Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Caenorhabditis Sil: Et Low-tech Instrument og metodikk for sortering liten Multicellular organismer

doi: 10.3791/58014 Published: July 4, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Gjeldende protokollen inneholder en metode for sortering og rengjøring av alder-matchet bestander av Caenorhabditis elegans. Den bruker en enkel, billig og effektiv skreddersydde verktøy for å få store eksperimentelle innbyggere nematoder for forskning.

Abstract

Caenorhabditis elegans (C. elegans) er en veletablert modell organisme brukes på tvers av en rekke grunnleggende og biomedisinsk forskning. I Rundormer forskning samfunnet er det behov for en rimelig og effektiv måte å opprettholde store, alder-matchet bestander C.elegans. Her presenterer vi en metodikk for mekanisk sortering og rengjøring C. elegans. Vårt mål er å gi en kostnadseffektiv, effektiv, rask og enkel prosess for å få dyr uniform størrelser og livsstadier bruke eksperimenter. Dette verktøyet, Caenorhabditis silen, bruker en spesialbygd lokket system som tråder på vanlige koniske lab rør og sorterer C. elegans basert på kroppsstørrelse. Vi viser også at Caenorhabditis silen effektivt overfører dyr fra en kultur plate til en annen slik at for rask sortering, synkronisering og rengjøring uten innvirkning indikatorer for helse, inkludert motilitet og stress-induserbart Gene journalister. Tilgjengelig og nyskapende verktøyet er en rask, effektiv og ikke-stressende alternativ for å opprettholde C. elegans populasjoner.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Rundormer ormen Caenorhabditis elegans, er en fremste modell organisme. I tillegg til enkel og kontrollert innholdet i sin dyrking i laboratoriet, deres hele genom er sekvensert1 og utviklingsmessige skjebnen til hver celle er kjent2. Disse funksjonene er C. elegans en mye brukt modell organisme for genetiske studier. Men kommer sammen med disse gunstige egenskaper noen utfordringer for forskere. På grunn av deres raske generasjonstid, C. elegans befolkninger kan raskt gå tom for mat og/eller bli blandet populasjoner med flere generasjoner og utviklingsstadier presentere samtidig. Dermed krever eksperimenter utført på solid Rundormer vekst medier (NGM) forskere å fysisk flytte dyr til frisk plater før bakteriell matkilde reduserer og nye larvene. Dette kan være kjedelig som en hyppig overføring av dyrene er krevde å forhindre eksperimentelle befolkningen fra blir blandet med avkom generasjoner. Likevel, noen eksperimenter krever både stort antall dyr og utvidet tidspunkt (f.eks, DNA eller RNA utvinning i voksen alder). Dette forbindelser utfordringer nøyaktig vedlikeholde synkroniserte innbyggere og overføre store antall dyr.

Gjeldende metoder av overfører C. elegans kultivert på NGM plukke eller vaske dyrene fra platen til plate; kjemisk behandling av dyr (f.eksmed DNA replikering hemmer fluorodeoxyuridine eller FUDR); eller bruke flowcytometri til å sortere dyrene i flere bra plater. Plukking innebærer bruk av en hånd verktøy, laget med en tynn platina wire eller en øyenvippe, manuelt overføre enkelte eller flere dyr3,4. Denne metoden er korrekt men krever både dyktighet og tid og er en begrensning for studier som involverer mange dyr. Plukke kan også være fysisk skade og stressende til dyrene ved å utsette potensielt individer til unaturlig og inkonsekvent mengder forstyrrelser og kraft. Vask innebærer skylling en kultur parabol med en buffer løsning og overføre løsningen med dyr via glass Pasteur Pipetter til en ny kultur plate. Denne metoden er rask og effektiv, men er ikke nøyaktig som flere generasjoner og utviklingsstadier av dyr overføres i bulk. Kjemiske behandlinger, for eksempel FUDR, kan forsvinne i culturing media å forhindre produksjon av avkom gjennom blokkerer noen utryddelse, og dermed Kjønnscelle produksjon og egg utvikling. Mens effektive, denne metoden må brukes etter utviklingsmessige modning som ikke forstyrre vanlige utviklingsprosesser, og dette betyr at det er fortsatt et krav å overføre dyrene før sin administrasjon3. Denne metoden også påvirker flere mobilnettet signalnettverk trasé, som resulterer i merkbare effekter på dyrene som de alder (f.eks, en livslengden utvidelse eller en forandret proteostasis) avhengig av belastningen av C. elegans brukt5, 6,7,8,9,10. Flow cytometri metoder automatisk sortere og overføre personlige C. elegans fra en multi godt plate til en11. Selv om denne metoden er svært effektiv og effektiv, er flow cytometri utstyr uoverkommelig dyrt og utilgjengelig for mange forskere. Et alternativ til overføring av dyr er å bruke mutant modeller som er ømfintlig, som fer-15 og fem-1, som blir steril med temperatur justering12. Mens bruke mutant dyr er nyttig i enkelte situasjoner, disse spesifikke stammer vokser saktere enn vill-type dyr og de er avhengige av en endret Genova, som dårlig representanter for aldring eller sunn. I tillegg avhengigheten av en temperatur skift å indusere sterilitet resulterer også i fravær av et statisk miljø, og temperaturendringer lett har vist å påvirke genet uttrykk13,14, 15. forskningsgrupper har tidligere publisert teknikker som beskriver bruken av en mesh filtrere C. elegans etter størrelse16. Men kunne vi ikke finne tidligere arbeid tester for endringer i de totale helse utfallene som kan knyttes til bruk av slike filtre.

Det er derfor et behov i C. elegans forskning samfunnet for en rimelig, effektiv, rask og nøyaktig metode for å overføre store antall dyr mellom kultur plater. Vi har utviklet en forbedret, tilgjengelig stykke utstyr (kalt Caenorhabditis silen) og en tilhørende protokoll for produksjon og operasjon som oppfyller behovene til C. elegans forskningen fellesskapet. Her, vi dele utformingen av Caenorhabditis sil og metodene for bruk, og vi viser at bruken ikke påvirker felles helse eller noen stress markører i forhold til standard manuell plukking og behandling med det vanlige, fruktbarhet-begrense kjemiske FUDR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Caenorhabditis sil bygging og bruk

  1. Konstruksjon-protokollen
    1. Få 2 dekslene fra 50 mL konisk rør (figur 1A).
    2. Fjerne det midterste området i den indre kanten av lokkene (når sett fra bunnen, figur 1B) bruker en Bunsen brenner og en varmt metall sonde eller en loddebolt eller gikk drill litt.
      Merk: Ved hjelp av varme for å kutte plast lokket er å foretrekke fremfor et blad fordi det er mindre risiko for skade.
    3. Rengjør og sand klippkanten og toppen overflaten med en buet fil eller en roterende sliping verktøyet (f.eksDremel). Se figur 1 c.
    4. Kuttet sirkel monofilament mesh til riktig diameter (figur 1 d). For dette, spore lokk til et monofilament nylon maske ark og kuttet rett innenfor linjen.
    5. Skjær riller/skråstreker i overflaten av lokkene å forbedre vedheft av to lokkene når limet på plast (figur 1E).
    6. Rengjør lokkene med etanol og la dem tørke.
    7. Bruke cyanoacrylate lim på overflaten av både lokk, til den ytre kanten.
      Merk: en liten lim går en lang vei.
    8. Lå monofilament mesh, ifølge tabell 1, på en limt lokk (figur 1F). Plass andre lokket invertert på nettet; begge lokkene må ha sine topper sammen. Trykk fast sammen (figur 1G). Kontroller at nettet er stram.
      Merk: som et sikkerhetsnett, bruke pinsett plassere mesh på lokkene.
    9. Når det første laget av limet har tørket, gjelde en ring av cyanoacrylate lim rundt ytre gapet mellom lokkene. Være sjenerøse ettersom dette legger integritet og forhindrer noen peeling hverandre eller lekker.
    10. Merk filteret med mesh porestørrelse av monofilament mesh.
      Merk: Her, bruker vi to mesh pore størrelser-20 µm og 50 µm.
  2. Bruke protokollen
    1. Pre våt silen.
      1. Pipetter en saltvannsoppløsning, som M9 [5 g av NaCl, 6 g Na2HPO4, 3 g KH2PO4, 1 L ultrapure H2O og 1 mL av MgSO4 (1 M)]17, gjennom midten av silen til en dråpe former , komprimerer og drypper av midten av filteret (figur 2A). Eventuelt bruke en lofri tørke (f.eksKimwipe) til bunnen figuren eller spre en fuktighet dråpe på nettet.
      2. Plass silen over en 50 mL konisk rør. Etiketten røret som "Avfall tube" (figur 2B).
    2. Vask en befolkning C. elegans av en agar plate.
      1. Vaske platen med M9 bufferen og plasser ormen inneholder mediet på oversiden av monofilament mesh 1 mL samtidig (figur 2C). Kontroller at maskinen i midten av nettet. Vask alle ormer fra platen.
        Merk: Vanligvis 3 mL M9 for en 60 mm plate er tilstrekkelig.
      2. For å minimere antallet av ormer tapt i pipettering, bruker du et glass Pasteur pipette flytte ormer av platen og på mesh center (gjenta etter behov).
      3. Skyll filteret med M9 bufferen fra toppen. Igjen, sørg for å operere i midten av nettet og skyll alle ormer i dette området. Vask så mange ganger som nødvendig for å sikre at alle bakterier og mindre ormer har gått gjennom nettet.
    3. Høste størrelse-matchet dyrene fra silen.
      1. Knytte en ny 50 mL konisk tube til toppen av sil, med voksen ormer fra trinn 1.2.2.3 mot innsiden av den nye samling rør (figur 2D).
      2. Fjerne første røret (avfall rør) og raskt bla over sil og ny tube å holde slippverktøyet overføring (figur 2E).
        NOTE Hvis sterilitet ikke er nødvendig, bruk en lofri tørke (f.eksKimwipe) til veken væsken fra bunnen av nettet før bla.
      3. Skyll mesh med M9 inn i nye 50 mL røret fra nye dekket (figur 2F). Igjen, operere i mesh sentrum og vedlikeholde et slippverktøy på undersiden av nettet.
      4. Tillate ormer bosette seg eller forsiktig spinne dem ned (f.eks< 16 x g) i ca 1 min (figur 2 g).
      5. Sug opp den buffer løsningen fra pellet ormer, ideelt ned til > 0,5 mL, eller fjerne så mye væske som mulig uten å forstyrre pellet.
      6. Pipetter ormer med et glass Pasteur pipette på en NGM plate og la dem tørke. Space flere dråper ut på en ny plate slik de tørker raskere (figur 2 H).
    4. Rengjøre silen.
      1. Skyll silen forsiktig og nøye med etanol og omvendt osmose vann. La det tørke.
      2. Oppbevares i en ren beholder for ubestemt fremtid bruk.
      3. Kaste den når mesh utvikler et "sag" utseende.

2. validering av Caenorhabditis sil sorteringsmetoden

  1. Generelt vedlikehold
    1. For alle eksperimenter, kultur ormer på en standard Rundormer vekst medier17 (1 L NGM består av 2.5 g pepton 17 g agar, 3 g av NaCl, 975 mL dobbel-destillert vann, 1 mL av 5 mg/mL kolesterol, 1 mL 1 M CaCl2 1 mL 1 M MgSO4, 25 mL 1 M KHPO4og 0,5 mL av 100 mg/mL streptomycin) på 25 ° C.
  2. Eksperimentell behandling administrasjon
    1. Sammenligne tre behandlingsgrupper: plukke, fluorodeoxyuridine (FUDR) og Caenorhabditis sil.
      1. Legge til 100 mg/mL FUDR NGM media å en final konsentrasjon av 100 μM å forhindre alle avkom produksjon gruppen FUDR behandling og overføre ormer annenhver dag til en frisk NGM plate å unngå mat uttømming.
      2. For gruppen plukke velger og overføre ormer manuelt ved hjelp av en platina loop.
      3. Den Caenorhabditis sil behandling gruppen Følg trinn 1.2 og Pipetter ormer på en NGM plate.
  3. Caenorhabditis Sil prosentvis yield
    1. For å måle hvor effektiv silen er sortering C. elegans, vokse alder-synkron N2 dyr til dag 1 voksen ved 25 ° C (dvs., 48 timer etter egglegging) og deretter overføre dem ved å plukke dem til frisk NGM plater (totalt N = 50 eller N = 100 dyr per tre atment gruppe).
    2. Etter 24 timer for utvinning, overføre befolkningen til nye NGM plater med Caenorhabditis silen etter ovennevnte protokollen (se trinn 1.2) og telle antall vellykket overført dyr.
    3. Beregn den prosentvise yield som forholdet mellom antall dyr overført sammenlignet startnummeret i begynnelsen av multiplisert med 100 (%).
  4. Healthspan analyser
    Merk: Score healthspan parametere for motilitet, pharyngeal pumpe ofte, og både det fremre og bakre utfordringen svaret på dager 2, 4, 6 og 8 voksen for alder-synkroniserte N2 dyr opprettholdt på 25 ° C.
    1. Motilitet sporing
      1. Tildele motilitet score basert på en klasse-basert system (klasser A, B og C) følgende metoder av Herndon et al. 18. sammenligne effekten av de tre eksperimentelle gruppene bruker en ordenstallet logistikk statistikk modell i statistisk analyse software.
        Merk: Klasse A enkeltpersoner flytte spontant i en normal, sinusformet mønster. Klasse B enkeltpersoner flytte i markert ikke-sinusformet bevegelser og kan kreve prodding å oppmuntre bevegelse. Klasse C enkeltpersoner flytte sine hodet og/eller hale svar på prodding, men ikke kan flytte over agar.
    2. Pharyngeal pumpe rate
      1. Telle jeksel bevegelsen av dyrets terminal pharyngeal pære visuelt under en stereomicroscope på en 600 X siste forstørrelsen for 1 min.
      2. Utføre en statistisk analyse med en én-veis VARIANSANALYSE med α = 0,05 og Bonferroni etter tester med α = 0,05.
    3. Touch svar
      1. Registrerer en skånsom touch svar og sammenligne mellom tre behandling. Utføre analyser basert på metodene beskrevet av Calixto et al. 19.
      2. Posten det fremre og bakre trykk svar ved å forsiktig stryke en øyenvippe plukke vinkelrett på halen eller hodet (5 x, vekslende hodet og halen) av dyrene.
      3. Score enhver bevegelse i motsatt retning av strøket 1 punkt på en skala fra 0 til 5 for både det fremre og bakre svaret.
      4. Utføre statistisk analyse med en én-veis VARIANSANALYSE med α = 0,05 og Bonferroni etter tester med α = 0,05.
  5. Fruktbarhet analysen
    1. For å avgjøre bruken av Caenorhabditis Silens innvirkning på reproduksjon, vokse alder-synkron N2 dyr til dag 2 av voksen på 25 ° C.
    2. 60 h etter egg lå, overføre dyr til nye NGM plater med enten en platina hakke eller Caenorhabditis silen og gi dem 4 h å gjenopprette (tørr soldet platene i 20-30 minutter).
    3. Etter utvinning, individuelt plate dyrene via en øyenvippe plukke NGM plater, gi dem 24 h å legge egg, og fjern dyrene. Tillate avkommet på hver plate å utvikle under normale forhold ved 25 ° C i en annen 24 timer.
      Merk: En øyenvippe plukking er en menneskelig øyenvippe sikret på slutten av en Pasteur pipette med neglelakk og sterilisert med etanol.
    4. Telle antall levedyktig F1 generasjon individer. Utføre en statistisk analyse med en T-test med α = 0,05.
      Merk: Levedyktig avkom anses å være egg som vellykket Luke og begynner deres utvikling gjennom vanlige larver sykluser.
  6. Fluorescerende reporter stress respons analyser
    1. Utføre tre brukte lysstoffrør reporter analyser for å oppdage potensielle markører stress: en DAF-16::GFP translokasjon i kjerner av celler i en belastning [TJ356-zIs356 (pDAF-16::DAF-16-GFP, rol-6)]20; hsp-16.2 uttrykk [TJ375-gpIs1 (hsp-16.2p::GFP)]21; og et torv-3 uttrykk [CF1553-muIs84([pAD76]sod-3p::GFP+rol-6[su1006])]22.
    2. For hver analysen, kultur alder-synkron dyr fra tre behandlingsgrupper på 20 ° C og undersøke dem på dag 3 av voksen: Bruk en negativ kontroll (daglig, overføre en gruppe dyr manuelt med en platina plukke), en positiv kontroll (på daglig basis overføre en gruppe dyr manuelt med en platina plukke pluss en etablert stressor), og Caenorhabditis silen (dyrene passere silen og tillate dem å gjenopprette for 30 min på NGM like før imaging).
    3. I DAF-16::GFP analysen, varme sjokk positiv kontroll dyrene på 37 ° C i 30 min før imaging20. For hsp-16.2 analysen, varme sjokk positiv kontroll dyr 90 min, 20 h før imaging21. For torv-3 analysen, Unn positiv kontroll dyrene med 100 mM paraquat 4 h før imaging22.
    4. Høste ormer umiddelbart med en øyenvippe plukke og montere dem til en dekkglassvæske med 1 μL en 36% poloxamer 407 surfactant løsning nakkens ormer.
    5. Sandwich ormene montert med en annen dekkglassvæske. Monter de to coverslips en standard mikroskopi objektglass og bilde ormer med en 8 X forstørrelse på en invertert fluorescerende mikroskopet (for en generell forstørrelse 80 X) og konstant eksponering i et FITC-filter.
    6. For å oppdage eventuelle forskjeller mellom de tre gruppene i DAF-16::GFP analysen, kategorisere dyrene basert på plasseringen av DAF-16::GFP reporter (kjernefysisk hvis reporteren translocated til kjerner, cytosolic hvis reporteren ligger i stoffer og mellomliggende hvis reporteren i både kjerner og stoffer).
    7. Sammenligne resultatene med en ordenstallet logistikk statistiske modell i statistisk analyse software. Hsp-16.2 og torv-3 uttrykk analyser, bruke en enveis VARIANSANALYSE med α = 0,05 og Tukey's post hoc tester med α = 0,05 å sammenligne den totale fluorescensen i hodet regionen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Caenorhabditis silen består av 2 skrulokk, sikre et område av vevd nylon monofilament mesh mindre enn kroppen diameteren av ønsket utviklingsmessige alder, brukt til å hente live befolkninger av benytter en enkel vask teknikk. Det festes til standard konisk rør og bruker mesh skjermen mekanisk sortere dyr etter kroppen diameter, forlate ønsket dyrene i røret klar for ytterligere vedlikehold og eksperimentering (f.eks, overføring eller genetisk harvest). En mild manuell vask med Caenorhabditis silen er rask, ca 5 minutter per 60-100 mm plate og organismene gjenopprettes lett fra nettet.

Prosent avkastning på dyr etter Caenorhabditis Sil bruk
For å etablere den prosentvise yield på Caenorhabditis sil, ble enheter testet med både 20 μm og 50 μm pore-størrelse duk på voksen dyr. A mener avkastning på en > 90% vellykket dyr overføring ble oppnådd mesh størrelsen testet (tabell 1).

Monofilament maske med annerledes størrelse hull kan brukes til å skille dyr av ulike livsstadier. Mesh med 20 μm-huller passer for vask bort utvikling embryo og larver stadier mindre enn fjerde larvestadiet, beholde sistnevnte (L4, med en gjennomsnittlig kroppen diameter på 32 μm) og noen dyr i senere stadier, mens mesh med 50 μm-huller vil tillate alle andre livet scener bortsett fra voksne (med en gjennomsnittlig kroppen diameter på 70 μm) vaskes bort (tabell 2).

Caenorhabditis Sil bruk påvirker ikke healthspan beregninger
Motilitet: C. elegans normal sinusformet bevegelsen (dvs., motilitet) avslår alder18 og er en markør for helse. For å finne ut om Caenorhabditis silen påvirket motilitet, motilitet score var sammenlignet for plukking, FUDR og Caenorhabditis sil behandlingsgrupper på dager 2, 4, 6 og 8 i voksen alder. Alle dyrene over hver gruppe (n = 10/gruppe) utstilt normal og spontan bevegelsesmønstre (klasse A) på flere aldre gjennom hele voksenlivet (dager 2, 4, 6 og 8 voksen; p > 0,05 for flere sammenligninger på alle dager, Figur 3).

