Summary
Het huidige protocol bevat een methode voor het sorteren en het schoonmaken van leeftijd-matched populaties van Caenorhabditis elegans. Het gebruikt een eenvoudig, goedkoop, en efficiënt instrument is op maat te verkrijgen een grote experimentele populatie van nematoden voor onderzoek.
Abstract
Caenorhabditis elegans (C. elegans) is een reeds lang gevestigde model-organisme gebruikt in een heel scala van fundamenteel en biomedisch onderzoek. Binnen de nematode onderzoeksgemeenschap is er een behoefte aan een betaalbare en effectieve manier om grote, leeftijd-matched populaties van C. elegans. Hier presenteren we een methode voor het mechanisch sorteren en reiniging van C. elegans. Ons doel is om een rendabel, efficiënt, snel en eenvoudig proces om te verkrijgen van dieren van uniforme afmetingen en levensfasen voor hun gebruik in experimenten. Deze tool, zeef Caenorhabditis hanteert een custom-built deksel die draden op gemeenschappelijke conische lab buizen en sorteert C. elegans gebaseerd op lichaamsgrootte. We laten ook zien dat de Caenorhabditis zeef effectief dieren van één cultuur plaat brengt naar een ander toe te staan voor een snelle sorteren, synchroniseren, en het schoonmaken zonder de beïnvloedende markers van gezondheid, met inbegrip van de motiliteit en stress-afleidbare gen de verslaggevers. Deze toegankelijk en innovatieve tool is een snelle, efficiënte en niet-stressvolle optie voor het handhaven van C. elegans populaties.
Introduction
De nematode worm, Caenorhabditis elegans, is een premier model-organisme. Naast het eenvoudig en gecontroleerde karakter van hun teelt in het laboratorium, hun gehele genoom is gesequenceerd1 en het ontwikkelings lot van elke cel2is bekend. Als gevolg van deze functies is C. elegans een veel gebruikte modelorganisme voor genetische studies. Nochtans, samen met deze gunstige kenmerken komen sommige uitdagingen voor onderzoekers. Als gevolg van hun snelle generatietijd, C. elegans populaties kunnen snel opraken van voedsel en/of populaties met meerdere generaties worden gemengd en ontwikkelingsstadia presenteren in een keer. Zo vereisen experimenten uitgevoerd op solide nematode groei media (NGM) onderzoekers om fysiek naar dieren verse platen voordat de bacteriële voedselbron uitput en nieuwe larven ontwikkelen. Dit kan vervelend zijn als een frequente overbrengen van de dieren is nodig om te voorkomen dat de experimentele populaties van steeds vermengd met generaties nakomelingen. Enkele experimenten vereisen nog, beide grote aantallen dieren en langere tijd punten (bijvoorbeeld, DNA of RNA extractie in volwassenheid). Deze verbindingen de uitdagingen van nauwkeurig vasthouden van een gesynchroniseerde bevolking en de overdracht van grote aantallen dieren.
Huidige methoden van de overdracht van C. elegans gekweekte op NGM zijn plukken of wassen van de dieren uit plaat op plaat; chemisch behandeling van de dieren (bijvoorbeeldmet de DNA-replicatie remmer fluorodeoxyuridine of FUDR); of stroom cytometry gebruikt voor het sorteren van de dieren in de multi goed platen. Picken impliceert het gebruik van een handje, gemaakt met een dunne draad van platina of een wimper, handmatig overbrengen individu of meerdere dieren3,4. Deze methode is nauwkeurig maar vereist zowel de vaardigheid en de tijd en is een beperking voor studies waarbij grote aantallen dieren. Mei ook plukken worden fysiek schadelijk en stressvolle tot aan de dieren door individuen mogelijk te onderwerpen aan onnatuurlijk en inconsistent bedragen van verstoring en kracht. Wassen gaat spoelen van een cultuur-schotel met een bufferoplossing en overbrengen van de oplossing met de dieren via glazen pipet van Pasteur aan een nieuwe plaat van de cultuur. Deze methode is snel en efficiënt, maar is niet juist als meerdere generaties en ontwikkelingsstadia van dieren worden overgebracht in bulk. Chemische behandelingen, zoals FUDR, kunnen worden ontbonden in de kweken media om te voorkomen dat de productie van nakomelingen door het blokkeren van een DNA-replicatie, en dus de gameet-productie en ei-ontwikkeling. Tijdje effectief, deze methode moet worden toegepast na developmental rijping over niet verstoren de normale ontwikkelings processen, en dit betekent dat er nog steeds sprake is van een eis tot overdracht van de dieren vóór haar administratie3. Deze methode beïnvloedt ook meerdere mobiele signalering van trajecten, wat resulteert in merkbare gevolgen voor de dieren, naarmate zij ouder worden (b.v., een verlenging van de levensduur of een gewijzigde proteostasis) afhankelijk van de stam van C. elegans gebruikt5, 6,7,,8,,9,10. Stroom cytometry methoden automatisch sorteren en individuele C. elegans van één Multi goed bord overbrengen in een andere11. Hoewel deze methode zeer effectief en efficiënt is, is stroom cytometry apparatuur onbetaalbaar duur en ontoegankelijk voor veel onderzoekers. Een alternatief voor het overbrengen van de dieren is het gebruik van mutant modellen die zijn temperatuur gevoelig, zoals fer-15 en fem-1, die steriel met temperatuur aanpassing12geworden. Terwijl met behulp van mutant dieren nuttig in sommige situaties is, deze specifieke stammen groeien langzamer dan wild-type dieren en ze rekenen op een gewijzigde genoom, arme vertegenwoordigers voor veroudering of gezonde wormen bijeenkomen. Bovendien, de afhankelijkheid van een verschuiving van de temperatuur ertoe steriliteit resulteert ook in het ontbreken van een statische omgeving en temperatuurveranderingen gemakkelijk is aangetoond dat de invloed van gen expressies13,14, 15. onderzoeksgroepen technieken met een beschrijving van het gebruik van een Maas wilt filteren C. elegans grootte16eerder hebt gepubliceerd. Maar waren we niet in staat om vorige werk testen op eventuele wijzigingen in de algemene gezondheidsresultaten dat geassocieerd met het gebruik van deze filters worden kunnen te vinden.
Er is dus behoefte aan een binnen de Gemeenschap van C. elegans onderzoek een betaalbare, efficiënte, snelle en nauwkeurige methode voor het overbrengen van grote aantallen dieren tussen cultuur platen. We hebben een verbeterde, toegankelijke stuk van apparatuur (genoemd de Caenorhabditis zeef) en een bijbehorende protocol voor de fabricage en de werking die voldoet aan de behoeften van de onderzoekgemeenschap C. elegans ontwikkeld. Hierin delen we het ontwerp van de Caenorhabditis zeef en methoden voor het gebruik ervan, en we laten zien dat het gebruik ervan heeft geen gevolgen voor de gezondheid van de gemeenschappelijk of eventuele stress markeringen in vergelijking met standaard manuele picking en een behandeling met de veelgebruikte, beperking van de vruchtbaarheid chemische FUDR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Caenorhabditis zeef constructie en het gebruik
-
Opbouw protocol
- Verwerven 2 deksels van 50 mL conische buisjes (figuur 1A).
- Verwijderen van het centrum-gebied binnen de binnenste lip van de deksels (wanneer bekeken vanaf de onderkant, figuur 1B) met behulp van een bunsenbrander en een sonde van ruwijzer of een soldeerbout of stapte boor bits.
Opmerking: Gebruik van warmte te snijden van de plastic deksel is beter dan een mes omdat er minder risico van verwonding. - Schoon en zand van gesneden randen en top van het oppervlak met een gebogen bestand of een rotary tool (bijvoorbeeldDremel) slijpen. Zie Figuur 1 c.
- Knip de cirkel van de monofilamenten Maas aan de juiste diameter (Figuur 1 d). Voor dit, het traceren van een deksel op een monofilament nylon mesh vel en snijd net binnen de getekende lijn.
- Snijd de groeven/schuine strepen in de oppervlaktelaag van de deksels ter verbetering van de hechting van de twee deksels wanneer lijm wordt toegepast op de plastic (figuur 1E).
- Reinig de deksels met ethanol en laat ze drogen.
- Cyanoacrylaat lijm toepassen op de bovenkant van beide deksels, houden aan de buitenrand.
Opmerking: een beetje lijm gaat een lange weg. - Leg de monofilamenten mesh, volgens tabel 1, op één gelijmd deksel (figuur 1F). Plaats het tweede deksel ondersteboven op de top van de Maas; beide deksels moet samen hun toppen. Druk op stevig samen (figuur 1G). Zorg ervoor dat de strik strak.
Opmerking: als een veiligheidsmaatregel, gebruik pincet te plaatsen van de Maas op de deksels. - Zodra de eerste laag van de lijm is opgedroogd, een ring van Cyanoacrylaat lijm rond de buitenste kloof tussen de deksels van toepassing. Wees gul als dit integriteit voegt en een peeling uit elkaar of lekkende voorkomt.
- Label het filter met de maaswijdte van de porie van de Maas monofilament.
Opmerking: Hier, gebruiken we twee maaswijdten porie — 20 µm en 50 µm.
-
Protocol gebruiken
- Vooraf natte zeef.
- Pipetteer een zoutoplossing, zoals M9 [5 g NaCl, 6 nb2HPO4g, 3 g van KH2PO4, 1 L ultrazuiver H2O en 1 mL van MgSO4 (1 M)]17, dwars door de zeef tot een druppel vormen , condenseert en druipt uit het midden van de onderzijde van de filter (figuur 2A). Desgewenst een pluisvrije doekje (bijvoorbeeldKimwipe) van toepassing op de bodem naar vorm of verspreiden van een druppel vocht op de Maas.
- Plaats de zeef boven een conische tube van 50 mL. Label de buis als 'Afval tube' (figuur 2B).
- Wassen van een bevolking van C. elegans uit een agarplaat.
- Wassen van de plaat met de M9 buffer en plaatst u het medium worm-bevattende aan de bovenzijde van de monofilamenten Maas 1 mL tegelijkertijd (figuur 2C). Zorg ervoor om te werken in het midden van de Maas. Wassen alle wormen van de plaat.
Opmerking: 3 mL M9 voor een 60 mm plaat is meestal voldoende. - Om te minimaliseren van het aantal wormen verloren in pipetteren, een glazen pipet van Pasteur Hiermee kunt de wormen uit de plaat en op het gaas center (Herhaal zo nodig).
- Spoel het filter met de M9 buffer vanaf de bovenkant. Nogmaals, zorg ervoor om te opereren in het midden van de Maas en spoel alle wormen in dat gebied. Wassen zoveel keer als nodig is om ervoor te zorgen dat alle bacteriën en kleinere wormen zijn gepasseerd via de Maas.
- Wassen van de plaat met de M9 buffer en plaatst u het medium worm-bevattende aan de bovenzijde van de monofilamenten Maas 1 mL tegelijkertijd (figuur 2C). Zorg ervoor om te werken in het midden van de Maas. Wassen alle wormen van de plaat.
- Oogst de grootte-matched dieren uit de zeef.
- Bevestig een nieuwe conische tube van 50 mL aan de bovenkant van de zeef met de volwassen wormen uit stap 1.2.2.3 geconfronteerd met de binnenkant van de nieuwe collectie-buis (figuur 2D).
- Verwijder de eerste buis (afval buis) en snel flip-over de zeef en nieuwe buis om te voorkomen dat de druppel migreren (afbeelding 2E).
Opmerking: Als steriliteit niet vereist is, gebruik een pluisvrije doekje (bvKimwipe) om wick vloeistof vanaf onderkant van het net vóór het wegknippen. - Spoel de gaas met M9 in de nieuwe tube van 50 mL van de nieuwe bovenzijde (figuur 2F). Opnieuw, werken in het centrum van mesh en onderhouden van een druppel aan de onderzijde van de Maas.
- Toestaan dat de wormen te regelen of laat ze zachtjes naar beneden (bijvoorbeeld< 16 x g) voor ongeveer 1 minuut (Figuur 2 g).
- De bufferoplossing uit de pellet van wormen, ideaal gecombineerd tot > 0,5 mL, of verwijderen van zo veel vloeistof mogelijk zonder de pellet te verstoren.
- Pipetteer met behulp van een glazen pipet van Pasteur op een bord NGM wormen en laat ze drogen. Ruimte meerdere druppels uit op een nieuwe plaat zodat ze sneller (Figuur 2 H drogen).
- Reinig de zeef.
- Spoel de zeef voorzichtig en grondig met ethanol en omgekeerde-osmose water. Laat het drogen.
- Bewaar het in een schone container voor onbepaalde tijd toekomstig gebruik.
- Gooi het wanneer de Maas een "sag" uitstraling ontwikkelt.
- Vooraf natte zeef.
2. bevestiging van Caenorhabditis zeef sorteermethode
- Algemeen onderhoud
- Voor alle experimenten, cultuur wormen op een standaard Nematode groei Media17 (1 L voor NGM bestaat uit 2,5 g pepton, 17 g agar, 3 g NaCl, 975 mL tweemaal gedestilleerd water, 1 mL 5 mg/mL cholesterol, 1 mL van de 1 M CaCl2 1 mL van de 1 M MgSO4, 25 mL 1 M KHPO4en 0,5 mL 100 mg/mL streptomycine) bij 25 ° C.
- Experimentele behandeling administratie
- Vergelijk de drie behandelgroepen: pick, fluorodeoxyuridine (FUDR), en Caenorhabditis zeef.
- Voor de FUDR behandelde groep, 100 mg/mL FUDR toevoegen aan de NGM media om een eindconcentratie van 100 μM om te voorkomen dat de productie van nakomelingen en overbrengen in de wormen om de andere dag een verse NGM plaat om te voorkomen dat voedsel uitputting.
- Voor de pick-groep, selecteer en breng de wormen handmatig met behulp van een platina entoog.
- Voor de Caenorhabditis zeef behandelde groep, voert u stap 1.2 en Pipetteer de wormen op een bord NGM.
- Vergelijk de drie behandelgroepen: pick, fluorodeoxyuridine (FUDR), en Caenorhabditis zeef.
- Caenorhabditis Zeef percentage opbrengst
- Om te meten hoe effectief de zeef is bij het sorteren van C. elegans, leeftijd-synchrone N2 dieren groeien tot dag 1 van volwassenheid bij 25 ° C (dat wil zeggen, 48 uur na het leggen van eieren) en breng hen door het plukken van hen aan verse NGM platen (totaal N = 50 of N = 100 dieren per tre atment groep).
- Na 24u van herstel, de bevolking naar nieuwe NGM platen overbrengen met de Caenorhabditis zeef na het bovenstaande protocol (zie stap 1.2) en het aantal met succes overgebrachte dieren.
- De opbrengst van percentage worden berekend als de verhouding van het aantal dieren overgedragen in vergelijking met het beginnummer aan het begin van de overdracht vermenigvuldigd met 100 (%).
- Healthspan testen
Opmerking: Score healthspan parameters van de motiliteit klasse, de faryngaal pomp tarief, en zowel de voorste en de achterste zachte touch antwoord op dagen 2, 4, 6 en 8 van volwassenheid voor leeftijd-gesynchroniseerde N2 dieren onderhouden bij 25 ° C.- Motility bijhouden
- Toewijzen van beweeglijkheid scores gebaseerd op een klasse gebaseerde systeem (klassen A, B en C) de methoden van Herndon et al. na 18. vergelijken van de effecten van de drie experimentele groepen met behulp van een ordinale logistieke statistieken model in statistische analysesoftware.
Opmerking: Klasse A individuen gaan spontaan in een normale, sinusvormige patroon. Klasse B individuen verplaatsen in sterk niet-sinusvormige bewegingen en vereisen porren ter bevordering van de beweging. Klasse C individuen verplaatsen hun hoofd en/of staart in reactie op te porren, maar zijn niet in staat om over de agar te bewegen.
- Toewijzen van beweeglijkheid scores gebaseerd op een klasse gebaseerde systeem (klassen A, B en C) de methoden van Herndon et al. na 18. vergelijken van de effecten van de drie experimentele groepen met behulp van een ordinale logistieke statistieken model in statistische analysesoftware.
- Faryngaal pomp tarief
- Tellen van het verkeer van de grinder van van het dier terminal faryngaal lamp visueel onder een stereomicroscoop op een 600 X laatste vergroting voor 1 min.
- Een statistische analyse met een one-way ANOVA met α = 0,05 en Bonferroni na tests met α = 0,05.
- Drukpunt
- Een zachte touch antwoord opnemen en vergelijk tussen de drie behandelgroepen. Uitvoeren van de tests op basis van de methoden die worden beschreven door Calixto et al. 19.
- Record de anterior en posterior touch antwoord door zachtjes strelen een wimper pick loodrecht op de staart of het hoofd (elk 5 x, afwisselend kop en staart) van de dieren.
- Score van elke beweging in de tegenovergestelde richting van de lijn vanaf 1 punt op een schaal van 0 tot en met 5 voor zowel de voorste als de achterste reactie.
- Statistische analyse met een one-way ANOVA met α = 0,05 en Bonferroni na tests met α = 0,05.
- Motility bijhouden
- Vruchtbaarheid test
- Om te bepalen van het gebruik van Caenorhabditis zeef van invloed op de voortplanting, leeftijd-synchrone N2 dieren groeien tot dag 2 van volwassenheid bij 25 ° C.
- 60 h na ei leggen, dieren aan nieuwe NGM platen met een platina pick of de Caenorhabditis zeef en geeft ze 4 uur om te herstellen (droge de gezeefde platen voor 20 – 30 min).
- Na herstel, individueel plaat de dieren via een wimper NGM platen uitkiest, geef ze 24 h om eieren te leggen, en het verwijderen van de dieren. Toestaan dat de nakomelingen op elke plaat te ontwikkelen onder normale omstandigheden bij 25 ° C voor een andere 24 h.
Opmerking: Een wimper pick is een menselijke wimper beveiligd aan het einde van een pipet van Pasteur met nagellak en gesteriliseerd met ethanol. - Het aantal levensvatbare F1 generatie individuen. Uitvoeren van een statistische analyse met behulp van een T-toets met α = 0,05.
Opmerking: Levensvatbare nakomelingen worden beschouwd als eieren die met succes uitkomen en beginnen hun ontwikkeling door middel van de regelmatige larvale cycli.
- Fluorescerende verslaggever stress reactie testen
- Uitvoeren van drie veelgebruikte fluorescerende verslaggever testen om te ontdekken van potentiële markeringen van stress: een translocatie van de DAF-16::GFP in de kernen van cellen in een stam [TJ356-zIs356 (pDAF-16::DAF-16-GFP; rol-6)]20; een hsp-16.2 expressie [TJ375-gpIs1 (hsp-16.2p::GFP)]21; en een graszode-3 expressie [CF1553-muIs84([pAD76]sod-3p::GFP+rol-6[su1006])]-22.
- Voor elke assay, cultuur leeftijd-synchrone dieren uit de drie behandelgroepen bij 20 ° C en ze op dag 3 van volwassenheid behandelen: gebruik een negatieve controle (transfer op een dagelijkse basis, een groep dieren handmatig met een platina pick), een positieve controle (op een dagelijkse basis overdracht van een groep dieren handmatig met een platina pick plus een gevestigde stressor), en de Caenorhabditis zeef (de dieren passeren door een zeef en laten herstellen voor 30 min op NGM net voor imaging).
- In het DAF-16::GFP assay schok warmte de dieren van de positieve controle bij 37 ° C gedurende 30 minuten vóór20imaging. Voor de hsp-16.2 assay schok warmte de dieren van de positieve controle voor 90 min, 20 h vóór21imaging. Voor de graszode-3 assay, omgaan met de positieve controledieren met 100 mM paraquat voor 4 uur vóór22imaging.
- Oogst de wormen onmiddellijk met een wimper pick en monteren ze tot een dekglaasje aan met 1 μL van een 36% poloxamer 407 oppervlakteactieve stof oplossing voor het immobiliseren van de wormen.
- Sandwich van de gemonteerde wormen met een dekglaasje aan. Monteer de twee coverslips naar een standaard glasplaatje microscopie en image de wormen met behulp van een 8 X vergroting op een omgekeerde fluorescente microscoop (voor een algemene vergroting van 80 X) en een constante blootstelling met een FITC-filter.
- U wilt het opsporen van eventuele verschillen tussen de drie groepen in de bepaling van de DAF-16::GFP, categoriseren de dieren die op basis van de locatie van de DAF-16::GFP verslaggever (nucleaire als de verslaggever translocated aan kernen, cytosolische als de verslaggever in cytosol en tussenliggende als gelegen de verslaggever gelegen in de kernen zowel cytosol).
- Vergelijk de resultaten met behulp van een statistisch model van ordinale logistiek in statistische analysesoftware. Voor de hsp-16.2 en de graszode-3 expressie testen, gebruik een one-way ANOVA met α = 0,05 en de Tukey post hoc tests met α = 0,05 te vergelijken de totale fluorescentie van de hoofd regio.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De Caenorhabditis zeef bestaat uit 2 schroefdoppen, beveiligen van een gebied met een geweven nylon monofilament maaswijdte kleiner zijn dan de diameter van het lichaam van de gewenste developmental leeftijd, gebruikt voor het onttrekken van levende populaties van organismen met behulp van een eenvoudige wassen techniek. Het hecht aan standaard conische buizen en gebruikt het scherm mesh mechanisch dieren sorteren door de diameter van het lichaam, waardoor de gewenste dieren in de buis klaar voor verdere onderhoud en experimenteren (bijvoorbeeld, transfer of genetische oogst). Een zachte handleiding wassen met de Caenorhabditis zeef is snel, ongeveer 5 min per 60 – 100 mm plaat en de organismen zijn gemakkelijk hersteld van de Maas.
Percentage opbrengst van dieren na Caenorhabditis Sieve gebruiken
Om vast te stellen van de opbrengst van percentage van de Caenorhabditis zeef, zijn apparaten getest met zowel 20 μm en 50 μm porie-grootte mazen op volwassen dieren. A betekent dat de opbrengst van een > 90% succesvolle dierlijke overdracht werd bereikt voor beide maaswijdten getest (tabel 1).
Monofilamenten gaas met verschillende grootte lacunes kunnen worden gebruikt voor het scheiden van dieren van verschillende levensfasen. Gaas met openingen van 20 μm is geschikt voor wassen weg ontwikkeling van embryo's en larvale stadia kleiner is dan het vierde larvale stadium, behoud van de laatste (L4; met een diameter van gemiddeld lichaam van 32 μm) en alle dieren in latere levensfasen, terwijl de mesh met 50 μm hiaten toestaat alle andere leven stadia afgezien van volwassenen (met een gemiddelde lichaam diameter van 70 μm) te worden weggewassen (tabel 2).
Caenorhabditis Sieve gebruik heeft geen gevolgen voor healthspan statistieken
Motility: In C. elegans het normale sinusvormige verkeer (dat wil zeggen, beweeglijkheid) neemt af met de leeftijd18 en is een marker voor de algehele gezondheid. Om te bepalen als de Caenorhabditis zeef beïnvloed motiliteit, beweeglijkheid scores waren vergeleken voor pick, FUDR en Caenorhabditis zeef behandelgroepen op dagen 2, 4, 6 en 8 van volwassenheid. Alle dieren binnen elke groep (n = 10/groep) normale en spontane bewegingspatronen (klasse A) tentoongesteld op meerdere leeftijden tijdens volwassenheid (dagen 2, 4, 6 en 8 van volwassenheid; p > 0,05 voor meerdere vergelijkingen op alle dagen, Figuur 3).
Faryngaal pomp tarief: Het vermogen van C. elegans faryngaal spieren te pompen, daalt met de leeftijd en is een andere biomarker van healthspan23. Om te bepalen als de Caenorhabditis zeef beïnvloed de dieren faryngaal pomp tarief, pick, FUDR en Caenorhabditis zeef behandeling groepen werden vergeleken op dagen 2, 4, 6 en 8 van volwassenheid (n = 8 tot 10 per groep). Er was een significant verschil tussen dieren die onderging het oprapen en FUDR methoden op dagen 6 (p < 0.001) en 8 (p < 0,001). Ook was er een significant verschil tussen de zeef en FUDR groepen op 6 dagen (p < 0.001) en dag 8 van volwassenheid (p < 0,001). Echter was er geen statistisch significant verschil tussen de pick en de Caenorhabditis zeef groepen voor elke dag (p > 0,05, Figuur 4), die aangeeft dat de zeef geen voor deze maatregel van de healthspan gevolgen heeft.
Zachte touch antwoord: Reactie op een mechanische prikkel is een fysiologische marker te beoordelen van veroudering of algemene gezondheid24,25; Dus, de impact van verschillende overdracht methoden op zowel de voorste als de achterste zachte aanraking reacties werden getest. Er was geen statistisch significant verschil tussen de pick, het FUDR en de Caenorhabditis zeef behandelgroepen (n = 8/groep), anteriorly of posteriorly, voor elke dag van het testen (p > 0,4 voor alle vergelijkingen; Figuur 5A en 5B).
Vruchtbaarheid: Om vast te stellen of de zeef Caenorhabditis beïnvloed de hoeveelheid levensvatbare nakomelingen geproduceerd door C. elegans, de individuele nakomelingen in een periode van 24 uur gedurende dag 3 van volwassenheid werd geteld en vergeleken (n = 20 tot en met 22 per groep). Het gebruik van Caenorhabditis zeef deed geen aanzienlijk invloed op het aantal nakomelingen geproduceerd wanneer vergeleken bij een pick behandelde groep (p = 0.61, Figuur 6).
Moleculaire verslaggever testen
Nucleaire translocatie van de DAF-16: In C. eleganswordt de activering van de transcriptiefactor DAF-16 geassocieerd met toegenomen stress weerstand26. De nucleaire localisatie van DAF-16 werd onderzocht in een transgene nematode stam TJ356, die spreekt van DAF-16 gesmolten tot een groen fluorescent proteïne (DAF-16::GFP)-20. Onder normale groei omstandigheden, DAF-16::GFP is gelokaliseerd vooral in het cytosol, maar onder verschillende stressoren (bijvoorbeeld, hittestress), is het snel translocated in de kern-20. Als u wilt testen van het effect van sorteren met de Caenorhabditis zeef op DAF-16 translocatie, DAF-16::GFP lokalisaties werden vergeleken bij dag-5 volwassenen leeftijd zoekwoorden in een positieve controlegroep (hitte-stress), een negatieve controlegroep (handmatige transfer via pick), en een Caenorhabditis zeef behandelgroepen (n = 10/groep). De overdracht met de zeef Caenorhabditis beïnvloedde niet de nucleaire translocatie van DAF-16::GFP, en een soortgelijk fenotype toonde aan de dieren van de negatieve controle (p > 0,05, Figuur 7).
HSP-16.2 verslaggever: kleine hitteschokprotëinen als HSP-16.2 zijn biomarkers voor een stress-respons, en ze zijn zeer uitgedrukt tijdens een blootstelling aan warmte schok of oxidatieve stress agenten21,27. De TJ375-stam heeft een verslaggever GFP-gen gefuseerd met een hsp-16.2 promotor die niet onder normale omstandigheden21actief is. Echter na een blootstelling aan een warmte, HSP-16.2 eiwit expressie wordt geïnduceerd, en de dieren hoge niveaus van GFP expressie21weergeven. Voor het testen van de betrokkenheid van de Caenorhabditis zeef op een HSP-16.2-gemedieerde stressrespons, de dichtheid van de fluorescentie in de regio van de keelholte (n = 10 dieren/groep) van dieren leeftijd-matched bedroeg vergeleken in dag-5 volwassenen tussen een positieve controlegroep (warmte stress), een negatieve controle groep (ophalen), en een groep van de behandeling Caenorhabditis zeef. De overdracht met de zeef Caenorhabditis deed geen aanzienlijk veroorzaken de uitdrukking van HSP-16.2::GFP (hsp-16.2::gfp) in vergelijking met de negatieve controle (p > 0,05, Figuur 8).
SOD-3 verslaggever: In C. elegansis de anti-oxydant-gen dat voor superoxide dismutase 3 (SOD-3 codeert) omhoog-geregeld tijdens oxidatieve stress28. De stam van C. elegans CF1553 spreekt groen fluorescente proteïne (GFP)-label SOD-3 promotor, waarvan de expressie wordt geïnduceerd door oxidatieve stressoren, zoals paraquat5. Om te testen de betrokkenheid van de Caenorhabditis zeef sorteren op de reactie van de antioxidant in C. elegans, werd de dichtheid van de fluorescentie in de hoofd regio van leeftijd-matched dag-5 volwassenen vergeleken tussen de bevolking van een positieve controle (100 μM paraquat behandeling), een negatieve controle bevolking (handmatig plukken), en een Caenorhabditis zeef warmteprocédé overgebracht bevolking. De overdracht met de zeef Caenorhabditis deed geen aanzienlijk veroorzaken de uitdrukking van sod-3::gfp in vergelijking met de negatieve controle (p > 0,05, Figuur 9).
Figuur 1: Caenorhabditis zeef bouw. De progressie van de 'do-it-yourself' vervaardiging van het hulpprogramma wordt weergegeven. Deze panelen tonen (A) twee 50 mL conische buis caps (B) waarvan centra zijn verwijderd, (C) gesneden randen vloeiend, en (D - F) die zijn uitgerust met monofilamenten maaswijdte overeenkomt met de gewenste leven fase van C. elegans (Zie Protocol voor details). (G) de voltooide zeef blijkt ook. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Stapsgewijze afbeelding representatie van gebruik van Caenorhabditis Sieve. (A) de zeef is vooraf nat met een daling van de M9 oplossing, en (B) passen bovenop een conische tube van 50 mL. (C) 1 mL van de M9 afgepipetteerde oplossing met wormen is op de bovenzijde van de zeef, (D) een conische tube van 50 mL wordt geplaatst op de top van de zeef met de wormen geconfronteerd met de binnenkant van de buis, en (E) de zeef met een zojuist gekoppelde bovenste buis is snel gespiegelde o ver. (G) de zeef wordt nagespoeld met M9 uitvoering van de gewenste dieren in de nieuwe 50 mL tube en de wormen zijn toegestaan te regelen door de zwaartekracht naar de onderkant van de buis. (H) de wormen zijn afgepipetteerde en als druppels op een verse NGM plaat geplaatst. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Caenorhabditis zeef heeft geen gevolgen voor beweeglijkheid in de gehele levensduur. Deze figuur toont de verdeling van de motiliteit-klasse van de dieren dagen 2, 4, 6 en 8 van volwassenheid voor pick, FUDR, en Caenorhabditis zeef behandelgroepen. Klasse A dieren verhuisde normaal en spontaan, klasse B dieren abnormaal verplaatst en kunnen moeten porren en klasse C dieren waren niet in staat om te bewegen. Er was geen verschil tussen Caenorhabditis zeef, pick en FUDR groepen (p > 0,05). Drie wordt gerepliceerd (n = 10 dieren per behandeling plaat) werden uitgevoerd en geanalyseerd met ordinale logistieke model. klasse B dieren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Gebruik van Caenorhabditis zeef heeft geen gevolgen voor faryngaal pompen gedurende de levensduur. Deze figuur toont de faryngaal pomp tarieven van plukken, FUDR, en behandelgroepen Caenorhabditis zeef, op dagen ten opzichte van 2, 4, 6 en 8 van volwassenheid. De sterretjes geven een betekenis tussen de pick, zeef en FUDR behandelgroepen voor de dagen opgegeven (*** p < 0,05). Er was geen verschil tussen de Caenorhabditis zeef en de pick-groep (p > 0,05). Twee wordt gerepliceerd (N = 10 dieren per behandeling plaat) werden uitgevoerd en geanalyseerd met een one-way ANOVA en een Bonferroni na de test. De balken vertegenwoordigen de gemiddelde ± de standaardfout van het gemiddelde. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: Gebruik van Caenorhabditis zeef heeft geen invloed op anterior drukpunt in de gehele levensduur. Deze panelen tonen (A) de anterior en (B) de posterieure touch antwoord graaf van pick, FUDR en Caenorhabditis zeef behandelgroepen vergeleken op dagen 2, 4, 6 en 8 van volwassenheid. Twee replicatieonderzoeken werden uitgevoerd met N = 10 voor alle behandelde groepen en vergeleken met een one-way ANOVA en een Bonferroni na de test (p = 0,4 en p = 0,9 voor anterior en posterior, respectievelijk). De balken vertegenwoordigen de gemiddelde ± de standaardfout van het gemiddelde. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: Caenorhabditis zeef heeft geen invloed op de hoeveelheid levensvatbare nakomelingen op dag 3 van volwassenheid. Deze afbeelding ziet u de levensvatbare nakomelingen van dag-3 volwassenen na een 24u ei-leggen, verspreid over 3 dag van volwassenheid voor moederdieren. De balken vertegenwoordigen de gemiddelde ± de standaardfout van het gemiddelde. N = 20-22 dieren uit ten minste twee afzonderlijke biologische duplo's per groep van de behandeling. De behandeling in groepen worden vergeleken met een t-testen, (p > 0,05). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7: Caenorhabditis zeef beïnvloedde niet nucleaire translocatie van DAF-16::GFP. Deze panelen tonen beelden van de vertegenwoordiger van de DAF-16 translocatie van (A) een warmte-schok groep (de positieve controle), (B) een pick groep (de negatieve controle), en (C) een Caenorhabditis zeef behandelde groep. (D) de dieren in de positieve controlegroep weergegeven een activering van de DAF-16 nucleaire translocatie. De Caenorhabditis zeef deed niet veroorzaken een nucleaire translocatie en cytosolische fusieproteïne vergelijkbaar met de dieren in de negatieve controlegroep weergegeven. N = 10 dieren per behandeling groep uit ten minste drie afzonderlijke biologische wordt gerepliceerd. De behandeling in groepen werden vergeleken met een one-way ANOVA en van een Tukey post hoc test. Schaal bar = 100 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 8: Caenorhabditis zeef beïnvloedde niet de expressie van hsp16.2::gfp. De HSP-16.2 expressies (in willekeurige fluorescentie eenheden) van een warmte schok groep (de positieve controle), een pick-groep (de negatieve controle), en een Caenorhabditis zeef behandelde groep worden vergeleken. De sterretjes geven een hoge uitdrukking van hsp16.2::gfp voor de positieve controlegroep die sterk van de andere behandelgroepen afwijkt (*** p < 0,05). De Caenorhabditis zeef beïnvloedde niet de expressie hsp16.2::gfp en intensiteit van de fluorescentie vergelijkbaar met dieren weergegeven in de negatieve controlegroep (p > 0,05). Drie replicaat-organismen werden uitgevoerd met N = 10 voor alle behandelde groepen en vergeleken met een one-way ANOVA en van een Tukey post hoc test. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 9: Caenorhabditis zeef beïnvloedde niet de expressie van sod-3::gfp. De expressies SOD-3 (in willekeurige fluorescentie eenheden) van een groep paraquat 100 μM (de positieve controle), een pick-groep (de negatieve controle), en een Caenorhabditis zeef behandelde groep worden weergegeven. De sterretjes geven een hoge uitdrukking van sod-3::gfp voor de positieve controlegroep die sterk van de andere fracties afwijkt (*** p < 0,05). De Caenorhabditis zeef beïnvloedde niet de graszode-3::gfp-expressie en intensiteit van de fluorescentie vergelijkbaar met de dieren in de negatieve controlegroep weergegeven (p > 0,05). Drie replicaat-organismen werden uitgevoerd met N = 10 voor alle behandelde groepen en vergeleken met een one-way ANOVA en van een Tukey post hoc test. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Maaswijdte | N = 50 | N = 100 |
| 20 μm | 95.33% | |
| 50 μm | 99,00% | 93.33% |
Tabel 1: Percentage opbrengst van maaswijdten. In deze tabel worden de resultaten weergegeven van een apparaat van de 20 μm getest met N = 50 volwassenen voor 3 wordt gerepliceerd en een 50 μm apparaat getest met N = 50 volwassenen voor 2 wordt gerepliceerd en met N = 100 voor 3 wordt gerepliceerd.
| Maaswijdte | Ontwikkelingsstadium | Diameter van het lichaam |
| 20 μm | Larvale stadium 4 | ~ 35 μm |
| 50 μm | Dag 1 volwassene | ~ 70 μm |
Tabel 2: gemiddelde lichaam diameter. Deze tabel toont de gemiddelde lichaam diameter verkregen door het gemiddelde van 3 metingen even verspreid over elke worm voor 15 dieren in elk stadium gemeten leven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We geïntroduceerd hierin, het ontwerp en gebruik van een toegankelijke, effectieve Caenorhabditis zeef als een instrument voor het sorteren en het onderhouden van C. elegans. Dit hulpmiddel heeft verschillende voordelen aan het handmatig plukken van individuele dieren, het wassen van populaties, chemische behandelingen (bijvoorbeeldFUDR) of duurder methoden van laagniveau dieren. Ten eerste, de Caenorhabditis zeef efficiënt en snel (minder dan 20 min) sorteert nakomelingen van grote gemengde bevolking van dieren (tabel 2). Ook het gebruik van de tool geen waarneembare toxische effecten op de dieren healthspan (Figuur 3, Figuur 4, Figuur 5, Figuur 6) heeft, er niet toe brengt goed beschreven genetische stress verslaggevers (Figuur 7, Figuur 8 Figuur 9), en vermindert de hoeveelheid vreemde chemische stof die invloed kan zijn op de toegepaste behandeling van de cultuur-platen of een moleculaire assay daarna. Het gebruiksgemak is een belangrijk voordeel; een onderzoeker in elke fase van hun opleiding kan worden opgeleid te gebruiken (Figuur 1 en Figuur 2; Protocol).
De materialen die nodig zijn voor de fabricage en het gebruik van de zeef (bv, pipetten, buffers) zijn beschikbaar in standaard onderzoekslaboratoria; Dus, als gebroken, de Caenorhabditis zeef is geen dure vervanging of reparatie. De zelfgebouwde aard van de Caenorhabditis zeef toelaat om een veelzijdige tool: ruimtelijke figuur kan worden geconstrueerd met maaswijdten geschikt is voor verschillende C. elegans ontwikkelingsstadia en fenotypen. De Caenorhabditis zeef kan ook worden gebruikt in de tests die zijn uitgevoerd in andere nematode soorten of bij het isoleren van kleine organismen, mits de juiste maaswijdte wordt gebruikt bij de vervaardiging.
Dit hulpprogramma biedt naast de voordelen voor C. elegans bevolking onderhoud, de zeef kan worden gebruikt voor het schoonmaken van dieren vóór het gebruik ervan in andere experimentele toepassingen. Bijvoorbeeld met de ontwikkeling van microfluidics uit te voeren van C. elegans komt onderzoek de kwestie van de chip gebruik en schoonmaken. Afhankelijk van de hoeveelheid bacteriën die zijn gekoppeld aan de dieren, moeten speciale voorzorgsmaatregelen worden genomen om niet te verstoppen van de microfluidic-chip, waardoor zij onbruikbaar29. Vaak wanneer C. elegans worden overgebracht naar een microfluidic chip, wordt residu van de bacteriële gazon gebracht met hen. Dit residu kan en verstoppen de microfluidic kanalen, waardoor de chip storing, die vervolgens reiniging vereist of vervanging. De constructie van het apparaat in dit protocol biedt een methode om niet alleen oogsten gesynchroniseerde dieren voor microfluidics, maar ook voor het reinigen van de dieren vóór hun plaatsing in een microfluidic apparaat. Door het verwijderen van het puin en bacteriële residu, opgepakt bij het verzamelen van de dieren, zijn de microfluidic-kanalen minder gevoelig voor storing, waardoor de levensduur van individuele fiches en de daaropvolgende doorvoer van onderzoek met hen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen. De auteurs verklaren dat het onderzoek werd uitgevoerd in de afwezigheid van eventuele commerciële of financiële relaties kan worden opgevat als een mogelijke belangenconflicten.
Acknowledgments
De auteurs bedank Heather Currey voor haar eerste bijdrage aan de studie ontwerp, en Dr. Swarup Mitra voor zijn kritische beoordeling van het manuscript. Ook bedank wij Dr. Michael B. Harris voor opmerkingen, verbeteringen en bijstand bij het opstellen van de demonstratie van deze methodologie. De stammen werden verstrekt door de Caenorhabditis genetica Center, dat wordt gefinancierd door het Bureau van de NIH onderzoek infrastructuur programma's (P40 OD010440). Het onderzoek in deze publicatie gerapporteerd werd gesteund door de National Institute Of General Medical Sciences van de National Institutes of Health onder Award nummers UL1GM118991, TL4GM118992 of RL5GM118990 en door een institutionele Development Award (idee) van het National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health onder grant nummer 5P20GM103395-15. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de National Institutes of Health. UA is een AA/EO werkgever en onderwijsinstelling en verbiedt onwettige discriminatie tegen een individu: www.alaska.edu/titleIXcompliance/nondiscrimination.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Safety glasses | Uline | S-21076 | |
| Protective heat resistant glove | Grainger | Item # 3AT17 Mfr. Model # 3AT17 Catalog Page # 1703 | |
| 50 mL conical tube | Falcon | 14-432-22 | |
| Synthetic Nylon mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd |
NTX20 and NTX50 | |
| Cyanoacrylate glue | Scotch Super Glue Liquid | SAD114 | |
| Pliers | Vampliers | VMPVT-001-8 | |
| Dremmel tool with circular file | Lowe's | Item # 525945 Model # 100-LG | |
| FUDR | Sigma | F0503 | |
| M9 chemicals ( NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4) | Sigma | S7653, RES20908-A7, 1551139, M7506 | |
| NGM plate chemicals (Bactopeptone, Agar, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2,Cholesterol, Streptomycin) | BD Biosciences (bactopeptone) , Lab express (agar), Sigma ( rest) | BD bioscience 211677, Lab Express 1001, Sigma 1551139, 1551128, C1016, C8667, S6501 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443 | |
| Paraquat dichloride hydrate | Sigma | 36541 | |
| Inverted fluorescence microscope | Olympus | FSX100 |
References
- C elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).
- Herman, M. A. Hermaphrodite cell-fate specification. WormBook. , 1-16 (2006).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Chalfie, M., Hart, A. C., Rankin, C. H., Goodman, M. B. Assaying mechanosensation. WormBook. , (2014).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Deletion of the Mitochondrial Superoxide Dismutase sod-2 Extends Lifespan in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 5 (2), e1000361 (2009).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of Ageing Development. 132 (10), 519-521 (2011).
- Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing Development. 12 (2), 137-150 (1980).
- Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of Ageing and Development. 131 (5), 364-365 (2010).
- Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing Development. 133 (1), 46-49 (2012).
- Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9 (1), e85964 (2014).
- Pulak, R. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. Methods Molecular Biology. 351, 275-286 (2006).
- Argon, Y., Ward, S. Caenorhabditis elegans fertilization-defective mutants with abnormal sperm. Genetics. 96 (2), 413-433 (1980).
- Lee, S. J., Kenyon, C. Regulation of the longevity response to temperature by thermosensory neurons in Caenorhabditis elegans. Current Biology. 19 (9), 715-722 (2009).
- Klass, M. R. Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span. Mechanisms of Ageing Development. 6 (6), 413-429 (1977).
- Zhang, B., et al. Environmental Temperature Differentially Modulates C. elegans Longevity through a Thermosensitive TRP Channel. Cell Reports. 11 (9), 1414-1424 (2015).
- Michaelson, L. C. C. elegans: A Practical Approach. Ian A. Hope (ed.). Oxford University Press, Oxford. 1999. Pp. 281. ISBN 0 19 963738 5. Heredity. 85 (1), 97-100 (2000).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).
- Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).
- Henderson, S. T., Johnson, T. E. daf-16 integrates developmental and environmental inputs to mediate aging in the nematode Caenorhabditis elegans. Current Biology. 11 (24), 1975-1980 (2001).
- Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).
- Libina, N., Berman, J. R., Kenyon, C. Tissue-specific activities of C. elegans DAF-16 in the regulation of lifespan. Cell. 115 (4), 489-502 (2003).
- Keith, S. A., Amrit, F. R., Ratnappan, R., Ghazi, A. The C. elegans healthspan and stress-resistance assay toolkit. Methods. 68 (3), 476-486 (2014).
- Scerbak, C., Vayndorf, E. M., Hernandez, A., McGill, C., Taylor, B. E. Mechanosensory neuron aging: Differential trajectories with lifespan-extending alaskan berry and fungal treatments in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Aging Neuroscience. 8, 173 (2016).
- Vayndorf, E. M., et al. Morphological remodeling of C. elegans neurons during aging is modified by compromised protein homeostasis. npj Aging and Mechanisms of Disease. 2, 16001 (2016).
- Murakami, S., Johnson, T. E. A genetic pathway conferring life extension and resistance to UV stress in Caenorhabditis elegans. Genetics. 143 (3), 1207-1218 (1996).
- Abbas, S., Wink, M. Green Tea Extract Induces the Resistance of Caenorhabditis elegans against Oxidative Stress. Antioxidants (Basel). 3 (1), 129-143 (2014).
- Yanase, S., Hartman, P. S., Ito, A., Ishii, N. Oxidative stress pretreatment increases the X-radiation resistance of the nematode Caenorhabditis elegans. Mutation Research. 426 (1), 31-39 (1999).
- Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).
