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Developmental Biology

Caenorhabditis Tamiz: Un instrumento de baja tecnología y metodología para la clasificación de los organismos multicelulares pequeños

Published: July 4, 2018 doi: 10.3791/58014
Automatic Translation
*1,2, *3, 4, 2, 5
1Department of Biology and Wildlife, University of Alaska Fairbanks, 2Institute of Arctic Biology, University of Alaska Fairbanks, 3Department of Chemistry and Biochemistry, University of Alaska Fairbanks, 4Departments of Biology and Chemistry, Earlham College, 5Department of Biological Sciences, College of Natural Science and Mathematics, California State University Long Beach
* These authors contributed equally

Summary

El protocolo actual incluye una metodología para la clasificación y limpieza de las poblaciones de edad comparable de elegans de Caenorhabditis. Utiliza un simple, barato y eficaz herramienta a la medida para obtener una población experimental de nematodos para la investigación.

Abstract

Elegans de Caenorhabditis (C. elegans) es un organismo modelo bien establecido usado en una amplia gama de investigación básica y biomédica. Dentro de la comunidad de nematodos de la investigación, hay una necesidad de una forma asequible y eficaz mantener poblaciones grandes, edad comparable de C. elegans. Aquí, presentamos una metodología para la clasificación mecánica y limpieza C. elegans. Nuestro objetivo es proporcionar un proceso rentable, eficiente, rápido y simple para obtener animales de tamaños uniformes y estadios para su uso en experimentos. Esta herramienta, el tamiz de Caenorhabditis , utiliza un sistema de tapa a la medida que los hilos de rosca en tubos de laboratorio cónico común y tipo C. elegans basado en tamaño de cuerpo. También demostramos que el tamiz de Caenorhabditis efectivamente transfiere animales de placa de un cultivo a otro lo que permite una rápida clasificación, sincronización y limpieza sin afectar a los marcadores de salud, incluyendo la movilidad e inducible por estrés Reporteros de gene. Esta herramienta accesible e innovador es una opción rápida, eficiente y no estresante para el mantenimiento de las poblaciones de C. elegans .

Introduction

El gusano nematodo Caenorhabditis elegans, es un organismo modelo principal. Además de la naturaleza sencilla y controlada de su cultivo en el laboratorio, es de su genoma completo secuenciado1 y el destino del desarrollo de cada célula se conoce2. Debido a estas características, C. elegans es un organismo modelo ampliamente utilizado para los estudios genéticos. Sin embargo, junto con estas características beneficiosas vienen algunos desafíos para los investigadores. Debido a su tiempo de generación rápido, las poblaciones de C. elegans pueden quedarse rápidamente sin alimentos o mezcladas poblaciones con múltiples generaciones y etapas de desarrollo se presentan a la vez. Por lo tanto, experimentos llevados a cabo en medios del sólido crecimiento de nematodos (NGM) requieren investigadores moverse físicamente animales a platos frescos antes de agota la fuente bacteriana de alimentos y desarrollan de nuevas larvas. Esto puede ser tedioso como una transferencia frecuente de los animales es necesaria para evitar que las poblaciones experimentales de ser mezclado con generaciones de crías. Aún así, algunos experimentos requieren ambos números grandes de animales y puntos de tiempo prolongado (por ejemplo, la extracción de DNA o RNA en la edad adulta). Esto agrava los retos de mantener una población sincronizada con precisión y transferir grandes cantidades de animales.

Los métodos actuales de transferencia de C. elegans cultivadas el NGM se cosecha o lavar los animales placa; tratando químicamente los animales (por ejemplo, con la replicación de ADN inhibidor fluorodeoxyuridine o FUDR); o mediante citometría de flujo para clasificar los animales en placas de varios pocillos. Selección implica el uso de una herramienta de mano, hecha con un alambre fino de platino o una pestaña, a transferir manualmente individuales o múltiples animales3,4. Este método es exacto, pero requiere habilidad y tiempo y es una limitación para estudios con gran número de animales. Cosecha de mayo también ser físicamente perjudiciales y estresante para los animales potencialmente someter a individuos a cantidades inconsistentes y antinaturales del disturbio y de fuerza. Lavado consiste en enjuagar una placa de cultivo con una solución tampón y transferir la solución con los animales con pipeta Pasteur de vidrio a una placa de cultivo nuevo. Este método es rápido y eficiente pero no es exacto como múltiples generaciones y etapas de desarrollo de los animales se transfieren a granel. Tratamientos químicos, tales como FUDR, pueden ser disuelto en los medios de cultivo para evitar la producción de descendencia a través del bloqueo de cualquier réplica de la DNA y por lo tanto, el desarrollo de la producción y huevos de gametos. Si bien efectivo, este método debe ser aplicado después de la maduración del desarrollo en cuanto a no alterar los procesos normales de desarrollo, y esto significa que aún es un requisito para la transferencia de los animales antes de su administración3. Este método también influencias múltiples celular vías de señalización, dando por resultado efectos notables sobre los animales a medida que envejecen (p. ej., una extensión de vida útil o una alterada proteostasis) dependiendo de la cepa de C. elegans utilizadas5, 6,7,8,9,10. Métodos de citometría de flujo automáticamente clasificar y transferir individual C. elegans de una placa de un bien a otro11. Si bien este método es muy eficaz y eficiente, equipos de citometría de flujo es prohibitivamente costoso e inaccesible para muchos investigadores. Una alternativa a la transferencia de animales es usar modelos mutantes termosensible, como fer-15 fem-1, que se convierten en estériles con ajuste de temperatura12. Mientras que el uso de animales mutantes es útil en algunas situaciones, estas cepas específicas crecen más lentamente que los animales de tipo silvestre y dependen de un genoma alterado, que sirve como representantes pobres gusanos envejecimiento o sano. Además, la dependencia de un cambio de temperatura para inducir esterilidad también resulta en la ausencia de un entorno estático, y los cambios de temperatura han demostrado fácilmente influir gene expresiones13,14, 15. grupos de investigación anteriormente han publicado técnicas que describe el uso de una malla para filtrar C. elegans por tamaño16. Sin embargo, hemos podido encontrar trabajo previo para cualquier cambio en los resultados generales de salud que pueden estar asociados con el uso de estos filtros.

Por lo tanto, es una necesidad dentro de la comunidad de investigación de C. elegans para un método asequible, eficiente, rápido y preciso para la transferencia de grandes cantidades de animales entre placas. Hemos desarrollado una pieza accesible, mejora de equipo (nombrado el tamiz de Caenorhabditis ) y un protocolo asociado para su fabricación y funcionamiento que satisfaga las necesidades de la comunidad de investigación de C. elegans . Aquí, compartimos el diseño de la criba de Caenorhabditis y métodos para su uso, y nos demuestran que su uso no afecta la salud común o cualquier marcador de estrés en comparación con la cosecha manual estándar y un tratamiento con el uso común, restricción de fertilidad química FUDR.

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Protocol

1. construcción de tamiz de Caenorhabditis y el uso

  1. Protocolo de construcción
    1. Adquirir 2 tapas de tubos cónicos de 50 mL (figura 1A).
    2. Quitar el área de centro dentro del borde interno de los párpados (cuando se mira desde la parte inferior, figura 1B) utilizando un mechero Bunsen y una sonda de metal caliente o un soldador o caminó broca.
      Nota: Usando el calor para cortar la tapa de plástico es preferible una hoja porque hay menos riesgo de lesiones.
    3. Limpiar y lijar los bordes de corte y superior la superficie con un archivo de curva o un rotatorio (e.g., Dremel) herramienta de pulido. Ver figura 1.
    4. Cortar el círculo de la malla de monofilamento con el diámetro apropiado (figura 1). Para ello, trazar una tapa sobre una hoja de malla de nylon monofilamento y cortar dentro de la línea dibujada.
    5. Cortar ranuras/barras diagonales en la superficie superior de los párpados para mejorar la adhesión de los dos párpados cuando se aplica pegamento para plástico (Figura 1E).
    6. Limpie las tapas con etanol y deje secar.
    7. Aplique pegamento de cianocrilato en la superficie superior de ambas tapas, manteniendo hasta el borde exterior.
      Nota: un poco de pegamento va una manera larga.
    8. Coloque la malla de monofilamento, según la tabla 1, sobre una tapa encolada (Figura 1F). Colocar la segunda tapa invertida encima de la malla; ambas tapas juntos deben tener sus tapas. Presione firmemente junto (figura 1). Asegúrese que la malla esté tensada.
      Nota: como medida de seguridad, uso de pinzas para colocar la malla en las tapas.
    9. Una vez que ha secado la capa inicial de adhesivo, aplicar un anillo de pegamento de cianocrilato en el espacio exterior entre las tapas. Ser generosos, ya que esto agrega integridad y evita cualquier pelado aparte o con fuga.
    10. Etiqueta el filtro con el tamaño de poro de malla de la malla de monofilamento.
      Nota: Aquí, usamos dos tamaños de poro de malla: 20 μm y 50 μm.
  2. Protocolo de uso
    1. Humedezca previamente el tamiz.
      1. Pipetear una solución salina, como M9 [5 g de NaCl, 6 g de Na2HPO4, 3 g de KH2PO4, 1 L de la poste-limpieza de H2O y 1 mL de MgSO4 (1 M)]17, a través del centro de la criba hasta que se forme gota , se condensa y gotea del centro de la parte inferior del filtro (figura 2A). Opcionalmente, aplicar una toallita libre de pelusas (por ejemplo, Kimwipe) al fondo a la forma o extensión de una gota de humedad sobre la malla.
      2. Colocar el tamiz sobre un tubo cónico de 50 mL. Etiquetar el tubo como 'Tubo de residuos' (figura 2B).
    2. Lave una población de C. elegans una placa de agar.
      1. Lave la placa con el buffer M9 y hacer el medio que contiene el gusano en la parte superior de la malla de monofilamento de 1 mL a la vez (figura 2). Asegúrese de operar en el centro de la malla. Lave todos los gusanos de la placa.
        Nota: Típicamente, 3 mL de M9 en una placa de 60 mm es suficiente.
      2. Para minimizar el número de gusanos en el pipeteo, utilice un pipeta Pasteur de vidrio para mover los gusanos fuera del plato y en el centro de la malla (repetir según sea necesario).
      3. Enjuague el filtro con el buffer M9 de la parte superior. Una vez más, asegúrese de que operar en el centro de la malla y enjuague todos los gusanos en esa zona. Lavar tantas veces como sea necesario para asegurar que todas las bacterias y gusanos más pequeños han pasado a través de la malla.
    3. Cosechar los animales emparejados por el tamaño del tamiz.
      1. Instale un nuevo tubo cónico de 50 mL a la cima del tamiz de los gusanos adultos del paso 1.2.2.3 hacia el interior del tubo nuevo de colección (Figura 2D).
      2. Retire el primer tubo (tubo de desagüe) y rápidamente se voltea el colador y tubo nuevo para evitar que la gota de migración (Figura 2E).
        Nota: Si la esterilidad no es necesaria, utilice un trapo sin pelusa (por ejemplo, Kimwipe) fluido mecha desde la parte inferior de la malla antes de los bancos.
      3. Lavar la malla con la M9 en el nuevo tubo de 50 mL de la nueva superestructura (figura 2F). Otra vez, operar en el centro de la malla y mantener una gotita en la parte inferior de la malla.
      4. Permitir a los gusanos a depositarse o hace girar suavemente hacia abajo (por ejemplo, < 16 x g) durante aproximadamente 1 minuto (figura 2).
      5. Aspirar la solución tampón de la pelotilla de gusanos, idealmente a > 0.5 mL, o quitar tanto líquido como sea posible sin perturbar el pellet.
      6. Pipetear los gusanos utilizando un vidrio pipeta Pasteur sobre una placa de NGM y deje secar. Espacio múltiples gotitas hacia fuera en una nueva placa para que sequen más rápido (figura 2 H).
    4. Limpiar el tamiz.
      1. Enjuague el colador suavemente y a fondo con etanol y ósmosis inversa de agua. Deje que se seque.
      2. Almacenar en un recipiente limpio para su uso futuro indefinido.
      3. Deséchela cuando la malla desarrolla un aspecto de "holgura".

2. validación de Caenorhabditis tamiz método de ordenación

  1. Mantenimiento en general
    1. Para todos los experimentos, cultura gusanos en un estándar medio de crecimiento de nematodos17 (1 L de NGM consta de 2,5 g de peptona, 17 g de agar, 3 g de NaCl, 975 mL de agua doble destilada, 1 mL de colesterol 5 mg/mL, 1 mL de 1 M CaCl2 1 mL de 1 M MgSO4, 25 mL de 1 M KHPO4y 0,5 mL de estreptomicina 100 mg/mL) a 25 ° C.
  2. Administración del tratamiento experimental
    1. Comparar los grupos de tres tratamiento: selección, fluorodeoxyuridine (FUDR) y tamiz de Caenorhabditis .
      1. Para el grupo de tratamiento de FUDR, agregue 100 mg/mL FUDR a los medios NGM a una concentración final de 100 μM para prevenir cualquier producción de progenie y transferir los gusanos todos los días a una placa NGM fresca para evitar el agotamiento de la comida.
      2. Para el grupo de selección, seleccionar y transferir los gusanos manualmente utilizando un asa de platino.
      3. Para el grupo de tratamiento del tamiz de Caenorhabditis , siga el paso 1.2 y pipetear los gusanos sobre una placa de NGM.
  3. Caenorhabditis Porcentaje de rendimiento del tamiz
    1. Cuantificar qué tan eficaz es el tamiz en la clasificación de C. elegans, crecer edad síncrono N2 animales a día 1 de la edad adulta a 25 ° C (es decir, 48 h después de la puesta de huevos) y luego transferirlos por escoger a platos frescos de NGM (N total = 50 o N = 100 animales por tre atment grupo).
    2. Después de 24 horas de recuperación, transferencia de la población a nuevas placas NGM con el tamiz de Caenorhabditis siguiendo el anterior protocolo (véase el paso 1.2) y contar el número de animales transferidos con éxito.
    3. Calcular el porcentaje de rendimiento como el cociente entre el número de animales transferidos en comparación con el número inicial al principio de la transferencia multiplicado por 100 (%).
  4. Healthspan ensayos
    Nota: Puntuación healthspan parámetros de la clase de movilidad, la velocidad de la bomba faríngea y el anterior y la respuesta posterior de tacto suave en los días 2, 4, 6 y 8 de la edad adulta por edad-que sincronizados N2 animales mantenidos a 25 ° C.
    1. Seguimiento de la movilidad
      1. Asignar puntuaciones de movilidad basados en un sistema basado en clases (clases A, B y C) siguiendo los métodos de Herndon et al. 18. comparar los efectos de los tres grupos experimentales utilizando un modelo de la ordinal logístico estadísticas en software de análisis estadístico.
        Nota: Personas de clase A moverse espontáneamente en un patrón normal, sinusoidal. Individuos de la clase B se mueven en movimientos marcadamente no-sinusoidal y requieran insistencia para animar movimiento. Individuos de la clase C movieran su cabeza o cola en respuesta a la insistencia pero son incapaces de moverse en el agar.
    2. Velocidad de la bomba faríngea
      1. Cuenta el movimiento de la amoladora del terminal bulbo faríngeo del animal visualmente bajo un estereomicroscopio en 600 X final aumento durante 1 minuto.
      2. Realizar un análisis estadístico con un ANOVA unidireccional con α = 0.05 y post-test de Bonferroni con α = 0.05.
    3. Respuesta táctil
      1. Registrar una respuesta de toque suave y comparar entre los grupos de tres tratamiento. Realizar el análisis basados en los métodos descritos por Calixto et al. 19.
      2. Registro de la parte anterior y posterior toquen respuesta por suavemente acariciando una pestaña selección perpendicular a través de la cola o la cabeza (5 x, alterna cabeza y cola) de los animales.
      3. Anotar cualquier movimiento en la dirección opuesta del trazo como 1 punto en una escala de 0 a 5 para la parte anterior y la posterior respuesta.
      4. Llevar a cabo análisis estadístico con un ANOVA unidireccional con α = 0.05 y post-test de Bonferroni con α = 0.05.
  5. Análisis de la fecundidad
    1. Para determinar el uso de impacto del tamiz de Caenorhabditis en reproducción, crecer edad síncrono N2 animales al día 2 de la edad adulta a 25 ° C.
    2. 60 h después de ponga huevo, transferencia de animales para nuevas placas NGM con una selección platino o el tamiz de Caenorhabditis y les dan 4 h para recuperar (seque las placas tamizadas para 20-30 min).
    3. Después de la recuperación, placa individual de escoger los animales a través de una pestaña a planchas NGM, les dan 24 horas para poner huevos y retirar los animales. Permitir que la progenie en cada plato para desarrollar en condiciones normales a 25 ° C por 24 h otro.
      Nota: Una selección de pestañas es una pestaña humana asegurado hasta el final de una pipeta Pasteur con esmalte de uñas y esterilizado con etanol.
    4. Contar el número de individuos de generación F1 viables. Realizar un análisis estadístico utilizando una prueba T con α = 0.05.
      Nota: Descendencia Viable se considera huevos que eclosionan y comienzan su desarrollo a través de los ciclos regulares de larvas con éxito.
  6. Ensayos de respuesta de estrés reportero fluorescente
    1. Realizar tres ensayos reportero fluorescente utilizado para detectar posibles marcadores de estrés: un desplazamiento de la DAF-16::GFP en los núcleos de las células en una cepa [TJ356-zIs356 (pDAF-16::DAF-16-GFP; rol-6)]20; expresión de hsp-16.2 [TJ375-gpIs1 (hsp-16.2p::GFP)]21; y una expresión de la sod-3 [CF1553-muIs84([pAD76]sod-3p::GFP+rol-6[su1006])]22.
    2. Para cada ensayo, cultura animales sincrónica a la edad de los grupos de tratamiento de tres a 20 ° C y examinar en el día 3 de la edad adulta: utilizar un control negativo (sobre una base diaria, transferencia de un grupo de animales manualmente con un pico de platino), un control positivo (sobre una base diaria transferencia de un grupo de animales manualmente con un pick de platino además de un estresor establecido) y el tamiz de Caenorhabditis (pasar los animales a través del tamiz y que puedan recuperar durante 30 min en el NGM justo antes de la proyección de imagen).
    3. En el ensayo de DAF 16::GFP, calor choque los animales control positivo a 37 ° C por 30 min antes de la proyección de imagen20. Para el análisis de hsp-16.2, calor choque los animales de control positivo de 90 min, 20 h antes de la proyección de imagen21. Para el análisis de la sod-3, tratar los animales de control positivo con paraquat 100 mM durante 4 horas antes de la proyección de imagen22.
    4. Los gusanos inmediatamente con una selección de pestañas de la cosecha y montar a un cubreobjetos con 1 μL de una solución de surfactante 407 36% poloxamer para inmovilizar los gusanos.
    5. Los gusanos montados con otro cubreobjetos del emparedado. Monte los dos cubreobjetos y un portaobjetos de microscopio de vidrio estándar de imagen los gusanos con una ampliación de 8 X en un microscopio fluorescente invertido (para una ampliación total de 80 X) y una exposición constante con un filtro FITC.
    6. Para detectar diferencias entre los tres grupos en el ensayo 16::GFP DAF, clasificar los animales según la ubicación de la reportera 16::GFP DAF (nuclear si el reportero transloca al núcleo, citosol si el reportero encuentra en citosol y si es intermedio el reportero situado en núcleo y citosol).
    7. Comparar los resultados usando un modelo estadístico de logística ordinal en el software de análisis estadístico. Para hsp-16.2 y los análisis de expresión de la sod-3, un ANOVA unidireccional con α = 0.05 y las pruebas post hoc de Tukey con α = 0.05 para comparar la fluorescencia total de la región de la cabeza.

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Representative Results

El tamiz de Caenorhabditis consta de 2 tapones, asegurando una superficie de malla de monofilamento de nylon tejido más pequeño que el diámetro del cuerpo de la edad del desarrollo deseado, usado para extraer energizadas poblaciones de organismos usando una técnica simple lavado. Fijaciones para tubos cónicos y la malla se utiliza para ordenar mecánicamente animales por el diámetro del cuerpo, dejando los animales deseados en el tubo lista para más mantenimiento y experimentación (p. ej., transferencia o cosecha genética). Un suave lavado con el tamiz de Caenorhabditis es rápida, aproximadamente 5 min por placa de 60-100 mm y los organismos son fácilmente recuperados de la malla.

Porcentaje de rendimiento de los animales después de Caenorhabditis Uso de tamiz
Para establecer el porcentaje de rendimiento del tamiz Caenorhabditis , aparatos fueron probados con 20 μm y mallas de tamaño de poro de 50 μm en animales adultos. A significa rendimiento de un > 90% transferencia animal exitosa se logró para ambos tamaños de acoplamiento probados (tabla 1).

Malla de monofilamento con diverso tamaño vacíos pueden utilizarse para separar los animales de diferentes estadios. Malla de 20 μm las lagunas es apropiado para lavar lejos desarrollo de embriones y estadios larvarios más pequeños que el cuarto estadio larvario, conservando este último (L4, con un diámetro promedio de 32 μm) y los animales en etapas posteriores de la vida, mientras que la malla de 50 μm huecos permitirá a todos otra vida etapas al lado de los adultos (con un diámetro promedio de 70 μm) al ser arrastrados (tabla 2).

Caenorhabditis Uso de tamiz no afecta healthspan métricas
Movilidad: En C. elegans el movimiento sinusoidal normal (es decir, la motilidad) disminuye con la edad18 y es un marcador de salud general. Para determinar si el tamiz Caenorhabditis había influenciado motilidad, motilidad los resultados fueron comparados para recoger, FUDR y tamiz de Caenorhabditis grupos de tratamiento en los días 2, 4, 6 y 8 de la edad adulta. Todos los animales en cada grupo (n = 10/grupo) exhiben patrones de movimiento normal y espontánea (clase A) a múltiples edades a lo largo de la edad adulta (días 2, 4, 6 y 8 de la edad adulta; p > 0.05 para comparaciones múltiples en todos los días, figura 3).

Bomba faríngea: La capacidad de los músculos faríngeos de la C. elegans para bomba disminuye con la edad y es otro biomarcador de healthspan23. Para determinar si el tamiz Caenorhabditis influenciado los animales bomba faríngea, pick, FUDR y Caenorhabditis se compararon grupos de tratamiento de tamiz en los días 2, 4, 6 y 8 de la edad adulta (n = 8 a 10 por grupo). Hubo una diferencia significativa entre los animales que experimentaron la cosecha y métodos FUDR días 6 (p < 0,001) y 8 (p < 0,001). También, hubo una diferencia significativa entre los grupos FUDR y tamiz en los días 6 (p < 0,001) y el día 8 de la edad adulta (p < 0,001). Sin embargo, no hubo ninguna diferencia estadísticamente significativa entre la captación y los grupos de tamiz de Caenorhabditis para cualquier día (p > 0.05, figura 4), indicando que el tamiz no afecta esta medida de healthspan.

Respuesta de toque suave: Respuesta a la estimulación mecánica es un marcador fisiológico para evaluar el envejecimiento o general salud24,25; así, se analizaron el impacto de los métodos de transferencia diferentes en la parte anterior y la respuesta posterior de tacto suave. No hubo diferencias estadísticamente significativas entre el pick, FUDR y Caenorhabditis tamiz de grupos de tratamiento (n = 8/Grupo), ya sea anterior o posterior, para cualquier día de la prueba (p > 0.4 para todas las comparaciones; Figura 5A y 5B).

Fecundidad: Establecer si el tamiz Caenorhabditis influyó la cantidad de progenie viable producido por C. elegans, la descendencia individual producida en un período de 24 horas durante el día 3 de la edad adulta fue contado y Comparado (n = 20 a 22 por grupo). El uso del tamiz Caenorhabditis no afectar significativamente el número de progenie producida en comparación con un grupo de tratamiento de pick (p = 0,61, figura 6).

Análisis molecular de reportero
DAF-16 translocación nuclear: En C. elegans, la activación del factor de transcripción DAF-16 está asociada con aumento del estrés resistencia26. La localización nuclear de DAF-16 fue examinada en una cepa transgénica de nematodos TJ356, que expresa el DAF-16, unida a un proteína verde fluorescente (DAF-16::GFP)20. Bajo condiciones de crecimiento normal, DAF-16::GFP se localiza principalmente en el citosol, pero bajo diversos factores de estrés (p. ej., estrés por calor), se desplaza rápidamente en el núcleo20. Para probar el impacto de la clasificación con el tamiz de Caenorhabditis en desplazamiento de DAF-16, DAF 16::GFP localizaciones fueron comparados en pareados por edad día 5 adultos en un grupo de control positivo (estrés térmico), un grupo de control negativo (transferencia manual a través de la selección), y un grupos de tratamiento de Caenorhabditis tamiz (n = 10/grupo). La transferencia con el tamiz de Caenorhabditis no afectó la translocación nuclear de DAF-16::GFP y demostró un fenotipo similar a los animales de control negativo (p > 0.05, figura 7).

HSP-16.2 reportero: proteínas de choque térmico pequeño como HSP-16.2 son biomarcadores de la respuesta de estrés, y son altamente expresaron durante una exposición a choque térmico o estrés oxidativo agentes21,27. La cepa TJ375 presenta un gen reportero GFP fusionado con un promotor de hsp-16.2 que no está activo bajo condiciones normales21. Sin embargo, después de una exposición a un choque de calor, se induce la expresión de la proteína HSP-16.2, y los animales Mostrar altos niveles de expresión de GFP21. Para probar la participación del tamiz de Caenorhabditis en una respuesta de estrés HSP-16.2-mediada, la densidad de fluorescencia en la región de la faringe (n = 10 animales/grupo) de los animales de edad comparable se comparó en día 5 adultos entre un grupo de control positivo (calor el estrés), un negativo control de grupo (cosecha) y un grupo de tratamiento de Caenorhabditis tamiz. La transferencia con el tamiz de Caenorhabditis no indujo significativamente la expresión de HSP-16.2::GFP (hsp-16.2::gfp) en comparación con el control negativo (p > 0.05, figura 8).

SOD 3 reportero: En C. elegans, el antioxidante gen que codifica para la superóxido dismutasa (SOD-3) de 3 es regulada hacia arriba durante el estrés oxidativo28. La cepa de C. elegans CF1553 expresa la proteína verde fluorescente (GFP)-etiquetado promotor SOD-3, cuya expresión es inducida por el estrés oxidativos, tales como paraquat5. Para probar la participación de la clasificación de tamiz de Caenorhabditis en la respuesta antioxidante en C. elegans, se comparó la densidad de la fluorescencia en la región central de adultos de día-5 de edad comparable entre una población de control positivo (paraquat 100 μM tratamiento), una población de control negativo (cosecha manual) y un Caenorhabditis transferido por el tamiz de la población. La transferencia con el tamiz de Caenorhabditis no indujo significativamente la expresión de la sod-3::gfp en comparación con el control negativo (p > 0.05, figura 9).

Figure 1
Figura 1: Construcción de tamiz de Caenorhabditis . Se muestra la evolución de la fabricación 'hágalo usted mismo' de la herramienta. Estos paneles muestran (A) dos 50 mL cónicos Casquillos del tubo (B) cuyos centros se han quitado, (C) cortados Esquinas suavizadas y (D - F) que cuentan con malla de monofilamento de correspondiente a la etapa de la vida deseada de C. elegans (para detalles, véase el Protocolo ). (G) el tamiz completo también se muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Representación de imagen paso a paso del uso de tamiz Caenorhabditis . (A) el tamiz es previamente mojado con una gota de solución de la M9, y (B) en la parte superior un tubo cónico de 50 mL. Tubo superior (C) 1 mL de solución con los gusanos se pipetea en la parte superior del tamiz, (D) un tubo cónico de 50 mL se coloca sobre el tamiz con los gusanos hacia el interior del tubo y (E) el tamiz con un recién adjunto M9 es rápidamente girada o Ver (G) el tamiz, se enjuaga con M9 llevando los animales deseados en los nuevos 50 mL tubo y los gusanos se les permitió asentarse por gravedad a la parte inferior del tubo. (H) los gusanos se pipetea y se colocan como gotas en un plato fresco de NGM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Caenorhabditis tamiz no afectan la motilidad a lo largo de la vida. Esta figura muestra la distribución de la clase de movilidad de los animales en días 2, 4, 6 y 8 de la edad adulta para recoger, FUDR y grupos de tratamiento de tamiz de Caenorhabditis . Animales de clase A se movieron normalmente y espontáneamente, animales clase B movido anormalmente y pueden han requerido insistencia y animales de la clase C fueron incapaces de mover. No hubo diferencias entre grupos FUDR, pick y tamiz de Caenorhabditis (p > 0.05). Tres repeticiones (n = 10 animales por placa de tratamiento) se llevó a cabo y se analizaron con el modelo logístico Ordinal. animales clase B. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Uso de Caenorhabditis tamiz impacto el bombeo faríngeo durante toda la vida. Esta figura muestra los tipos de bomba faríngea de pick, FUDR, y grupos de tratamiento de Caenorhabditis tamiz, en comparación con los días 2, 4, 6 y 8 de la edad adulta. Los asteriscos denotan un significado entre la selección, tamiz y los grupos de tratamiento de FUDR para los días especificaron (*** p < 0.05). No hubo diferencias entre el tamiz de Caenorhabditis y el grupo de selección (p > 0.05). Dos repeticiones (N = 10 animales por placa de tratamiento) se llevó a cabo y se analizaron con un ANOVA unidireccional y un post-test de Bonferroni. Las barras representan la media ± el error estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Uso de Caenorhabditis tamiz no afectan respuesta táctil anterior a lo largo de la vida. Estos paneles muestran la anterior (A) y grupos de tratamiento (B) la cuenta de respuesta táctil posterior de recogida, FUDR y Caenorhabditis tamiz en comparación con los días 2, 4, 6 y 8 de la edad adulta. Se realizaron dos repeticiones con N = 10 para cada grupo de tratamiento y en comparación con un ANOVA unidireccional y un post-test de Bonferroni (p = 0,4 y p = 0.9 para anterior y posterior, respectivamente). Las barras representan la media ± el error estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Tamiz de Caenorhabditis impacto la cantidad de progenie viable el día 3 de la edad adulta. Esta figura muestra la progenie viable de adultos 3 días después de un período de puesta de huevos de 24 h, abarcando el día 3 de la edad adulta para parentales. Las barras representan la media ± el error estándar de la media. N = 20-22 animales de por lo menos dos repeticiones biológicos separados por grupo de tratamiento. Los grupos de tratamiento se comparan con un t-test, (p > 0.05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Caenorhabditis tamiz no afectó la translocación nuclear de DAF-16::GFP. Estos paneles muestran imágenes representativas de la DAF-16 translocación de grupo (A) un choque de calor (control positivo), (B) una selección de grupo (control negativo) y grupo de tratamiento (C) un Caenorhabditis tamiz. (D) los animales del grupo control positivo muestran una activación de la translocación nuclear de DAF-16. El tamiz de Caenorhabditis no indujo una translocación nuclear y aparece proteína citosólica de fusión similar a los animales en el grupo control negativo. N = 10 animales por grupo de tratamiento de al menos tres réplicas biológicas separadas. Los grupos de tratamiento fueron comparados con un ANOVA de una vía y prueba post hoc de Tukey. Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Caenorhabditis tamiz no afectó la expresión de hsp16.2::gfp. Se comparan las expresiones de HSP-16.2 (en unidades arbitrarias de la fluorescencia) de un grupo de choque de calor (control positivo), un grupo de selección (control negativo) y un grupo de tratamiento de Caenorhabditis tamiz. Los asteriscos denotan una alta expresión de la hsp16.2::gfp para el grupo control positivo que era perceptiblemente diferente de los otros grupos de tratamiento (*** p < 0.05). El tamiz de Caenorhabditis no afectó la expresión de hsp16.2::gfp y muestra intensidades de fluorescencia similares a animales en el grupo control negativo (p > 0.05). Se realizaron tres repeticiones con N = 10 para cada grupo de tratamiento y en comparación con un ANOVA de una vía y prueba post hoc de Tukey. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 9
Figura 9: Caenorhabditis tamiz no afectó la expresión de la sod-3::gfp. Se muestran las expresiones de la SOD-3 (en unidades arbitrarias de la fluorescencia) de un grupo de paraquat 100 μM (control positivo), un grupo de selección (control negativo) y un grupo de tratamiento del tamiz de Caenorhabditis . Los asteriscos denotan una alta expresión de la sod-3::gfp para el grupo control positivo que era perceptiblemente diferente de los otros grupos (*** p < 0.05). El tamiz de Caenorhabditis no afectó la expresión de la sod-3::gfp y muestran intensidades de fluorescencia similares a los animales en el grupo control negativo (p > 0.05). Se realizaron tres repeticiones con N = 10 para cada grupo de tratamiento y en comparación con un ANOVA de una vía y prueba post hoc de Tukey. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tamaño de la malla N = 50 N = 100
20 μm 95.33%
50 μm 99.00% 93.33%

Tabla 1: producción de porcentaje de mallas. Esta tabla muestra los resultados de un dispositivo de 20 μm a prueba con N = 50 adultos para 3 repeticiones y un dispositivo de 50 μm a prueba con N = 50 adultos para 2 repeticiones y con N = 100 para 3 repeticiones.

Tamaño de la malla Etapa de desarrollo Diámetro del cuerpo
20 μm Etapa larval 4 ~ 35 μm
50 μm Día 1 adulto ~ 70 μm

Tabla 2: diámetro medio del cuerpo. Esta tabla muestra el diámetro del cuerpo media adquirido por un promedio de 3 Mediciones igualmente repartidas cada gusano de 15 animales en cada etapa de la vida medidos.

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Discussion

En este documento, presentamos el diseño y el uso del tamiz de Caenorhabditis accesible, eficaz como herramienta para ordenar y mantener la C. elegans. Esta herramienta tiene varias ventajas para escoger manualmente cada animal, el lavado de las poblaciones, tratamientos químicos (p. ej., FUDR) y más costosos métodos de segregación de animales. En primer lugar, el Caenorhabditis tamiz de forma eficiente y rápida (menos de 20 min) clases descendientes de grandes poblaciones mixtas de animales (cuadro 2). Además, el uso de la herramienta no tiene ningún efecto tóxico detectable en healthspan los animales (figura 3, figura 4, figura 5, figura 6), no induce estrés genético bien-descrito Reporteros (figura 7, figura 8 Figura 9) y reduce la cantidad de químicos extraños que podrían influir en el tratamiento aplicado a las placas de cultivo o cualquier análisis molecular después de eso. Su facilidad de uso es una ventaja significativa; un investigador en cualquier etapa de su formación puede ser entrenado para utilizarlo (figura 1 y figura 2; De Protocolo).

Los materiales necesarios para la fabricación y el uso del tamiz (p. ej., pipetas, buffers) están disponibles en laboratorios de investigación estándar; así, si se rompe, no es caro para reemplazar o reparar el tamiz Caenorhabditis . El construido por la propia naturaleza del tamiz Caenorhabditis le permite ser una herramienta versátil: puede ser construido con mallas apropiadas para distintos C. elegans etapas de desarrollo y fenotipos. El tamiz de Caenorhabditis puede usarse también en ensayos realizados en otras especies de nematodos o aislar organismos pequeños, proporcionados el tamaño de malla apropiado se utiliza en la fabricación.

Además de los beneficios que esta herramienta ofrece para el mantenimiento de la población de C. elegans , el tamiz puede utilizarse para limpiar animales antes de su uso en otras aplicaciones experimentales. Por ejemplo, con el desarrollo de la microfluídica para llevar a cabo C. elegans investigación viene el tema de chip uso y limpieza. Dependiendo de la cantidad de bacterias a los animales, las precauciones especiales deben tomarse para no obstruir el chip de microfluidos, haciéndola inutilizable29. A menudo, cuando C. elegans se transfiere a un chip de microfluidos, residuos del césped bacteriano es traído con ellos. Este residuo puede y obstruir los canales de microfluidos, haciendo el mal funcionamiento del chip, que requiere limpieza o reemplazo. La construcción del dispositivo en este protocolo ofrece un método para la recolección no sólo animales sincronizados de microfluídica, sino también para la limpieza de los animales antes de su inserción en un dispositivo de microfluidos. Mediante la eliminación de los desechos y residuos bacterianos, tomado en la recogida de animales, los canales microfluídicos son menos propensos a un mal funcionamiento, incrementando la vida operacional de fichas individuales y el rendimiento posterior de la investigación que está llevando a cabo con ellos.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar. Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pueda interpretarse como un potencial conflicto de interés.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer a Heather Currey por su contribución inicial para el diseño del estudio y el Dr. Swarup Mitra por su revisión crítica del manuscrito. También nos gustaría agradecer al Dr. Michael B. Harris comentarios, refinamientos y asistencia en la producción de la demostración de esta metodología. Las cepas fueron proporcionadas por el centro de genética de Caenorhabditis, que está financiado por la oficina de NIH de investigación programas de infraestructura (P40 OD010440). La investigación en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de General médica Ciencias de los institutos nacionales de salud, bajo la concesión número UL1GM118991, TL4GM118992 o RL5GM118990 y por un premio institucional de desarrollo (IDeA) de el Instituto Nacional de General médica Ciencias de los institutos nacionales de salud bajo la concesión número 5P20GM103395-15. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud. UA es un empleador de AA/EO y la institución educativa y prohíbe la discriminación ilegal contra cualquier persona: www.alaska.edu/titleIXcompliance/nondiscrimination.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Safety glasses Uline S-21076
Protective heat resistant glove Grainger Item # 3AT17 Mfr. Model # 3AT17 Catalog Page # 1703
50 mL conical tube Falcon 14-432-22
Synthetic Nylon mesh Dynamic
Aqua-Supply Ltd		 NTX20 and NTX50
Cyanoacrylate glue Scotch Super Glue Liquid SAD114
Pliers Vampliers VMPVT-001-8
Dremmel tool with circular file Lowe's Item # 525945 Model # 100-LG
FUDR Sigma F0503
M9 chemicals ( NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4)  Sigma  S7653, RES20908-A7, 1551139, M7506
NGM plate chemicals (Bactopeptone, Agar, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2,Cholesterol, Streptomycin) BD Biosciences (bactopeptone) , Lab express (agar), Sigma ( rest) BD bioscience 211677, Lab Express 1001,  Sigma 1551139, 1551128, C1016, C8667, S6501
Pluronic F-127 Sigma P2443
Paraquat dichloride hydrate Sigma 36541
Inverted fluorescence microscope Olympus FSX100

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References

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<em>Caenorhabditis</em> Tamiz: Un instrumento de baja tecnología y metodología para la clasificación de los organismos multicelulares pequeños
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Hunter, S., Maulik, M., Scerbak, C., Vayndorf, E., Taylor, B. E. Caenorhabditis Sieve: A Low-tech Instrument and Methodology for Sorting Small Multicellular Organisms. J. Vis. Exp. (137), e58014, doi:10.3791/58014 (2018).

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