Pharyngeal pumpe rate: Muligheten for C. elegans pharyngeal musklene å pumpe avtar med alderen, og er en annen biomarkør healthspan23. For å avgjøre hvis Caenorhabditis silen påvirket dyrenes pharyngeal pumpe rate, hakke, FUDR og Caenorhabditis sil behandling gruppene ble sammenlignet på dager 2, 4, 6 og 8 voksen (n = 8 til 10 per gruppe). Det var en betydelig forskjell mellom dyr som gjennomgikk plukking og FUDR metoder på dager 6 (p < 0,001) og 8 (p < 0,001). Også var det en betydelig forskjell mellom sil og FUDR grupper på dager 6 (p < 0,001) og dag 8 voksen (p < 0,001). Men det var ingen statistisk signifikant forskjell mellom plukkingen og Caenorhabditis sil grupper for en dag (p > 0,05, Figur 4), som indikerer at silen ikke påvirker dette tiltaket av healthspan.

Utfordringen svar: Svar på mekanisk stimulans er en fysiologisk å vurdere aldring eller generell helse24,25; dermed effekten av overføre metoder på både det fremre og bakre utfordringen svar ble testet. Det var ingen statistisk signifikant forskjell mellom plukke, FUDR og Caenorhabditis sil behandlingsgrupper (n = 8/gruppe), enten peke eller posteriorly, for noen dager med testing (p > 0,4 for alle sammenligninger; Figur 5A og 5B).

Fruktbarhet: For å etablere hvorvidt Caenorhabditis silen påvirket mengden levedyktig avkom produsert av C. elegans, personlige avkom produsert i en 24-timers periode under dag 3 av voksen ble talt og forhold (n = 20-22 per gruppe). Bruk av Caenorhabditis silen ikke betydelig innvirkning antall avkom produsert sammenlignet med en plukke behandlingsgruppe (p = 0,61, figur 6).

Molekylær reporter analyser
DAF-16 kjernefysiske translokasjon: C. eleganser aktivering av transkripsjon faktoren DAF-16 assosiert med økt stress motstand26. Den kjernefysiske lokaliseringen av DAF-16 ble undersøkt i en transgene Rundormer belastning TJ356, som uttrykker DAF-16 sammensmeltet med en grønn fluorescerende protein (DAF-16::GFP)20. Under normal vekst forhold, DAF-16::GFP er lokalisert i stoffer, men under ulike stressorer (f.eks, varmestress), er det raskt translocated i kjernen20. For å teste effekten av sortering med Caenorhabditis silen på DAF-16 translokasjon, DAF-16::GFP lokaliseringer ble sammenlignet i alder-matchet dag-5 voksne i en positiv kontrollgruppe (varmestress), en negativ kontrollgruppe (manuell overføring via plukke), og en Caenorhabditis sil behandlingsgrupper (n = 10/gruppe). Med Caenorhabditis silen ikke påvirke kjernefysiske translokasjon av DAF-16::GFP og viste en lignende fenotypen til negativ kontroll dyrene (p > 0,05, figur 7).

HSP-16.2 reporter: lite varme sjokk proteiner som HSP-16.2 er biomarkers en stress reaksjon, og de er svært uttrykt ved en eksponering for varme støt eller Oksidativt stress agenter21,27. TJ375 belastning har en GFP reporter genet smeltet sammen med en hsp-16.2 arrangøren som ikke er aktiv under normale forhold21. Men etter en eksponering for en varme sjokk, HSP-16.2 protein uttrykk er indusert og dyrene vise høye nivåer av GFP uttrykk21. Teste involvering av Caenorhabditis silen på en HSP-16.2-mediert stressrespons, fluorescens tettheten i regionen pharynx (n = 10 dyr/gruppe) av alder-matchet dyr ble sammenlignet i dag-5 voksne mellom en positiv kontrollgruppe (varme stress), en negativ kontroll gruppe (plukkes), og en Caenorhabditis sil behandlingsgruppe. Overføring med Caenorhabditis silen ikke betydelig induserer uttrykk for HSP-16.2::GFP (hsp-16.2::gfp) sammenlignet med kontrollen negative (p > 0,05, Figur 8).

torv-3 reporter: C. eleganser antioksidant genet som koder for superoxide dismutase 3 (TORV-3) opp-regulert under oksidativt stress28. C. elegans belastningen CF1553 uttrykker grønne fluorescerende protein (GFP)-merket TORV-3 promoter, der uttrykk er indusert av oksidativt stress, for eksempel paraquat5. For å teste involvering av Caenorhabditis sil sorteringen på antioksidant respons i C. elegans, var fluorescens tettheten i regionen hodet i alder-matchet dag-5 voksne forhold mellom en positiv kontroll befolkning (100 μM paraquat behandling), en negativ kontroll befolkning (manuell plukking), og en Caenorhabditis sil-overført befolkningen. Overføring med Caenorhabditis silen ikke betydelig induserer uttrykk for torv-3::gfp sammenlignet med kontrollen negative (p > 0,05, figur 9).

Figure 1
Figur 1: Caenorhabditis sil konstruksjon. Utviklingen av "gjør det selv" produksjon av verktøyet vises. Disse skjermbildene viser (A) to 50 mL konisk tube caps (B) hvis sentre er fjernet, (C) kuttet kantene glattes og (D - F) som er utstyrt med monofilament mesh tilsvarer ønsket livet scenen C. elegans (se protokollen for detaljer). (G) fullført silen vises også. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Trinnvise bilde representasjon av Caenorhabditis sil. (A) silen er pre våt med en dråpe M9 løsning, og (B) passer oppå en 50 mL konisk rør. (C) 1 mL av M9 løsning med ormer er pipetted på oversiden av silen, (D) en 50 mL konisk tube plasseres oppå silen av ormer mot innsiden av røret, og (E) silen med en nylig tilknyttede øvre tube er raskt snudd o ver. (G) silen skylles med M9 bærer ønsket dyrene i den nye 50 mL tube og ormer kan slå av tyngdekraften til bunnen av røret. (H) ormer er pipetted og som dråper på en fersk NGM plate. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Caenorhabditis sil bydde ikke innvirkningen motilitet gjennom hele levetiden. Denne illustrasjonen viser motilitet klasse utbredelsen av dyr dager 2, 4, 6 og 8 voksen for plukking, FUDR, og Caenorhabditis sil behandlingsgrupper. Klasse A dyr flyttet normalt og spontant, klasse B dyr flyttet unormalt og kan ha nødvendig prodding, og klasse C dyr klarte ikke å bevege. Det var ingen forskjell mellom Caenorhabditis sil, plukke og FUDR grupper (p > 0,05). Tre replikat (n = 10 dyr per behandling plate) ble utført og analysert med ordenstallet logistikk modell. klasse B dyr. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Caenorhabditis sil bruk bydde ikke innvirkningen pharyngeal pumping gjennom hele levetiden. Denne illustrasjonen viser pharyngeal pumpen prisene for plukke, FUDR, og Caenorhabditis sil behandlingsgrupper, sammenlignet på dager 2, 4, 6 og 8 voksen. Stjernene betegne en betydning mellom hakke, sil og FUDR behandlingsgrupper for dager angitt (*** p < 0,05). Det var ingen forskjell mellom Caenorhabditis silen og plukke gruppen (p > 0,05). To replikat (N = 10 dyr per behandling plate) ble utført og analysert med en enveis ANOVA og en Bonferroni post-test. Bars forestiller det gjennomsnittlig ± standardfeilen til gjennomsnittet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Caenorhabditis sil bruk bydde ikke innvirkningen fremre touch svar gjennom hele levetiden. Disse skjermbildene viser (A) den fremre og (B) bakre touch svar greven av hakke, FUDR og Caenorhabditis sil behandlingsgrupper sammenlignet på dager 2, 4, 6 og 8 voksen. To gjentak ble gjennomført med N = 10 for hver behandling og sammenlignet med en enveis ANOVA og en Bonferroni post-test (p = 0,4 og p = 0,9 for fremre og bakre, henholdsvis). Bars forestiller det gjennomsnittlig ± standardfeilen til gjennomsnittet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Caenorhabditis sil ikke påvirke mengden levedyktig avkom dag 3 av voksen alder. Denne illustrasjonen viser levedyktig avkommet dag-3 voksne etter en 24-timers egg-legging periode, som dekker dag 3 av voksen for overordnede dyr. Bars forestiller det gjennomsnittlig ± standardfeilen til gjennomsnittet. N = 20-22 dyr fra minst to separate biologiske gjentak per behandlingsgruppe. Behandlingsgrupper sammenlignes med en t-test, (p > 0,05). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: Caenorhabditis sil ikke påvirke kjernefysiske translokasjon av DAF-16::GFP. Disse skjermbildene viser representant bilder av DAF-16 translokasjon av (A) en varme sjokk gruppe (positiv kontrollen), (B) en hakke gruppe (negativ kontrollen) og (C) en Caenorhabditis sil behandlingsgruppe. (D) dyrene i positiv kontrollgruppen vises en aktivering av DAF-16 kjernefysiske translokasjon. Caenorhabditis silen vises cytosolic fusion protein ligner på dyrene i gruppen negativ kontroll og få ikke en kjernefysisk translokasjon. N = 10 dyr per behandlingsgruppe fra minst tre separate biologiske gjentak. Behandling gruppene ble sammenlignet med en enveis ANOVA og en Tukey legge hoc test. Skala bar = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8: Caenorhabditis sil ikke påvirke uttrykket av hsp16.2::gfp. HSP-16.2 uttrykkene (i vilkårlig fluorescens enheter) en varme sjokk gruppe (positiv kontrollen), en plukke gruppe (negativ kontrollen) og en Caenorhabditis sil behandlingsgruppe sammenlignes. Stjernene betegne en høy uttrykk for hsp16.2::gfp for positiv kontrollgruppen som var vesentlig forskjellig fra de andre behandling gruppene (*** p < 0,05). Caenorhabditis silen ikke påvirke hsp16.2::gfp uttrykket og vises fluorescens intensiteter ligner på dyr i negativ kontrollgruppen (p > 0,05). Tre gjentak ble gjennomført med N = 10 for hver behandling og sammenlignet med en enveis ANOVA og en Tukey legge hoc test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 9
Figur 9: Caenorhabditis sil ikke påvirke uttrykket av torv-3::gfp. TORV-3 uttrykkene (i vilkårlig fluorescens enheter) en 100 μM paraquat gruppe (positiv kontrollen), en plukke gruppe (negativ kontrollen) og en Caenorhabditis sil behandlingsgruppe vises. Stjernene betegne en høy uttrykk for torv-3::gfp for positiv kontrollgruppen som var vesentlig forskjellig fra de andre gruppene (*** p < 0,05). Caenorhabditis silen ikke påvirke uttrykket torv-3::gfp og vises fluorescens intensiteter ligner på dyrene i negativ kontrollgruppen (p > 0,05). Tre gjentak ble gjennomført med N = 10 for hver behandling og sammenlignet med en enveis ANOVA og en Tukey legge hoc test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Mesh størrelsen N = 50 N = 100
20 μm 95.33%
50 μm 99.00% 93.33%

Tabell 1: prosentvis yield mesh størrelser. Denne tabellen viser resultatet av en 20 μm enhet testet med N = 50 voksne for 3 gjentak og en 50 μm testet med N = 50 voksne for 2 gjentak og med N = 100 for 3 gjentak.

Mesh størrelsen Utviklingsstadiet Kroppen Diameter
20 μm Larvestadiet 4 ~ 35 μm
50 μm Dag 1 voksen ~ 70 μm

Tabell 2: gjennomsnittlig diameter. Denne tabellen viser gjennomsnittlig diameter av snitt 3 målinger like spredt over hver orm for 15 dyr på hver målte liv stadium.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Her, introdusert vi av design og bruk av tilgjengelig, effektiv Caenorhabditis silen som et verktøy for sortering og vedlikeholde C. elegans. Dette verktøyet har flere fordeler å manuelt velge enkelte dyr, vaske befolkninger, kjemiske behandlinger (f.eksFUDR) og dyrere metoder segregerende dyr. Først Caenorhabditis sil effektivt og raskt (mindre enn 20 min) sorterer avkom fra blandet folkerike dyr (tabell 2). Også bruk av verktøyet har ingen synlig toksiske effekter på dyrene healthspan (Figur 3, Figur 4, figur 5, figur 6), få ikke godt beskrevet genetisk stress journalister (figur 7, Figur 8 Figur 9), og reduserer mengden av utenlandske kjemikalie som kan påvirke anvendt behandling kultur plater eller noen molekylær analysen etterpå. Sin brukervennlighet er en betydelig fordel; forsker på noe Stadium i utdanning kan trenes til å bruke det (figur 1 og figur 2; Protokollen).

Materialer som kreves for fabrikasjon og bruk av silen (f.eks, Pipetter, buffere) er tilgjengelig i standard forskningslaboratorier; Dermed, hvis ødelagt, Caenorhabditis silen er ikke dyrt å erstatte eller reparere. Selv bygget natur Caenorhabditis silen tillater det å være en allsidig verktøy: det kan konstrueres med mesh størrelser passer for forskjellige C. elegans utviklingsstadier og fenotyper. Caenorhabditis silen kan også brukes i analyser utført i andre Rundormer arter eller når isolere små organismer, gitt riktig mesh størrelsen er brukt på produksjon.

I tillegg til fordelene gir dette verktøyet C. elegans befolkningen vedlikehold, silen kan brukes til å rense dyr før deres bruk i andre programmer, eksperimentelle. For eksempel med utviklingen av microfluidics å gjennomføre C. elegans kommer forskning problemet chip og rengjøring. Avhengig av bakterier knyttet til dyrene, må spesielle forholdsregler tas for ikke å tette microfluidic chip, gjengi den ubrukelig29. Ofte når C. elegans overføres til en microfluidic chip, brakte rester fra bakteriell plenen med seg. Denne rester kan og tette microfluidic kanalene, chip feil, som deretter krever rengjøring eller erstatning. Enheten Konstruer i denne protokollen gir en metode for ikke bare høsting synkronisert dyr for microfluidics, men også for rengjøring dyrene før deres innsetting i en microfluidic enhet. Ved å fjerne restene og bakteriell rester, tatt opp når dyr, er microfluidic kanalene mindre utsatt for feil, dermed øker driftstiden personlige chips og påfølgende gjennomstrømningen av forskning utført med dem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre. Forfatterne erklærer at forskningen ble utført i fravær av noen kommersielle eller økonomiske relasjoner som kan tolkes som en potensiell interessekonflikt.

Acknowledgments

Forfatterne vil gjerne takke Heather Currey for hennes første bidrag til studien design, og Dr. Swarup Mitra for hans kritiske gjennomgangen av manuskriptet. Vi vil også gjerne takke Dr. Michael B. Harris for kommentarer, forbedringer og hjelp i å produsere demonstrasjon av denne metoden. Stammene ble levert av Caenorhabditis genetikk sentrum, som er finansiert av kontor NIH forskning infrastruktur programmer (P40 OD010440). Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av National Institute Of General Medical Sciences av National Institutes of Health under prisen tall UL1GM118991, TL4GM118992 eller RL5GM118990 og en institusjonell utvikling pris (idé) fra National Institute of General Medical Sciences av National Institutes of Health under gi nummer 5P20GM103395-15. Innholdet er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet til National Institutes of Health. UA er en AA/EO arbeidsgiver og utdanningsinstitusjon og forbyr ulovlig diskriminering mot enkeltpersoner: www.alaska.edu/titleIXcompliance/nondiscrimination.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Safety glasses Uline S-21076
Protective heat resistant glove Grainger Item # 3AT17 Mfr. Model # 3AT17 Catalog Page # 1703
50 mL conical tube Falcon 14-432-22
Synthetic Nylon mesh Dynamic
Aqua-Supply Ltd
NTX20 and NTX50
Cyanoacrylate glue Scotch Super Glue Liquid SAD114
Pliers Vampliers VMPVT-001-8
Dremmel tool with circular file Lowe's Item # 525945 Model # 100-LG
FUDR Sigma F0503
M9 chemicals ( NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4)  Sigma  S7653, RES20908-A7, 1551139, M7506
NGM plate chemicals (Bactopeptone, Agar, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2,Cholesterol, Streptomycin) BD Biosciences (bactopeptone) , Lab express (agar), Sigma ( rest) BD bioscience 211677, Lab Express 1001,  Sigma 1551139, 1551128, C1016, C8667, S6501
Pluronic F-127 Sigma P2443
Paraquat dichloride hydrate Sigma 36541
Inverted fluorescence microscope Olympus FSX100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. C elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282, (5396), 2012-2018 (1998).
  2. Herman, M. A. Hermaphrodite cell-fate specification. WormBook. 1-16 (2006).
  3. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. 1-11 (2006).
  4. Chalfie, M., Hart, A. C., Rankin, C. H., Goodman, M. B. Assaying mechanosensation. WormBook. (2014).
  5. Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Deletion of the Mitochondrial Superoxide Dismutase sod-2 Extends Lifespan in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 5, (2), e1000361 (2009).
  6. Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of Ageing Development. 132, (10), 519-521 (2011).
  7. Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing Development. 12, (2), 137-150 (1980).
  8. Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of Ageing and Development. 131, (5), 364-365 (2010).
  9. Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing Development. 133, (1), 46-49 (2012).
  10. Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9, (1), e85964 (2014).
  11. Pulak, R. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. Methods Molecular Biology. 351, 275-286 (2006).
  12. Argon, Y., Ward, S. Caenorhabditis elegans fertilization-defective mutants with abnormal sperm. Genetics. 96, (2), 413-433 (1980).
  13. Lee, S. J., Kenyon, C. Regulation of the longevity response to temperature by thermosensory neurons in Caenorhabditis elegans. Current Biology. 19, (9), 715-722 (2009).
  14. Klass, M. R. Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span. Mechanisms of Ageing Development. 6, (6), 413-429 (1977).
  15. Zhang, B., et al. Environmental Temperature Differentially Modulates C. elegans Longevity through a Thermosensitive TRP Channel. Cell Reports. 11, (9), 1414-1424 (2015).
  16. Michaelson, L. C. C. elegans: A Practical Approach. Ian A. Hope (ed.). Oxford University Press, Oxford. 1999. Pp. 281. ISBN 0 19 963738 5. Heredity. 85, (1), 97-100 (2000).
  17. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, (1), 71-94 (1974).
  18. Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419, (6909), 808-814 (2002).
  19. Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7, (7), 554-559 (2010).
  20. Henderson, S. T., Johnson, T. E. daf-16 integrates developmental and environmental inputs to mediate aging in the nematode Caenorhabditis elegans. Current Biology. 11, (24), 1975-1980 (2001).
  21. Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 37, (8), 894-898 (2005).
  22. Libina, N., Berman, J. R., Kenyon, C. Tissue-specific activities of C. elegans DAF-16 in the regulation of lifespan. Cell. 115, (4), 489-502 (2003).
  23. Keith, S. A., Amrit, F. R., Ratnappan, R., Ghazi, A. The C. elegans healthspan and stress-resistance assay toolkit. Methods. 68, (3), 476-486 (2014).
  24. Scerbak, C., Vayndorf, E. M., Hernandez, A., McGill, C., Taylor, B. E. Mechanosensory neuron aging: Differential trajectories with lifespan-extending alaskan berry and fungal treatments in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Aging Neuroscience. 8, 173 (2016).
  25. Vayndorf, E. M., et al. Morphological remodeling of C. elegans neurons during aging is modified by compromised protein homeostasis. npj Aging and Mechanisms of Disease. 2, 16001 (2016).
  26. Murakami, S., Johnson, T. E. A genetic pathway conferring life extension and resistance to UV stress in Caenorhabditis elegans. Genetics. 143, (3), 1207-1218 (1996).
  27. Abbas, S., Wink, M. Green Tea Extract Induces the Resistance of Caenorhabditis elegans against Oxidative Stress. Antioxidants (Basel). 3, (1), 129-143 (2014).
  28. Yanase, S., Hartman, P. S., Ito, A., Ishii, N. Oxidative stress pretreatment increases the X-radiation resistance of the nematode Caenorhabditis elegans. Mutation Research. 426, (1), 31-39 (1999).
  29. Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nature Methods. 5, (7), 637-643 (2008).
<em>Caenorhabditis</em> Sil: Et Low-tech Instrument og metodikk for sortering liten Multicellular organismer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hunter, S., Maulik, M., Scerbak, C., Vayndorf, E., Taylor, B. E. Caenorhabditis Sieve: A Low-tech Instrument and Methodology for Sorting Small Multicellular Organisms. J. Vis. Exp. (137), e58014, doi:10.3791/58014 (2018).More

Hunter, S., Maulik, M., Scerbak, C., Vayndorf, E., Taylor, B. E. Caenorhabditis Sieve: A Low-tech Instrument and Methodology for Sorting Small Multicellular Organisms. J. Vis. Exp. (137), e58014, doi:10.3791/58014 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter