Summary
Geçerli protokol sıralama ve nüfus yaş eşlemeli temizlik için bir metodoloji içerir Caenorhabditis elegans. Nematodlar araştırma için büyük bir deneysel nüfusa elde etmek için basit, ucuz ve verimli özel yapım aracı kullanır.
Abstract
Caenorhabditis elegans (C. elegans) temel ve Biyomedikal araştırma bir dizi kullanılan bir iyi kurulmuş model organizmadır. Nematot araştırma topluluğu içinde C. elegansbüyük, Yaş eşlemeli nüfusu korumak uygun fiyatlı ve etkili bir şekilde gerek yoktur. Burada, mekanik olarak sıralama ve C. eleganstemizlik için bir metodoloji mevcut. Amacımız hayvanlar Tekdüzen boyutları ve yaşam evreleri deneyler kullanımları için elde etmek için düşük maliyetli, verimli, hızlı ve basit bir süreç sağlamaktır. Bu araç, Caenorhabditis elek, ortak konik Laboratuvar tüpleri konu ve gövde boyutuna göre C. elegans sıralar bir ölçüye göre kapak sistemi kullanır. Biz de Caenorhabditis elek etkili hayvanlar bir kültür tabaktan başka bir hızlı sıralama, eşitleme, sağlık, işaretçileri etkilemeden temizlik sunan ve için aktarımlarına göstermek ve stres-indüklenebilir hareketliliği dahil olmak üzere gen gazetecilere. Bu erişilebilir ve yenilikçi araç C. elegans nüfusu korumak için hızlı, verimli ve olmayan stresli bir seçenektir.
Introduction
Yuvarlak solucan Caenorhabditis elegans, premier model organizmadır. Onların ekimi laboratuvarda basit ve kontrollü doğası, yanı sıra tüm onların genom sıralı1 ve her hücre gelişimsel kaderi2bilinir. Bu özellikleri nedeniyle, C. elegans genetik çalışmalar için yaygın olarak kullanılan model bir organizmadır. Ancak, bu faydalı özellikleri ile birlikte bazı sorunlar için araştırmacılar geliyor. Onların hızlı oluşturma süresi nedeniyle C. elegans nüfus gıda dışında hızlı bir şekilde çalıştırabilirsiniz ve/veya nüfus birden çok nesiller ile karışık hale ve gelişim dönemleri aynı anda mevcut. Böylece, katı nematodunun büyüme ortamında (NGM) gerçekleştirilen deneyler bakteriyel gıda kaynak tüketir ve yeni larva geliştirmek önce hayvanlar taze tabakaları bana fiziksel olarak taşımak araştırmacılar gerektirir. Bir sık hayvanların aktarma çoluk çocuk nesiller ile karışık hale gelen deneysel örneğin alınma olasılığını önlemek için gerektiği şekilde bu sıkıcı olabilir. Yine de, bazı deneyler her iki çok sayıda hayvan ve genişletilmiş zaman puan (Örneğin, DNA veya RNA ayıklama erişkin dönemde) gerektirir. Bu doğru bir şekilde senkronize bir popülasyon sürdürmek ve hayvanlar çok sayıda aktarma sorunları bileşikleri.
C. elegans NGM üzerinde kültürlü aktarma geçerli yöntemleri seçmek veya hayvanlar tabak tabak yıkama; kimyasal tedavi hayvanlar (Örneğin, DNA çoğaltma inhibitörü fluorodeoxyuridine veya FUDR); ya da çok iyi plakaları hayvanlarda sıralamak için akış sitometresi kullanma. Malzeme çekme el ile tek tek veya birden çok hayvanlar3,4aktarmak için ince platin tel veya bir kirpik ile yapılan bir el araç kullanımını gerektirir. Bu yöntem doğru ama beceri ve zaman gerektirir ve çok sayıda hayvan içeren çalışmalar için bir kısıtlamadır. Mayıs da toplama bireyler doğal olmayan ve tutarsız miktarda bozukluğu ve kuvvet için potansiyel olarak subjecting tarafından fiziksel olarak zarar ve stresli hayvanlar için. Çamaşır bir arabellek çözüm ile bir kültür yemek durulama ve hayvanlar ile çözüm için yeni bir kültür plaka cam Pasteur pipet ile aktarma içerir. Bu yöntem hızlı ve etkili ama birden fazla nesiller ve hayvanların gelişim aşamalarında toplu olarak aktarılır olarak doğru değil. Kimyasal tedaviler, FUDR gibi herhangi bir DNA ikileşmesi ve böylece, gamet üretim ve yumurta gelişim engelleme yoluyla yavru önlemek için kodlamayla medya çözülmüş. Süre etkili, bu yöntem gelişimsel olgunlaşma sonra normal gelişim süreçleri bozmak değil olarak uygulanmış olması gerekir ve bu hala onun Yönetim3önce hayvanlar aktarmak için bir gereklilik olduğu anlamına gelir. Bu yöntem de yollar sinyal, hayvanlar üzerinde göze çarpan etkileri onlar yaş olarak sonuçlanan birden çok cep (Örneğin, bir ömrü uzatma veya değiştirilmiş bir proteostasis) kullanılan C. elegans 5suşu bağlı olarak etkiler, 6,7,8,9,10. Akış Sitometresi yöntemleri otomatik olarak sıralamak ve bireysel C. elegans bir çok iyi tabaktan başka bir11' e aktarın. Bu yöntem çok etkili ve verimli iken, akış sitometresi prohibitively pahalı ve pek çok araştırmacı için ulaşılmaz cihazıdır. Hayvanlar aktarma alternatif sıcaklık hassas sıcaklık ayarı12ile steril hale fer-15 ve fem-1, gibi mutant modelleri kullanmaktır. Mutant hayvanlar kullanarak bazı durumlarda yararlı olmakla birlikte, bu belirli suşları vahşi-türü hayvanlar daha yavaş büyür ve değiştirilmiş bir soykırım, eskime veya sağlıklı solucanlar için zavallı temsilcileri olarak hizmet veren güveniyor. Buna ek olarak, kısırlık ikna etmek için bir sıcaklık üst karakter üzerine güven aynı zamanda statik ortamı yokluğunda sonuçlar ve sıcaklık değişiklikleri kolayca gösterilmiştir gen ifadeleri13,14, etkilemek için 15. araştırma grupları daha önce teknikleri C. elegans boyutu16tarafından filtre uygulamak için bir kafes kullanımını açıklayan yayınlandı. Ancak, biz bu tür filtre kullanımı ile ilişkili olabilecek genel sağlık sonuçları herhangi bir değişiklik için test önceki iş bulmak koyamadık.
Böylece, çok sayıda hayvan kültür plakalar arasında aktarmak için ekonomik, verimli, hızlı ve doğru bir yöntem için C. elegans araştırma topluluk içinde bir ihtiyaç olduğunu. Biz ekipman ( Caenorhabditis elek olarak adlandırılır) ve onun üretim ve C. elegans araştırma topluluğu dizayn çalışması için ilişkili bir protokol bir geliştirilmiş, erişilebilir parça geliştirdik. Burada, tasarım Caenorhabditis elek ve yöntemlerin kullanımı için paylaştığımız ve biz kullanımı yaygın sağlık ya da herhangi bir stres işaretleri çift el ile malzeme çekme ve yaygın olarak kullanılan bir tedaviyle karşılaştırıldığında etki etmez göstermek, doğurganlık kısıtlama kimyasal FUDR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Caenorhabditis elek İnşaat ve kullanım
-
İnşaat iletişim kuralı
- 2 kapaklar 50 mL konik tüpler (Şekil 1A) dan elde etmek.
- Çıkarmak belgili tanımlık merkezi alan (alttan Şekil 1Bgörüntülendiğinde) kapaklarının iç dudak içinde Bunsen brülör ve bir sıcak metal sonda veya bir havya kullanarak veya drill bit bastı.
Not: daha az yaralanma riski olduğundan ve plastik kapak kesmek için ısı kullanarak bir bıçak için tercih edilir. - Temiz ve kesilmiş kenarları kum ve kavisli bir dosya veya bir rotary Aracı (Örneğin, Dremel) zımpara ile yüzey top. Şekil 1 cbakın.
- Monofilament ağ çemberi uygun çap (Şekil 1 d) kesti. Bunun için bir fırça kılı naylon mesh levha üzerine bir kapak izleme ve çizilen çizginin içine kesti.
- Oluklar/eğik çizgi (Şekil 1E) plastik tutkal uygulandığında iki kapakları yapışma geliştirmek için kapakları üst yüzeyine oyulmuş.
- Etanol kapaklı temiz ve kuru bırakın.
- Cyanoacrylate tutkal dış kenarına tutmak her iki kapaklarında, üst yüzeyine uygulamak.
Not: biraz tutkal uzun bir yol gidiyor. - Monofilament ağ, Tablo 1göre bir yapıştırılmış kapak (Şekil 1F) yattı. Yer üstünde tepe-in kafes ters ikinci kapak; Her iki kapakları üst kısımları birlikte olması gerekir. Basın sıkıca birlikte (Şekil 1G). Mesh gergin olduğundan emin olun.
Not: kullanım cımbız mesh kapakları yerleştirmek için bir güvenlik önlemi olarak. - İlk katman tutkal kuruduktan sonra bir yüzük cyanoacrylate tutkal kapakları arasındaki dış boşluğu çevresinde geçerli. Bu bütünlük ekler ve apart ya da sızıntı herhangi bir peeling engeller gibi cömert olun.
- Filtre monofilament kafes kafes gözenek büyüklüğü ile etiketleyin.
Not: Burada, iki kafes gözenek boyutunu kullan — 20 µm ve 50 µm.
-
İletişim kuralı kullanın
- Elek önceden ıslak.
- M9 gibi tuzlu bir çözüm pipette [NaCl, 6 g Na2HPO4, KH2PO4, 1 ultrasaf H2O L ve 1 mL MgSO4 (1 M) 3 g, 5 g]17, elek bir damlacık oluşturur kadar merkezi aracılığıyla , yoğunlaşarak ve damlar filtre alt (Şekil 2A) Merkezi kapalı. İsteğe bağlı olarak, şeklin altına hav bırakmayan mendil (Örneğin, Kimwipe) uygulamak veya nem damlacık mesh üzerinde yayılmış.
- Elek 50 mL konik tüp yerleştirin. Tüp 'Atık tüp' olarak etiketleyin (Şekil 2B).
- C. elegans nüfusu bir agar plaka kapalı yıkayın.
- M9 arabellek Tabağını yıka ve solucan içeren orta monofilament kafes 1 mL topside vasıl a zaman (Şekil 2C) yerleştirin. Mesh Merkezi'nde çalışmaya emin olun. Tüm solucanlar plaka yıkayın.
Not: Genellikle, M9 3 mL 60 mm plaka için yeterlidir. - Pipetting içinde kayıp solucanlar sayısını en aza indirmek için bir cam Pasteur pipet solucanlar plaka kapalı ve kafes Merkezi (gerektiği gibi tekrar) üzerine taşımak için kullanın.
- M9 arabellek üstten filtresiyle durulayın. Yine, mesh merkezinde çalışan ve o bölgede tüm solucanlar durulama emin olun. Tüm bakteri ve daha küçük solucanlar kafes geçti emin olmak gerektiği gibi birçok kez yıkayın.
- M9 arabellek Tabağını yıka ve solucan içeren orta monofilament kafes 1 mL topside vasıl a zaman (Şekil 2C) yerleştirin. Mesh Merkezi'nde çalışmaya emin olun. Tüm solucanlar plaka yıkayın.
- Elek boyutu eşlemeli hayvanlardan hasat.
- Elek, Yetişkin solucanlar adım 1.2.2.3 yeni koleksiyon tüp (Şekil 2B) içine bakan ile üst yeni 50 mL konik tüp takın.
- İlk tüp (atık tüp) kaldırmak ve hızlı bir şekilde geçiş--dan damlacığı tutmak için yeni tüp ve elek üzerine çevirmek (Şekil 2E).
Not: kısırlık gerekli değilse, hav bırakmayan bir silme (Örneğin, Kimwipe) fitil sıvısı için saygısız önce kafes altından kullanın. - M9 ile kafes içine yeni 50 mL tüp yeni topside (Şekil 2F) sizden durulayın. Yine, kafes ortasında kullanımı ve bir damlacık mesh alt bakımı.
- Solucanlar yerleşmek veya yavaşça onları aşağı spin izin (Örneğin, < 16 x g) yaklaşık 1 dk (Şekil 2 g) için.
- Solucanlar, Pelet arabellek çözümden ideal aşağı Aspire edin > 0.5 mL, veya pelet bozmadan mümkün olduğu kadar sıvı kaldırın.
- Bir cam Pasteur pipet NGM plaka üzerine kullanarak solucanlar pipette ve koyup kuruyuncaya kadar bırakın. Onlar daha hızlı (Şekil 2 H) Kuru böylece birden çok damlacıkları dışarı yeni bir tabağa uzay.
- Elek temiz.
- Elek yavaşça ve iyice etanol ve ters osmoz su ile durulayın. Kurumasını bekleyin.
- Belirsiz gelecekte kullanmak için temiz bir kapta saklayın.
- Zaman mesh "sag" görünümünü geliştirir atmak.
- Elek önceden ıslak.
2. sıralama yöntemi Caenorhabditis elek doğrulama
- Genel bakım
- Tüm deneyler için kültür solucanlar üzerinde standart bir yuvarlak solucanlar büyüme medya17 (1 litre NGM oluşur pepton, 17 g agar, NaCl, 3 g çift distile su, 5 mg/mL kolesterol, 1 M CaCl2 1 mL 1 mL 975 mL 2.5 gram 1 mL 1 M MgSO4, 25 mL 1 M KHPO4ve 100 mg/mL streptomisin 0.5 mL) 25 ° C'de
- Deneysel bir tedavi yönetimi
- Üç tedavi grupları karşılaştırın: çekme, fluorodeoxyuridine (FUDR) ve Caenorhabditis elek.
- FUDR tedavi grubu için herhangi bir döl önlemek için 100 mikron son bir konsantrasyon NGM medyaya 100 mg/mL FUDR eklemek ve solucanlar her geçen gün gıda tükenmesi önlemek için bir taze NGM tabağa aktarın.
- Seçim grubu için seçmek ve platin bir döngü kullanarak el ile solucanlar aktarmak.
- Caenorhabditis elek tedavi grubu için izlemek adım 1.2 ve solucanlar bir NGM plaka üzerine pipette.
- Üç tedavi grupları karşılaştırın: çekme, fluorodeoxyuridine (FUDR) ve Caenorhabditis elek.
- Caenorhabditis Elek yüzde verim
- Ne kadar etkili elek C. eleganssıralama yönü olduğunu ölçmek için gün 1 25 ° c (yani, yumurta döşeme sonra 48 h) erişkin yaş zaman uyumlu N2 hayvanlar büyümeye ve sonra taze NGM plakaları için seçerek aktarmak (Toplam alma N = 50 veya N tre başına 100 hayvan = atment grup).
- Yeni NGM plakaları için nüfus kurtarma, 24 h aktardıktan sonra yukarıdaki takip Caenorhabditis elek ile (bkz. Adım 1.2) protokol ve başarıyla aktarılan hayvanları saymak.
- Hayvanlar ile karşılaştırıldığında 100 (%) ile çarpılmış transfer başlangıç sayısı başında transfer miktarının oranı olarak yüzde verim hesaplayın.
- Healthspan deneyleri
Not: healthspan parametreleri hareketliliği sınıfı, faringeal pompa hızı ve hem anterior ve posterior nazik dokunuş yanıt günlerde 2, 4, 6 ve 8 erişkin yaş senkronize N2 hayvanlar 25 ° C'de muhafaza için puan edinildi- İzleme hareketliliği
- Sınıf tabanlı bir sistemi (sınıf A, B ve C) temelinde hareketliliği puanları atamak Herndon vd yöntemleri takip 18. bir sıralı lojistik istatistikleri modeli istatistiksel analiz yazılımı kullanarak üç deneysel grupları etkileri karşılaştırın.
Not: Sınıf A bireyler kendiliğinden bir normal, sinüs desen taşımak. Sınıf B bireylerin belirgin sinüsoidal hareketlerinde taşımak ve hareketi teşvik etmek için dürtmeye gerektirebilir. C sınıfı bireyler dürtmeye karşılık onların baş ve/veya kuyruk hareket ama agar arasında hareket edemiyoruz.
- Sınıf tabanlı bir sistemi (sınıf A, B ve C) temelinde hareketliliği puanları atamak Herndon vd yöntemleri takip 18. bir sıralı lojistik istatistikleri modeli istatistiksel analiz yazılımı kullanarak üç deneysel grupları etkileri karşılaştırın.
- Faringeal pompa hızı
- Değirmeni hareketi hayvanın terminal faringeal ampul bir stereomicroscope 600 X 1 dk. için son büyütme altında görsel olarak say.
- α ile tek yönlü ANOVA ile istatistiksel analizi yapmak 0,05 ve Bonferroni sonrası testlerle α = 0,05 =.
- Dokunmatik yanıt
- Nazik dokunuş yanıtı kaydettikten ve üç tedavi grupları arasında karşılaştırın. Calixto vd tarafından açıklanan yöntemleri temel alan deneyleri yapmak 19.
- Kayıt anterior ve posterior yanıt yavaşça kirpik kıracağı dik kuyruk veya hayvanlar Başkanı (5 x, alternatif baş ve kuyruk) boyunca okşayarak tarafından dokun.
- Herhangi bir hareket kontur ters yönde bir ölçekte 1 puan 0-5 olarak hem anterior ve posterior yanıt için puan.
- α ile tek yönlü ANOVA ile istatistiksel analizi yapmak 0,05 ve Bonferroni sonrası testlerle α = 0,05 =.
- İzleme hareketliliği
- Verimlilik tahlil
- Üreme Caenorhabditis elek'ın etkisi kullanımı belirlemek için yaş zaman uyumlu N2 hayvanlar yetişkinlik 25 ° C'de 2 gün büyümeye
- 60 yumurta sonra h hayvanlar yeni NGM tabak platin bir çekme veya Caenorhabditis elek ile transfer ve 4 h kurtarmak için onlara (20-30 dk için elenmiş tabak kuru).
- Kurtarma, tek tek bir kirpik ile hayvanlar NGM plakaları için almak plaka sonra onları yumurtlamak için 24 saat ver ve hayvanlar kaldırın. Döl her tabakta başka bir 24 h için 25 ° c normal şartlarda geliştirmeye olanak sağlar.
Not: Tırnak cilası ile Pasteur pipet sonu için güvenli ve etanol ile sterilize insan bir kirpik kirpik kıracağı var. - Uygun F1 üretimi bireylerin saymak. Bir istatistiksel analiz kullanarak bir T-test ile α = 0,05.
Not: Canlı yavru başarıyla yumurtadan ve gelişimleri normal larva döngüleri ile başlayan yumurta olarak kabul edilir.
- Floresan muhabir stres yanıt deneyleri
- Stres potansiyeli işaretleyicileri algılamak için üç yaygın olarak kullanılan floresan muhabir deneyleri yapmak: çekirdeklerin içine bir DAF-16::GFP translocation hücrelerinin bir zorlanma [TJ356-zIs356 (pDAF-16::DAF-16-GFP; rol-6)]20; hsp-16,2 ifade [TJ375-gpIs1 (hsp-16.2p::GFP)]21; ve çimen-3 ifade [CF1553-muIs84([pAD76]sod-3p::GFP+rol-6[su1006])]22.
- Her tahlil için 20 ° C'de üç tedavi gruplarından yaşında zaman uyumlu hayvanlar kültür ve erişkin 3 gün inceleyebilirsiniz: bir negatif kontrol kullanın (günlük olarak, el ile bir platin pick ile hayvanların bir grup transferi), pozitif bir denetim (üstünde a günlük temel bir grup hayvan platin bir çekme artı kurulan bir tetikleyici ile elle aktarmak) ve Caenorhabditis Elek (hayvanlar elekten geçirmek ve onları NGM üzerinde 30 dk önce sadece görüntüleme yeniden elde etmek için izin).
- DAF-16::GFP assay olarak, Isı şok olumlu denetim hayvanlar için 30 dk 37 ° C'de20Imaging önce. Hsp-16,2 tahlil için ısı şok olumlu denetim hayvanlar 90 dk,21Imaging önce 20 h için. Çimen-3 tahlil için22Imaging önce 100 mM bozması 4 h için olumlu denetim hayvanlarla tedavi.
- Solucanlar hemen kirpik kıracağıyla hasat ve solucanlar hareketsiz için % 36 poloxamer 407 yüzey aktif çözüm 1 μL ile bir coverslip için mount.
- Başka bir coverslip takılı kurtlarla sandviç. İki coverslips bir standart cam mikroskobu slayt ve görüntü ters bir Floresan Mikroskobu (için genel bir büyütme 80 X) üzerinde bir 8 X büyütme ve sürekli maruz olan bir FITC filtre kullanarak solucanlar bağlayın.
- DAF-16::GFP tahlil üç grup arasındaki farklılıkları algılamak için DAF-16::GFP muhabir (muhabir sitozol ve ara Eğer bulunsa muhabiri hücre çekirdeği, sitozolik translocated Eğer nükleer konumunu temel alan hayvanlar kategorilere ayırma muhabir) çekirdeği ve sitozol bulunan.
- Bir sıra lojistik istatistiksel model istatistiksel analiz yazılımı kullanarak sonuçları karşılaştırın. α ile tek yönlü ANOVA hsp 16,2 ve çimen-3 ifade deneyleri kullanmak için = 0,05 ve Tukey'nın post hoc testlerle α = 0,05 baş bölgesinin toplam floresans karşılaştırmak için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Caenorhabditis Elek 2 vidalı kapakları dokuma naylon monofilament kafes organizmaların basit yıkama tekniği kullanarak canlı nüfus ayıklamak için kullanılan istenen gelişimsel yaş, vücut çapından daha küçük bir alanı güvenliğini sağlama oluşur. Bu standart konik tüpler için ekler ve mesh ekran mekanik olarak istenen hayvanlar tüp daha fazla bakım ve deneme (Örneğin, havalesi ya da genetik hasat) hazır bırakarak gövde çapı göre hayvanlar sıralamak için kullanır. Caenorhabditis elek ile yıkama nazik bir el ile hızlı, 60-100 mm plaka başına yaklaşık 5 dk ve organizmaların kolayca kafes kazanılmaktadır.
Yüzde verim takip hayvanların Caenorhabditis Elek kullanın
Caenorhabditis elek yüzde verim kurmak için cihazlar ile 20 mikron ve 50 mikron gözenek boyutu kafesleri Yetişkin hayvanlar üzerinde test edildi. A demek, verim bir > % 90 başarılı hayvan transferi test her iki kafes boyutları için (Tablo 1) elde.
Monofilament mesh farklı boyut aralıkları hayvanlar farklı yaşam aşamaları ayırmak için kullanılan. Mesh ile 20 mikron boşlukları uygun yıkama uzakta gelişmekte olan embriyo ve larva aşamaları ikinci istinat dördüncü larva sahne küçük (L4; 32 mikron bir ortalama beden çapı ile) ve mesh 50 mikron boşluklar ile tüm izin verirken daha sonraki yaşam evreleri, herhangi bir hayvan diğer yaşam uzakta (Tablo 2) yıkanması (ile 70 mikron bir ortalama beden çapı) Yetişkin bir yana aşamalarında.
Caenorhabditis Elek kullanım healthspan ölçümleri etki etmez
Motilite: C. elegans normal sinüs hareketi (yani, hareketliliği) yaş18 ile azalır ve genel sağlık belirtecidir. Caenorhabditis elek hareketliliği etkiledi Eğer hareketliliği puanları olduğunu belirlemek için çekme, FUDR ve Caenorhabditis elek tedavi grupları günlerde erişkin 2, 4, 6 ve 8 karşılaştırıldığında. Her Grup genelinde tüm hayvanlar (n = 10/grup) birden çok çağlar yetişkinlik boyunca, normal ve spontan hareket desenler (A sınıfı) sergilenen (gün 2, 4, 6 ve 8 erişkin; Her gün, Şekil 3çoklu karşılaştırmalar için p > 0.05).
Faringeal pompa hızı: C. elegans faringeal kasları pompa yeteneği yaşla azalır ve healthspan23başka bir biyomarker olduğunu. Caenorhabditis elek hayvanların faringeal pompa hızı, çekme, FUDR ve Caenorhabditis etkisinde belirlemek için elek tedavi grupları gün 2, 4, 6 ve 8 erişkin karşılaştırıldı (n = 8-10 grup başına). Gün 6 malzeme çekme uygulandı hayvanlar ve FUDR yöntemleri arasında anlamlı bir fark yoktu (p < 0.001) ve 8 (p < 0.001). Ayrıca, gün 6 elek ve FUDR gruplar arasında anlamlı bir fark yoktu (p < 0.001) ve günde 8 erişkin (p < 0.001). Ancak, herhangi bir gün için çekme ve Caenorhabditis elek gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark yoktu (p > 0,05, Şekil 4), elek healthspan bu ölçüsü etki etmez gösteren.
Nazik dokunuş yanıt: Mekanik uyarana tepki yaşlanma veya genel sağlık24,25değerlendirmek için fizyolojik bir işaretleyicidir; Böylece, farklı aktarım yöntemlerini anterior ve posterior nazik dokunuş yanıt üzerinde etkisini test edildi. Çekme, FUDR ve Caenorhabditis arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark vardı elek tedavi grupları (n = 8/grup), ya anteriorly ya da özafagusu, test herhangi bir gün için (p > 0,4 için tüm karşılaştırmalar; Şekil 5A ve 5B).
Verimlilik: Kurmak için olsun veya olmasın Caenorhabditis elek uygun Döl C. elegans, bireysel çoluk çocuk yetişkinlik 3 günün 24 saat süresince üretilen tarafından üretilen miktarı sayılır karşılaştırıldığında ve etkiledi (n = 20-22 grubu başına). Caenorhabditis elek kullanımını önemli ölçüde zaman bir çekme tedavi grubuna göre üretilen Döl sayısı etkisi olmadı (p = 0,61, Şekil 6).
Moleküler muhabir deneyleri
DAF-16 nükleer translocation: C. elegansiçinde transkripsiyon faktörü DAF-16 aktivasyonu artan stres direnç26ile ilişkilidir. DAF-16 nükleer lokalizasyonu transgenik nematodunun zorlanma DAF-16 yeşil flüoresan protein (DAF-16::GFP)20erimiş ifade TJ356 incelenmiştir. Normal büyüme koşullarda DAF-16::GFP sitozol öncelikle yerelleştirilmiştir ama çeşitli stresler (Örneğin, ısı stres) altında hızla çekirdeği20translocated. DAF-16 translocation üzerinde Caenorhabditis elek ile sıralama etkisini test etmek için DAF-16::GFP yerelleştirmeler erişkinlerde yaş eşlemeli gün-5 bir pozitif kontrol grubunda (ısı stres) karşılaştırıldı bir negatif kontrol grubu (çekme el ile transferi), ve Caenorhabditis elek tedavi grupları (n = 10/grup). DAF-16::GFP nükleer translocation etkilemedi ve negatif kontrol hayvanlara benzer bir fenotip gösterdi Caenorhabditis elek ile transferi (p > 0,05, Şekil 7).
HSP-16,2 muhabir: küçük Isı şok proteinleri HSP-16,2 gibi biyolojik bir stres yanıtının vardır ve son derece ısı şok veya oksidatif stres ajanları21,27bir pozlama sırasında ifade edilir. TJ375 zorlanma normal şartlar21altında etkin değil bir hsp-16,2 organizatörü ile erimiş GFP muhabir gen vardır. Ancak, uzun süre bir maruz bir ısı şok, HSP-16,2 protein ifade indüklenen ve hayvanlar GFP ifade21yüksek düzeyde görüntülemek. HSP 16,2 aracılı stres yanıt Caenorhabditis elek katılımı, floresan yoğunluğu farinks bölgesinde test etmek için (n = 10 hayvanlar/grup) arasında bir pozitif kontrol grubu (ısı gün-5 erişkinlerde yaş eşlemeli hayvanların karşılaştırıldığında stres), bir negatif kontrol grubu (malzeme çekme) ve Caenorhabditis elek tedavi grubu. Transferi Caenorhabditis elek ile önemli ölçüde HSP ifade teşvik değil-16.2::GFP (hsp-16.2::gfp) zaman negatif denetimine göre (p > 0,05, Şekil 8).
çimen-3 muhabir: C. elegansiçinde süperoksit dismutaz (SOD-3) 3 için kodları anti-oksidan gen oksidatif stres28sırasında yukarı düzenlenir. C. elegans zorlanma CF1553 yeşil flüoresan protein (GFP) ifade eder-çimen-3 organizatörü, Ifade bozması5gibi oksidatif stres tarafından indüklenen etiketli. C. elegansantioksidan yanıtta üzerinde sıralama Caenorhabditis elek katılımı sınamak için gün-5 Yetişkin yaş eşlemeli baş bölgesinin floresan yoğunluğu arasında bir pozitif kontrol nüfus (100 mikron bozması karşılaştırıldı tedavi), bir negatif kontrol nüfus (el ile malzeme çekme) ve bir Caenorhabditis elek transfer nüfus. Transferi Caenorhabditis elek ile önemli ölçüde çimen-3::gfp negatif kontrol karşılaştırıldığında ifade teşvik değil (p > 0,05, Şekil 9).
Resim 1: Caenorhabditis elek inşaat. Aracın 'kendin yap' üretimi progresyon gösterilmiştir. Bu paneller düzeltti kenarları kesilmiş olan merkezleri kaldırdık,(a)iki 50 mL konik tüp kapaklar (B) (C) ve (D - F) kim C. elegans istenilen hayat aşaması için karşılık gelen monofilament mesh ile donatılmış göstermek ( iletişim kuralı Ayrıntılar için bakınız). (G) tamamlanan elek de gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: Adım adım resim gösterimi Caenorhabditis elek kullanım. (A) elek M9 çözüm bir damla ile önceden ıslak ve (B) uygun bir 50 mL konik tüp üstüne. (C) çözüm solucanlarla elek, (D) 50 mL konik tüp tüp ve (E) ile yeni iliştirilen elek içine bakan solucanlarla elek üzerine yerleştirilir topside Doğum pipetted M9 1 mL üst tüp "hızlı bir şekilde saygısız o". Elek M9 ile durulanır ver. (G) istenen hayvanlar yeni 50 mL taşıyan tüp ve solucanlar tarafından yerçekimi tüp altına yerleşmek için izin verilir. (H) solucanların pipetted ve taze NGM tabakta damlacıkları olarak yerleştirilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Caenorhabditis elek hareketliliği ömrü boyunca etkisi olmadı. Bu rakam gün 2, 4, 6 ve 8 için malzeme çekme, FUDR, erişkin, hayvanların hareketliliği sınıf dağılım gösterir ve Caenorhabditis elek tedavi grupları. A sınıfı hayvanlar normalde ve kendiliğinden, B sınıfı hayvanların normal olmayan bir şekilde taşındı ve dürtmeye ve C sınıfı hayvan were yapamaz-e doğru taşımak gerekli hareket. Caenorhabditis elek, çekme ve FUDR gruplar arasında fark yoktu (p > 0.05). Üç çoğaltır (n = 10 hayvan tedavi plaka başına) yürütülen ve sıralı lojistik modeli ile analiz. B sınıfı hayvanlar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: Caenorhabditis elek kullanım ömrü faringeal pompa etkisi olmadı. Bu şekilde, FUDR, almak ve Caenorhabditis elek tedavi grupları, karşılaştırıldığında günlerde 2, 4, 6 ve 8 erişkin faringeal pompa oranları gösterilmektedir. Elek ve FUDR tedavi grupları gün için belirtilen bir önemi çekme arasında yıldız işaretlerini göstermek (*** p < 0,05). Caenorhabditis elek ve çekme grubu (p > 0,05) arasında hiçbir fark vardı. İki çoğaltır (N = 10 hayvan tedavi plaka başına) yürütülen ve bir tek yönlü ANOVA ve Bonferroni sonrası test analiz etti. Çubuklar ortalama ± standart hata ortalamaya gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: Caenorhabditis elek kullanım ömrü boyunca anterior dokunmatik yanıt etkisi olmadı. Bu paneller(a)ön göstermek ve (B) çekme, FUDR ve Caenorhabditis arkadan dokunmatik yanıt sayısı elek tedavi grupları günlerde 2, 4, 6 ve 8 erişkin karşılaştırılır. İki çoğaltır N ile yürütülen = 10 her tedavi grubu için ve tek yönlü ANOVA ve Bonferroni sonrası test ile karşılaştırıldığında (p = 0,4 ve p = 0,9 için anterior ve posteiror, sırasıyla). Çubuklar ortalama ± standart hata ortalamaya gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: Caenorhabditis elek yetişkinlik gün 3 uygun Döl miktarı etkisi olmadı. Gün 3 erişkin üst hayvanlar için kapsayan bu rakam gün-3 Yetişkin uygun Döl yumurta atarken bir 24 saat süre sonra gösterir. Çubuklar ortalama ± standart hata ortalamaya gösterir. N = 20-22 hayvanları tedavi grubu başına en az iki ayrı biyolojik çoğaltır. Tedavi grupları bir tile karşılaştırıldığında-test, (p > 0.05). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7: DAF-16::GFP nükleer translocation Caenorhabditis elek etkilemedi. Bu paneller DAF-16 translocation (A) bir ısı şok grup (pozitif kontrolü), (B) bir çekme grubu (negatif kontrol) ve (C) bir Caenorhabditis elek tedavi grubu temsilcisi görüntülerini göster. (D) DAF-16 nükleer translocation an harekete geçirmek hayvanlar pozitif kontrol grubunda görüntülenir. Caenorhabditis elek bir nükleer translocation teşvik değil ve sitozolik füzyon protein hayvanlara benzer negatif kontrol grubunda görüntülenir. N = 10 hayvan başına en az üç ayrı biyolojik çoğaltır grubundan tedavi. Tedavi grupları tek yönlü ANOVA ve bir Tukey'nın post hoc testi ile karşılaştırıldı. Ölçek çubuğu 100 mikron =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 8: Hsp16.2::gfp ifade Caenorhabditis elek etkilemedi. Isı şok grup (pozitif kontrolü), bir çekme grubu (negatif kontrol) ve Caenorhabditis elek tedavi grubunda (rasgele floresan biriminde) HSP-16,2 ifadelerin karşılaştırılır. Yıldız işaretlerini hsp16.2::gfp diğer tedavi gruplardan önemli ölçüde farklı pozitif kontrol grubu için yüksek bir ifade belirtmek (*** p < 0,05). Caenorhabditis elek hsp16.2::gfp ifade etkilemez mi ve floresan yoğunluklarda hayvanlara benzer negatif kontrol grubunda görüntülenir (p > 0.05). Üç çoğaltır N ile yürütülen = 10 her tedavi grubu için ve tek yönlü ANOVA ve bir Tukey'nın post hoc testi ile karşılaştırıldığında. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 9: Çimen-3::gfp ifade Caenorhabditis elek etkilemedi. 100 μm kalınlığında bozması grubu (pozitif kontrolü), bir seçim grubu (negatif kontrol) ve Caenorhabditis elek tedavi grubunda SOD-3 ifadeleri (rasgele floresan biriminde) gösterilir. Yıldız işaretlerini çimen-3::gfp diğer gruplardan farklı pozitif kontrol grubu için yüksek bir ifade belirtmek (*** p < 0,05). Caenorhabditis elek çimen-3::gfp ifade etkilemez mi ve floresan yoğunluklarda hayvanlara benzer negatif kontrol grubunda görüntülenir (p > 0.05). Üç çoğaltır N ile yürütülen = 10 her tedavi grubu için ve tek yönlü ANOVA ve bir Tukey'nın post hoc testi ile karşılaştırıldığında. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Kafes boyutu | N = 50 | N = 100 |
| 20 mikron | %95.33 | |
| 50 mikron | %99,00 | %93.33 |
Tablo 1: yüzde verim kafes boyutlarda. Bu tablo sonuçlar gösterir N ile test bir 20 mikron cihazın 3 çoğaltır ve N ile sınanan 50 mikron aygıt için 50 Yetişkin = 50 yetişkinler için 2 çoğaltır = ve = N ile 100 için 3 çoğaltır.
| Kafes boyutu | Gelişimsel sahne | Gövde çapı |
| 20 mikron | Larva evre 4 | ~ 35 mikron |
| 50 mikron | 1. gün yetişkin | ~ 70 mikron |
Tablo 2: ortalama beden çapı. Bu tablo 3 ölçümleri eşit her solucan 15 hayvanlar için her ölçülen hayat aşamasında yayılmış sayı ortalaması alınarak elde kötü gövde çapı görüntüler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, tasarım ve sıralama ve C. eleganssürdürmek için bir araç olarak kullanmak erişilebilir, etkili Caenorhabditis elek, tanıttı. Bu araç, bireysel hayvanlar, nüfus, kimyasal işlemler (Örneğin, FUDR) ve daha pahalı Yöntemler yavru hayvan yıkama el ile seçmek için çeşitli yararları vardır. İlk olarak, Caenorhabditis elek verimli ve hızlı bir şekilde büyük karışık nüfus (Tablo 2) hayvanların Döl (az 20 dk) sıralar. Ayrıca, aracın kullanımıyla hayvanların healthspan (Şekil 3, Şekil 4, Şekil 5, Şekil 6) üzerinde tespit hiçbir toksik etkileri vardır, iyi tarif genetik stres gazetecilere (Şekil 7, Şekil 8 neden değil Şekil 9) ve bundan sonra uygulanan tedavi kültür plakaları veya moleküler herhangi bir tahlil etkileyen yabancı kimyasal miktarını azaltır. Kullanım kolaylığı önemli bir avantaj olduğunu; eğitimlerini herhangi bir aşamasında bir araştırmacı (resim 1 ve Şekil 2; kullanmak için eğitilmiş olabilir İletişim kuralı).
Malzemeler imalat ve elek (Örneğin, pipetler, arabellekleri) kullanımı için gerekli standart araştırma laboratuvarlarında kolayca kullanılabilir; Böylece, Eğer kırık Caenorhabditis elek değiştirin ya da tamir için pahalı değildir. Caenorhabditis elek kendini inşa doğası çok yönlü bir araç olmasını sağlar: kafes boyutu farklı C. elegans için uygun olan inşa edilecek gelişim dönemleri ve fenotipleri. Caenorhabditis elek da Nematot diğer türler veya üretim küçük organizmalar, belirtilen uygun kafes boyutunu yalıtma kullanıldığında yürütülen deneyleri kullanılabilir.
Faydaları yanı sıra bu araç sağlar C. elegans nüfus bakım, elek hayvanlar bunların kullanımı diğer deneysel uygulamalarda önce temizlemek için kullanılabilir. Örneğin, havacilik C. elegans davranış gelişimi ile araştırma çip kullanım ve temizlik sorunu gelir. Hayvanlar için bağlı bakteri miktarına bağlı olarak, özel önlemler kullanılamaz29işleme mikrosıvısal çip yapışmasına neden vermemek için alınması gerekir. C. elegans kez transfer edildiğinde bir mikrosıvısal çip, bakteriyel çim gelen kalıntı onlarla getirilir. Bu kalıntı olabilir ve sonra temizleme gerektirir çip arıza veya değiştirme yapmak mikrosıvısal kanalları yapışmasına neden olabilir. Bu iletişim kuralı aygıtı inşa sadece senkronize hayvanlar havacilik, aynı zamanda bir mikrosıvısal aygıt içine onların ekleme önce hayvan temizliği için hasat için bir yöntem sunar. Enkaz ve bakteriyel kalıntı, hayvanlar, toplarken almak yukarıya kaldırarak mikrosıvısal kanalları böylece bireysel cips operasyonel ömrünü ve onlarla birlikte yürütülen araştırma sonraki işlem hacmi artan arıza, daha az eğilimli olduğunu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok. Yazarlar araştırma potansiyel bir çatışması olarak yorumlanamaz herhangi bir ticari veya mali ilişkileri yokluğunda yapılmıştır bildirin.
Acknowledgments
Yazarlar çalışma tasarım ilk onun katkısı için Heather Currey ve Dr. Swarup Mitra el yazması onun eleştiri için teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca Dr Michael B. Harris Yorumlar, iyileştirme ve bu metodoloji gösteri üreten yardım için teşekkür etmek istiyorum. Suşları araştırma altyapı programları (P40 OD010440) NIH ofisi tarafından finanse edilen Caenorhabditis genetik Merkezi tarafından temin edilmiştir. Bu yayında bildirilen araştırma tarafından ulusal genel tıbbi Bilimler Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri Ödülü numaraları UL1GM118991, TL4GM118992 veya RL5GM118990 altında ve bir Kurumsal Geliştirme Ödülü (fikir)'tarafından desteklenmiştir Ulusal genel tıbbi Bilimler Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri grant sayı 5P20GM103395-15 altında. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmiyor. UA bir AA/EO işveren ve eğitim kurumu ve herhangi bir bireysel karşı yasadışı ayrımcılık yasaklar: www.alaska.edu/titleIXcompliance/nondiscrimination.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Safety glasses | Uline | S-21076 | |
| Protective heat resistant glove | Grainger | Item # 3AT17 Mfr. Model # 3AT17 Catalog Page # 1703 | |
| 50 mL conical tube | Falcon | 14-432-22 | |
| Synthetic Nylon mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd |
NTX20 and NTX50 | |
| Cyanoacrylate glue | Scotch Super Glue Liquid | SAD114 | |
| Pliers | Vampliers | VMPVT-001-8 | |
| Dremmel tool with circular file | Lowe's | Item # 525945 Model # 100-LG | |
| FUDR | Sigma | F0503 | |
| M9 chemicals ( NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4) | Sigma | S7653, RES20908-A7, 1551139, M7506 | |
| NGM plate chemicals (Bactopeptone, Agar, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2,Cholesterol, Streptomycin) | BD Biosciences (bactopeptone) , Lab express (agar), Sigma ( rest) | BD bioscience 211677, Lab Express 1001, Sigma 1551139, 1551128, C1016, C8667, S6501 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443 | |
| Paraquat dichloride hydrate | Sigma | 36541 | |
| Inverted fluorescence microscope | Olympus | FSX100 |
References
- C elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).
- Herman, M. A. Hermaphrodite cell-fate specification. WormBook. , 1-16 (2006).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Chalfie, M., Hart, A. C., Rankin, C. H., Goodman, M. B. Assaying mechanosensation. WormBook. , (2014).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Deletion of the Mitochondrial Superoxide Dismutase sod-2 Extends Lifespan in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 5 (2), e1000361 (2009).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of Ageing Development. 132 (10), 519-521 (2011).
- Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing Development. 12 (2), 137-150 (1980).
- Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of Ageing and Development. 131 (5), 364-365 (2010).
- Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing Development. 133 (1), 46-49 (2012).
- Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9 (1), e85964 (2014).
- Pulak, R. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. Methods Molecular Biology. 351, 275-286 (2006).
- Argon, Y., Ward, S. Caenorhabditis elegans fertilization-defective mutants with abnormal sperm. Genetics. 96 (2), 413-433 (1980).
- Lee, S. J., Kenyon, C. Regulation of the longevity response to temperature by thermosensory neurons in Caenorhabditis elegans. Current Biology. 19 (9), 715-722 (2009).
- Klass, M. R. Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span. Mechanisms of Ageing Development. 6 (6), 413-429 (1977).
- Zhang, B., et al. Environmental Temperature Differentially Modulates C. elegans Longevity through a Thermosensitive TRP Channel. Cell Reports. 11 (9), 1414-1424 (2015).
- Michaelson, L. C. C. elegans: A Practical Approach. Ian A. Hope (ed.). Oxford University Press, Oxford. 1999. Pp. 281. ISBN 0 19 963738 5. Heredity. 85 (1), 97-100 (2000).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).
- Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).
- Henderson, S. T., Johnson, T. E. daf-16 integrates developmental and environmental inputs to mediate aging in the nematode Caenorhabditis elegans. Current Biology. 11 (24), 1975-1980 (2001).
- Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).
- Libina, N., Berman, J. R., Kenyon, C. Tissue-specific activities of C. elegans DAF-16 in the regulation of lifespan. Cell. 115 (4), 489-502 (2003).
- Keith, S. A., Amrit, F. R., Ratnappan, R., Ghazi, A. The C. elegans healthspan and stress-resistance assay toolkit. Methods. 68 (3), 476-486 (2014).
- Scerbak, C., Vayndorf, E. M., Hernandez, A., McGill, C., Taylor, B. E. Mechanosensory neuron aging: Differential trajectories with lifespan-extending alaskan berry and fungal treatments in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Aging Neuroscience. 8, 173 (2016).
- Vayndorf, E. M., et al. Morphological remodeling of C. elegans neurons during aging is modified by compromised protein homeostasis. npj Aging and Mechanisms of Disease. 2, 16001 (2016).
- Murakami, S., Johnson, T. E. A genetic pathway conferring life extension and resistance to UV stress in Caenorhabditis elegans. Genetics. 143 (3), 1207-1218 (1996).
- Abbas, S., Wink, M. Green Tea Extract Induces the Resistance of Caenorhabditis elegans against Oxidative Stress. Antioxidants (Basel). 3 (1), 129-143 (2014).
- Yanase, S., Hartman, P. S., Ito, A., Ishii, N. Oxidative stress pretreatment increases the X-radiation resistance of the nematode Caenorhabditis elegans. Mutation Research. 426 (1), 31-39 (1999).
- Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).
