metod kan eliminera dagligen hantering som möjliggör oss att utföra långsiktigt beteende övervakning med bedömning av kognitiva funktioner, och det kan eliminera kraven för specialiserad praktisk hantering, och aktivera mycket reproducerbara data förvärv7. Här beskriver vi de långsiktiga fenotypning och validering i genetiska musmodeller av Alzheimers sjukdom (AD) som har genererats nyligen8,9,10 med hjälp av automatiserade hem-bur övervakning systemet. En test-batteri, som ingår bedömningar av spatial inlärning och exekutiva funktioner, utfördes upprepade gånger på flera år points (9 – 12 och 14 – 17 månader gammal). Detta åldersberoende fenotypning tillät oss att identifiera gener övergående eller permanenta effekter på olika kognitiva aspekter. Vi fann att vissa AD modeller visade både tillfälliga och permanenta fenotyper av flera kognitiva aspekter testas i långsiktiga analysen med automatiserade hem-bur övervakning system10. Automatiserad studien använder system för övervakning av hem-buren är alltså fördelaktigt och kostnadseffektiv för långsiktiga beteendemässiga fenotypning och validering i olika modeller av kognitiv dysfunktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden som godkändes av institutionella djuret och användning kommittén, och de utfördes enligt RIKEN hjärnan vetenskap institutets riktlinjer för djurförsök.
1. ställa in apparaten
Obs: En översikt av hem-bur automatiserade övervakningssystem visas i figur 1. Varje system (39 x 58 cm x 21 cm) innehåller en mikroprocessor och fyra hörn chambers, som alla har två vattenflaskor och en ring antenn för att upptäcka radiofrekvens identifiering av transpondrarna implanteras i djuren (figur 1A). Identifikationsnumren för mikroprocessorn definieras av vridväljaren (maskinvaruadresser) (figur 1B). Identifikationsnumren för mikroprocessorn ska inte överlappa. Två dörrar i varje hörn styrs av datorer som används för den operant betingning (figur 1 c). Varje bur kan vanligen bedöma upp till 12 möss (se figur 2 exempel på gruppboende). Det är acceptabelt att använda ett större antal möss. Man bör dock se till att mössen inte slåss överdrivet och att de inte är överbefolkad när de utför starkt konkurrenskraftiga uppgifter.
- Anslut burarna seriellt via kan kablar till en dator.
- Anslut batterikablarna till pluggarna i mikroprocessorn (Power-on). Alla lysdioder bör sedan vara påslagen i några sekunder och alla dörrar ska flytta. Om lysdioderna inte Stäng av eller om dörrarna inte flytta, koppla från och nätkabeln (dåliga elektriska anslutningar kan leda till felaktig funktion).
- Säkerställa att skjutdörrarna öppna och stänga korrekt. Om dörrarna inte flyttar korrekt, kontrollera de små magneterna knutna till den svart arm. Om problemet uppstår ofta kan överväga att limma magneten på armen.
- Fortsätta att kontrollera villkoren för dörrarna under experimenten (minst en gång per dag).
- Slå på datorn.
2. programvara
Obs: Alla tre komponenter i programvaran (”Designer”, ”Controller” och ”Analyzer”) för automatiserade hem-bur övervakningssystemet har utformats som grafiska användargränssnitt (figur 3). Användare kan enkelt styra eller lägga till olika funktioner under experimentet.
- Att göra experimentera filer med hjälp av ”Designer”
Obs: Den ”designern” används för att skapa och redigera experimentella filer (program på systemet) för att utföra olika experimentella protokoll och för att testa status för systemet (figur 3A). En experimentell fil bäddar in listan djur, maskinvaruinställningar och flera experimentella protokoll. Användare kan också få publicerade journal protokoll genom att kontakta författarna.- Skapa listan djur
- Definiera villkoren. Bygga den experimentella grand design, som innehåller följande parametrar: 1) antalet föremål möss, 2) antal genetiska linjer (eller behandlingsgrupperna), 3) sex (handjur, hondjur eller båda) och (4) antalet buren ska användas.
- Välj vilken lämplig transponder (DataMars eller Trovan) i verktygsfältet central.
- Ange ”grupper”. Lägga till eller ta bort de experimentella grupperna i panelen ”grupper” (dvs., genotyper eller behandlingar) genom att trycka på ”grön plustecken (+)” eller ”röda korset (x)” knappen i fönstret ”grupper”, respektive.
- Ange ”kluster”. Använd funktionen ”kluster” för att använda undergrupper lika genom att definiera rätt, felaktiga och neutrala hörnen och på sidorna.
Obs: De besök, nosepoke och slicka händelser, de viktigaste uppgifterna för eventuella beteendemässiga uppgifter, är alla associerade med definitionen. Den här inställningen krävs för spatial inlärning uppgifter. De definiera kluster för varje djur förblir densamma under hela försöket. Exempelvis i ett kluster för plats preferens (PP) aktivitet eller plats preferens återföring (PPR), ett hörn definieras som rätt (vatten-tillgänglig) och tre hörn definieras som felaktiga (vatten-oåtkomliga). Kluster kan dessutom kopplas till en annan med ”länk”-funktionen. - Tilldela variabler inklusive ”namn”, ”Tag” (transponder ID), ”Sex”, ”koncernen” och ”kluster”.
- Spara och klistra listorna djur genom att välja ”exportera”... och ”importera djur”... i baren ”fil” menyn att replikera den animaliska listorna för ett annat experiment.
- Ställa in hårdvaran i ”Setup” tab. uppsättning upp alla system som använder deras motsvarande ID-nummer (maskinvaruadress) ”Setup” på fliken motsvara antalet adresser i avsnittet ”designer” till de faktiska antalet adresser.
- Bygga de experimentella protokoll på fliken ”IntelliCage”
- Bygga de experimentella protokoll i fliken ”IntelliCage” med hjälp av följande huvud och sämre flikar (”modul” och ”alternativet” flikar).
- Utforma de experimentella strukturerna i ”modul Space” genom att klicka på fliken ”modul” (figur 3A). För att lägga till nya moduler, tryck på ”Lägg till” (green plus knappen på fliken ”modul”).
Obs: Det finns fyra olika typer av komponenter, nämligen ”uppgifter”, ”Utils”, ”reportrar” och ”händelser”. Ett experiment börjar normalt med en utlösande händelse, nämligen ”besök”, ”Nosepoke”, eller ”dricka”. Markera den utlösande händelsen, dra den motsvarande enheten från avsnittet händelser att definiera tecknet börjar. Därefter ange utdata för vissa manöverdon (till exempel dörröppningen) genom dra enheterna från avsnittet ”uppgifter” (t.ex., ”dörr”, ”LED” och ”Air”). - Dra enheter, visas i ”enheter” del, in i ”modul utrymme”.
Obs: Igen, användare kan få publicerade protokoll (som experimentella filer) från författarna och återanvända filer genom att importera nya djur lista. Användare behöver inte göra alla moduler. - Gör en nosepoke anpassning (NPA) modul (figur 6A), dra enheten ”dörr” från avsnittet ”uppgifter”, ”Gate” och ”Timer” enheter i avsnittet ”Utils” och de ”besök” och ”Nosepke” enheterna i avsnittet ”händelser” i ”modul utrymmet”.
- Länk ”någon” på raden ”på” av Nosepoke enheten till ”In” i enheten Gate. Länk ”Out” till ”nära” i enheten ”Gate”. Länken ”ut” i ”porten” till ”aktivera” i enheten ”Timer”. Länken ”ut” i porten till öppen i enheten ”dörr”. Länk ”ut” i enheten ”Timer” till ”nära” i enheten ”dörr”. Ange ”Period” som 5000 (ms) i avsnittet Timer.
Obs: ”Gate” enheten används för att kontrollera indata och utdata av sekvensen. I ”öppna” staten (standardläget), kommer sekvensen ansluten till ”utgång” att drivas. Däremot ”Stäng” skick, kommer sekvensen ansluten till utgång att stoppas. Sannolikheten för den öppning som kan vara angivna (figur 6A, figur 8Aoch figur 9A). Väljaren ”modul” används för att ändra modulerna på måfå eller i en viss sekvens under samma experimentell period. I seriell reaktionstid (SRT) uppgiften, exempelvis kopplas moduler (av variabel fördröjning längder) slumpmässigt i varje ände av besöket med hjälp av modulen väljaren (ange ”RandomExcludeDefault”-läge) kopplad till raden ”slutet” av enheten ”besök” (figur 8A ). ”Splitter” enheten kommer att användas för att rikta en insignal till en viss sida av hörnet. Detta krävs för mer komplicerade moduler som används i SRT eller dröjsmål diskontering (DD) uppgift, som kräver användning av en specifik sida. Till exempel i DD uppgiften, kommer att endast en sida (sötad sida) öppna med en fördröjning (figur 9A). - Definiera dörrarna ursprungliga status i burar i fliken ”Alternativ” ange alla dörrar stängas i icke-drickande session som typiska ursprungliga status för PP eller PPR uppgifter.
- Ange tidsscheman på fliken ”Alternativ”. Modulerna byts vid vissa tidpunkter, och åtgärden som definieras i fönstret ”dag Patterns” utförs.
Obs: Den ”dag Patterns” delen kan användas att ställa fönstret experimentell tid. Vanligtvis används nattetid, aktiva fasen av möss, att bedöma beteendet i de kognitiva uppgifterna. Det bör märkas som en aktivitets varaktighet kan påverka mängden vattenintag. Om varaktigheten är lång i relativt enkla uppgifter, kan prestanda i slutet av tidsfönstret-minska på grund av tillfredsställelse. Således krävs tidsfönstret ställas in noggrant.
- Skapa listan djur
- Köra experiment med ”Controller”
- Läsa in experimentella filen genom att trycka på ”Experiment”... knappen i avsnittet ”Inställningar” i ”Controller”.
- Köra experimentet genom att trycka på knappen ”Start” av den ”Controller” (center högra delen).
- Övervaka och visualisera aktuell status för systemet och möss.
Obs: De beteendemässiga händelserna förklaras enligt följande: besök, in till ett hörn (upptäcks av termisk sensor); nosepoke, att sätta näsan i hålet inuti hörnet (detekteras av IR-strålen, och kan delas in i vänster och höger nosepoke); «««slicka, slickar detekteras av lickometer (räknas som tid och frekvens). - Noggrant kontrollera status för systemet, att särskilt uppmärksamma varningarna.
Varning: Fel på grund av en felaktig djur tagg (transponder nummer) kommer att rapporteras i loggen även om den faktiska tag-numret är korrekt (dvs. ”, oregistrerade tagg ***”, ”närvaro signal utan antenn registrering”, etc.). Detta kan bero på användningen av en transponder som håller på att förfalla. Felet är dock inte ett allvarligt problem. I detta fall bör man kontrollera att djuret identifieras i meddelandet kan upptäckas. Fel på grund av långa perioder utan ett besök eller dryck kommer att visas som, till exempel ”*** (animal ID) inte gjorde några besök under förra 720 minuter” (figur 3B). Kontrollera noga flera möjligheter som kan leda till sådana fel. Det allvarligaste fallet är att djuret redan är död. Näst allvarligaste möjligheten är att det finns ett problem med detektionssystemet för djuret (transpondern fungerar inte, eller har fallit ut). Den tredje möjligheten är att djuret bara inte är aktiv. Om djuret inte gör några besök på hela 24 h tid, bör försöksledaren överväga att ta bort djuret från buren på grund av sitt hälsotillstånd. Ett allvarligt problem som inte har en felindikering är misslyckandet med dörren stänga (nästan alltid på grund av problemen med magneter på dörren). Detta resulterar i skapandet av ett olämpligt dricka hörn. För att kontrollera detta problem, bör villkoren för alla dörrar kontrolleras under en icke-drickande session minst en gång om dagen. De uppgifter som erhållits när problemet är närvarande kan inte användas för analys av PP, PPR, SRT eller DD uppgifter. - Utgång alla beteendemässiga händelser med etiketten för den tid och djur information genom att trycka på ”Stop”-knappen på ”Controller” (figur 3B).
- Datahantering med hjälp av ”Analyzer”
- Med hjälp av ”Analyzer”, analysera och visualisera data.
- Exportera tid-kastas i papperskorgen data som Excel-filer (figur 3 c). Grafiska resultaten visas i fliken ”diagram” kan underlätta förståelsen av data. I fliken ”Data” data ordnas i flera kolumner och kan sorteras och filtreras med eventuella parametrar.
3. djur förberedelse
- Använda djur över 15 g (2 månader eller äldre).
Obs: Om djuren är mindre än 15 g, flera möss kan besöka ett hörn samtidigt, vilket leder till fel i datainsamlingen. Äldre djur övervakas noggrant för att säkerställa att de har möjlighet att hoppa in i hörnen och klättra mataren. Vissa äldre möss eller möss med genetiska mutationer uppvisar motoriska funktionsnedsättningar kan dö eftersom de inte kan komma åt vatten eller mat. - Minska risken för aggression.
Obs: Även när du använder honmöss, det är bättre att börja bostäder alla möss tillsammans i en bur i unga år (dvs.vid 1 månads ålder) före start experimentet. En profil av musen, särskilt med avseende på aggressivitet, bör erhållas när du använder manliga möss i bur. -
Implantatet radiofrekvent identifiering transpondrarna (steriliserad, nål ingår) subkutant i möss i regionen dorso-cervikal under isofluran inandning anestesi (figur 4).
- Placera musen i kammaren för anestesi med induktion.
- Justera syre flödesmätarens till 0,8 till 1,5 L/min och isofluran spridare till 2.0 till 2,5%.
- Släpp musen från induktion kammaren efter andningsfrekvensen blivit långsam (ca 5% droppe).
- Underhåll av anestesi med en ansiktsmask.
- Gälla ögon att förhindra ögat torkning oftalmologiska salva.
- Nyp och lyfta huden runt den bakre delen av scapulae att skapa en ficka.
- Släck injektionsstället med 70% etanol att minimera införandet av hår i subkutan utrymmet. Sätt sedan injicera nålen genom huden parallellt med ryggraden.
- Mata ut microchip subkutant.
- Nypa mikrochip genom huden att hålla det mellan skulderblad utrymme.
- Dra ut injektionsnålen långsamt. Fortsätt att nypa området i några sekunder för att ge hemostas.
- Använd efter administreringen smärtlindring om nålen är felaktigt isatt.
- Släpp musknappen från anestesi.
- Placera musen i en återhämtning bur och övervaka det tills de vaknar upp och flytta runt. Undvik att lämna musen obevakad.
- Återgå musen till buren när det blivit fullt ambulatory.
- Kontrollera den implanterade transpondern med en transponder läsare för minst 1 vecka.
FÖRSIKTIGHET: Placera av de implanterade transpondrarna är helt avgörande för identifiering (se figur 2). Sätt inte transpondern vertikalt i halsen; Detta kan orsaka, djur få allvarliga skador av djurets ryggmärgen. Transpondrar falla ibland efter några timmar eller dagar. Kontrollera om transpondern fungerar med hjälp av en transponder läsare. I valfritt, implantat transponder igen om det faller ut; det upprepade åter implantat kan dock orsaka konstgjorda beteendeförändringar. Kontrollera utgångsdatum. Utgångna transpondrar sänder felaktiga signaler ofta som följer i saknas data.
- Införa djuren i buren och kontrollera de transpondrar som implanteras i möss med transponder läsarna. Ta bort mössen om transpondrarna inte upptäcks.
4. kör experiment
Obs: Möss utfodras ad libitum med vanlig mus chow och underhålls med syntetiska sängkläder som ändras varje 1 eller 2 veckor beroende på aktivitetsschemat. Undvik att ändra sängkläder under spatial inlärning uppgift speciellt första 1 – 2 dagar. Lamporna är på mellan 08:00 och 20:00. De experimentella modulerna utförs sekventiellt enligt de vetenskapliga frågorna. Experimentell schemat illustreras i figur 5.
- Allmän aktivitet
Obs: Möss är sekventiellt anpassade till miljön i buren med hjälp av tre experimentella villkor: gratis anpassning, där djuren kan alltid komma åt vatten flaskorna i hörnen frikostigt (en dag till 1 veckas tillvänjning anses normalt (adekvat); NPA, där mössen kan komma åt vatten flaskor för 5 s efter varje nosepoke i hålen framför dörrarna i hörnen (3 dag till 1 vecka tillvänjning är vanligtvis tillräcklig); och dricka Session anpassning, där mössen kan komma åt vattenflaskor vid en viss tid på dagen.- Förbered filerna experiment för FA, NPA och DSA uppgifter.
- Köra aktiviteten FA i den ”Controller”.
- Mäta antalet besök, nosepokes eller slicka episoder dagligen eller dygnsrytm aktivitet regelbundet som ett index av allmänna verksamhet.
- Köra aktiviteten NPA i den ”Controller”.
- Köra aktiviteten DSA i den ”Controller”.
Observera: Många learning paradigm kräver anpassning för dricka session. Ange tidsschema för DSA med två olika experimentella moduler: standard (för vatten frihetsberövande) sessionen, och dricka session. Möss kan inte komma åt vattenflaskor eftersom ingenting händer efter en nosepoke i modulen standard. Dricka sessionen är identisk med NPA modulen. Den tidsplan som definierats på fliken ”Alternativ” i ”Designer” kan då skifta till dricksvatten sessionen definieras av en annan modul.
- Spatial inlärning och minne uppgifter
Obs: PP uppgiften används för att bedöma rumsliga lärande (vanligtvis 5 – 7 dagar). I PP uppgiften, har möss begränsad tillgång till vatten i tre av fyra hörn (ett rätt hörn och tre felaktiga hörn). Djuren skulle således behöva besöka ett visst hörn för att dricka vatten under dricka sessioner. PPR uppgiften används för att bedöma flexibilitet eller tvångsmässighet och möjligheten att ändra beteende flytande (normalt 5-7 dagar). I PPR uppgiften, mössen kan bara komma åt vatten i motsatt hörn används som rätt hörnet i PP uppgift.- Förbered filerna experiment för PP och PPR uppgifter. Definiera rätt hörnen för mössen genom att ange ”kluster” (vanligtvis 1-4 hörn varje) i fliken ”djur” av ”Designer” (se figur 6A, botten). För att undvika tung trafik i ena hörnet, fördela de fyra hörnen på alla möss jämnt.
- Köra aktiviteten PP i handkontrollen.
- Utvärdera spatial inlärning på tidsförloppet, antalet och procentandelen av rätt nosepokes.
Obs: Den aktuella versionen av PP uppgiften fokuserar mer på spatial inlärning snarare än, rumsliga minne, eftersom uppgiften inte kräver en lucka mellan de olika studierna. För att fokusera mer på rumsliga minne, överväga att använda aktiviteten plats undvikande (PA) eller en odefinierad nya version av rumsliga uppgiften som utnyttjar specifik tid luckor mellan prövningar. - Köra aktiviteten PPR i den ”Controller”.
- Utvärdera flexibilitet eller tvångsmässighet utifrån kursens tid, antalet och procentandelen av den rätta nosepokes.
Obs: Tolkning av PPR data kräver flera försiktig domar. Ursprungliga utförandet av aktiviteten PPR är starkt beroende av prestanda i PP uppgift. Detta beror på att PPR uppgiften bygger på störningar eller nödvändigheten att ändra beteende. Utförandet av PPR kan därför särskilt fattiga om utförandet av aktiviteten PP är nära 100% rätt. Flexibilitet kan anses vara en av de exekutiva funktioner11,12,13. - Bedöma rumsliga rädsla minne i PA.
Obs: PA uppgiften består av 4 kontinuerlig sessioner: tillvänjning (dag 1); luftkonditionering (luft-puff introduceras efter nospoke på alla sidor av ett fördefinierat hörn [Felaktiga nosepoke], dag 2); 24 h paus utanför testning buren (mössen placeras tillbaka i sin normala hem-burar, day3). att placera möss tillbaka in i testing buren utan luft-puff (dagar 4 – 10).- Förbereda filerna experiment för PA.
- Kör tillvänjning (dag 1).
- Köra luftkonditionering (dag 2).
- Ta möss normala hem burar och hålla för 24 h (day3).
- Ta möss tillbaka till testning buren och kör testprotokollet (dag 4 – 10).
- Utvärdera den aversiva spatial inlärning baserat på kvoten av felaktiga nosepokes på luftkonditionering (dag 2), aversiva rumsliga minne baserat på som på dagen för återgång till testning buren (dag 3) och utrotning lärande baserat på som på dagar 4 – 10.
- Bedömning av verkställande funktionen (impulsivitet, uppmärksamhet och tvångsmässighet)
- SRT uppgifter
Obs: Detta förfarande var tidigare beskrivs i mer detalj10,14. I denna uppsättning aktiviteter drivs alla fyra hörnen på samma sätt, 24 h per dag. SRT består av två träningspass (SRT-utbildning 1 och 2) och två test sessioner (SRT-Test 1 och 2). I det första träningspasset (SRT-utbildning 1), är djuren utbildade för att lära sig att den gula LED-lampan är en startsignal för en nosepoke. LED lamporna blinkar alltid omedelbart efter den inledande nosepoke (dröjsmål sätts till 0 s).
Fördröjningen ligger i andra träningspasset (SRT-utbildning 2), varierar slumpmässigt bland 0.5, 1.0, 2.0 och 4.0 s. Under denna period har för tidigt Svaren ingen betydelse (före träning). Någon nosepoke under perioden dröjsmål anses ett förtida svar, medan den första nosepoke när dörren öppnas (5 s) anses vara ett korrekt svar. I den första testomgång (SRT-Test 1, används för att bedöma impulsivitet), den första nosepoke definierar rätt sida och initierar en fördröjningstid (0,5 – 4,0 s, beroende på uppgift fasen), efter vilket gula lysdioder är aktiverat för en viss tidsperiod (stimulans varaktighet = 2.0 s, beroende på fasen uppgift). Dörren öppnas då. Den första nosepoke efter perioden fördröjning öppnar dörren (5 s) och räknas som en rätt nosepoke medan någon nosepoke under perioden dröjsmål anses för tidigt nosepoke. Det finns flera ändringar i andra testsession (SRT-Test 2, används för att bedöma uppmärksamhet). Efter att ha startat ett stimulus (0,2-1,0 s, något kortare än det första testet), mössen är försedda med en tidsperiod under vilken nosepokes är tillåtna (begränsad håller, vanligtvis 2 s). Dörrar öppna (5 s) endast efter en rätt nosepoke, som är den första nosepoke under begränsad lastrummet. Nosepokes efter begränsad hold anses utelämnas nosepoke och leder inte till förändringar i resultatet. Felen delas in i tre typer: tidig nosepoke, utelämnade nosepoke och utelämnande (endast första nosepoke). Uppmärksamhet testet kräver förmåga att märka LED-blixt (definierad av varaktigheten av stimulans varaktighet) samt måttligt snabbt svar (definierad av varaktigheten av begränsad håll). Tidsförloppet för rättegången illustreras i figur 7.- Förbered filerna experiment för SRT uppgifter.
- Kör den SRT-utbildning 1 i 3 dagar.
- Köra SRT-utbildning 2 i 7 dagar.
- Kör den SRT-Test 1 (impulsivitet) i 7 dagar. Beräkna den impulsivitet baserat på följande formel:
där P är antalet förtida nosepoke försök (eller antalet felaktiga nosepoke), och T är antalet totala försök (antalet första nosepoke). - Köra SRT-Test 2 (uppmärksamhet) i 7 dagar. Beräkna korrekta (som anses vara en resultatindikator för uppmärksamhet) med följande formel:
där C är antalet rätt nosepoke försök (antal rätt andra nosepokes), T är antalet totala prövningar (antalet första nosepokes), O är antalet underlåtenhet försök (antal prov saknas en andra nosepoke) och P är antalet för tidigt nosepoke prövningar (eller antalet andra felaktiga nosepoke innan begränsad hold).
-
DD uppgift
Obs: Detta är ett enkelt val uppgift, där djuren välja att vänta med att dricka sötad vatten (SW, 0,5% sackarin eller 10% sackaros) med fördröjning eller att dricka vanligt vatten utan en fördröjning. Dörren på den valda sidan öppnas medan dörren på den motsatta sidan är stängd. De SW och vanligt vatten fördelas i höger eller vänster sidor av alla hörn identiskt. DD aktivitetsschemat inkluderar utbildning och test sessioner. I träningspasset åt mössen både SW och vatten utan en väntetid. Mössen kommer således att utveckla deras preferens till SW sida. I testet sessioner, väntetiden ökar dagligen (dvs., 0, 1, 2,..., 8 s). Förseningarna öka sekventiellt dagligen genom att göra flera moduler uppvisar olika fördröjning längd (0, 1, 2,..., 8 s) och ange ”länk” i områdena ”modul” och ”alternativ” (dag mönster). I denna uppgift fungerar alla fyra hörnen på samma sätt, 24 h per dag.- Förbereda filen experimentella för DD uppgift.
- Definiera sidan av SW (höger eller vänster sidor i alla hörnen).
- Ersätta vattenflaskor på definierade sidorna med flaskorna innehåller SW.
- Kör träningspasset för att träna djuren att dricka SW på definierade sidorna utan fördröjning för 5 – 7 dagar.
- Beräkna preferens-index, som definieras som förhållandet mellan slicka eller nosepoking vid sidan av SW till det totala antalet slickar eller nosepokes. Preferens indexet för den sida som innehåller SW beräknas således som:
eller
Det tidigare indexet fokuserar mer på action resultat, medan de sistnämnda fokuserar mer på val beteende.
Anmärkning: Se till att de flesta möss företrädesvis väljer sidorna med SW (> 90% för slicka nummer-baserat index, > 80% för de första nosepoke-baserat indexet) i slutet av utbildningen. - Därefter kör testsession DD uppgift för 9 dagar (fördröjning 0 till 8 s).
- Bedöma tidsförloppet för förändringen i inställningen mot sida med SW att utvärdera tvångsmässighet.
- SRT uppgifter
- Analys av data
- Öppna Arkiv med hjälp av ”Analyzer” och exportera alla data till Excel-filer. Om mängden data belopp är ganska stor, är det bättre att filtrera data (dvs., extrahera rumsliga uppgifter dricka session och extrahera den första och andra nosepokes för SRT uppgifter).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I vår tidigare studie upptäcktes de åldersberoende kognitiva bristerna i AD modeller av experimenten med automatiserade hem-bur övervakning system10. Deras resultat av AD modeller i PP var intakt i både unga vuxna och äldre patienter; prestanda i PPR var dock betydligt och successivt nedsatt (figur 6). Det är också viktigt att iaktta de allmänna beteende eller ångest i fasen anpassning eftersom sådana egenskaper kan påverka kognition15. AD modeller visade inte någon grov avvikelser i besök, nosepoke och slicka nummer i FA, NP och DSA sessioner. AD modeller kan alltså lägre flexibilitet.
För att bedöma exekutiva funktioner, spelades beteendemässiga prestanda i SRT och DD. Äldre AD modeller (NL-G-F) saknade noggrannhet i den sista etappen av SRT (SRT-Test 2) (figur 8). Förenklad tvångsmässighet observerades hos unga vuxna och gamla försökspersoner av NL-G-F möss (figur 9B, överst). Intressant, även om det var en ökning av tvångsmässighet av NL-F möss som var unga vuxna, ålderdom, blev det jämförbar med vildtyp möss (figur 9B, botten). Detta är ett exempel på övergående fenotypen av NL-F mutationen.
Figur 1: komponenter av automatiserade hem-bur övervakningssystemet. (A) Översikt över systemet. (B) platsen för kontakter. (C) hörnet kammare med operant dörr. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: exempel på gruppboende för studien. Vanligtvis används 12 möss per bur. Vid användning av fyra grupper (tre genetiska modeller och en vildtyp), anses tre möss per grupp per IntelliCage lämpliga. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: programvara för system. (A), ”Designer” används för att bygga experimentella filer. Vänster: Å djur lista innehåller information av djur och koncernen definitionerna. Höger: Modul utrymmet används för att definiera experimentell verksamhet. (B), den ”Controller” kan användas för att köra, övervaka och spela in experiment. Vänster: Statusen av en av buren arbetar med visar djurens besök, nosepoke, och slickar i de fyra hörnen. Höger: Larm windows visas om några problem hända. (C) The Analyzer kan användas för att hantera och exportera data förvärvas av registeransvarige. Vänster: Alla data är märkta med information om djur miljön inuti buren, och tid. Filtrering hjälper vidare analys i Excel eller andra analytiska programvara. Höger: Den tid-line av besöken (också nosepoke eller slickar) kan visas individuellt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Transponder implantation. (A) mikrochip av transponder (DataMars). (B) Side Visa av transponder implantation (transpondering). Undvik att orsaka skada på ryggmärgen. (C) ovanifrån av transponder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: tid-lina av experimenten för kognitiv bedömning med automatiserade hem-bur övervakningssystemet. Ett test batteri för kognitiv utvärdering utfördes två gånger (1: a set, 9 – 12 månader gammal; och 2 uppsättningar, 14 – 17 månader gammal) följt av experiment för att bedöma allmän aktivitet i slutet (3: e set [18 månader gamla]). Detta batteri utsågs för att bedöma flera kognitiva domäner (indikeras av färger – rött: allmän aktivitet; Blå: spatial inlärning och minne; Grön: verkställande funktionen), som har fördelar i validering och karakterisering av de förväntade kognitiva bristerna. FA: Fri anpassning; NPA: Nosepoke anpassning; DSA: Dricka Session anpassning; PP: Placera preferens; PPR: Placera preferens återföring; SRT: Serial reaktionstid (för impulsivitet och uppmärksamhet); PA: Placera skatteflykt. DD: Dröjsmål diskontering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: experimentell design och representativa resultat av PP och PPR uppgifter. (A) topp, en exempel modul design för PP eller PPR. Botten, rätt hörn ändras till motsatta sidan i PPR. (B) underskott i rumsliga återföring lärande i en annons modell (NL-G-F) framkallas vid äldre ålder. Data är uttryckta som medelvärde ± medelfelet för medelvärde (SEM). ∗p < 0,05; ∗∗p < 0,01. Färgerna anger grupper av jämförelse: blå: NL vs WT; Röd: NL-F vs WT; Grön: NL-G-F vs WT. Denna siffra har ändrats från referens10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: rättegång flödet av SRT uppgifter. Vänster: rättegång flödet av SRT (imp). Den första nosepoke definierar rätt sida och initierar en fördröjningstid (0,5 – 4,0 s), efter vilket gula lysdioder är påslagna. Dörren öppnas då. Höger: rättegång flödet av SRT (att). Den första nosepoke definierar rätt sida och initierar en fördröjningstid (2.0 s), efter vilket gula lysdioder är påslagna i kortare tid (0,2-1,0 s). Mössen är försedda med en tidsperiod under vilken nosepokes är tillåtna (begränsad håll, 2 s). Dörrar öppna (5 s) endast efter en rätt nosepoke, som är den första nosepoke under begränsad lastrummet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: experimentell design och representativa resultat av SRT uppgifter. (A) ett exempel modul design för SRT. (B) uppmärksamhet nedgång i en annons modell specifika för vid äldre ålder. Data är uttryckta som medelvärde ± SEM. ∗p < 0,05; ∗∗p < 0,01. Färgerna anger grupper av jämförelse: blå: NL vs WT; Röd: NL-F vs WT; Grön: NL-G-F vs WT. Denna siffra har ändrats från referens10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9: experimentell design och representativa resultat DD aktivitets. (A) ett exempel på modulen för DD uppgiften. (B) underlättas tvångsmässighet i AD modellen (NL-G-F) på både unga och gamla åldrar. Detta är ett exempel på fenotyp. Tvångsmässighet ökades däremot, övergående i en annan annons modell (NL-F). Data är uttryckta som medelvärde ± SEM. ∗p < 0,05; ∗∗p < 0,01. Färgerna anger grupper av jämförelse: blå: NL vs WT; Röd: NL-F vs WT; Grön: NL-G-F vs WT. Denna siffra har ändrats från tidigare arbete10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta dokument beskriver metoden som använder automatiserade hem-bur övervakningssystemet för långsiktiga kognitiva och beteendemässiga analyser i genetiskt modifierade AD modeller. Det mest kritiska steget är implantation av transpondern i lämpligt läge. Innan du utför implantation, säkerställa som utgångsdatum för transpondern inte har passerat. Den andra viktiga punkten är att kontrollera en fungerande systemet dagligen, särskilt som ett mindre problem kan därefter blivit ett mer allvarligt under studien (dvs., en staplade fallit ut transponder, dåliga elektriska anslutningar, dörr, etc .). För det tredje är det viktigt att kunna problem skjuta eftersom många problem kan uppstå i hela det experimentella schemat.
Detta paper infört ett baspaket av uppgifterna för kognitiv utvärdering. Dessa uppgifter har producerats genom att hänvisa till de konventionella beteendemässiga testerna, men de kan inte perfekt efterliknar konventionella testerna. SRT uppgifter Ange exempelvis inte val-läge. Fem val seriell val uppgift (5CSRTT), en modell av SRT uppgifter, bedrivs normalt i en kammare med 9, 5 eller 3 hål för nosepoke att mäta den noggrannhet16,17. Vårt team har tidigare försökt att genomföra en val version av SRT, men mössen misslyckades att lära regeln inom relativt lång tid (2 veckor eller mer). Användaren av detta system bör vara medveten om skillnaden och diskutera uppgifter noggrant.
En annan fråga är om begränsningar för upprepad mätning. Som nämnts i föregående studie18, är den första att de upprepa experiment helt enkelt inte kan jämföra effekten av ålder. Vi observerade att data från det andra PA-testet misslyckades att replikera försämring av minnet i AD modeller10. Prestanda för alla genotyp var mycket värre än det första PA-testet. Denna skillnad kan komma från åldersskillnad eller tillvänjning på aversivt stimulus (erfarenhet av tidigare PA uppgift). Praktiker bör tänka upprepa effekten och överväga ordningen på uppgifterna. För att övervinna tillvänjning av aversivt stimulus i det andra PA-testet, kan det vara bättre att använda starkare luft-puff stimulans eller lägga till vissa roman miljömässiga stimulus såsom olika typer av sängkläder eller ljud-19.
Olika forskare har utvecklat nya metoder och protokoll för automatiserad hem-bur övervakning studier20,21,22,23,24,25, 26, och stödjande programvara med öppen källkod bibliotek27. Därmed har möjligheten att systemet utökats. Slutligen, systemet ger automatiserad hög genomströmning beteendemässiga screening för långsiktiga analyser som används för att studera ett brett utbud av kognitiva funktioner, vilket är fördelaktigt i fenotypning och validera sjukdomsmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter förklarade.
Acknowledgments
Vi tackar Reiko Ando för hennes hjälp i fotografering material. Denna forskning stöddes av bidrag för förberedande forskning (JSPS KAKENHI licensnummer 16K 15196).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IntelliCage | TSE Systems | - | Parchased in 2011 or later |
| PC | Dell | Inspiron 580s | - |
| Display | Dell | SI75T-WL | - |
| ALPHA-dri | Shepherd Specialty Papers | - | Standard bedding |
| Aron Alpha (Krasy Glue) 2 g | Toagosei (Krasy Glue) | #04612 | Cyanoacrylates for gluing magnet and blak arm |
| Handheld Transponder Reader | BTS-ID | R-560 | Transponder reader, which reads both Trovan and DataMars |
| Transponder | DataMars | T-VA, T-VAS, or another series | Basic package of transponders and implanters |
| Diamond Grip Plus | Ansel Microflex | DGP-INT-M | Experimental glove |
| Isoflurane | Pfizer | 1119701G1092 | - |
| Vaporizer for small animals | DS Pharma Biomedical | SF-B01 | Facemask included |
| Neo-Medrol | Pfizer | 006472-001 | Eye ointment |
| Ethanol (70%) | - | - | - |
| Excel | Microsoft | 00202-51382-15524-AA928 | For data analysis |
References
- Bryan, K. J., Lee, H., Perry, G., Smith, M. A., Casadesus, G. Transgenic Mouse Models of Alzheimer's Disease: Behavioral Testing and Considerations. Methods of Behavior Analysis in Neuroscience. , CRC Press/Taylor & Francis. (2009).
- Nestler, E. J., Hyman, S. E. Animal models of neuropsychiatric disorders. Nature Neuroscience. 13 (10), 1161-1169 (2010).
- Crawley, J. N. Behavioral Phenotyping Strategies for Mutant Mice. Neuron. 57 (6), 809-818 (2008).
- Zarringhalam, K., Ka, M., et al. An open system for automatic home-cage behavioral analysis and its application to male and female mouse models of Huntington's disease. Behavioural Brain Research. 229 (1), 216-225 (2012).
- Prusiner, S. B., Jackson, W. S., King, O. D., Lindquist, S. The power of automated high-resolution behavior analysis revealed by its application to mouse models of Huntington's and prion diseases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (23), 13363-13383 (1998).
- Jhuang, H., Garrote, E., et al. Automated home-cage behavioural phenotyping of mice. Nature Communications. 1 (6), 1-9 (2010).
- Krackow, S., Vannoni, E., et al. Consistent behavioral phenotype differences between inbred mouse strains in the IntelliCage. Genes, brain, and behavior. 9 (7), 722-731 (2010).
- Nilsson, P., Saito, T., Saido, T. C. New mouse model of Alzheimer's. ACS chemical. 5 (7), 499-502 (2014).
- Saito, T., Matsuba, Y., et al. Single App knock-in mouse models of Alzheimer's disease. Nat Neurosci. 17 (5), 661-663 (2014).
- Masuda, A., Kobayashi, Y., Kogo, N., Saito, T., Saido, T. C., Itohara, S. Cognitive deficits in single App knock-in mouse models. Neurobiology of Learning and Memory. , (2016).
- Chan, R. C. K., Shum, D., Toulopoulou, T., Chen, E. Y. H. Assessment of executive functions: Review of instruments and identification of critical issues. Archives of Clinical Neuropsychology. 23 (2), 201-216 (2008).
- Jurado, M. B., Rosselli, M. The Elusive Nature of Executive Functions: A Review of our Current Understanding. Neuropsychology Review. 17 (3), 213-233 (2007).
- Diamond, A. Executive Functions. Annual Review of Psychology. 64 (1), 135-168 (2013).
- Kobayashi, Y., Sano, Y., et al. Genetic dissection of medial habenula-interpeduncular nucleus pathway function in mice. Frontiers in behavioral neuroscience. 7, 17 (2013).
- Robinson, O. J., Vytal, K., Cornwell, B. R., Grillon, C. The impact of anxiety upon cognition: perspectives from human threat of shock studies. Frontiers in human neuroscience. 7, 203 (2013).
- Robbins, T. The 5-choice serial reaction time task: behavioural pharmacology and functional neurochemistry. Psychopharmacology. (3-4), 362-380 (2002).
- Asinof, S. K., Paine, T. A. The 5-Choice Serial Reaction Time Task: A Task of Attention and Impulse Control for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (90), e51574 (2014).
- Codita, A., Gumucio, A., et al. Impaired behavior of female tg-ArcSwe APP mice in the IntelliCage: A longitudinal study. Behavioural brain research. 215 (1), 83-94 (2010).
- Blumstein, D. T. Habituation and sensitization: new thoughts about old ideas. Animal Behaviour. 120, 255-262 (2016).
- Endo, T., Maekawa, F., et al. Automated test of behavioral flexibility in mice using a behavioral sequencing task in IntelliCage. Behavioural brain research. 221 (1), 172-181 (2011).
- Voikar, V., Colacicco, G., Gruber, O., Vannoni, E., Lipp, H. -P., Wolfer, D. P. Conditioned response suppression in the IntelliCage: assessment of mouse strain differences and effects of hippocampal and striatal lesions on acquisition and retention of memory. Behavioural brain research. 213 (2), 304-312 (2010).
- Puścian, A., Łęski, S., Górkiewicz, T., Meyza, K., Lipp, H. -P., Knapska, E. A novel automated behavioral test battery assessing cognitive rigidity in two genetic mouse models of autism. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 140 (2014).
- Voikar, V., Colacicco, G., Gruber, O., Vannoni, E., Lipp, H. -P., Wolfer, D. P. Conditioned response suppression in the IntelliCage: assessment of mouse strain differences and effects of hippocampal and striatal lesions on acquisition and retention of memory. Behavioural brain research. 213 (2), 304-312 (2010).
- Harda, Z., Dzik, J. M., et al. Autophosphorylation of αCaMKII affects social interactions in mice. Genes, Brain and Behavior. , e12457 (2018).
- Aarts, E., Maroteaux, G., et al. The light spot test: Measuring anxiety in mice in an automated home-cage environment. Behavioural Brain Research. 294, 123-130 (2015).
- Safi, K., Neuhäusser-Wespy, F., et al. Mouse anxiety models and an example of an experimental setup using unconditioned avoidance in an automated system -IntelliCage. Cognition Brain & Behavior. 10 (4), 475-488 (2006).
- Dzik, J. M., Puścian, A., Mijakowska, Z., Radwanska, K., Łęski, S. PyMICE: APython library for analysis of IntelliCage data. Behavior Research Methods. 50 (2), 804-815 (2018).
