Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

كاينورهابديتيس غربال: صك التكنولوجيا المنخفضة ومنهجية لفرز الكائنات متعددة الخلايا الصغيرة

Published: July 4, 2018 doi: 10.3791/58014
Automatic Translation
*1,2, *3, 4, 2, 5
1Department of Biology and Wildlife, University of Alaska Fairbanks, 2Institute of Arctic Biology, University of Alaska Fairbanks, 3Department of Chemistry and Biochemistry, University of Alaska Fairbanks, 4Departments of Biology and Chemistry, Earlham College, 5Department of Biological Sciences, College of Natural Science and Mathematics, California State University Long Beach
* These authors contributed equally

Summary

يشمل البروتوكول الحالي منهجية للفرز والتنظيف لمطابقة سن السكان من ايليجانس كاينورهابديتيس. فإنه يستخدم بسيطة وغير مكلفة، وكفاءة أداة مصنوعة خصيصا للحصول على عدد كبير من سكان تجريبية من الديدان الخيطية للبحوث.

Abstract

ايليجانس كاينورهابديتيس (C. ايليجانس) كائن نموذج راسخة المستخدمة عبر مجموعة من البحوث الطبية الحيوية والأساسية. داخل مجتمع البحوث السلكية، هناك حاجة لطريقة الفعالة والميسورة التكلفة للحفاظ على السكان الكبيرة، وتطابق العمر من C. ايليجانس. وهنا، نقدم منهجية لفرز ميكانيكيا وتنظيف C. ايليجانس. أن هدفنا توفير عملية فعالة من حيث التكلفة، وفعالة وسريعة وبسيطة للحصول على الحيوانات من أحجام موحدة ومراحل الحياة لاستخدامها في التجارب. تستخدم هذه الأداة، غربال كاينورهابديتيس ، نظام غطاء مبنية خصيصا بالمواضيع على المشترك مختبر مخروطية أنابيب ويفرز C. ايليجانس استناداً إلى حجم الجسم. نحن أيضا إثبات أن غربال كاينورهابديتيس ينقل فعالية الحيوانات من لوحة ثقافة واحدة إلى آخر السماح للفرز السريع، مزامنة، وتنظيف دون التأثير على علامات للصحة، بما في ذلك الحركة والإجهاد إيندوسيبلي الصحافيين الجينات. هذه الأداة موجوداً والمبتكرة خيار سريعة وفعالة، وغير مجهدة للحفاظ على السكان C. ايليجانس .

Introduction

الدودة السلكية، ايليجانس كاينورهابديتيس، كائن نموذج رئيس وزراء. بالإضافة إلى الطابع مباشرة والتي تسيطر عليها لزراعتها في المختبر، الجينوم أكمله هو التسلسل1 ويعرف مصير الإنمائية لكل خلية2. بسبب هذه الميزات، C. ايليجانس كائن نموذج مستخدمة على نطاق واسع للدراسات الوراثية. ومع ذلك، جنبا إلى جنب مع هذه الخصائص المفيدة تأتي بعض التحديات للباحثين. سبب وقتهم الجيل السريع، C. ايليجانس السكان يمكن أن تنفد بسرعة الغذاء و/أو تصبح مختلطة السكان مع أجيال متعددة ويقدم مراحل النمو في وقت واحد. وهكذا، تتطلب تجارب أجريت على وسائط النمو السلكية الصلبة (NGM) الباحثين لنقل الحيوانات فعلياً إلى لوحات جديدة قبل أن يستنفد المصدر الغذائي الجرثومي ووضع اليرقات الجديدة. هذا يمكن أن يكون مملا كما نقل متكررة من الحيوانات مطلوب لمنع السكان تجريبية من أن تصبح مختلطة مع الأجيال ذرية. لا يزال، تتطلب بعض التجارب كلا أعدادا كبيرة من الحيوانات والنقاط الزمنية الممتدة (مثلاً، استخراج الحمض النووي الريبي أو في مرحلة البلوغ). وهذا يضاعف التحديات المتمثلة في الحفاظ على عدد سكان متزامنة بدقة ونقل إعداد كبيرة من الحيوانات.

الأساليب الحالية لنقل C. ايليجانس مثقف في NGM الانتقاء أو غسل الحيوانات من لوحة للوحة؛ علاج كيميائيا الحيوانات (مثلاً، مع الحمض النووي النسخ المتماثل مثبط فلوروديوكسيوريديني أو فودر)؛ أو استخدام التدفق الخلوي لفرز الحيوانات في لوحات متعددة جيدا. الانتقاء ينطوي على استخدام أداة اليد، المصنوع من سلك البلاتين رقيقة أو جفن، أما يدوياً نقل الفرد أو3،الحيوانات متعددة4. هذا الأسلوب هو دقيقة ولكن يتطلب المهارة والوقت وهو القيد للدراسات التي تشمل أعدادا كبيرة من الحيوانات. اختيار مايو أيضا أن تكون ضررا جسديا والمجهدة للحيوانات التي يحتمل أن إخضاع الأفراد لكميات غير طبيعية وغير متناسقة من اضطراب وقوة. ينطوي غسيل الشطف طبق ثقافة مع حل المخزن مؤقت ونقل الحل مع الحيوانات عبر الزجاج ماصة باستور إلى لوحة ثقافة جديدة. هذا الأسلوب هو سريعة وفعالة ولكن ليست دقيقة كما يتم نقل متعددة الأجيال والمراحل التنموية للحيوانات بكميات كبيرة. ويمكن حل العلاجات الكيميائية، مثل فودر، في تثقيف وسائل الإعلام لمنع إنتاج ذرية من خلال منع أي تكرار الحمض النووي، ومن ثم، وضع البيض وإنتاج مشيج. وبينما فعالة، يجب أن يكون تطبيق هذا الأسلوب بعد نضوج الإنمائية فيما يتعلق بعدم عرقلة العمليات الإنمائية العادية، وهذا يعني أنه لا يزال هناك شرط لنقل الحيوانات قبل الإدارة3. هذا الأسلوب أيضا تأثيرات متعددة الخلوية مما يشير إلى مسارات، وأسفر عن تأثيرات ملحوظة على الحيوانات مع تقدمهم في السن (مثلاً، بتمديد عمر أو تغيير بروتيوستاسيس) اعتماداً على سلالة C. ايليجانس تستخدم5، 6،،من78،،من910. التدفق الخلوي أساليب الفرز ونقل الفردية C. ايليجانس من لوحة متعددة جيدا واحد إلى آخر11تلقائياً. بينما يكون هذا الأسلوب فعالة وكفؤة جداً، التدفق الخلوي معدات باهظة باهظة الثمن وغير متاحة للعديد من الباحثين. هو بديل لنقل الحيوانات استخدام نماذج المسخ التي تعتبر حساسة، مثل فر-15 و فيم-1، التي أصبحت عقيمة مع ضبط درجة الحرارة12درجة الحرارة. بينما استخدام الحيوانات المسخ مفيد في بعض الحالات، هذه السلالات المحددة تنمو بشكل أبطأ من الحيوانات البرية من نوع وأنهم يعتمدون المجين غيرت، بوصفه ممثلي الفقراء للديدان الشيخوخة أو صحية. وبالإضافة إلى ذلك، يؤدي أيضا إلى الاعتماد على درجة حرارة تحول إلى الحث على العقم في غياب بيئة ثابتة، والتغيرات في درجات الحرارة قد ثبت سهولة التأثير على الجينات تعبيرات13،14، 15-المجموعات البحثية قد نشرت سابقا تقنيات تصف استخدام شبكة لتصفية C. ايليجانس بحجم16. ومع ذلك، كنا غير قادر على العثور على عمل السابقة اختبار أية تغييرات في النتائج الصحية العامة التي قد تكون مرتبطة باستخدام عوامل التصفية هذه.

ومن ثم، هناك حاجة داخل مجتمع البحوث C. ايليجانس طريقة معقولة، فعالة وسريعة ودقيقة لنقل إعداد كبيرة من الحيوانات بين لوحات الثقافة ل. وقد وضعنا قطعة محسنة، يمكن الوصول إليها من المعدات (تسمى غربال كاينورهابديتيس ) وبروتوكول المقترنة لتصنيع وعملية تلبي احتياجات مجتمع البحوث C. ايليجانس . هنا، نشاطر تصميم منخل كاينورهابديتيس وطرق استخدامها، ونظهر أن استخدامها لا تؤثر صحة المشترك أو أي من علامات الإجهاد عند مقارنتها بمعيار الانتقاء اليدوي وعلاج مع شائعة، فودر الكيميائية المقيدة للخصوبة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1- كاينورهابديتيس غربال البناء والاستخدام

  1. بروتوكول الإنشاء
    1. الحصول على أغطية 2 من أنابيب مخروطية 50 مل (الشكل 1A).
    2. إزالة منطقة مركز داخل الشفة الداخلية للجفن (عندما ينظر إليها من الأسفل، الشكل 1B) استخدام موقد بنسن وتحقيق معدنية ساخنة أو لحام حديد أو صعدت الحفر بت.
      ملاحظة: استخدام الحرارة لقطع الغطاء البلاستيك الأفضل لنصل لأن هناك مخاطر أقل للإصابة.
    3. تنظيف والرمال حواف قطع وأعلى السطح مع ملف منحنية أو دوارة طحن الأداة (مثلاً، Dremel). انظر الشكل 1.
    4. قص دائرة شبكة شعيرات إلى القطر المناسب (الشكل 1). ولهذا، تتبع غطاء على ورقة مش نايلون حيدة وقص فقط داخل الخط الذي رسمته.
    5. قطع الأخاديد/مائلة إلى السطح العلوي للأغطية لتعزيز التصاق الجفن اثنين عندما يتم تطبيق الغراء للبلاستيك (الشكل 1E).
    6. تنظيف الأغطية مع الإيثانول والسماح لهم الجافة.
    7. تطبيق الغراء cyanoacrylate على السطح العلوي لكل الأغطية، الحفاظ على الحافة الخارجية.
      ملاحظة: الغراء قليلاً يقطع شوطا طويلاً.
    8. إرساء شبكة شعيرات، وفقا الجدول 1، غطاء لاصق واحد (الشكل 1F). ضع غطاء الثاني مقلوب على رأس الشبكة؛ يجب أن يكون كلا الأغطية على قمم معا. اضغط بحزم معا (الشكل 1). تأكد من أن الشبكة مشدود.
      ملاحظة: كإجراء وقائي، استخدام الملقط لوضع الشبكة على الأغطية.
    9. مرة واحدة وقد جفت الطبقة الأولى من الغراء، تنطبق على عصابة من الغراء cyanoacrylate حول الفجوة الخارجي بين الأغطية. أن تكون سخية كما يضيف سلامة هذا ويمنع أي تقشير بعيداً أو تسرب.
    10. قم بتسمية عامل التصفية مع حجم المسام مش مش حيدة.
      ملاحظة: هنا، يمكننا استخدام اثنين من أحجام المسام مش – 20 ميكرون و 50 ميكرون.
  2. استخدام بروتوكول
    1. قبل الرطب المنخل.
      1. "الماصة؛" من المحلول الملحي، مثل M9 [5 غ من كلوريد الصوديوم، ز 6 غ2هبو4، ز 3 خ2ص4، 1 لتر من النقاوة ح2س، و 1 مل من مجسو4 (م 1)]17، من خلال مركز غربال حتى أشكال المعالجة تجميعية ، يتكثف، وتقطر قبالة مركز تصفية السفلي (الشكل 2A). اختيارياً، تطبيق مسح خالية من الوبر (مثلاً، كيمويبي) إلى الأسفل إلى الشكل أو نشر معالجة رطوبة تجميعية على الشبكة.
      2. ضع المنخل عبر أنبوب مخروطي 50 مل. تسمية الأنبوب ك 'أنبوب النفايات' (الشكل 2).
    2. أغسل عدد سكانها C. ايليجانس قبالة صفيحة أجار.
      1. أغسل اللوحة مع المخزن المؤقت M9 ومكان المتوسطة المحتوية على دودة على ظهر المركب مش حيدة 1 مل في وقت واحد (الشكل 2). تأكد من أن تعمل في مركز الشبكة. تغسل جميع الديدان من اللوحة.
        ملاحظة: عادة، 3 مل M9 لوحة 60 ملم غير كافية.
      2. لتقليل عدد الديدان التي فقدت في بيبيتينج، استخدام زجاج ماصة باستور لنقل الديدان قبالة اللوحة وعلى مركز شبكة (كرر حسب الحاجة).
      3. شطف عامل التصفية مع المخزن المؤقت M9 من الأعلى. مرة أخرى، تأكد من تعمل في مركز الشبكة، وشطف جميع الديدان في هذا المجال. تغسل عدة مرات حسب الضرورة لضمان أن جميع البكتيريا والديدان الصغيرة قد مروا عبر الشبكة.
    3. حصاد الحيوانات مطابقة حجم من المنخل.
      1. إرفاق أنبوب مخروطي 50 مل جديدة إلى الجزء العلوي من غربال، مع الديدان الكبار من الخطوة 1.2.2.3 تواجه داخل الأنبوب مجموعة جديدة (الشكل 2D).
      2. إزالة الأنبوب الأول (أنبوب النفايات) واقلب بسرعة منخل وأنبوب جديد للحيلولة دون ترحيل الحبرية (الشكل 2E).
        ملاحظة: إذا كان غير مطلوب العقم، استخدام مسح خالية من الوبر (مثلاً، كيمويبي) للسائل فتيلة من أسفل الشبكة قبل التقليب.
      3. شطف مش مع M9 في أنبوب 50 مل جديدة من ظهر المركب الجديد (الشكل 2 واو). مرة أخرى، تعمل في مركز الشبكة والمحافظة على معالجة تجميعية على الجزء السفلي الشبكة.
      4. السماح للديدان تسوية أو تدور لهم بلطف إلى أسفل (مثل< 16 x g) لحوالي 1 دقيقة (الشكل 2).
      5. نضح الحل المخزن المؤقت من بيليه الديدان، ومن الناحية المثالية وصولاً إلى > 0.5 مل، أو إزالة السوائل قدر ممكن دون الإخلال بيليه.
      6. "الماصة؛" الديدان استخدام زجاج ماصة باستور على صفيحة NGM والسماح لهم الجافة. الفضاء قطرات متعددة بها على لوحة جديدة حيث أن تجف أسرع (ح الشكل 2).
    4. تنظيف المنخل.
      1. شطف المنخل بلطف ودقة مع الماء الإيثانول والتناضح العكسي. اتركها تجف.
      2. تخزينها في حاوية نظيفة للاستخدام في المستقبل إلى أجل غير مسمى.
      3. تجاهل ذلك عندما تطور الشبكة مظهر "تبلد".

2. التحقق من كاينورهابديتيس منخل أسلوب الفرز

  1. الصيانة العامة
    1. لكل التجارب، الديدان الثقافة على "ديدان أسطوانية وسائط النمو" قياسي17 (1 لتر NGM يتكون من 2.5 g ببتون، ز 17 من أجار، 3 غرام من كلوريد الصوديوم، مل 975 مزدوجة المقطر المياه، 1 مل 5 ملغ/مل الكولسترول، 1 مل كاكل م 12 ، 1 مل 1 م MgSO4، 25 مل من خبو 1 M4، و 0.5 مل من ستربتوميسين 100 مغ/مل) في 25 درجة مئوية.
  2. إدارة العلاج التجريبي
    1. مقارنة مجموعات العلاج الثلاثة: بيك، فلوروديوكسيوريديني (فودر) وغربال كاينورهابديتيس .
      1. لمجموعة العلاج فودر، إضافة 100 مغ/مل فودر NGM وسائط الإعلام إلى تركيز نهائي من 100 ميكرومتر منع أي إنتاج ذرية، ونقل الديدان كل يوم إلى لوحة NGM طازجة لتجنب نضوب الغذاء.
      2. لاختيار مجموعة، حدد ونقل الديدان يدوياً باستخدام حلقة البلاتين.
      3. لمجموعة العلاج غربال كاينورهابديتيس ، اتبع الخطوة 1.2 و "الماصة؛" الديدان على صفيحة NGM.
  3. كاينورهابديتيس غربال نسبة العائد
    1. لقياس مدى فعالية المنخل في الفرز C. ايليجانس، تنمو السن متزامن N2 الحيوانات لليوم الأول من مرحلة البلوغ عند 25 درجة مئوية (أي48 ساعة بعد وضع البيض) وثم نقلها بانتقاء منهم إلى لوحات NGM الطازجة (N إجمالي = 50 أو N = 100 الحيوانات الواحدة ترى مجموعة أتمينت).
    2. بعد 24 ساعة انتعاش، ونقل السكان إلى لوحات NGM جديدة مع غربال كاينورهابديتيس عقب ما ورد أعلاه البروتوكول (راجع الخطوة 1، 2)، وحساب عدد الحيوانات المنقولة بنجاح.
    3. حساب نسبة العائد بنسبة عدد الحيوانات المنقولة بالمقارنة مع عدد الانطلاق في البداية نقل مضروبة في 100 (%).
  4. فحوصات هيلثسبان
    ملاحظة: نقاط المعلمات هيلثسبان من الفئة حركية ومعدل ضخ البلعوم، وسواء الأمامي والخلفي لمس لطيف الاستجابة في أيام 2 و 4، 6، و 8 لسن البلوغ لمزامنة العمر الحيوانات N2 الإبقاء على 25 درجة مئوية.
    1. تتبع حركية
      1. تعيين عشرات حركية استناداً إلى نظام يستند إلى الفئة (الفئات A، B و C) اتباع أساليب هيرندون et al. 18-مقارنة آثار ثلاث مجموعات تجريبية باستخدام نموذج إحصاءات ترتيبية سوقي في برمجيات التحليل الإحصائي.
        ملاحظة: نقل أفراد الفئة أ عفويا في نمط عادي جيبية. أفراد الفئة ب التحرك في الحركات غير الجيبية ملحوظا، وقد تتطلب الحث على تشجيع حركة. أفراد الفئة C تحريك الرأس و/أو ذيل استجابة للحث ولكن غير قادر على الانتقال عبر أجار.
    2. معدل ضخ البلعوم
      1. عد حركة طاحونة لمبة البلعوم المحطة الطرفية للحيوان بصريا تحت ستيريوميكروسكوبي 600 X التكبير النهائي لمدة 1 دقيقة.
      2. إجراء تحليل إحصائي مع ANOVA أحادي اتجاه مع α = 0.05 والاختبارات بعد بونفيروني مع α = 0.05.
    3. استجابة اللمس
      1. تسجيل استجابة لمس لطيف وقارن بين المجموعات الثلاث في المعاملة. إجراء فحوصات استناداً إلى الأساليب الموصوفة كاليكستو et al. 19.
      2. سجل الأمامي والخلفي لمس استجابة بلطف الجرة انتقاء جفن عمودياً عبر الذيل أو الرأس (5 س والتناوب الرأس والذيل) من الحيوانات.
      3. نقاط أي حركة في الاتجاه المعاكس من السكتة الدماغية كالنقطة 1 على مقياس من 0 إلى 5 الأمامي والخلفي استجابة.
      4. إجراء التحليل الإحصائي مع ANOVA أحادي اتجاه مع α = 0.05 والاختبارات بعد بونفيروني مع α = 0.05.
  5. فحص الخصوبة
    1. لتحديد استخدام غربال كاينورهابديتيس للتأثير على الإنجاب، تنمو السن متزامن N2 الحيوانات لليوم الثاني من مرحلة البلوغ عند 25 درجة مئوية.
    2. ح 60 بعد وضع البيض، نقل الحيوانات إلى لوحات NGM جديدة مع اختيار البلاتين أو غربال كاينورهابديتيس وإعطائهم ح 4 لاسترداد (الجاف لوحات ينخل لمدة 20 – 30 دقيقة).
    3. بعد الاسترداد، منفردة لوحة الحيوانات عبر جفن بيك إلى لوحات NGM، منحهم 24 ساعة لوضع البيض، وإزالة الحيوانات. السماح الذرية في كل لوحة لوضع تحت الظروف العادية عند 25 درجة مئوية لآخر 24 ساعة.
      ملاحظة: انتقاء جفن جفن الإنسان المضمونة إلى نهاية ماصة باستور مع طلاء الأظافر وتعقيمها مع الإيثانول.
    4. حساب عدد أفراد الجيل F1 قابلة للحياة. إجراء تحليل إحصائي باستخدام اختبار T مع α = 0.05.
      ملاحظة: تعتبر ذرية قابلة للحياة أن البيض هاتش بنجاح والبدء في تنميتها من خلال دورات منتظمة في اليرقات.
  6. مراسل الفلورسنت الإجهاد استجابة فحوصات
    1. أداء ثلاثة فحوصات مراسل الفلورية استخداماً للكشف عن علامات محتملة للإجهاد: إزفاء DAF-16::GFP في النواة الخلايا في20سلالة [TJ356-zIs356 (pDAF-16::DAF-16-التجارة والنقل؛ ورول-6)]؛ تعبير hsp-16.2 [TJ375-gpIs1 (hsp-16.2p::GFP)]21؛ والهيئة العامة للسدود-3 تعبير [CF1553-muIs84([pAD76]sod-3p::GFP+rol-6[su1006])]22.
    2. لكل فحص، ثقافة الحيوانات العمر متزامن من المجموعات الثلاث في المعاملة عند 20 درجة مئوية ودراستها في اليوم الثالث من مرحلة البلوغ: استخدام عنصر تحكم سلبية (على أساس يومي، نقل مجموعة من الحيوانات يدوياً مع اختيار البلاتين)، عنصر تحكم إيجابية (على أساس يومي ، نقل مجموعة من الحيوانات يدوياً باختيار البلاتين بالإضافة إلى الضغوطات المنشأة)، وغربال كاينورهابديتيس (يمر غربال الحيوانات والسماح لهم باستعادة لمدة 30 دقيقة على NGM قبل التصوير).
    3. في مقايسة DAF-16::GFP، صدمة الحرارة الحيوانات التحكم الإيجابي في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل التصوير20. للمقايسة hsp-16.2، صدمة الحرارة الحيوانات السيطرة الإيجابية لمدة 90 دقيقة، ح 20 قبل التصوير21. للمقايسة 3 الهيئة العامة للسدود، معاملة الحيوانات السيطرة الإيجابية مع بركات 100 مم ح 4 قبل التصوير22.
    4. حصاد الديدان فورا مع اختيار جفن ويشن منها إلى ساترة مع ميكروليتر 1 حل الفاعل 407 بولوكسامير 36% لشل الديدان.
    5. ساندويتش الديدان المحملة مع ساترة آخر. جبل كوفيرسليبس اثنين إلى شريحة مجهرية الزجاج القياسية وصورة الديدان باستخدام 8 X تكبير على مقلوب مجهر فلوري (بالنسبة تكبير العام 80 X) ومن تعرض مستمر مع عامل تصفية فيتك.
    6. للكشف عن أي فروق بين المجموعات الثلاث في مقايسة DAF-16::GFP، تصنيف الحيوانات استناداً إلى موقع المراسل DAF-16::GFP (النووية إذا المراسل ذوبانها إلى نويات، سيتوسوليك إذا كان المراسل الموجود في سيتوسول، وإذا كان الوسيط مراسل الموقع في كل من نوى وسيتوسول).
    7. مقارنة النتائج باستخدام نموذج إحصائية سوقيات ترتيبي في برمجيات التحليل الإحصائي. Hsp-16.2 وفحوصات التعبير 3 الهيئة العامة للسدود، استخدام ANOVA اتجاه واحد مع α = 0.05 واختبارات الوظائف المخصصة توكي مع α = 0.05 مقارنة مجموع الأسفار من منطقة الرأس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

غربال كاينورهابديتيس يتكون من 2 الأغطية اللولبية، تأمين منطقة المنسوجة النايلون حيدة مش أصغر من قطر الجسم سن الإنمائية المرجوة، تستخدم لاستخراج يعيش السكان من الكائنات باستخدام تقنية غسيل بسيطة. وهو يعلق على الأنابيب المخروطية القياسية ويستخدم الشاشة مش ميكانيكيا فرز الحيوانات حسب القطر الجسم، ترك الحيوانات المرغوبة في الأنبوب جاهز لمزيد من الصيانة والتجريب (مثلاً، أو نقل أو الحصاد الوراثية). دليل لطيف الغسل منخل كاينورهابديتيس السريع، وحوالي 5 دقائق كل لوح 60 – 100 ملم، والكائنات الحية يتم استردادها بسهولة من الشبكة.

نسبة العائد من الحيوانات التالية كاينورهابديتيس استخدام غربال
إنشاء العائد النسبة المئوية من غربال كاينورهابديتيس ، تم اختبار الأجهزة مع 20 ميكرومتر وتنسجم حجم المسام ميكرومتر 50 على الحيوانات الكبار. يعني بالعائد من > تحقق 90% نجاح نقل الحيوانات لأحجام مش كل اختبار (الجدول 1).

مش شعيرات مع حجم مختلف الثغرات التي يمكن أن تستخدم لفصل حيوانات مراحل الحياة المختلفة. مش مع 20 ميكرو الثغرات المناسبة للغسيل بعيداً وضع الأجنة واليرقات مراحل أصغر من مرحلة اليرقات الرابعة، الإبقاء على هذا الأخير (L4؛ ومع قطر متوسط جسم من 32 ميكرومتر) وأي الحيوانات في مراحل لاحقة في الحياة، بينما مش مع 50 ميكرومتر الثغرات سوف تسمح لجميع مراحل الحياة الأخرى جانبا من الكبار (مع قطر متوسط جسم 70 ميكرومتر) لتكون جرفت (الجدول 2).

كاينورهابديتيس لا يؤثر استخدام غربال المقاييس هيلثسبان
حركية: في C. ايليجانس حركة جيبية عادي (أي، حركية) ينخفض مع سن18 وهو علامة على الصحة العامة. لتحديد ما إذا أثرت غربال كاينورهابديتيس حركية، كانت عشرات حركية مقارنة لانتقاء، فودر وغربال كاينورهابديتيس مجموعات العلاج في أيام 2، 4، 6، و 8 في مرحلة البلوغ. جميع الحيوانات عبر كل مجموعة (n = 10/المجموعة) عرضت أنماط الحركة العادية وعفوية (الفئة A) في الإعمار متعددة طوال مرحلة البلوغ (أيام 2 و 4، 6، و 8 لسن الرشد؛ p > 0.05 لمقارنات متعددة في جميع الأيام، الشكل 3).

معدل ضخ البلعوم: قدرة عضلات البلعوم C. ايليجانس لضخ تنخفض مع التقدم في السن، وهو آخر العلامات البيولوجية هيلثسبان23. لتحديد إذا كان غربال كاينورهابديتيس تأثر معدل ضخ البلعوم الحيوانات وانتقاء وفودر و كاينورهابديتيس قورنت غربال معاملة الجماعات في أيام 2 و 4، 6، و 8 لسن البلوغ (n = 8 إلى 10 كل مجموعة). كان هناك فرق كبير بين الحيوانات التي خضعت للانتقاء وأساليب فودر يوم 6 (ف < 0.001) و 8 (ف < 0.001). أيضا، كان هناك اختلاف كبير بين غربال والجماعات فودر في أيام 6 (ف < 0.001) ويوم 8 لسن البلوغ (ف < 0.001). بيد أنه كان هناك لا فرق معتد به إحصائيا بين الانتقاء ومجموعات غربال كاينورهابديتيس لأي يوم (p > 0.05، الرقم 4)، مما يشير إلى أن غربال لا يؤثر هذا التدبير من هيلثسبان.

استجابة اللمس اللطيف: استجابة لحافز الميكانيكية علامة فسيولوجية لتقييم عامة أو الشيخوخة الصحية24،25؛ وهكذا، تم اختبار تأثير وسائل نقل مختلفة الأمامي والخلفي لمس لطيف الردود. كان هناك لا فرق معتد به إحصائيا بين بيك، فودر و كاينورهابديتيس منخل مجموعات العلاج (n = 8/المجموعة)، أما من الأسفل أو من الخلف، لأي يوم لاختبار (ف > 0.4 لكل المقارنات؛ الشكل 5A و 5B).

الخصوبة: إنشاء أم لا تتأثر غربال كاينورهابديتيس مقدار ذرية قابلة للحياة التي تنتجها C. ايليجانس، نسل الفردية المنتجة في فترة 24 ساعة خلال اليوم الثالث من مرحلة البلوغ عد ومقارنة (n = 20 إلى 22 كل مجموعة). استخدام غربال كاينورهابديتيس لا يؤثر بشكل ملحوظ عدد ذرية تنتج عند مقارنتها بمجموعة علاج بيك (p = 0.61، الشكل 6).

فحوصات مراسل الجزيئية
داف-16 النووية إزفاء: في C. ايليجانس، تنشيط عامل النسخ DAF-16 يرتبط بازدياد الإجهاد المقاومة26. كان درس التعريب النووية DAF-16 في سلالة السلكية المعدلة وراثيا TJ356، الذي يعبر عن داف-16 التي تنصهر فيها البروتينات فلورية خضراء (DAF-16::GFP)20. ظروف النمو الطبيعي، هو مترجم DAF-16::GFP في سيتوسول المقام الأول، ولكن تحت الضغوطات المختلفة (مثلاً، الإجهاد الحراري)، هو سرعة ذوبانها إلى نواة20. لاختبار أثر الفرز مع غربال كاينورهابديتيس عن إزفاء DAF-16، قورنت تعريب DAF-16::GFP في مطابقة عصر اليوم-5 أشخاص بالغين في مجموعة مراقبة إيجابية (الإجهاد الحراري)، مجموعة مراقبة سلبية (نقل يدوي عن طريق اختيار)، و مجموعات علاج غربال كاينورهابديتيس (n = 10/المجموعة). النقل مع غربال كاينورهابديتيس لم تؤثر على نقل جسد النووية DAF-16::GFP، وأظهر النمط الظاهري مشابهة للحيوانات السيطرة السلبية (p > 0.05، رقم 7).

مراسل hsp 16.2 : البروتينات صدمة الحرارة الصغيرة مثل HSP 16.2 المؤشرات الحيوية لاستجابة الإجهاد، ويتم التعبير عنها عاليا أثناء تعرض لصدمة الحرارة أو الأكسدة وكلاء21،27. سلالة TJ375 بجينات مراسل بروتينات فلورية خضراء تنصهر مع مروج hsp 16.2 غير نشطة تحت الظروف العادية21. ومع ذلك، بعد تعرض لصدمة حرارة، فعل التعبير البروتين HSP-16.2، والحيوانات عرض مستويات عالية من بروتينات فلورية خضراء التعبير21. لاختبار مشاركة غربال كاينورهابديتيس على استجابة إجهاد HSP 16.2-بوساطة، وكثافة fluorescence في منطقة البلعوم (n = 10 الحيوانات/المجموعة) العمر مطابقة الحيوانات مقارنة في يوم-5 أشخاص بالغين بين مجموعة مراقبة إيجابية (الحرارة الإجهاد)، مراقبة سلبية مجموعة (اختيار)، ومجموعة علاج غربال كاينورهابديتيس . النقل مع غربال كاينورهابديتيس لا حمل كبير التعبير عن HSP-16.2::GFP (hsp-16.2::gfp) عند مقارنتها بمراقبة سلبية (p > 0.05، الرقم 8).

3-الهيئة العامة للسدود المراسل: في C. ايليجانس، الجينات المضادة للأكسدة التي رموز لفائق أكسيد الفاءق (الأحمق-3) 3 ينظم حتى أثناء الأكسدة28. البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) وتعرب عن سلالة C. ايليجانس CF1553-المسمى المروج 3 الهيئة العامة للسدود، التعبير الذي هو الناجم عن عوامل إجهاد الأكسدة، مثل بركات5. لاختبار مشاركة كاينورهابديتيس غربال الفرز على الاستجابة المضادة للأكسدة في C. ايليجانس، كثافة fluorescence في منطقة الرأس مطابقة سن البالغين اليوم-5 مقارنة بين سكان السيطرة إيجابية (100 ميكرومتر بركات العلاج)، عدد سكان السيطرة سلبية (الانتقاء اليدوي)، و كاينورهابديتيس غربال نقل السكان. النقل مع غربال كاينورهابديتيس لا الحث على كثيرا التعبير عن 3::gfp أبله عند مقارنتها بمراقبة سلبية (p > 0.05، الشكل 9).

Figure 1
الشكل 1: كاينورهابديتيس غربال البناء- ويبين تطور صناعة الأداة 'أفعل ذلك بنفسك'. تظهر هذه الألواح (A) هما 50 مل الأنبوبة المخروطية قبعات (ب) المراكز التي أزيلت، (ج) قطع حواف ممهدة، و (د - و) منظمة الصحة العالمية وهي مزودة بشعيرات مش المقابلة إلى مرحلة الحياة المرجوة من ايليجانس جيم (انظر البروتوكول للحصول على التفاصيل). (ز) هو أيضا سيظهر غربال المكتملة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2: تمثيل الصورة خطوة بخطوة استخدام غربال كاينورهابديتيس . (أ) غربال الرطب مسبقاً مع قطره حل M9، وتناسب (ب) على رأس أنبوب مخروطي 50 مل. (ج) 1 مل M9 هو بيبيتيد الحل مع الديدان على ظهر المركب غربال، (د) هو وضع أنبوب مخروطي 50 مل أعلى المنخل مع الديدان التي تواجهها داخل أنبوب، و (ه) غربال مع المرفق حديثا الأنبوب العلوي س سرعان ما انقلبت ver. (ز) يتم شطفها المنخل مع M9 تحمل الحيوانات المرغوبة إلى 50 مل جديدة يسمح أنبوب والديدان تسوية بالجاذبية إلى الجزء السفلي من الأنبوب. (ح) بيبيتيد الديدان ووضعها كقطرات على لوحة NGM طازجة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: عدم تأثير غربال كاينورهابديتيس حركية طوال عمر- وهذا الرقم يبين توزيع فئة حركية الحيوانات في أيام 2 و 4، 6، و 8 لسن البلوغ لانتقاء، فودر، و كاينورهابديتيس غربال معاملة الجماعات. نقل الحيوانات "من الدرجة الأولى" عادة وعفوية، الحيوانات الفئة ب نقل صورة غير طبيعية، وقد يكون مطلوباً الحث، والحيوانات من الفئة جيم لم يتمكنوا من نقل. لم يكن هناك فرق بين غربال كاينورهابديتيس واختيار مجموعات فودر (p > 0.05). Replicates ثلاثة (n = 10 الحيوانات للوحة المعاملة الواحدة) قد أجرى وتحليلها مع النموذج اللوجستي ترتيبي. الفئة ب الحيوانات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: استخدام غربال كاينورهابديتيس لا يؤثر الضخ البلعوم طوال العمر- وهذا الرقم يبين معدلات ضخ البلعوم بيك، فودر، وغربال كاينورهابديتيس معاملة الجماعات، بالمقارنة مع أيام 2، 4، 6، و 8 من مرحلة البلوغ. العلامات النجمية تدل دلالة بين الانتقاء، غربال، ومجموعات العلاج فودر في الأيام المحددة (* * * ف < 0.05). لم يكن هناك فرق بين غربال كاينورهابديتيس واختيار المجموعة (p > 0.05). Replicates اثنين (N = 10 الحيوانات للوحة المعاملة الواحدة) كانت تجري وتحليلها مع أحادي اتجاه ANOVA واختبار بونفيروني بعد. وتمثل القضبان ± يعني الخطأ المعياري للوسط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5: لا يؤثر استخدام غربال كاينورهابديتيس استجابة اللمس الأمامي طوال عمر- إظهار هذه الألواح (A) الأمامي وغربال (ب) عدد استجابة اللمس الخلفي بيك وفودر كاينورهابديتيس معاملة مجموعات المقارنة في أيام 2، 4، 6، و 8 من مرحلة البلوغ. Replicates اثنين أجريت مع N = 10 لكل مجموعة العلاج ومقارنة مع أحادي اتجاه ANOVA واختبار بونفيروني بعد (ف = 0.4 و p = 0.9 الأمامي والخلفي، على التوالي). وتمثل القضبان ± يعني الخطأ المعياري للوسط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
الشكل 6: غربال كاينورهابديتيس لا يؤثر مقدار ذرية قابلة للحياة في اليوم 3 من مرحلة البلوغ. يظهر هذا الشكل ذرية قابلة للحياة للبالغين اليوم-3 بعد فترة وضع بيض ح 24، التي تغطي اليوم 3 لسن البلوغ للحيوانات الأصل. وتمثل القضبان ± يعني الخطأ المعياري للوسط. N = الحيوانات 20-22 من اثنين على الأقل replicates بيولوجية منفصلة كل مجموعة العلاج. مجموعات العلاج مقارنة مع تي-اختبار، (p > 0.05). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
الشكل 7: لم يؤثر على غربال كاينورهابديتيس النووية إزفاء من DAF-16::GFP- هذه اللوحات تظهر الصور التمثيلية إزفاء DAF-16 من المجموعة (A) صدمة حرارة (عنصر التحكم الإيجابي) والمجموعة (ب) اختيار (عنصر التحكم السلبية) ومجموعة العلاج غربال (ج) كاينورهابديتيس . (د) عرض الحيوانات في مجموعة مراقبة إيجابية تنشيط من إزفاء النووية DAF-16. الحث على عدم إزفاء نووية غربال كاينورهابديتيس وعرض البروتين الانصهار سيتوسوليك مشابهة للحيوانات في مجموعة المراقبة السلبية. N = 10 الحيوانات كل معاملة مجموعة من ثلاثة على الأقل replicates بيولوجية منفصلة. مجموعات العلاج قورنت مع أحادي اتجاه ANOVA واختبار توكي الوظائف المخصصة . شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 8
الشكل 8: غربال كاينورهابديتيس لا يؤثر على التعبير عن hsp16.2::gfp- تتم مقارنة التعبيرات HSP 16.2 (في وحدات التعسفي الأسفار) مجموعة صدمة حرارة (عنصر التحكم الإيجابي) ومجموعة اختيار (عنصر التحكم السلبي)، ومجموعة علاج غربال كاينورهابديتيس . تعبير عالية من hsp16.2::gfp لمجموعة المراقبة الإيجابية التي كانت تختلف اختلافاً كبيرا عن المجموعات المعاملة الأخرى تدل على العلامات النجمية (* * * ف < 0.05). غربال كاينورهابديتيس لم يؤثر على التعبير hsp16.2::gfp وعرض fluorescence كثافة مماثلة للحيوانات في مجموعة المراقبة السلبية (p > 0.05). Replicates ثلاثة أجريت مع N = 10 لكل مجموعة العلاج ومقارنة مع أحادي اتجاه ANOVA واختبار توكي الوظائف المخصصة . الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 9
الشكل 9: غربال كاينورهابديتيس لا يؤثر على التعبير عن الهيئة العامة للسدود-3::gfp- وترد عبارات الأحمق-3 (بوحدات التعسفي الأسفار) مجموعة بركات 100 ميكرومتر (عنصر التحكم الإيجابي) ومجموعة اختيار (عنصر التحكم السلبي)، ومجموعة علاج غربال كاينورهابديتيس . العلامات النجمية تدل على تعبير عالية من الهيئة العامة للسدود-3::gfp لمجموعة المراقبة الإيجابية التي كانت تختلف اختلافاً كبيرا عن المجموعات الأخرى (* * * ف < 0.05). غربال كاينورهابديتيس لم يؤثر على التعبير 3::gfp الهيئة العامة للسدود وعرض fluorescence كثافة مماثلة للحيوانات في مجموعة المراقبة السلبية (p > 0.05). Replicates ثلاثة أجريت مع N = 10 لكل مجموعة العلاج ومقارنة مع أحادي اتجاه ANOVA واختبار توكي الوظائف المخصصة . الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

حجم الشبكة N = 50 N = 100
20 ميكرومتر 95.33%
50 ميكرومتر 99.00% 93.33%

الجدول 1: النسبة المئوية العائد من أحجام مش- ويبين هذا الجدول النتائج جهاز ميكرومتر 20 اختبار مع N = البالغين 50 3 replicates وجهاز ميكرومتر 50 اختبار مع N = 50 من البالغين ل 2 replicates ومع N = 100 ل 3 replicates.

حجم الشبكة مرحلة النمو قطر الجسم
20 ميكرومتر مرحلة اليرقات 4 ميكرومتر ~ 35
50 ميكرومتر الكبار يوم 1 ~ 70 ميكرومتر

الجدول 2: القطر يعني الجسم. يعرض هذا الجدول قطر الجسم يعني اكتسبت بمتوسط 3 قياسات نفس القدر تنتشر عبر كل دودة الحيوانات 15 في كل مرحلة من مراحل الحياة المقيسة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وهنا، قدمنا تصميم واستخدام غربال كاينورهابديتيس ميسرة وفعالة كأداة للفرز والحفاظ على C. ايليجانس. هذه الأداة ومزايا عدة لانتقاء الحيوانات الفردية، غسل السكان والعلاجات الكيميائية (مثلاً، فودر)، وأساليب أكثر تكلفة من الحيوانات فصل يدوياً. أولاً، منخل كاينورهابديتيس كفاءة وسرعة (أقل من 20 دقيقة) يفرز ذرية من عدد كبير من السكان مختلطة من الحيوانات (الجدول 2). أيضا، استخدام الأداة أي آثار سامة قابلة للكشف على هيلثسبان الحيوانات (الشكل 3، الرقم 4، 5 الشكل، الشكل 6)، والحث على عدم الإجهاد الوراثية جيدا وصف الصحفيين (الشكل 7، 8 الشكل ، رقم 9)، ويقلل من كمية المواد الكيميائية الخارجية التي يمكن أن تؤثر على معاملة التطبيقية إلى لوحات الثقافة أو أي التحليل الجزيئي بعد ذلك. سهولة الاستخدام ميزة كبيرة؛ ويمكن تدريب باحث في أي مرحلة من مراحل التعليم لاستخدامه (الشكل 1 و الشكل 2؛ البروتوكول).

المواد اللازمة لتصنيع واستعمال غربال (مثلاً، الماصات، ومخازن) متوفرة بسهولة في مختبرات البحوث القياسية؛ وهكذا، إذا كانت مكسورة، غربال كاينورهابديتيس ليست مكلفة لاستبدال أو إصلاح. طبيعة ذاتية شيدت غربال كاينورهابديتيس يسمح لها أن تكون أداة متعددة الاستخدامات: فإنه يمكن بناؤها مع أحجام مش مناسبة لمختلف ايليجانس جيم- مراحل النمو وتعمل. كما يمكن استخدام غربال كاينورهابديتيس في الاختبارات التي تجري في سائر الأنواع السلكية أو عند عزل الكائنات الصغيرة، وتوفير حجم مناسب مش المستخدمة عند تصنيع.

بالإضافة إلى الفوائد التي توفر هذه الأداة لصيانة السكان C. ايليجانس ، يمكن استخدامها في غربال لتنظيف الحيوانات قبل استخدامها في تطبيقات تجريبية أخرى. على سبيل المثال، مع وضع ميكروفلويديكس لإجراء C. ايليجانس يأتي البحث مسألة استخدام رقاقة والتنظيف. اعتماداً على مقدار البكتيريا التي تعلق على الحيوانات، الاحتياطات الخاصة الواجب اتخاذها حتى لا تتعرض لتسد رقاقة موائع جزيئية، جعلها غير صالحة للاستعمال29. غالباً عندما يتم نقل C. ايليجانس على رقاقة موائع جزيئية، وبقايا من العشب الجرثومي جلبت معها. يمكن هذه المخلفات وتسد القنوات موائع جزيئية، مما عطل رقاقة، ثم تتطلب التنظيف أو الاستبدال. بناء الجهاز في هذا البروتوكول يوفر طريقة للحصاد ليس فقط الحيوانات متزامنة ميكروفلويديكس، ولكن أيضا لتنظيف الحيوانات قبل إدخالهم في جهاز موائع جزيئية. عن طريق إزالة الحطام وبقايا البكتيرية، عندما جمع الحيوانات، قنوات موائع جزيئية أقل عرضه لخلل، وبالتالي زيادة العمر التشغيلي لرقائق الفردية والإنتاجية اللاحقة من البحوث التي تجري معهم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن. الكتاب يعلن أنه أجرى البحث في غياب أي علاقات تجارية أو مالية يمكن أن يفسر تضارب المصالح محتملة.

Acknowledgments

الكتاب يود أن يشكر هيذر كوري لمساهمتها الأولية في تصميم الدراسة، والدكتور سواراب ميترا لبلده استعراض نقدي للمخطوطة. ونود أيضا أن نشكر الدكتور مايكل باء هاريس على التعليقات، والتحسينات والمساعدة في إعداد البيان العملي لهذه المنهجية. وقدمت السلالات كاينورهابديتيس مركز علم الوراثة، والذي يموله مكتب المعاهد الوطنية للصحة "برامج الهياكل الأساسية للبحوث" (P40 OD010440). وأيد البحث عنها في هذا المنشور بالمعهد الوطني للعلوم الطبية العامة "معاهد الصحة الوطنية في" إطار جائزة أرقام UL1GM118991 أو TL4GM118992 أو RL5GM118990 وجائزة التنمية المؤسسية (فكرة) من المعهد الوطني للعامة الطبية العلوم من "معاهد الصحة الوطنية في" إطار المنحة رقم 5P20GM103395-15. المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية "المعاهد الوطنية للصحة". تعميم الوصول إلى الخدمات هو AA/EO صاحب العمل والمؤسسة التعليمية، ويحظر التمييز غير المشروع ضد أي فرد: www.alaska.edu/titleIXcompliance/nondiscrimination.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Safety glasses Uline S-21076
Protective heat resistant glove Grainger Item # 3AT17 Mfr. Model # 3AT17 Catalog Page # 1703
50 mL conical tube Falcon 14-432-22
Synthetic Nylon mesh Dynamic
Aqua-Supply Ltd		 NTX20 and NTX50
Cyanoacrylate glue Scotch Super Glue Liquid SAD114
Pliers Vampliers VMPVT-001-8
Dremmel tool with circular file Lowe's Item # 525945 Model # 100-LG
FUDR Sigma F0503
M9 chemicals ( NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4)  Sigma  S7653, RES20908-A7, 1551139, M7506
NGM plate chemicals (Bactopeptone, Agar, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2,Cholesterol, Streptomycin) BD Biosciences (bactopeptone) , Lab express (agar), Sigma ( rest) BD bioscience 211677, Lab Express 1001,  Sigma 1551139, 1551128, C1016, C8667, S6501
Pluronic F-127 Sigma P2443
Paraquat dichloride hydrate Sigma 36541
Inverted fluorescence microscope Olympus FSX100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. C elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).
  2. Herman, M. A. Hermaphrodite cell-fate specification. WormBook. , 1-16 (2006).
  3. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  4. Chalfie, M., Hart, A. C., Rankin, C. H., Goodman, M. B. Assaying mechanosensation. WormBook. , (2014).
  5. Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Deletion of the Mitochondrial Superoxide Dismutase sod-2 Extends Lifespan in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 5 (2), e1000361 (2009).
  6. Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of Ageing Development. 132 (10), 519-521 (2011).
  7. Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing Development. 12 (2), 137-150 (1980).
  8. Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of Ageing and Development. 131 (5), 364-365 (2010).
  9. Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing Development. 133 (1), 46-49 (2012).
  10. Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9 (1), e85964 (2014).
  11. Pulak, R. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. Methods Molecular Biology. 351, 275-286 (2006).
  12. Argon, Y., Ward, S. Caenorhabditis elegans fertilization-defective mutants with abnormal sperm. Genetics. 96 (2), 413-433 (1980).
  13. Lee, S. J., Kenyon, C. Regulation of the longevity response to temperature by thermosensory neurons in Caenorhabditis elegans. Current Biology. 19 (9), 715-722 (2009).
  14. Klass, M. R. Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span. Mechanisms of Ageing Development. 6 (6), 413-429 (1977).
  15. Zhang, B., et al. Environmental Temperature Differentially Modulates C. elegans Longevity through a Thermosensitive TRP Channel. Cell Reports. 11 (9), 1414-1424 (2015).
  16. Michaelson, L. C. C. elegans: A Practical Approach. Ian A. Hope (ed.). Oxford University Press, Oxford. 1999. Pp. 281. ISBN 0 19 963738 5. Heredity. 85 (1), 97-100 (2000).
  17. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  18. Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).
  19. Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).
  20. Henderson, S. T., Johnson, T. E. daf-16 integrates developmental and environmental inputs to mediate aging in the nematode Caenorhabditis elegans. Current Biology. 11 (24), 1975-1980 (2001).
  21. Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).
  22. Libina, N., Berman, J. R., Kenyon, C. Tissue-specific activities of C. elegans DAF-16 in the regulation of lifespan. Cell. 115 (4), 489-502 (2003).
  23. Keith, S. A., Amrit, F. R., Ratnappan, R., Ghazi, A. The C. elegans healthspan and stress-resistance assay toolkit. Methods. 68 (3), 476-486 (2014).
  24. Scerbak, C., Vayndorf, E. M., Hernandez, A., McGill, C., Taylor, B. E. Mechanosensory neuron aging: Differential trajectories with lifespan-extending alaskan berry and fungal treatments in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Aging Neuroscience. 8, 173 (2016).
  25. Vayndorf, E. M., et al. Morphological remodeling of C. elegans neurons during aging is modified by compromised protein homeostasis. npj Aging and Mechanisms of Disease. 2, 16001 (2016).
  26. Murakami, S., Johnson, T. E. A genetic pathway conferring life extension and resistance to UV stress in Caenorhabditis elegans. Genetics. 143 (3), 1207-1218 (1996).
  27. Abbas, S., Wink, M. Green Tea Extract Induces the Resistance of Caenorhabditis elegans against Oxidative Stress. Antioxidants (Basel). 3 (1), 129-143 (2014).
  28. Yanase, S., Hartman, P. S., Ito, A., Ishii, N. Oxidative stress pretreatment increases the X-radiation resistance of the nematode Caenorhabditis elegans. Mutation Research. 426 (1), 31-39 (1999).
  29. Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 137، ايليجانس كاينورهابديتيس، الفرز، ونقل، والتزامن، سريعة وميسرة
<em>كاينورهابديتيس</em> غربال: صك التكنولوجيا المنخفضة ومنهجية لفرز الكائنات متعددة الخلايا الصغيرة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hunter, S., Maulik, M., Scerbak, C., … More

Hunter, S., Maulik, M., Scerbak, C., Vayndorf, E., Taylor, B. E. Caenorhabditis Sieve: A Low-tech Instrument and Methodology for Sorting Small Multicellular Organisms. J. Vis. Exp. (137), e58014, doi:10.3791/58014 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter