Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Caenorhabditis Si: En Low-tech Instrument og metode til sortering af små flercellede organismer

Published: July 4, 2018 doi: 10.3791/58014
* These authors contributed equally

Summary

Den nuværende protokol omfatter en metode til sortering og rensning af alder-matchede populationer af Caenorhabditis elegans. Det bruger en enkel, billig, og effektiv skræddersyet værktøj til at opnå en stor eksperimentelle population af nematoder til forskning.

Abstract

Caenorhabditis elegans (C. elegans) er en veletableret model organisme, der anvendes på tværs af en vifte af grundlæggende og biomedicinsk forskning. Fællesskabets ødelægge forskning er der behov for en overkommelig og effektiv måde at opretholde store, alder-matchede bestande af C. elegans. Her præsenterer vi en metode for mekanisk sortering og rensning C. elegans. Vores mål er at levere en omkostningseffektiv, effektiv, hurtig og enkel proces for at få dyr af ensartet størrelse og udviklingstrin for deres anvendelse til forsøg. Dette værktøj, Caenorhabditis si, bruger et specialbygget låg system tråde på fælles konisk lab rør og sorterer C. elegans baseret på kropsstørrelse. Vi viser også, at Caenorhabditis si effektivt overfører dyr fra én kultur plade til en anden giver mulighed for en hurtig sortering, synkronisering og rengøring uden at det påvirker markører for sundhed, herunder motilitet og stress-inducerbar gen journalister. Dette tilgængelige og innovative værktøj er en hurtig, effektiv og ikke-stressende mulighed for at opretholde C. elegans populationer.

Introduction

Ormen nematodeprøveudtagning, Caenorhabditis elegans, er en førende model organisme. Ud over den enkle og kontrolleret karakter af deres dyrkning i laboratoriet, deres hele genom er sekventeret1 og udviklingsmæssige skæbne af hver celle er kendt for2. På grund af disse funktioner er C. elegans en meget anvendt model organisme til genetiske undersøgelser. Men sammen med disse gavnlige egenskaber kommer nogle udfordringer for forskere. På grund af deres hurtig generationstid, C. elegans befolkninger kan hurtigt løbe tør for mad og/eller blive blandet populationer med flere generationer og udviklingsstadier præsenterer på én gang. Forsøg udført på solid ødelægge vækst medier (NGM) kræver således, forskere fysisk flytte dyrene til frisk plader før den bakterielle fødekilde udtømning og udvikling af nye larver. Dette kan være trættende, som en hyppige overførsel af dyrene er påkrævet for at forhindre de eksperimentelle befolkninger fra at blive blandet med afkom generationer. Stadig, nogle eksperimenter kræver begge stort antal dyr og udvidet tidspunkter (fx, DNA eller RNA udvinding i voksenalderen). Dette forbindelser udfordringer med præcist opretholde en synkroniseret befolkning og overføre store mængder af dyr.

Nuværende metoder til at overføre C. elegans kulturperler på NGM picking eller vaske dyrene fra plade til plade; kemisk behandling af dyr (f.eks.med DNA replikation hæmmer fluorodeoxyuridine eller FUDR); eller ved hjælp af flowcytometri for at sortere dyrene i multi godt plader. Picking indebærer anvendelse af en håndværktøj, lavet med enten en tynd platin tråd eller en øjenvipper, manuelt overføre enkelte eller flere dyr3,4. Denne metode er nøjagtig, men kræver både dygtighed og tid og er en begrænsning for undersøgelser, hvor stort antal dyr. Picking maj også være fysisk skade og stressende at dyrene af potentielt udsætte individer for unaturlige og inkonsekvent beløb forstyrrelse og kraft. Vask indebærer skylning en kultur parabol med en stødpudeopløsning og overføre løsning med dyr via glas Pasteur pipette til en ny kultur plade. Denne metode er hurtig og effektiv, men er ikke nøjagtig som flere generationer og udviklingsstadier af dyr overføres i bulk. Kemiske behandlinger, såsom FUDR, kan opløses i dyrkningsbaserede medierne til at forhindre produktion af afkom via blokering nogen DNA-replikation, og dermed gameter produktion og æg udvikling. Mens effektivt, denne metode skal anvendes efter udviklingsmæssige modning, ikke forstyrre de normale udviklingsprocesser, og det betyder, at der stadig et krav om at overføre dyr før sin administration3. Denne metode påvirker også flere cellulær signalering veje, hvilket resulterer i mærkbar indvirkning på dyr, som de bliver ældre (f.eks, en forlængelse af levetiden eller en ændret proteostasis) alt efter stamme af C. elegans brugt5, 6,7,8,9,10. Flow flowcytometri metoder automatisk sortere og overføre enkelte C. elegans fra en multi godt plade til en anden11. Mens denne metode er meget effektiv og produktiv, er flow flowcytometri udstyr uoverkommeligt dyre og utilgængelige for mange forskere. Et alternativ til overførsel af dyr er at bruge mutant modeller, der er temperaturen følsomme, som fer-15 og Five-1, som bliver steril med temperatur tilpasning12. Mens du bruger mutant dyr er nyttige i nogle situationer, disse specifikke stammer vokse langsommere end wild-type dyr og de er afhængige af en ændret genom, der tjener som fattige repræsentanter for aging eller sund orme. Derudover afhængigheden af en temperatur Skift til at fremkalde sterilitet resulterer også i mangel af en statisk miljø, og temperaturændringer har let vist sig at påvirke gen udtryk13,14, 15. forskergrupper har tidligere udgivet teknikker der beskriver brugen af en maske til at filtrere C. elegans af størrelse16. Men vi var afskåret fra hitte foregående arbejde testning for eventuelle ændringer i de samlede sundhedsresultater, der kan være forbundet med anvendelsen af sådanne filtre.

Der er således behov inden for forskningsverdenen C. elegans for en overkommelig, effektiv, hurtig og præcis metode til at overføre store mængder af dyr mellem kultur plader. Vi har udviklet en forbedret, tilgængelige stykke udstyr (opkaldt Caenorhabditis SI) og en tilknyttet protokol til dens fremstilling og drift, der opfylder behovene, som forskersamfundet C. elegans . Heri, vi dele design af Caenorhabditis si og metoder for dets anvendelse, og vi viser, at dets anvendelse ikke påvirker den almindelige sundhed eller nogen stress markører i forhold til standard manuel plukning og en behandling med de almindeligt anvendt, Fertility-begrænse kemiske FUDR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Caenorhabditis si konstruktion og brug

  1. Byggeri protokol
    1. Erhverve 2 låg fra 50 mL konisk rør (figur 1A).
    2. Fjerne center området inde den indre læbe af låg (når set fra bunden, figur 1B) ved hjælp af en bunsenbrænder og et varmt metal sonde eller en loddekolbe eller trådte drill bit.
      Bemærk: Ved hjælp af varme til at skære den plast låg er at foretrække frem for en kniv, fordi der er mindre risiko for skader.
    3. Ren og sand de afskårne kanter og top overfladen med en buet fil eller en rotary slibe værktøj (f.eks.Dremel). Se figur 1 c.
    4. Skær cirklen af monofilamenter-mesh til den passende diameter (fig. 1 d). For dette, spore et låg på en monofilamenter nylon mesh ark og skære lige inden den streg.
    5. Skær riller/flænger i den øverste overflade af låg til at forbedre vedhæftning af to låg, når limen påføres plastik (figur 1E).
    6. Rengør låg med ethanol og lad dem tørre.
    7. Anvende ren lim på oversiden af begge låg, holde på den ydre kant.
      Bemærk: en lille lim går en lang vej.
    8. Lå monofilamenter-mesh, ifølge tabel 1, på en limet låg (figur 1F). Placer den anden låg omvendt på toppen af trådnet; både låg skal have deres toppe sammen. Tryk på fast sammen (figur 1 g). Sikre at trådnet er stram.
      Bemærk: som en sikkerhedsforanstaltning, brug pincet til at placere trådnet på låg.
    9. Når det første lag i limen er tørret, anvende en ring af ren lim rundt den ydre kløften mellem låg. Være generøs som dette tilføjer integritet og forhindrer enhver peeling fra hinanden eller utæt.
    10. Mærke filter med den trådnet pore monofilamenter maskestørrelser.
      Bemærk: Her bruger vi to maskestørrelser pore-20 µm og 50 µm.
  2. Bruge protokollen
    1. Pre våd sigten.
      1. Med pipette udtages en saltopløsning, som M9 [5 g NaCl, 6 g Na2HPO4, 3 g KH2PO4, 1 L laves H2O og 1 mL af MgSO4 (1 M)]17, gennem midten af sien indtil en droplet former , kondenserer, og drypper ned i midten af filter bunden (figur 2A). Valgfrit, anvende en fnugfri serviet (f.eks.Kimwipe) til bunden til figur eller sprede en fugt dråbe på trådnet.
      2. Sigten over en 50 mL konisk slange. Label tube som 'Affald tube' (figur 2B).
    2. Vask en befolkning af C. elegans off en agar plade.
      1. Vaske pladen med M9 buffer og placere den orm-holdige medium på inderlåret af monofilamenter-mesh 1 mL ad gangen (figur 2 c). Sørg for at operere i midten af trådnet. Vask alle orme fra pladen.
        Bemærk: Typisk, 3 mL af M9 for en 60 mm plade er tilstrækkelig.
      2. For at minimere antallet af orme tabt i pipettering, skal du bruge et glas Pasteur pipette til at flytte orme ud på pladen og på den trådnet center (Gentag efter behov).
      3. Skyl filteret med M9 bufferen fra toppen. Igen, Sørg for at operere i midten af trådnet og skyl alle orme i dette område. Vask så mange gange som nødvendigt for at sikre, at alle de bakterier og mindre orme har passeret trådnet.
    3. Høste de størrelse-matchede dyr fra sigten.
      1. Knytte en ny 50 mL konisk slange til toppen af sigte de voksne orme fra trin 1.2.2.3 vender indersiden af nye samling røret (figur 2D).
      2. Fjern det første rør (affald tube) og hurtigt bladre over si og nye rør til at holde denne droplet fra overflytning (figur 2E).
        Bemærk: Hvis der ikke kræves sterilitet, bruge en fnugfri serviet (f.eks.Kimwipe) til vægen væske fra bunden af trådnet før flipping.
      3. Skyl trådnet med M9 ind i den nye 50 mL rør fra den nye inderlår (figur 2F). Igen, drive i trådnet centeret og opretholde et slipværktøj på undersiden af trådnet.
      4. Tillad orme til at bosætte sig eller forsigtigt dreje dem ned (f.eks.< 16 x g) for ca. 1 min. (fig. 2 g).
      5. Opsug stødpudeopløsning fra pellet af orme, ideelt set ned til > 0,5 mL, eller fjerne så meget væske som muligt uden at forstyrre pelleten.
      6. Afpipetteres ormene ved hjælp af et glas Pasteur afpipetteres på en NGM tallerken og lad dem tørre. Plads flere dråber ud på en ny plade så de tørre hurtigere (figur 2 H).
    4. Rens sien.
      1. Skyl sigten forsigtigt og grundigt med ethanol og omvendt-osmose vand. Lad det tørre.
      2. Opbevar det i en ren beholder til ubestemt fremtidig brug.
      3. Kassere det når trådnet udvikler en "sag" udseende.

2. validering af Caenorhabditis sigtes sorteringsmetoden

  1. Generel vedligeholdelse
    1. For alle eksperimenter, orme kultur på en standard Nematode vækst medier17 (1 L af NGM består af 2,5 g af pepton, 17 g agar, 3 g NaCl, 975 mL dobbeltdestilleret vand, 1 mL 5 mg/mL kolesterol, 1 mL 1 M CaCl2 1 mL 1 M MgSO4, 25 mL 1 M KHPO4og 0,5 mL af 100 mg/mL streptomycin) på 25 ° C.
  2. Eksperimentel behandling administration
    1. Sammenlign de tre behandlingsgrupper: pick, fluorodeoxyuridine (FUDR) og Caenorhabditis si.
      1. For gruppen FUDR behandling tilsættes 100 mg/mL FUDR NGM medier til en endelig koncentration på 100 μM at forhindre enhver afkom produktion og overføre orme hver anden dag til en frisk NGM plade til at undgå mad udtynding.
      2. For gruppen pluk vælge og overføre ormene manuelt ved hjælp af en platin løkke.
      3. For gruppen Caenorhabditis si behandling Følg trin 1.2 og afpipetteres orme på en NGM tallerken.
  3. Caenorhabditis Sigten procent udbytte
    1. For at opgøre, hvor effektiv sigten er på sortering C. elegans, vokse alder-synkron N2 dyr til dag 1 i voksenalderen ved 25 ° C (dvs., 48 timer efter æglægning) og derefter overføre dem ved at samle dem til frisk NGM plader (dimensionssammentælling N = 50 eller N = 100 dyr pr. tre atment gruppe).
    2. Efter 24 timer af recovery, overføre befolkningen til nye NGM plader med Caenorhabditis sigte efter ovennævnte protokol (Se trin 1.2) og tælle antallet af dyr, med held overført.
    3. Beregn den procentvise udbytte som forholdet mellem antallet af dyr overføres i forhold til startnummer i begyndelsen overdragelsen ganget med 100 (%).
  4. Healthspan assays
    Bemærk: Score healthspan parametre af klassen motilitet, svælg pumpe sats, og både de forreste og bageste blid touch svar på dag 2, 4, 6 og 8 i voksenalderen for alder-synkroniseret N2 dyr holdes på 25 ° C.
    1. Motilitet tracking
      1. Tildele motilitet point baseret på en klasse-baseret system (klasse A, B og C) efter metoder til Herndon et al. 18. sammenligne effekten af de tre eksperimentelle grupper ved hjælp af en ordinal logistisk statistik model i statistisk analyse software.
        Bemærk: Klasse A enkeltpersoner flytte spontant i en normal, sinusformet mønster. Klasse B personer flytter i markant ikke-sinusformede bevægelser og kan kræve prodding for at fremme bevægelse. Klasse C personer flytter deres hoved og/eller hale i kraftig tilskyndelse men er ikke i stand til at bevæge sig på tværs af agaren.
    2. Svælg pumpe sats
      1. Tælle grinder bevægelse af dyrets terminal svælg pære visuelt under et stereomikroskop på en 600 X endelige forstørrelse i 1 minut.
      2. Foretage en statistisk analyse med en en-vejs ANOVA med α = 0,05 og Bonferroni post test med α = 0,05.
    3. Touch svar
      1. Optage en blid touch svar og sammenligne mellem de tre behandlingsgrupper. Udføre assays baseret på de metoder beskrevet af Calixto et al. 19.
      2. Post den anteriore og posteriore touch svar af sagte slag en øjenvipper pick vinkelret på tværs af halen eller hoved (5 x, skiftende hoved og hale) af dyr.
      3. Score enhver bevægelse i den modsatte retning af slagtilfælde som 1 point på en skala fra 0 til 5 for både den forreste og den bageste svar.
      4. Gennemføre statistiske analyse med en en-vejs ANOVA med α = 0,05 og Bonferroni post test med α = 0,05.
  5. Frugtbarhed assay
    1. For at bestemme brugen af Caenorhabditis sien indvirkning på formeringsevnen, vokse alder-synkron N2 dyr til dag 2 i voksenalderen ved 25 ° C.
    2. 60 h efter æg lå, overføre dyr til nye NGM plader med enten en platin pluk- eller Caenorhabditis sigte og give dem 4 h at inddrive (tørre de sigtede plader for 20-30 min).
    3. Efter inddrivelsen, individuelt plade dyr via en øjenvipper pick at NGM plader, give dem 24 timer at lægge æg, og fjerne dyrene. Tillad afkommet på hver plade til at udvikle under normale forhold ved 25 ° C til en anden 24 h.
      Bemærk: En øjenvipper pick er en menneskelig øjenvipper sikret til slutningen af Pasteur pipette med neglelak og steriliseret med ethanol.
    4. Tæl antallet af levedygtige F1 generation individer. Udføre en statistisk analyse ved hjælp af en T-test med α = 0,05.
      Bemærk: Levedygtige afkom er anset for at være æg, der med held klækkes og begynde deres udvikling gennem de regelmæssige larve cykler.
  6. Fluorescerende reporter stress reaktion assays
    1. Udføre tre almindeligt anvendte fluorescerende reporter assays for at afsløre potentielle markører for stress: en DAF-16::GFP omplantning i kerner af celler i en stamme [TJ356-zIs356 (pDAF-16::DAF-16-NGL; rol-6)]20; hsp-16.2 udtryk [TJ375-gpIs1 (hsp-16.2p::GFP)]21; og en sod-3 udtryk [CF1553-muIs84([pAD76]sod-3p::GFP+rol-6[su1006])]22.
    2. For hvert assay, kultur alder-synkron dyr fra de tre behandlingsgrupper ved 20 ° C og undersøge dem på dag 3 af voksenalderen: Brug en negativ kontrol (på daglig basis, overføre en gruppe dyr manuelt med en platin pick), en positiv kontrol (på en daglig basis overføre en gruppe dyr manuelt med en platin pick plus en etableret stressor), og Caenorhabditis sigte (igennem sien dyrene og tillade dem at inddrive i 30 min på NGM lige før imaging).
    3. I analysen DAF-16::GFP varme chok positiv kontroldyr ved 37 ° C i 30 min før imaging20. For hsp-16.2 assay, varme chok positiv kontroldyr for 90 min, 20 h før imaging21. Sod-3 assay, behandle positive kontroldyr med 100 mM paraquat for 4 h før imaging22.
    4. Høste orme straks med en øjenvipper pick og montere dem på en coverslip med 1 μL af 36% poloxamer 407 overfladeaktivt opløsning til at immobilisere ormene.
    5. Sandwich ormene monteret med en anden coverslip. Montere de to coverslips til en standard glas mikroskopi dias og billede ormene ved hjælp af en 8 X forstørrelse på en inverteret fluorescerende mikroskop (for et samlet forstørrelse 80 X) og en konstant eksponering med FITC filter.
    6. For at afsløre eventuelle forskelle mellem de tre grupper i DAF-16::GFP analyse, kategorisere dyrene baseret på placeringen af DAF-16::GFP reporter (nukleare hvis reporter omplantes til kerner, cytosole hvis reporter beliggende i cytosol, og mellemliggende, hvis reporter beliggende i både kerner og cytosol).
    7. Sammenligne resultaterne ved hjælp af en ordinal logistik statistisk model i statistisk analyse software. For hsp-16.2 og sod-3 udtryk assays, bruge en en-vejs ANOVA med α = 0,05 og Tukey's post hoc test med α = 0,05 for at sammenligne de samlede fluorescens i regionen hoved.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Caenorhabditis si består af 2 skruelåg, sikring af et område med vævet nylon monofilamenter mesh mindre end kroppen diameteren af den ønskede udviklingsmæssige alder, anvendes til at udvinde levende populationer af organismer ved hjælp af en enkel vask teknik. Det tillægger standard koniske rør og bruger skærmen mesh mekanisk sortere dyr af kroppen diameter, forlader de ønskede dyr i røret klar til yderligere vedligeholdelse og eksperimenter (f.eks., overførsel eller genetiske høst). En blid manuel vask med Caenorhabditis sigte er hurtig, ca. 5 min. pr. 60-100 mm plade, og organismerne er let inddrives fra trådnet.

Procent udbytte af dyr efter Caenorhabditis Sigten bruge
For at etablere procent udbytte af Caenorhabditis si, blev enheder testet med både 20 μm og 50 μm porestørrelse masker på voksne dyr. A betyder udbytte af en > 90% vellykket animalske overførsel blev opnået for både maskestørrelser, testet (tabel 1).

Monofilamenter mesh med forskellig størrelse huller kan bruges til at adskille dyr af forskellige livsstadier. Mesh med 20 μm huller er egnet til vask væk udvikle embryoner og larver faser mindre end den fjerde larve fase, bevarer den sidstnævnte (L4, med en gennemsnitlig krop diameter 32 μm) og alle dyr i senere stadier af livet, mens mesh med 50 μm huller vil give alle andre liv stadier bortset fra voksne (med en gennemsnitlig krop diameter 70 μm) for at blive vasket væk (tabel 2).

Caenorhabditis Sigten brug påvirker ikke healthspan målinger
Motilitet: I C. elegans den normale sinusformet bevægelse (dvs., motilitet) falder med alder18 og er en markør for generelle sundhed. For at afgøre, om Caenorhabditis si påvirket motilitet, motilitet scoringer var sammenlignet for pick, FUDR og Caenorhabditis si-behandlingsgrupper på dage 2, 4, 6 og 8 i voksenalderen. Alle dyr på tværs af alle grupper (n = 10/gruppe) udstillet normale og spontane bevægelsesmønstre (klasse A) i flere aldre hele voksenalderen (dage 2, 4, 6 og 8 i voksenalderen; p > 0,05 for flere sammenligninger på alle dage, figur 3).

Svælg pumpe sats: C. elegans svælg muskler evne til at pumpe falder med alderen og er en anden biomarkør for healthspan23. Til at bestemme, hvis Caenorhabditis si påvirket dyrenes svælg pumpe sats, pick, FUDR og Caenorhabditis si behandlingsgrupper blev sammenlignet på dag 2, 4, 6 og 8 i voksenalderen (n = 8-10 pr. gruppe). Der var en signifikant forskel mellem dyr, der undergik plukning og FUDR metoder på dage 6 (p < 0,001) og 8 (p < 0,001). Også, der var en signifikant forskel mellem si og FUDR grupper på dage 6 (p < 0,001) og dag 8 i voksenalderen (p < 0,001). Men der var ingen statistisk signifikant forskel mellem pick og Caenorhabditis si grupper for en dag (p > 0,05, figur 4), der angiver, at sien ikke påvirker denne foranstaltning af healthspan.

Blid touch svar: Svar til mekaniske stimuli er en fysiologisk markør til at vurdere aging eller generelle sundhed24,25; således er effekten af forskellige overførselsmetoder på både den forreste og bageste blid touch svar blev testet. Der var ingen statistisk signifikant forskel mellem pick, FUDR og Caenorhabditis sigtes behandlingsgrupper (n = 8/gruppe), enten fortil eller bagtil, for hvilken som helst dag af test (p > 0,4 for alle sammenligninger; Figur 5A og 5B).

Frugtbarhed: For at etablere eller ej Caenorhabditis si påvirket mængden af levedygtige afkom produceret af C. elegans, individuelle afkom, der er produceret i en 24-timers periode, dag 3 af voksenalderen var tælles og sammenlignet (n = 20 til 22 pr. gruppe). Brugen af Caenorhabditis si påvirkede ikke væsentligt antallet af afkom produceret i forhold til en pick behandling gruppe (p = 0,61, figur 6).

Molekylær reporter assays
DAF-16 nukleare translokation: I C. eleganser aktivering af transkriptionsfaktor DAF-16 forbundet med øget stress modstand26. Den nukleare lokalisering af DAF-16 blev undersøgt i en transgene ødelægge stamme TJ356, som udtrykker DAF-16 smeltet til en grøn fluorescerende proteiner (DAF-16::GFP)20. Under normale vækstbetingelser, DAF-16::GFP er lokaliseret primært i cytosol, men under forskellige stressorer (fx, varmestress), er det hurtigt omplantes til kernen20. For at teste effekten af sortering med Caenorhabditis sigte på DAF-16 translokation, DAF-16::GFP Lokaliseringer blev i forhold til alder-matchede dag-5 voksne i en positiv kontrolgruppe (varmestress), en negativ kontrolgruppe (manuel overførsel via pick), og en Caenorhabditis si behandlingsgrupper (n = 10/gruppe). Overførslen med Caenorhabditis sigten ikke påvirkede nukleare omplantning af DAF-16::GFP, og viste en lignende fænotype til negative kontroldyr (p > 0,05, figur 7).

HSP-16.2 reporter: lille heat shock proteiner som HSP-16.2 er biomarkører for en stressrespons, og de er stærkt udtrykt under en udsættelse for varme chok eller oxidative stress agenter21,27. TJ375 stamme har en normal god landbrugspraksis reporter gen sammensmeltet med en hsp-16.2 promotor, der ikke er aktive under normale betingelser21. Men efter en udsættelse for en heat shock, HSP-16.2 protein udtryk er induceret, og dyrene viser høje niveauer af normal god landbrugspraksis udtryk21. At teste inddragelse af Caenorhabditis sigte på en HSP-16.2-medieret stressrespons, fluorescens tæthed i regionen svælget (n = 10 dyr/gruppe) af alder-matchede dyr blev sammenlignet med i dag-5 voksne mellem en positiv kontrolgruppe (varme stress), en negativ kontrol (picking), og en Caenorhabditis si behandling gruppen. Overførslen med Caenorhabditis sigte ikke væsentligt inducerer udtryk af HSP-16.2::GFP (hsp-16.2::gfp) i forhold til den negative kontrol (p > 0,05, figur 8).

sod-3 reporter: I C. eleganser anti-oxidant genet, der koder for superoxiddismutase 3 (SOD-3) op-reguleret under oxidative stress28. C. elegans stamme CF1553 udtrykker grøn fluorescerende proteiner (NGL)-mærket SOD-3 promotor, hvis udtryk er foranlediget af oxidative stressfaktorer, såsom paraquat5. For at teste inddragelse af Caenorhabditis si sortering på antioxidant svar i C. elegans, fluorescens tæthed i regionen hoved af alder-matchede dag-5 voksne var i forhold mellem en positiv kontrol befolkning (100 μM paraquat behandling), en negativ kontrol befolkning (manuel plukning), og en Caenorhabditis si-overført befolkning. Overførslen med Caenorhabditis sigte ikke væsentligt inducerer udtryk af sod-3::gfp i forhold til den negative kontrol (p > 0,05, figur 9).

Figure 1
Figur 1: Caenorhabditis si konstruktion. Progression af 'gør det selv' fremstilling af værktøjet er vist. Disse paneler viser (A) to 50 mL konisk tube caps (B) Hvis Centre er blevet fjernet, (C) Skær kanterne glattes og (D - F) som er udstyret med monofilamenter mesh svarende til den ønskede liv fase af C. elegans (Se protokol for detaljer). (G) udfyldte sigten er også vist. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Trinvis billede repræsentation af Caenorhabditis si brug. (A) sigten er pre våd med en dråbe af M9 løsning, og (B) passer på toppen af en 50 mL konisk slange. (C) 1 mL af M9 løsning med orme er pipetted på inderlåret om sigten, (D) en 50 mL konisk rør er placeret på toppen af sien med ormene vender indersiden af røret, og (E) si med en nyligt tilknyttede øverste tube er hurtigt vendt o ver. (G) sien skylles med M9 transporterer de ønskede dyr ind i den nye 50 mL tube og orme er tilladt at afregne ved tyngdekraft til bunden af røret. (H) orme er pipetted og placeret som dråber på en frisk NGM plade. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Caenorhabditis si påvirkede ikke motilitet i hele levetiden. Denne figur viser en motilitet klasse fordeling af dyr på dag 2, 4, 6 og 8 i voksenalderen for pick, FUDR, og Caenorhabditis si behandlingsgrupper. Klasse A dyr flyttes normalt og spontant, klasse B dyr flyttet unormalt og kan have krævet prodding, og klasse C dyr var ude af stand til at flytte. Der var ingen forskel mellem Caenorhabditis si, pluk og FUDR grupper (p > 0,05). Tre gentagelser (n = 10 dyr pr. behandling plade) blev gennemført og analyseret med Ordinal logistisk model. klasse B dyr. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Caenorhabditis si anvendelse påvirkede ikke svælg pumpe i hele levetiden. Denne figur viser svælg pumpe priser af pluk, FUDR, og Caenorhabditis si behandlingsgrupper, sammenlignet med dage 2, 4, 6 og 8 i voksenalderen. Stjernerne angiver en betydning mellem pick, si og FUDR behandlingsgrupper for dagene angivet (*** p < 0,05). Der var ingen forskel mellem Caenorhabditis si og pick gruppe (p > 0,05). To replikater (N = 10 dyr pr. behandling plade) blev gennemført og analyseret med en en-vejs ANOVA og en Bonferroni post-test. Søjlerne repræsenterer den gennemsnit ± standardafvigelse for middelværdien. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Caenorhabditis si anvendelse påvirkede ikke forreste touch svar i hele levetiden. Disse paneler viser (A) den forreste og (B) bageste touch svar optælling af pluk, FUDR og Caenorhabditis si behandlingsgrupper sammenlignet dage 2, 4, 6 og 8 i voksenalderen. To replikater blev gennemført med N = 10 for hver behandling og sammenlignet med en en-vejs ANOVA og en Bonferroni post-test (p = 0,4 og p = 0,9 til forreste og bageste, henholdsvis). Søjlerne repræsenterer den gennemsnit ± standardafvigelse for middelværdien. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Caenorhabditis si påvirkede ikke mængden af levedygtige afkom på dag 3 i voksenalderen. Denne figur viser de levedygtige afkom af dag-3 voksne efter en 24 h æglægning periode, der strækker sig over dag 3 af voksenalderen for forældredyrene. Søjlerne repræsenterer den gennemsnit ± standardafvigelse for middelværdien. N = 20-22 dyr fra mindst to særskilte biologiske replikater pr. behandling gruppe. Behandlingsgrupper er sammenlignet med en t-test, (p > 0,05). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Caenorhabditis si påvirkede ikke nukleare translokation af DAF-16::GFP. Disse paneler viser repræsentative billeder af DAF-16 omplantning af (A) en heat shock gruppe (positiv kontrol), (B) en pluk-gruppen (den negative kontrol) og (C) en Caenorhabditis si behandling gruppe. (D) dyr i positive kontrolgruppen vises en aktivering af DAF-16 nukleare translokation. Caenorhabditis si fremkalde ikke en nuklear translokation og vises cytosole fusion protein svarende til dyrene i negativ kontrolgruppen. N = 10 dyr pr. behandling gruppe fra mindst tre separate biologiske replikater. Behandlingsgrupper blev sammenlignet med en en-vejs ANOVA og en Tukey post hoc test. Skalalinjen = 100 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: Caenorhabditis si påvirkede ikke udtryk for hsp16.2::gfp. HSP-16.2 udtryk (i vilkårlig fluorescens enheder) af en heat shock gruppe (positiv kontrol), en pick gruppe (negativ kontrol) og en Caenorhabditis si behandling gruppe sammenlignes. Stjernerne angiver en høj udtryk for hsp16.2::gfp for den positive kontrolgruppe, som var signifikant forskellig fra de andre behandlingsgrupper, (*** p < 0,05). Caenorhabditis si ikke påvirkede hsp16.2::gfp udtryk og vises fluorescens intensiteter svarende til dyr i gruppen negativ kontrol (p > 0,05). Tre gentagelser blev gennemført med N = 10 for hver behandling og sammenlignet med en en-vejs ANOVA og en Tukey post hoc test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9: Caenorhabditis si påvirkede ikke udtryk for sod-3::gfp. SOD-3 udtryk (i vilkårlig fluorescens enheder) af en 100 μM paraquat gruppe (positiv kontrol), en pick gruppe (negativ kontrol) og en Caenorhabditis si behandling gruppe er vist. Stjernerne angiver en høj udtryk for sod-3::gfp for den positive kontrolgruppe, som var signifikant forskellig fra de andre grupper (*** p < 0,05). Caenorhabditis si påvirkede ikke sod-3::gfp udtryk og vises fluorescens intensiteter svarende til dyrene i negative kontrolgruppen (p > 0,05). Tre gentagelser blev gennemført med N = 10 for hver behandling og sammenlignet med en en-vejs ANOVA og en Tukey post hoc test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Maskestørrelse N = 50 N = 100
20 μm 95.33%
50 μm 99,00% 93.33%

Tabel 1: procentsats udbytte af maskestørrelser. Denne tabel viser resultaterne af en 20 μm enhed testet med N = 50 voksne for 3 gentagelser og en 50 μm enhed testet med N = 50 voksne for 2 replikater og med N = 100 for 3 replikater.

Maskestørrelse Udviklingsstadiet Kroppen Diameter
20 μm Larve stadie 4 ~ 35 μm
50 μm Dag 1 voksen ~ 70 μm

Tabel 2: gennemsnitlige kroppen diameter. Denne tabel viser de gennemsnitlige kroppen diameter erhvervet af gennemsnit 3 målinger ligeligt fordelt på hver orm til 15 dyr på hver målte livsstadium.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi indført heri, design og brug af de tilgængelige, effektive Caenorhabditis si som et redskab for sortering og vedligeholde C. elegans. Dette værktøj har flere fordele til manuelt plukke enkelte dyr, vask populationer, kemiske behandlinger (f.eks.FUDR) og dyrere metoder til adskillelse dyr. Første, Caenorhabditis sigtes effektivt og hurtigt (mindre end 20 min) sorterer afkom fra store blandede bestande af dyr (tabel 2). Også brugen af værktøjet har ingen påviselige toksiske virkninger på dyrenes healthspan (figur 3, figur 4, figur 5, figur 6), fremkalde ikke velbeskrevne genetiske stress journalister (figur 7, figur 8 Figur 9), og reducerer mængden af udenlandske kemikalie, der kan påvirke den anvendte behandling til kultur plader eller enhver Molekylær analyse derefter. Sin brugervenlighed er en betydelig fordel; en forsker i nogen fase af deres uddannelse kan være uddannet til at bruge det (figur 1 og figur 2; Protokol).

Materialeudgiften til fabrikation og brug af sigten (fx, pipetter, buffere) er let tilgængelige i standard forskningslaboratorier; således, hvis brudt, Caenorhabditis si er ikke dyrt at udskifte eller reparere. Caenorhabditis si selv konstruerede natur giver mulighed for det er et alsidigt værktøj: det kan være konstrueret med maskestørrelser, der er relevante for forskellige C. elegans udviklingsstadier og fænotyper. Caenorhabditis sien kan også anvendes i mutagenicitetstest udført i andre nematodeprøveudtagning arter, eller når isolere små organismer, forudsat at passende maskestørrelse er anvendt ved fremstillingen.

Ud over fordelene indeholder dette værktøj til C. elegans befolkning vedligeholdelse, sigten kan bruges til at rense dyr før deres brug i andre eksperimentelle programmer. For eksempel, med udviklingen af mikrofluidik at gennemføre C. elegans kommer forskning spørgsmålet om chip brug og rengøring. Afhængigt af mængden af bakterier er knyttet til dyr, skal særlige forholdsregler træffes for ikke at blokere mikrofluid chip, gør dem ubrugelige29. Ofte når C. elegans er overført til en mikrofluid chip, bragte rester fra bakteriel plænen med dem. Dette restprodukt kan og tilstoppe mikrofluid kanaler, hvilket gør chip svigt, som derefter kræver rengøring eller udskiftning. Enhed konstruere i denne protokol tilbyder en metode til ikke kun høst synkroniserede dyr for mikrofluidik, men også til rengøring af dyrene før deres indsættelse i en mikrofluid enhed. Ved at fjerne snavs og bakteriel rester, taget, når du indsamler dyr, er mikrofluid kanaler mindre tilbøjelige til at funktionsfejl, dermed øge den operationelle levetid af enkelte chips og den efterfølgende gennemløb af forskning udføres med dem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse. Forfatterne erklærer, at forskningen blev gennemført i mangel af nogen kommercielle eller finansielle forbindelser, der kunne opfattes som en potentiel interessekonflikt.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Heather Currey for hendes første bidrag til undersøgelsen design og Dr. Swarup Mitra for hans kritiske gennemgang af håndskriftet. Vi vil også gerne takke Dr. Michael B. Harris for kommentarer, justeringer og bistand i producerer demonstration af denne metode. Stammer, der var fastsat af Caenorhabditis genetik Center, som er finansieret af NIH Office for forskning infrastruktur programmer (P40 OD010440). Den forskning, der er rapporteret i denne publikation blev støttet af National Institute Of General Medical Sciences af National Institutes of Health under Award numre UL1GM118991, TL4GM118992 eller RL5GM118990 og af en institutionel udvikling Award (idé) fra National Institute of General Medical Sciences af National Institutes of Health under grant nummer 5P20GM103395-15. Indholdet er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af National Institutes of Health. UA er AA/EO arbejdsgiver og uddannelsesinstitution og forbyder ulovlig forskelsbehandling af enhver person: www.alaska.edu/titleIXcompliance/nondiscrimination.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Safety glasses Uline S-21076
Protective heat resistant glove Grainger Item # 3AT17 Mfr. Model # 3AT17 Catalog Page # 1703
50 mL conical tube Falcon 14-432-22
Synthetic Nylon mesh Dynamic
Aqua-Supply Ltd
NTX20 and NTX50
Cyanoacrylate glue Scotch Super Glue Liquid SAD114
Pliers Vampliers VMPVT-001-8
Dremmel tool with circular file Lowe's Item # 525945 Model # 100-LG
FUDR Sigma F0503
M9 chemicals ( NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4)  Sigma  S7653, RES20908-A7, 1551139, M7506
NGM plate chemicals (Bactopeptone, Agar, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2,Cholesterol, Streptomycin) BD Biosciences (bactopeptone) , Lab express (agar), Sigma ( rest) BD bioscience 211677, Lab Express 1001,  Sigma 1551139, 1551128, C1016, C8667, S6501
Pluronic F-127 Sigma P2443
Paraquat dichloride hydrate Sigma 36541
Inverted fluorescence microscope Olympus FSX100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. C elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).
  2. Herman, M. A. Hermaphrodite cell-fate specification. WormBook. , 1-16 (2006).
  3. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  4. Chalfie, M., Hart, A. C., Rankin, C. H., Goodman, M. B. Assaying mechanosensation. WormBook. , (2014).
  5. Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Deletion of the Mitochondrial Superoxide Dismutase sod-2 Extends Lifespan in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 5 (2), e1000361 (2009).
  6. Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of Ageing Development. 132 (10), 519-521 (2011).
  7. Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing Development. 12 (2), 137-150 (1980).
  8. Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of Ageing and Development. 131 (5), 364-365 (2010).
  9. Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing Development. 133 (1), 46-49 (2012).
  10. Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9 (1), e85964 (2014).
  11. Pulak, R. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. Methods Molecular Biology. 351, 275-286 (2006).
  12. Argon, Y., Ward, S. Caenorhabditis elegans fertilization-defective mutants with abnormal sperm. Genetics. 96 (2), 413-433 (1980).
  13. Lee, S. J., Kenyon, C. Regulation of the longevity response to temperature by thermosensory neurons in Caenorhabditis elegans. Current Biology. 19 (9), 715-722 (2009).
  14. Klass, M. R. Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span. Mechanisms of Ageing Development. 6 (6), 413-429 (1977).
  15. Zhang, B., et al. Environmental Temperature Differentially Modulates C. elegans Longevity through a Thermosensitive TRP Channel. Cell Reports. 11 (9), 1414-1424 (2015).
  16. Michaelson, L. C. C. elegans: A Practical Approach. Ian A. Hope (ed.). Oxford University Press, Oxford. 1999. Pp. 281. ISBN 0 19 963738 5. Heredity. 85 (1), 97-100 (2000).
  17. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  18. Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).
  19. Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).
  20. Henderson, S. T., Johnson, T. E. daf-16 integrates developmental and environmental inputs to mediate aging in the nematode Caenorhabditis elegans. Current Biology. 11 (24), 1975-1980 (2001).
  21. Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).
  22. Libina, N., Berman, J. R., Kenyon, C. Tissue-specific activities of C. elegans DAF-16 in the regulation of lifespan. Cell. 115 (4), 489-502 (2003).
  23. Keith, S. A., Amrit, F. R., Ratnappan, R., Ghazi, A. The C. elegans healthspan and stress-resistance assay toolkit. Methods. 68 (3), 476-486 (2014).
  24. Scerbak, C., Vayndorf, E. M., Hernandez, A., McGill, C., Taylor, B. E. Mechanosensory neuron aging: Differential trajectories with lifespan-extending alaskan berry and fungal treatments in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Aging Neuroscience. 8, 173 (2016).
  25. Vayndorf, E. M., et al. Morphological remodeling of C. elegans neurons during aging is modified by compromised protein homeostasis. npj Aging and Mechanisms of Disease. 2, 16001 (2016).
  26. Murakami, S., Johnson, T. E. A genetic pathway conferring life extension and resistance to UV stress in Caenorhabditis elegans. Genetics. 143 (3), 1207-1218 (1996).
  27. Abbas, S., Wink, M. Green Tea Extract Induces the Resistance of Caenorhabditis elegans against Oxidative Stress. Antioxidants (Basel). 3 (1), 129-143 (2014).
  28. Yanase, S., Hartman, P. S., Ito, A., Ishii, N. Oxidative stress pretreatment increases the X-radiation resistance of the nematode Caenorhabditis elegans. Mutation Research. 426 (1), 31-39 (1999).
  29. Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).

Tags

Udviklingsmæssige biologi sag 137 Caenorhabditis elegans sortering overførsel synkronisering hurtige tilgængelige
<em>Caenorhabditis</em> Si: En Low-tech Instrument og metode til sortering af små flercellede organismer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hunter, S., Maulik, M., Scerbak, C., More

Hunter, S., Maulik, M., Scerbak, C., Vayndorf, E., Taylor, B. E. Caenorhabditis Sieve: A Low-tech Instrument and Methodology for Sorting Small Multicellular Organisms. J. Vis. Exp. (137), e58014, doi:10.3791/58014 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter