Summary
정렬 및의 인구 나이 일치의 청소에 대 한 방법론을 포함 하는 현재 프로토콜 꼬마 선 충. 그것은 연구에 대 한 선 충의 큰 실험적인 인구를 간단 하 고, 저렴 한, 그리고 효율적인 맞춤 도구를 사용 합니다.
Abstract
꼬마 선 충 (C. 선 충)은 기본 및 생물 의학 연구의 범위에 걸쳐 사용 되는 기초가 튼튼한 모델 유기 체. 선 충 연구 커뮤니티 내에서 C. 선 충의 큰, 나이 일치 하는 인구를 유지 하는 저렴 하 고 효과적인 방법에 대 한 필요가 있다. 여기, 우리 기계적으로 정렬 및 청소 C. 선 충에 대 한 방법론을 제시. 우리의 목표는 동물의 균일 한 크기와 실험에 그들의 사용에 대 한 생활 단계를 비용 효과적, 효율적, 빠르고 간단한 프로세스입니다. 이 도구, 꼬마 체 사용 사용자 뚜껑 시스템을 일반적인 원뿔 실험실 튜브에 스레드 및 선 충 C. 신체 크기에 따라 정렬 합니다. 우리 또한 그 꼬마 체 효과적으로 동물에서에서 전송 하나의 문화 접시는 빠른 정렬, 동기화, 및 건강의 표시를 영향을 주지 않고 청소에 대 한 다른 허용 보여 운동 성 포함 하 고 스트레스를 유도할 수 있는 진 기자입니다. 이 접근 가능 하 고 혁신적인 도구 C. 선 충 인구를 유지 하기 위한 빠르고, 효율, 비-스트레스 옵션입니다.
Introduction
선 충 벌레, 꼬마 선 충, 최고의 모델 생물 이다. 실험실에 있는 그들의 경작의 간단 하 고 제어 특성, 뿐만 아니라 그들의 전체 게놈 시퀀스1 이며 각 셀의 개발 운명2알려져 있다. 이러한 기능을 구현, C. 선 충 유전자 연구에 대 한 널리 사용 되는 모델 생물 이다. 그러나, 이러한 유익한 특성 함께 연구자에 대 한 몇 가지 과제를 올. 그들의 빠른 생성 시간 때문에 C. 선 충 인구 음식에서 신속 하 게 실행할 수 있습니다 또는 여러 세대와 인구 혼합 되 고 발달 단계를 한 번에 제시. 따라서, 고체 선 충 성장 매체 (NGM)에서 수행 하는 실험 연구자 세균 식량 고갈 시키고 새로운 애벌레 개발 하기 전에 물리적으로 신선한 번호판 동물 이동에 필요 합니다. 이 자식 세대와 혼합 되 고에서 실험적인 인구를 방지 하는 데 필요한 동물의 빈번한 전송 지루한 될 수 있습니다. 아직도, 실험 동물 및 확장된 시간 포인트 (예, 성인 기에 DNA 또는 RNA 추출)의 둘 다 다 수 필요합니다. 이 정확 하 게 동기화 된 인구를 유지 하 고 전송 하는 동물의 많은 수의 문제 화합물.
C. 선 충 NGM에서 양식 전송의 현재 방법 따기 또는 세척 동물 격판덮개; 화학적 치료 동물 (예를들면, DNA 복제 억제 물 fluorodeoxyuridine 또는 FUDR); 또는 cytometry 정렬 다 잘 판에 동물을 사용 하 여. 따기 개인 또는 여러 동물3,4를 수동으로 전송 하는 얇은 백 금 철사 또는 속눈썹로 만든 손 도구를 사용 하 여를 포함 한다. 이 방법은 정확한 하지만 기술 그리고 시간 요구 이며 동물의 많은 수를 포함 하는 연구에 대 한 제한. 또한 5 월을 따기 되며 물리적으로 손상 동물에 스트레스 잠재적으로 힘의 부 자연스럽 고 일관성 없는 금액에 개인을 쓰는 하 여. 세척 포함 버퍼 솔루션 문화 접시를 헹 구 고 새로운 문화 접시에는 동물 들과 함께 솔루션 유리 파스퇴르 피 펫을 통해 전송 됩니다. 이 방법은 신속 하 고 효율적인 하지만 여러 세대와 동물의 발달 단계는 대량에서 전송에 정확 하지 않다. FUDR, 같은 화학 치료는 차단 어떤 DNA 복제 그리고 이렇게, 생식 체 생산 및 계란 개발 통해 자손의 생산을 방지 하기 위해 자란 미디어에 녹아 수 있습니다. 동안 효과, 즉, 자사의 관리3이전 동물을 전송 하는 요구는 여전히 그리고 정상적인 발달 과정을 방해 하지로 발달 성숙 후이 메서드를 적용 해야 합니다. 이 메서드는 또한 여러 개의 셀룰러 신호 경로, 결과 동물에 눈에 띄는 효과 (예를 들어, 수명 연장 또는 변경 된 proteostasis) C. 선 충 사용5의 변형에 따라 영향 6,,78,,910. 교류 cytometry 방법을 자동으로 정렬 하 고 다른11한 멀티 잘 플레이트에서 개별 C. 선 충 을 전송. 이 방법은 매우 효과적이 고 효율적인 동안 흐름 cytometry 장비는 엄청나게 비싼 많은 연구원에 액세스할 수 있습니다. 동물을 전송 하는 대신 온도 등 그다지 15 fem-1, 온도 조정12살 균 되는 민감한 돌연변이 모델을 사용 하는 것입니다. 돌연변이 동물을 사용 하 여 하는 것이 어떤 상황에 유용 하지만 이러한 특정 변종 야생-타입 동물 보다 느리게 성장 하 고 그들은 에이징 또는 건강 한 벌레에 대 한 불 쌍 한 대표자로 봉사 하는 변경 된 게놈에 의존. 또한, 무 균을 유도 하기 위해 온도 변화에 대 한 의존도 또한 정적 환경의 부재에 발생 하 고 온도 변화 유전자 식13,14, 에 영향을 쉽게 표시 되었습니다 15. 연구 그룹 이전 크기16 C. 선 충 을 필터링 하는 메시의 사용을 설명 하는 기술을 출판. 그러나, 우리가 이전 작품 어떤 변화 같은 필터의 사용과 관련 된 전반적인 건강 결과에 대 한 테스트를 찾을 수 없었습니다.
따라서, 문화 판 사이의 동물의 많은 수를 전송 하기 위한 저렴 한 가격, 신속, 효율적이 고 정확한 방법에 대 한 C. 선 충 연구 커뮤니티 내에서 필요 하다. 향상 된, 액세스할 수 (라는 이름의 꼬마 체) 장비 및 그것의 제조 및 C. 선 충 연구 커뮤니티의 요구를 충족 하는 작업에 대 한 연결된 프로토콜의 조각을 개발 했습니다. 여기, 우리 꼬마 체 및 그 사용 방법의 디자인을 공유 하 고 우리는 그것의 사용 영향을 주지 않는 일반적인 건강 또는 표준 수동 채집 및 치료는 일반적으로 사용 되에 비교 될 때 어떤 스트레스 마커 입증 다 산 제한 화학 FUDR
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Protocol
1. 꼬마 체 건설 및 사용
-
건설 프로토콜
- 50 mL 원뿔 튜브 (그림 1A)에서 2 뚜껑을 얻을.
- (하단, 그림 1B에서 볼) 때 뚜껑의 안쪽 입술 안쪽 중심 영역을 제거 분 젠 버너와 뜨거운 금속 프로브 또는 납땜을 사용 하 여 또는 드릴 비트를 강화.
참고: 상해의 위험이 있기 때문에 블레이드 보다는 플라스틱 뚜껑을 열을 사용 하 여입니다. - 청소 하 고 잘라 가장자리를 모래 톱 곡선된 파일 또는 로타리 연마 도구 (예를 들어, Dremel) 표면. 그림 1C참조.
- 적절 한 지름 (그림 1D) monofilament 메시의 동그라미를 잘라. 이 위해, monofilament 나일론 메쉬 시트에 뚜껑을 추적 하 고 그려진 라인 안에 그냥 잘라.
- 접착제 (그림 1E) 플라스틱에 적용 되 면 두 개의 뚜껑의 접착을 강화 하는 뚜껑의 위쪽 표면에 홈/슬래시 잘라.
- 에탄올과 뚜껑을 깨끗 하 고 건조 그들을 보자.
- 외부 가장자리를 유지 하는 두 뚜껑의 위쪽 표면에 cyanoacrylate 접착제를 적용 합니다.
참고: 접착제 조금 먼 길을 간다. - 하나 붙어 뚜껑 (그림 1 층)에 표 1에 따라 monofilament 메쉬를 하다. 메쉬; 위에 거꾸로 두 번째 뚜껑을 배치 두 뚜껑 함께 그들의 꼭대기를가지고 있어야 합니다. 단단히 함께 (그림 1G)을 누릅니다. 메쉬 긴장 된 인지 확인 합니다.
참고: 안전 조치로, 뚜껑에는 메쉬를 사용 하 여 족집게. - 접착제의 초기 레이어는 건조 되 면 뚜껑 사이의 외부 간격 주위 cyanoacrylate 접착제의 링을 적용 합니다. 이 무결성을 추가 하 고 떨어져 또는 새 어떤 필 링 방지 관대 한 수 있습니다.
- 필터 monofilament 메시의 메시 기 공 크기와 레이블을 지정 합니다.
참고: 여기, 우리가 사용 하 여 두 개의 메시 기 공 크기-20 µ m, 50 µ m.
-
프로토콜을 사용 하 여
- 미리 체 젖은.
- 염 분 해결책, M9 등 플라스틱 [5 g의 NaCl, 나2HPO46 g, KH2포4, 1 초순 H2O, L 그리고 MgSO4 (1 M)의 1 mL의 3 세대]17, 방울 양식까지 체의 센터를 통해 압축, 및 필터 아래쪽 (그림 2A)의 중심에서 drips. 필요에 따라 모양 아래쪽에 보풀 지우기 (예, Kimwipe)을 적용 하거나 메시에 수 분 물방울을 확산.
- 50 mL 원뿔 튜브 위에 체를 놓습니다. '폐 튜브' 튜브 라벨 (그림 2B).
- 한 천 배지에서 C. 선 충 의 인구를 씻어.
- M9 버퍼와 접시 세척 하 고 한 번 (그림 2C)에 웜 포함 된 매체 monofilament 메쉬 1 mL의 위쪽에 배치. 메시의 중심에서 작동 해야 합니다. 모든 벌레는 접시에서 씻는 다.
참고: 일반적으로, 60 m m 플레이트 m 9의 3 mL 충분 하다. - Pipetting에 벌레의 수를 최소화 하기 위해 유리 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 접시에서와 메쉬 센터 (필요에 따라 반복)에 벌레를 이동.
- 상단에서 M9 버퍼와 필터를 씻어. 다시, 메시의 센터에서 운영 하 고 그 지역에서 모든 벌레를 헹 굴에 있는지 확인 하십시오. 모든 박테리아와 작은 벌레는 메시를 통해 전달 되도록 필요한 만큼 여러 번 씻는 다.
- M9 버퍼와 접시 세척 하 고 한 번 (그림 2C)에 웜 포함 된 매체 monofilament 메쉬 1 mL의 위쪽에 배치. 메시의 중심에서 작동 해야 합니다. 모든 벌레는 접시에서 씻는 다.
- 체에서 크기 일치 하는 동물을 수확.
- 단계의 새 컬렉션 튜브 (그림 2D)의 내부를 직면 하는 1.2.2.3 어른 벌레와 체의 상단에 새로운 50 mL 원뿔 튜브를 연결 합니다.
- 첫 번째 관 (폐기물 관)을 제거 하 고 신속 하 게 체 고을 드롭릿에 마이그레이션 하는 것을 막기 위해 새로운 튜브를 뒤집어 (그림 2E).
참고: 무 균 필요 하지 않은 경우 사용 하 여 보풀 지우기 (예, Kimwipe) 윅 유체를 튀기기 전에 메시의 하단에서. - 새로운 위쪽 (그림 2F)에서 새로운 50 mL 튜브에 M9와 메쉬 린스. 다시, 메쉬 센터에서 운영 하 고 메시의 밑면에 작은 물방울을 유지 합니다.
- 정착 하거나 부드럽게 아래로 회전 웜 허용 (예를 들어, < 16 x g) 약 1 분 (그림 2G).
- 에 벌레, 펠 릿에서 버퍼 솔루션을 이상적으로 발음 > 0.5 mL, 또는 펠 릿을 방해 하지 않고 최대한 많은 액체를 제거.
- 플라스틱 유리 NGM 접시에 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 웜 하 고 그들을 건조. 공간 여러 방울 밖으로 새로운 접시에 그래서 그들은 더 빠른 (그림 2 H)를 건조.
- 체를 청소.
- 에탄올과 역방향 삼 투 물으로 체를 부드럽게 하 고 철저 하 게 린스. 건조 하자.
- 무기한 미래의 사용에 대 한 깨끗 한 용기에 그것을 저장 합니다.
- 메시 "sag" 외관을 개발 했을 때 그것을 폐기.
- 미리 체 젖은.
2. 꼬마 체 정렬 방법의 유효성 검사
- 일반 유지 보수
- 모든 실험에 대 한 문화 표준 선 충 류 성장 미디어17 에 벌레 (NGM의 1 L 펩, 한 천, 3 g의 NaCl, 이중 증 류 물, 5 mg/mL 콜레스테롤, 1 M CaCl2 의 1 mL의 1 mL의 975 mL의 17 g의 2.5 g의 구성 1 mL의 1 M MgSO4, 1m KHPO4, 25 mL 및 100 mg/mL 스의 0.5 mL) 25 ° c.에
- 실험 치료 관리
- 3 치료 그룹을 비교: 선택, fluorodeoxyuridine (FUDR), 그리고 꼬마 체.
- FUDR 치료 그룹에 대 한 NGM 미디어 어떤 자손 생산을 방지 하기 위해 100 μ M의 최종 농도를 100mg/mL FUDR을 추가 하 고 매일 음식 소모를 피하기 위해 신선한 NGM 접시에 벌레를 전송.
- 선택 그룹에 대 한 선택 하 고 웜 백 금 루프를 사용 하 여 수동으로 전송 합니다.
- 꼬마 체 치료 그룹에 대 한 1.2 단계를 수행 하 고 플라스틱 NGM 접시에 벌레.
- 3 치료 그룹을 비교: 선택, fluorodeoxyuridine (FUDR), 그리고 꼬마 체.
- 꼬마 체 백분율 수확량
- C. 선 충분류에 얼마나 효과적인 체는 계량, 25 ° C (즉, 달걀 누워 후 48 h)에서 성년의 날 1 세 동기 N2 동물을 성장 하 고 신선한 NGM 접시에 그들을 수확 하 여 그들을 전송 (총 N = 50 또는 N = 트 레 당 100 동물 atment 그룹)입니다.
- 24 시간 복구의 새로운 NGM 번호판 인구 전송 후 다음 위의 꼬마 체와 프로토콜 (단계 1.2 참조) 하 고 성공적으로 전송 된 동물의 수를 계산.
- 100 (%)을 곱한 전송의 시작 부분에 시작 번호에 비해 전송 하는 동물의 수의 비로 백분율 수확량을 계산 합니다.
- Healthspan 분석 실험
참고: 일 2, 4, 6, 및 8 나이 동기화 N2 동물 25 ° c.에 유지에 대 한 성인 기의 운동 성 클래스, 인 두 펌프 속도 및 모두는 앞쪽 및 후부 부드러운 터치 응답의 healthspan 매개 변수를 점수- 추적 운동
- 클래스를 기반으로 시스템 (A, B 및 C 클래스)에 따라 운동 성 점수를 할당 Herndon 외 의 방법에 따라 18. 통계 분석 소프트웨어에는 서 수 물류 통계 모델을 사용 하 여 세 가지 실험 그룹의 효과 비교.
참고: 클래스 A 개인 일반, 정현파 패턴에서 자연스럽 게 이동합니다. 클래스 B 개인 현저 하 게 비 정현파 움직임에 이동 하 고 장려 운동 괴롭히는 필요할 수 있습니다. 클래스 C 개인 괴롭히는에 그들의 머리 또는 꼬리를 이동 하지만 agar 가로질러 이동할 수 없습니다.
- 클래스를 기반으로 시스템 (A, B 및 C 클래스)에 따라 운동 성 점수를 할당 Herndon 외 의 방법에 따라 18. 통계 분석 소프트웨어에는 서 수 물류 통계 모델을 사용 하 여 세 가지 실험 그룹의 효과 비교.
- 인 두 펌프 속도
- 1 분에 대 한 최종 배율 X 600 stereomicroscope에서 시각적으로 동물의 터미널 인 두 전구의 분쇄기 움직임을 계산 합니다.
- Α와 일방통행 ANOVA와 통계 분석 = 0.05, Bonferroni 후 테스트 α = 0.05.
- 터치 응답
- 부드러운 터치 응답을 기록 하 고 3 개의 치료 그룹 사이 비교. Calixto 연구진이 설명 하는 방법에 따라 분석 실험을 수행 19.
- 레코드는 앞쪽 및 후부 부드럽게 쓰 다듬어 속눈썹 선택 수직 꼬리 또는 동물의 머리 (5 x, 번갈아가 며 머리와 꼬리) 하 여 응답을 터치 합니다.
- 앞쪽 및 후부 응답에 대 한 0 ~ 5의 규모에 1 점으로 선의 반대 방향으로 움직임을 점수.
- Α와 일방통행 ANOVA와 통계 분석 = 0.05, Bonferroni 후 테스트 α = 0.05.
- 추적 운동
- 통치 분석 결과
- 25 ° c.에 성년의 날 2에 나이 동기 N2 동물 복제에 꼬마 체의 영향의 사용을 확인 하려면 성장
- 달걀 누워 후 60 h 플래티넘 선택 또는 꼬마 체 새로운 NGM 번호판 동물을 전송 하 고 그들 복구에 4 h (20-30 분에 대 한 체질된 접시 건조).
- 복구, 개별적으로 접시 속눈썹 통해 동물 NGM 번호판 선택 후 그들에 게 산란, 24 h 하 고 동물을 제거 합니다. 또 다른 24 h에 대 한 25 ° C에서 표준 상태 하에서 개발을 각 접시에 자손을 허용 합니다.
참고: 속눈썹 선택은 인간의 속눈썹 매니큐어와 파스퇴르 피 펫의 끝을 확보 하 고 에탄올으로 소독. - 실행 가능한 F1 세대 개인의 수를 계산 합니다. Α와 T-검정을 사용 하 여 통계 분석을 수행 = 0.05.
참고: 가능한 자손 계란 성공적으로 해치 고 일반 애벌레 사이클을 통해 그들의 개발을 시작 하는 것으로 간주 됩니다.
- 형광 기자 스트레스 응답 분석 실험
- 스트레스의 잠재적인 마커를 감지 하 세 가지 일반적으로 사용 되는 형광 기자 분석 수행: 스트레인 [TJ356-zIs356 (pDAF-16::DAF-16-GFP; rol-6)]20; 세포의 핵에 DAF 16::GFP 전 hsp-16.2 식 [TJ375-gpIs1 (hsp-16.2p::GFP)]21; 그리고 잔디-3 식 [CF1553-muIs84([pAD76]sod-3p::GFP+rol-6[su1006])]22.
- 각 분석 결과 대 한 문화 20 ° C에서 3 개의 치료 그룹에서 나이 동기 동물 및 성년의 날 3에 그들을 검토: 부정적인 제어를 사용 하 여 (매일, 수동으로 백 금 선택과 동물의 그룹 전송), (매일에 긍정적인 통제 백 금 선택 플러스 설립된 스트레스와 수동으로 동물의 그룹 전송), 그리고 꼬마 체 (체 동물을 통과 하 고 이미징 직전 NGM에 30 분 동안 복구 하도록 허용).
- DAF 16::GFP 분석 결과에서 열 충격을 30 분 동안 37 ° C에서 긍정적인 제어 동물20이미징 하기 전에. Hsp-16.2 분석 결과 대 한 열 충격 90 분,21이미징 하기 전에 20 h 긍정적인 제어 동물. Sod-3 분석 결과 대 한 이미징22전에 4 h 100 m m 파라콰트와 긍정적인 제어 동물을 취급 합니다.
- 속눈썹 선택으로 즉시 벌레를 수확 하 고 벌레를 무력화 하는 36% poloxamer 407 계면 활성 솔루션의 1 μ와 coverslip에 탑재.
- 다른 coverslip로 탑재 된 웜 샌드위치 표준 유리 현미경 슬라이드 및 이미지를 두 개의 coverslips 벌레는 거꾸로 형광 현미경 (80 X의 전반적인 확대)에 8 배 확대와 지속적인 노출 FITC 필터를 사용 하 여 탑재 합니다.
- DAF 16::GFP 분석 결과에서 세 그룹 간의 차이 감지, DAF 16::GFP 기자 (핵 기자 기자 cytosol, 그리고 중간에 있는 cytosolic 핵을 translocated 경우의 위치에 따라 동물 분류 기자 핵 그리고 cytosol에 위치한).
- 통계 분석 소프트웨어에는 서 수 물류 통계 모델을 사용 하 여 결과 비교 합니다. Hsp-16.2 및 잔디-3 식 분석 일방통행 ANOVA를 사용 하 여 α와 = 0.05와 Tukey의 임시 게시물 테스트 α = 0.05 머리 영역의 총 형광 비교 하.
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Representative Results
꼬마 체 이루어져 있다 2 나사 모자, 짠된 나일론 monofilament 메쉬 간단한 세척 기술을 사용 하 여 생물의 라이브 인구를 추출 하는 데 사용, 원하는 개발 시대의 몸 직경 보다 작은 영역을 확보. 그것은 표준 원뿔 관에 부착 하 고 메쉬 스크린을 사용 하 여 기계적으로 동물 몸 직경, 튜브에 추가 유지 관리 및 실험 (예를 들어, 전송 또는 유전 수확)에 대 한 준비가 원하는 동물을 떠나 정렬. 꼬마 체 세척 부드러운 매뉴얼은 빠른, 60-100 mm 접시 당 약 5 분 및 유기 체는 망에서 쉽게 복구할.
비율에 따라 동물의 항복 꼬마 체 사용
꼬마 체의 백분율 수확량을 설정 하기 위해 장치는 20 μ m와 50 μ m 기 공 크기 메시 성인 동물에 시험 되었다. A 의미의 양보는 > 90% 성공 동물 전송 모두 메쉬 크기 테스트 (표 1)에 대 한 달성 했다.
Monofilament 간격 동물의 다른 생활 단계를 구분 하는 데 사용할 수 있습니다 다양 한 크기와 메쉬. 메쉬 20 μ m 간격으로 떨어져 배아 및 후자 유지 4 애벌레 단계 보다 작은 애벌레 단계 개발에 적합 하다 (L4; 32 μ m의 평균 신체 직경) 및 생활 후기, 메쉬 50 μ m 간격으로 모든 수 있도록 하는 동안에 어떤 동물 든 지 다른 생활 씻 겨 (표 2)를 (70 μ m의 평균 신체 직경)와 성인에서 옆으로 단계.
꼬마 체 사용 healthspan 통계에 영향을 주지 않습니다
운동 성: C. 선 충 에서 정상적인 정현파 운동 (즉, 운동 성) 나이18 와 하락 이며 전반적인 건강의 감 적. 있 었 하는지 확인 꼬마 체 좌우 운동 성, 운동 성 점수를 비교 선택, FUDR, 그리고 꼬마 체 치료 그룹 성인 기의 2, 4, 6, 및 8 일에 합니다. 모든 그룹에 걸쳐 모든 동물 (n = 10/그룹) 성인 기에 걸쳐 여러 연령대에서 정상적이 고 자발적인 운동 패턴 (클래스 A) 전시 (일 2, 4, 6, 및 8 성인; p > 0.05 모든 일, 그림 3에 여러 비교).
인 두 펌프 속도: C. 선 충 인 두 근육의 능력을 펌프 나 이와 함께 감소 이며 healthspan23의 다른 바이오 마커. 동물 인 두 펌프 속도, 선택, FUDR, 그리고 꼬마 꼬마 체 영향을 경우 확인 하려면 체 치료 그룹 일 2, 4, 6, 및 8 성인에 비교 했다 (n = 8 ~ 10 그룹 당). 일 6에 따기 받았다 동물과 FUDR 메서드 사이 상당한 차이가 있었다 (p < 0.001) 및 8 (p < 0.001). 또한, 6 일에 체 및 FUDR 그룹 사이 상당한 차이가 있었다 (p < 0.001) 및 성년의 날 8 (p < 0.001). 그러나, 어떤 날에 대 한 선택 및 꼬마 체 그룹 간의 통계적으로 유의 한 차이가 없었다 (p > 0.05, 그림 4), 체 healthspan의이 측정을 영향 하지 않습니다 나타내는.
부드러운 터치 응답: 기계적 자극에 응답은 에이징 또는 일반 건강24,25; 평가 하는 생리 적 마커 따라서, 다른 전송 메서드는 앞쪽 및 후부 부드러운 터치 응답에 미치는 영향 테스트 되었습니다. 선택, FUDR, 그리고 꼬마 사이 통계적으로 유의 한 차이가 없었다 체 치료 그룹 (n = 8/그룹), anteriorly 또는 뒤로, 테스트의 모든 날에 대 한 (p > 0.4 모든 비교; 그림 5A 그리고 5B).
통치: 설정 여부 꼬마 체 영향 C. 선 충, 성인 기의 3 일 동안 24 시간 기간에서 개별 자손에 의해 생산 가능한 자손의 금액을 계산 되었고 비교 (n = 그룹 당 20 ~ 22). 꼬마 체를 사용 하 여 크게 선택 치료 그룹에 비해 생산 하는 자손의 수에 영향 하지 않았다 (p = 0.61, 그림 6).
분석 실험 분자 기자
DAF 16 핵 전 좌: C. 선 충, 녹음 방송 요인 DAF-16의 활성화는 스트레스 증가 저항26연결 됩니다. DAF-16의 핵 지 방화 유전자 변형 선 충 스트레인 DAF-16 녹색 형광 단백질 (DAF-16::GFP)20융합을 표현 하는 TJ356에 시험 되었다. 정상적인 성장 조건 하에서 DAF 16::GFP는 cytosol에서 주로 지역화 됩니다 하지만 다양 한 스트레스 (예를 들어, 열 스트레스)에서 핵20으로 translocated 급속 하 게 이다. DAF-16 전 좌에 꼬마 체와 정렬의 영향을 테스트 하려면 DAF 16::GFP 있어 긍정적인 통제 그룹 (열 스트레스)에 일치 하는 나이 하루-5 성인에 비교 했다 부정적인 제어 그룹 (수동 전송 선택 통해), 그리고 꼬마 체 치료 그룹 (n = 10/그룹). 꼬마 체와 전송 DAF-16::GFP의 핵 전 좌에는 영향을 미치지 않았다 고 부정적인 제어 동물에 유사한 표현 형을 보였다 (p > 0.05, 그림 7).
hsp-16.2 기자: HSP 16.2 같은 작은 열 충격 단백질은 스트레스 반응의 biomarkers 그리고 그들은 높은 열 충격 또는 산화 스트레스 에이전트21,27에 노출 하는 동안 표시 됩니다. TJ375 변형 정상 조건21에서 비활성화 되는 hsp 16.2 발기인 융합 GFP 취재 원 유전자가 있다. 그러나, 열 충격에 노출, HSP 16.2 단백질 발현을 유도 하 고 동물 표시 GFP 식21의 높은 수준의 키를 누릅니다. 인 두 지역에서 꼬마 체 HSP 16.2 중재 하는 스트레스 반응에의 참여, 형광 밀도 테스트 하려면 (n = 10 동물/그룹) 나이 일치 하는 동물의 긍정적인 통제 그룹 (열 사이 하루 5 성인에 비교 했다 스트레스), 부정 (따기), 그룹 및 꼬마 체 치료 그룹을 제어 합니다. 꼬마 체와 전송에 크게 HSP의 식을 유도 하지 않았다-16.2::GFP (hsp-16.2::gfp) 부정적인 제어에 비해 (p > 0.05, 그림 8).
sod-3 기자: C. 선 충, 산화 유전자는 superoxide dismutase 3 (잔디-3)에 대 한 코드에서는 위로 산화 스트레스28중입니다. 녹색 형광 단백질 (GFP)를 표현 하는 선 충 C. 스트레인 CF1553-표시 잔디 3 발기인, 그 식 파라콰트5같은 산화 스트레스에 의해 유발 됩니다. 꼬마 체 정렬 C. 선 충에서 항 산화 반응에의 참여를 테스트 하려면 일치 하는 나이 하루-5 성인 머리 지역에 형광 밀도 긍정적인 통제 인구 (100 μ M 파라콰트 사이 비교 되었다 치료), 부정적인 컨트롤 인구 (수동 따기), 그리고는 꼬마 체 전송 인구. 꼬마 체와 전송 크게 떼-3::gfp 부정적인 제어에 비해 표현의 유도 하지 않았다 (p > 0.05, 그림 9).
그림 1: 꼬마 체 건설. 도구의 '자작' 제조의 진행이 표시 됩니다. 이러한 패널 표시 (A) 두 50 mL 원뿔 튜브 캡 (B)의 센터를 제거 (C) 부드럽게 가장자리를 잘라 고 (D - F) C. 선 충의 원하는 생활 단계에 해당 하는 monofilament 메쉬 장착 (자세한 내용은 프로토콜 참조). (G) 완성 된 체도 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 단계별 이미지 표현의 꼬마 체 사용. (A) 체 미리 M9 솔루션의 방울으로 젖은 이며 (B) 50 mL 원뿔 튜브 위에 맞는. (C) 1 mL M9 벌레 솔루션 체, (D) 50 mL 원뿔 튜브는 튜브, 및 (E)와 새로 연결 된 체의 내부를 직면 하는 벌레 체 상단에 배치의 윗면에 pipetted의 위 관은 신속 하 게 뒤집힌된 o 버전 (G) 체는 M9 씻어 서 새로운 50 mL에 원하는 동물을 운반 튜브 및 벌레 튜브의 아래쪽에 중력에 의해 정착 허용 됩니다. (H) 벌레 pipetted 및 신선한 NGM 접시에 방울으로 배치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 꼬마 체 수명에 걸쳐 운동 영향 하지 않았다. 이 그림 2, 4, 6, 및 8, FUDR, 선택에 대 한 성인 기의 일에 동물의 운동 성 클래스 분포와 꼬마 체 치료 그룹. 클래스 A 동물 이동 일반적으로 그리고 자발적으로, 클래스 B 동물 비정상적으로 이동 하 고 괴롭히는, 그리고 클래스 C 동물 하지 못했습니다 이동 필요 할 수도 있습니다. 꼬마 체, 선택 및 FUDR 그룹 사이 차이가 없었다 (p > 0.05). 3 복제 (n = 10 동물 치료 접시 당) 실시 하 고 서 수 로지스틱 모델 분석 했다. 클래스 B 동물입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 꼬마 체 사용 않았다 영향 수명에 걸쳐 인 두 펌핑. 이 그림의 인 두 펌프 속도, FUDR, 선택한 꼬마 체 치료 그룹, 2, 4, 6, 및 성인 기의 8 날에 비해. 별표 표시, 선택 사이의 의미 체, 및 일에 대 한 FUDR 치료 그룹 지정 (* * * p < 0.05). 꼬마 체 및 선택 그룹 (p > 0.05) 사이 차이가 없었다. 두 복제 (N = 10 동물 치료 접시 당) 실시 되었고 일방통행 ANOVA와 Bonferroni 테스트 후 분석. 막대는 평균 ±를 표준 오차의 의미를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 꼬마 체 사용 수명에 걸쳐 앞쪽 터치 응답을 영향 하지 않았다. 이러한 패널 표시 (A)는 이전 하 고 (B) 선택, FUDR, 그리고 꼬마 의 후부 터치 응답 수 체 치료 그룹 2, 4, 6, 및 8 성년의 날에 비해. 두 복제 n 실시 했다 = 각 치료 그룹에 대 한 10 하 고 일방통행 ANOVA와 Bonferroni 테스트 후 비교 (p = 0.4이 고 p = 0.9 앞쪽 및 후부, 각각). 막대는 평균 ±를 표준 오차의 의미를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 꼬마 체 않았다 하지 영향을 가능한 자손 양의 성년의 날 3. 부모 동물에 대 한 성인 기의 3 일에 걸친이 그림 3 일 성인의 가능한 자손 24 h 낳는 기간 후. 막대는 평균 ±를 표준 오차의 의미를 나타냅니다. N = 20-22 동물 치료 그룹 당 두 개 이상의 별도 생물 복제에서. 치료 그룹은 t와 비교-테스트 (p > 0.05). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: 꼬마 체 미치지 않았다 DAF 16::GFP의 핵 전 좌. 이러한 패널 (A) 열 충격 그룹 (긍정적인 통제), (B) 선택 그룹 (부정적인 제어), 및 (C) 꼬마 체 치료 그룹의 DAF-16 전 좌의 대표 이미지를 표시합니다. (D) 긍정적인 통제 그룹에 동물 표시 DAF 16 핵 전 좌의 활성화. 꼬마 체 핵 전 좌를 유도 하지 않았다 고 부정적인 제어 그룹에서 동물에 유사한 cytosolic 융해 단백질을 표시. N = 3 개 이상 별도 생물 복제에서 치료 그룹 당 10 동물. 치료 그룹 일방통행 ANOVA와 Tukey의 임시 게시물 테스트 비교 되었다. 눈금 막대 100 μ m =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8: 꼬마 체 미치지 않았다 hsp16.2::gfp의 식. 열 충격 그룹 (긍정적인 통제), 선택 그룹 (부정적인 제어), 그리고 꼬마 체 치료 그룹의 (임의의 형광 단위로) HSP 16.2 식 비교 됩니다. 별표 표시는 크게 다른 치료 그룹에서 다른 긍정적인 컨트롤 그룹에 대 한 hsp16.2::gfp의 높은 식 (* * * p < 0.05). 꼬마 체 hsp16.2::gfp 식에는 영향을 미치지 않았다 고 형광 강도 동물 비슷한 부정적인 제어 그룹에 표시 (p > 0.05). 3 복제 n 실시 했다 = 각 치료 그룹에 대 한 10 하 고 일방통행 ANOVA와 Tukey의 임시 게시물 테스트와 비교. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 9: 꼬마 체 미치지 않았다 잔디 3::gfp의 식. 100 μ M 파라콰트 그룹 (긍정적인 통제), 선택 그룹 (부정적인 제어), 그리고 꼬마 체 치료 그룹의 (임의의 형광 단위로) 잔디-3 식 표시 됩니다. 별표 표시 잔디-다른 그룹에서 현저 하 게 달랐다는 긍정적인 컨트롤 그룹에 대 한 3::gfp의 높은 식 (* * * p < 0.05). 꼬마 체 잔디 3::gfp 식에는 영향을 미치지 않았다 고 형광 강도 동물에 유사한 부정적인 제어 그룹에 표시 (p > 0.05). 3 복제 n 실시 했다 = 각 치료 그룹에 대 한 10 하 고 일방통행 ANOVA와 Tukey의 임시 게시물 테스트와 비교. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 메쉬 크기 | N = 50 | N = 100 |
| 20 μ m | 95.33% | |
| 50 μ m | 99.00% | 93.33% |
표 1: 메쉬 크기의 백분율 수확량. 이 표에서 결과 n 테스트는 20 μ m 장치 = 3 복제와 n 테스트 50 μ m 장치 50 성인 2 복제에 대 한 50 성인 =, N = 3 복제에 대 한 100.
| 메쉬 크기 | 발달 단계 | 본체 지름 |
| 20 μ m | 애벌레 단계 4 | ~ 35 μ m |
| 50 μ m | 1 일 성인 | ~ 70 μ m |
표 2: 평균 몸 직경. 이 테이블 평균 몸 직경 3 측정 각 측정된 생활 단계에서 동일 하 게 15 동물에 대 한 각 웜 분산 평균 하 여 인수를 표시 합니다.
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Discussion
여기, 우리 디자인 및 정렬 및 선 충 C.유지를 위한 도구로 서, 효과적인 꼬마 체의 사용을 소개 했다. 이 도구는 수동으로 개별 동물, 인구, 화학 치료 (예를 들어, FUDR), 그리고 더 비싼 방법 분리 동물의 세척을 따기 위해 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, 꼬마 체 효율적이 고 신속 하 게 (20 분 미만) 동물 (표 2)의 큰 혼합된 인구에서 자손을 정렬. 또한, 도구를 사용 하 여 효과가 없습니다 감지 독성 동물 healthspan (그림 3, 그림 4, 그림 5, 그림 6)에, 잘 설명된 유전 스트레스 기자 (그림 7, 그림 8 을 유도 하지 않습니다. 그림 9), 문화 접시 또는 어떤 분자 분석 결과를 적용 된 치료를 그 후에 영향을 미칠 수 있는 외국 화학 물질의 양을 감소 시킨다. 사용의 용이성은 상당한 이점을; 그들의 교육의 모든 단계에서 연구원 (그림 1 및 그림 2; 그것을 사용 하 여 훈련 될 수 있다 프로토콜)입니다.
제조 체 (예, 펫, 버퍼)의 사용에 필요한 자료는 쉽게 사용할 수 있는 표준 연구소; 따라서, 깨진, 꼬마 체 교체 또는 수리 하는 비용이 되지 않습니다. 자체 생성 된 성격의 꼬마 체 다양 한 도구가 될 수 있습니다: 다른 C. 선 충 에 대 한 적절 한 메쉬 크기와 건설 수 있습니다 발달 단계와 고기. 꼬마 체 분석 실험을 실시 하는 다른 선 충 종 또는 제조 시 사용 되는 적절 한 매쉬의 크기를 제공 하는 작은 유기 체를 분리 하는 경우에 사용할 수 있습니다.
혜택이이 도구 제공 합니다 C. 선 충 인구 유지 보수에 대 한 체 다른 실험 응용 프로그램에서 사용 하기 전에 동물을 청소 하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어 마이크로 C. 선 충 을 개발 연구 칩 사용 및 청소의 문제가 온다. 동물에 부착 된 세균의 금액에 따라 특별 한 예방 조치를 미세 칩, 그것을 사용할 수 없게29렌더링을 방해할 주의가 필요 합니다. 종종 C. 선 충 은 미세 칩에 전송 됩니다 때 세균 잔디밭에서 잔류물 그들과 함께 가져입니다. 이 찌 꺼이 기 수 고는 미세 채널, 칩 고장는 다음 청소 또는 교체를 방해할지 않습니다. 이 프로토콜에서 장치 구성 뿐만 아니라 마이크로, 뿐만 아니라 청소 미세 장치에 그들의 삽입 전에 동물에 대 한 동기화 된 동물을 수확 하는 방법을 제공 합니다. 파편과 동물, 수집 하는 때 채택 세균 잔류물을 제거 하 여 미세 채널 따라서 개별 칩의 작동 생활 하 고 그들과 함께 지휘 되는 연구의 후속 처리량을 증가 고장, 적은 경향이 있다.
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Disclosures
저자는 공개 없다. 저자는 연구 잠재적인 상충으로 해석 될 수 있는 어떤 상업적 또는 금융 관계의 부재에서 실시 되었다 선언 합니다.
Acknowledgments
저자는 그녀의 초기 공헌 연구 설계에 대 한 헤더 Currey 박사 Swarup Mitra 원고 그의 중요 한 검토를 위해 감사 하 고 싶습니다. 우리는 또한 마이클 B. 해리스 박사 의견, 개선,이 방법론의 시범 생산 지원을 감사 하 고 싶습니다. 변종 꼬마 유전학 센터, 연구 인프라 프로그램 (P40 OD010440)의 NIH 사무실에 의해 자금에 의해 제공 되었다. 이 간행물에서 보고 된 연구에 의해 국립 연구소의 일반 의료 과학 수상 번호 UL1GM118991, TL4GM118992, 또는 RL5GM118990 국립 보건원의와 제도적 개발 상 수상 (IDeA는)에 의해 지원 되었다 국립 연구소의 종합 의료 과학 보조금 번호 5P20GM103395-15 국립 보건원의. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다. UA는 AA/EO 고용주 및 교육 기관 및 개인에 대 한 불법 차별 금지: www.alaska.edu/titleIXcompliance/nondiscrimination.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Safety glasses | Uline | S-21076 | |
| Protective heat resistant glove | Grainger | Item # 3AT17 Mfr. Model # 3AT17 Catalog Page # 1703 | |
| 50 mL conical tube | Falcon | 14-432-22 | |
| Synthetic Nylon mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd |
NTX20 and NTX50 | |
| Cyanoacrylate glue | Scotch Super Glue Liquid | SAD114 | |
| Pliers | Vampliers | VMPVT-001-8 | |
| Dremmel tool with circular file | Lowe's | Item # 525945 Model # 100-LG | |
| FUDR | Sigma | F0503 | |
| M9 chemicals ( NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4) | Sigma | S7653, RES20908-A7, 1551139, M7506 | |
| NGM plate chemicals (Bactopeptone, Agar, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2,Cholesterol, Streptomycin) | BD Biosciences (bactopeptone) , Lab express (agar), Sigma ( rest) | BD bioscience 211677, Lab Express 1001, Sigma 1551139, 1551128, C1016, C8667, S6501 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443 | |
| Paraquat dichloride hydrate | Sigma | 36541 | |
| Inverted fluorescence microscope | Olympus | FSX100 |
References
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