Summary
이 프로토콜 마우스 splenocytes를 사용 하 여 분자 시계 유전자 발현을 변경 하는 병원 체 관련 된 분자 패턴을 검색 하는 기술을 설명 합니다.
Abstract
유전자 발현을 행동, circadian 리듬 생리학의 거의 모든 측면을 통제 한다. 여기, 우리 병원 체 관련 된 분자 패턴 (PAMPs) lipopolysaccharide (LPS), ODN1826, 및 열 죽 Listeria monocytogenes 와 마우스 splenocytes 도전 circadian는 분자에 그들의 효과 검사 하는 방법론을 제시 시계입니다. 이전, 연구는 다양 한 모델 (예: 마우스, 쥐, 및 인간)의 구색에서 vivo에서 및 비보 전 접근을 사용 하 여 분자 시계에 LPS의 영향 검토에 집중 했다. 이 프로토콜에는 분리와 시계 유전자 식 후 도전 정량 PCR 통해 평가 하는 방법론으로 splenocytes, 도전 설명 합니다. 이 방법은 시계의 식 변경할 수 있는 다른 분자 뿐만 아니라 분자 시계에 미생물 구성 요소 뿐만 아니라 영향을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 이 이렇게 애타게 떨어져 어떻게 PAMP 통행세 같이 수용 체 상호 작용에 영향을 미치는 시계 식의 분자 메커니즘을 활용 될 수 있습니다.
Introduction
생리학 및 행동의 거의 모든 측면에 대 한 24 시간 진동 총괄, 포유류, 마스터 클록은 시상 하 부1,2의 suprachiasmatic 핵 (SCN) 내에 있습니다. Organismal 수준에 생물학 과정을 통제, 이외 마스터 클록도 시체3,,45를 통해 주변 세포 시계를 동기화 합니다. 핵심 이루어져 있다 기간 (Per1-3), 신장의 (Cry1-2), Bmal1을 최소한 3 개의 맞물리는 transcriptional 변환 피드백 루프 분자 시계 기계 장치에 의하여 이루어져 있다, 하는 동안 그리고 시계 유전자6,7. 핵심 분자 시계의 정확한 타이밍을 유지, 게다가 일부 보조 시계 유전자 제품 (예, 레 브 erbα 및 Dbp) 또한 비 시계 유전자의 표현을 규제, 즉, 시계 제어 유전자 (CCGs)6 , 7.
기능성 분자 시계 다양 한 면역 조직 (예를 들어, 비장 및 림프절)8 셀 (예를 들어, B 세포, 수지상 세포, 대 식 세포)8,9에서 설명 했습니다. 이 세포를 감지 하 고 응답 병원 체 관련 된 분자 패턴 (PAMPs), 수용 체 통행세 같이 (TLRs)10등 타고 난 면역 인식 수용 체를 통해 보존된 미생물 구성 요소. 날짜 하려면, 13 기능 TLRs는 설명, 세균성 세포 벽 구성 요소, flagellar 단백질, 핵 산 미생물10등 미생물 성분 인식 하는. PAMP, lipopolysaccharide (LPS), TLR4에 의해 인식 하는 그람 음성 세균의 세포 벽 구성 요소 organismal와 분자 수준에서 circadian 리듬 변경 표시 되었습니다. 예를 들어 vivo에서 LPS의 빛 같은 위상 지연 마우스11 활동에 의해 측정 된 유도 도전과 SCN에 간 현장에서 교 잡 그리고 양이 많은 PCR에 의해 결정으로 감소 된 시계 유전자 발현에 쥐12에서 각각. vivo에서 도전 LPS와, 후 인간의 말 초 혈액 백혈구13 및 피하 지방 조직14 의 분석 통해 정량 측정으로 여러 시계 유전자의 바꾸 인된 표현을 밝혔다. 마지막으로, 인간의 세포와도 마우스 복 막 대 식 세포의 LPS 도전 비보 전 시계 식 정량14측정으로 변경.
여기, 우리 PAMPs LPS, ODN1826 (를 포함 하는 합성 oligonucleotides CpG 모티브 unmethylated)의 영향을 평가 하기 위해 프로토콜 설명 및 열 죽 Listeria monocytogenes (HKLM)에 의해 인식 TLR4, TLR9, 그리고 TLR2, 각각,에 분자 시계 유전자 식 마우스 splenocytes에. 프로토콜에는 마우스 splenectomy splenocyte 격리 및 도전, RNA 추출, cDNA 합성, 정량 여러 시계 유전자의 표정을 평가 하 포함 되어 있습니다. 이 프로토콜 면역 세포와 아주 작은 동물의 많은 수의 적시 취득 또는 세포 조작, 다음 수 있는 비보 전 다양 한 PAMPs와 도전. 분자 시계 변조 면역 응답8,,1516의 다양 한 측면을 보여줘 왔다, 그러므로, 분자 시계의 대부분의 적절 한 시간에 따른 변형 자유로울 것는 면역 응답입니다. 또한, 이후 circadian 리듬의 붕괴는 심각한 병 리17,18,,1920으로 이어질 수 있습니다., 그것은 연구자 도전 splenocytes의 넓은 범위에 대 한 관심의 있을 수 있습니다. 분자 시계에 그들의 영향을 평가 하 고.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
연구 기간 동안 동물 보호 및 치료 건강의 국가 학회 정책 준수, 기관 지침에 따라 되었고 하트포드의 대학 동물 제도 동물 보호와 사용 위원회에 의해 승인 했다.
1입니다. 동물의 유입
참고: 20 주 된 남성 B6129SF2/J 쥐 연구에 사용 됩니다.
- 쥐 라이트 12 h (표준 오버 헤드 화이트 빛)를 끌고가 다/어두운 12 h 주기 2 주 전에 실험에 대 한.
참고: 여기 zeitgeber 시간 (ZT) 0 해당 하에 조명과 ZT12 조명, 다른 모든 환경 요인 (즉, 음식, 물, 그리고 실내 온도)를 유지 하면서 지속적인 21.
2. 악기, 문화 매체, 및 도전 매체 준비
- 압력솥 집게와가 위 해입니다. 알루미늄 호 일 및 고압에 두르고 현미경 슬라이드의 쌍을 바꿈.
- 10%의 최종 농도에 소 태아 혈 청 (FBS)를 추가 하 여 RPMI 1640 배양을 준비 합니다. 다음 PAMPs 문화 매체에 추가 하 여 10 mL 50 mL 튜브에 도전 매체의 준비 (RPMI 10 %FBS); LPS (5 µ g/mL), ODN1826 (5 µ g/mL), Listeria monocytogenes 열 사망 (108 HKLM/mL), 또는 다른 PAMP 제안된 농도에.
- 문화 매체와 도전 매체 물 욕조에 37 ° C에 따뜻하고 실 온에서 약 70 mL의 멸 균 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS, pH 7.2) 계속.
- 얼음에 10 mL 피 펫 및 50 mL 튜브를 피펫으로 원조를 사용 하 여 문화 매체의 10 mL를 추가 합니다.
- 미생물 오염을 방지 하기 위해 비 커에가 위와 집게를 해 부의 100 mL 비 커와 장소 끝에 70% 에탄올의 약 30 mL를 추가 합니다.
- 50 mL 튜브에 버퍼 실내의 모든 1 ml (후드 연기) 10 µ L β-Mercaptoethanol을 추가 하 여 RNA 격리에 대 한 세포의 용 해 버퍼 준비. 필요한 (600 µ L 당 약 1 x 106 셀로 구성 된 샘플) 될 금액만 확인 합니다.
참고: 버퍼 실내의 RNA 추출 키트 실리 카 막에 RNA의 바인딩을 지 원하는 구성 요소입니다.
3. Splenocyte 절연 및 도전
- 그들의 원래 감 금 소에 그들을 유지 하 고 계속 호흡 중지 후 1 분 CO2 를 공급 3 L/분의 유량에 케이지를 CO2 를 추가 하 여 마 취 법을 통해 특정 zeitgeber 시간에 마우스를 안락사.
- 두개골의 기지에서 목의 양쪽에 엄지와 검지 손가락을 배치 하 여 자 궁 경부 전위를 통해 죽음을 확인 합니다. 또는 눌러 두개골의 기지에서 막대 (를 사용 하 여 다른 손) 신속 하 게 당기면 꼬리 또는 두개골22에서 자 궁 경부 척추의 분리를 일으킬 뒷 다리 사지의 기지.
- 70% 에탄올과 종이 타월로 닦아 마우스 트렁크를 스프레이. 다시 하 고 그것의 오른쪽으로 약간 기울어진에 마우스를 놓습니다. 버려야 모피, 해 부를 사용 하 여가 위, 마우스의 왼쪽된 측면을 따라에 대 한 중간 앞, 뒤 다리 사이.
- 집게를 사용 하 여, 복을 신중 하 게 만들 비장의 손상 수 없습니다 절 개. 집게로 비장을 제거 하 고 얼음에 문화 미디어의 약 10 mL를 포함 하는 살 균 50ml 튜브에 배치. 나머지 동물에 대 한 반복 합니다.
참고: 비장은 신장 콩의 색상 이며 길고 신장 보다 아첨. -
문화 매체의 2 mL와 함께 한 비장 작은 멸 균 페 트리 접시에 전송.
- 두 메 마른 서 리 낀된 슬라이드의 젖 빛된 부분 사이 그것을 연마 하 여 비장을 균질. 만약에 가능 하다 면, 계속 문제 및 셀 매체에 균질 화 과정.
- 일단 철저 하 게, 40 µ m 나일론 셀 스 트레이너를 통해 50 mL 튜브에는 splenocytes를 포함 하는 문화 매체의 2 개 mL를 피펫으로 무 균.
- 나머지 spleens 문화 매체와 셀 멤브레인 두르고 슬라이드의 새로운 쌍, 50 mL 튜브를 사용 하 여 위의 단계를 반복 합니다.
- 각각 10 mL/튜브의 전체 볼륨에 대 한 splenocytes를 포함 하는 50 mL 튜브의 감기 문화 매체의 8 mL를 추가 합니다. 당 밀리는 hemocytometer를 사용 하 여 셀의 개수를 결정 합니다.
- 6 잘 배양 배지를 약 1 x 106 셀/잘을 추가 합니다. 셀 추가 실험을 위해 사용 되 고 다른 PAMPs의 번호에 해당 하는 컨트롤을 포함 하는 우물의 수를 잘 합니다. 각 우물에 문화 매체의 또는 도전 매체의 3 mL 3 mL를 추가 합니다.
- 5% CO2 3 시간에서 37 ° C에서 번호판을 품 어.
- 잘 사용 하 여 1000 µ L 피펫으로 팁 P1000 micropipette에 연결 된 아래에서 세포를 다쳤어요. 15 mL 튜브에 동일한 1000 µ L 피펫으로 팁을 사용 하 여 셀을 포함 하는 매체를 전송 합니다.
- 실 온에서 5 분 동안 167 x g 에서 원심 분리를 통해 셀 작은 상쾌한을 제거 하 고 PBS의 5 mL와 함께 셀 펠 릿을 세척.
- 작은 셀 5 분 동안 167 x g 에서 두 번째 시간, 상쾌한, 제거 하 고 셀 펠 릿을 위하여 세포를 lyse 세포의 용 해 버퍼의 600 µ L를 추가. 그런 다음 RNA 격리를 진행 합니다.
4. RNA 분리 및 cDNA 합성
- 제조업체의 지침에 따라 RNA 추출 키트를 사용 하 여 splenocytes에서 RNA를 분리 하 고 '옵션'에 열 DNA 소화를 수행.
- CDNA 합성 전에 cDNA 합성 키트의 농도 범위 내에서 최적의 RNA (최대 2 µ g) 인지 확인 하는 microvolume 분 광 광도 계를 사용 하 여 RNA 농도 결정 합니다.
- 각 제조업체의 지침에 따라 역방향 전송 키트를 사용 하 여 샘플의 종합 cDNA. RNA의 10 µ L를 사용 하 여 각 20 µ L 총 반응 볼륨에서 샘플에 대 한. 반전 녹음 방송 (thermocycler 실행) 완료에 추가 20 μ H2O 각 반응에.
- P10 또는 P20 micropipette 준비는 cDNA를 0.5 mL 튜브에는 몇 가지 컨트롤 샘플 (예를 들어, 5에서 10 µ L의 총 2 샘플 µ L)에서 mRNA를 풀을 사용 하 여 표준 커브를 생성 합니다.
- 10 µ L 2 x 역전사 마스터 믹스를 추가 합니다.
- 반전 녹음 방송의 완료에 표준 곡선에 대 한 희석 시리즈에 사용 시작 농도 ("1") 될 것입니다 반응 관에 H2O 10 µ L을 추가 합니다.
- P100 또는 P200 micropipette를 사용 하 여 지정 하는 10-1, 10-2, 10-3, 그리고 10-44 개의 0.5 mL 튜브에 물 45 µ L을 추가 하 여 10 희석 시리즈 (1 ~ 10-4)를 수행 합니다.
- P20 micropipettor, 아래로 pipetting으로 믹스를 사용 하 여 첫 번째 튜브 (10-1)에 "1" 시작 농도의 5 µ L를 추가, 여러 번 다음 튜브에 10-1 튜브에서 전송 5 µ L 지정 10-2 와 혼합.
- 5 µ L 10-3 을 지정 하는 튜브에 10-2 관에서 P20 micropipette를 사용 하 여 전송 및 혼합. 5 µ L 10-4 지정 관에 10-3 관에서 P20 micropipettor를 사용 하 여 전송 및 혼합.
5. 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량)
- 정량에 의해 mRNA 수준의 상대 정량을 확인 합니다. 내 실험에서 "정량-상대 표준 곡선" 및 "TaqMan" 화학을 선택. 변경 10 µ L. 반응 볼륨 플레이트 레이아웃 (예:대상 유전자, 표준 곡선, 기자, 등)에 관련 된 정보를 입력 합니다.
- 0.5 µ L의 뇌관/조사 분석 결과, 유전자 표현 마스터 믹스의 5 µ L, H2O 2 µ L 및 2.5 포함 되도록 반응 준비 µ L의 cDNA (10-100 ng).
- 반응, 표준 곡선에서 그들을 포함 하도록 확인 하 고 중복 계정을 2 추가 반응에서 각 반응이 수행 부정적인 컨트롤의 숫자에 의해 (cDNA)를 제외 하 고 위의 시 약의 각각 곱하여 마스터 믹스를 준비 대 한 pipetting 변화.
- 피펫으로 7.5 µ L는 micropipette 또는 멀티 채널 피 펫 96-잘 반응 판에 미리 결정 된 우물에 준비 된 마스터 믹스의. 피펫으로 미지수 및 표준에 대 한 적절 한 우물에 cDNA의 2.5 µ L 및 2.5 µ L H2O 부정적인 제어 우물에의.
- 다양 한 분자 시계 유전자에 대 한 입문서/조사 분석을 포함 하 고 또한 내 생 컨트롤 (예를 들어, β-말라)에 대 한 분석 결과 포함 합니다.
- 상대 식 값을 결정 하기 위해 각 복제에 대 한 상대적인 평균 수량을 계산 후, 각 샘플에 대 한 β-걸에 대 한 평균 상대 수량으로 대상 유전자에 대 한 평균 상대 수량 분할.
6. 통계 분석
- 통계 분석 소프트웨어를 사용 하 여 열 통계 옵션 아래 프로그램으로 데이터를 입력 합니다. 일방통행 ANOVA Dunnett의 포스트 hoc 테스트 컨트롤 대 PAMP 도전 후 시계 유전자 발현의 의미 값 간의 차이 평가 하기 위해 선택 합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
마우스 ZT13에 희생 했다, splenocytes 고립 된 비보 전 PAMPs LPS, ODN1826, 또는 HKLM 도전. 3 h 후 RNA 격리, 고 정량 시계, Per2, Dbp, 및 레 브 erbα 당된 컨트롤 셀에 비해 분자 시계 유전자의 상대 식 수준을 평가 하는 데 사용 되었다. PAMP 도전 후 시계 식 레벨 제어 셀 (그림 1A) 식 보다 크게 다른 되지 않았습니다. Per2 식 레벨 LPS와 ODN1826 당된 컨트롤 (그림 1B)에 비해 도전 셀에 크게 상승 했다. LPS는 mRNA 수준 당된 컨트롤 (그림 1C)에 비해 크게 낮은 것 처럼 레 브 erbα 식 변경 유일한 PAMP 이었다. 마지막으로, 상당히 낮은 mRNA 수준 관찰 되었다 Dbp 에 대 한 각 컨트롤 (그림 1D)에 비해 PAMPs 도전 후. 어떤 이전 표시 되었습니다, 모든 시계 관련 유전자 검사, Dbp 식 PAMP 도전23에 의해 가장 영향을 받는 수 하는 경향이 있다와 일치.
그림 1 : 변경 된 시계 유전자 발현 마우스 splenocytes에 PAMP 도전 비보 전 후. Splenocytes는 ZT13에서 고립 되었고, LPS, ODN1826, 또는 HKLM 도전. 상대 시계 mRNA 수준 (β-걸으로 표준화) 된 정량 3 h 도전 후에 결정 됩니다. 각 데이터 요소 1 동물에 대 한 식 수준을 나타냅니다. 실험적 의미 + SEM 받는다. p < 0.05, * *p < 0.01, * * *p < 0.001. 지정된 과제 Dunnett의 포스트 hoc 테스트와 일방통행 ANOVA에 의하여 제어 (당된 세포)에서 크게 달랐다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 프로토콜 내에서 계량 하 여 유전자 발현을 결정 하는데 사용 되는 RNA의 순도 평가 microvolume 분 광 광도 계를 사용할 수 있습니다. 260에 자외선을 흡수 하는 핵 산 nm, 일반적으로 280에 빛을 흡수 하는 단백질 nm, 다른 잠재적인 오염 물질 RNA 추출 절차 (예, 페 놀) 동안 사용 되는 230에서 감지 하는 동안 nm. 따라서, () 비율 260/280에서 흡 광도 평가 하 여 nm (단백질 RNA) 및 260/230 nm (비 단백질 오염 물질에 RNA) RNA의 품질 평가 될 수 있다. 높은 품질 RNA는 단백질 오염을 나타내는 1.8-2.1, 더 낮은 비율으로 간 A260/280 비율. 순수한 RNA 샘플 2.0의 A260/230 비율이 있을 것 이다.
(즉, Per2, 시계, 레 브-erbα, 및 Dbp), 대상 유전자의 상대적 식을 결정할 때 생 제어 유전자 (유전자는 식에서 수준 차이가 없습니다 샘플 사이)도 선택 해야 합니다. 대상 유전자의 상대 식 생 제어 유전자의 표현에 다음 정규화 됩니다. 시작 물자 (splenocytes 수), 역전사 효율성에 변이, RNA 저하, 등의 다양 한 속도 차이 생 제어 유전자 (β-말라 이 프로토콜)에 대 한 수정 될 것입니다. 그러나, 그것은 검사를 받고 치료 생 제어 유전자의 표현을 변경 하지 않습니다 확인 하는 것이 현명입니다. 이 동일한 수의 셀 (치료 대 비-처리)의 여러 복제에서 β-말라 레벨을 평가 하 여 수행할 수 있습니다. 이론에서는, 그들의 β-말라 수준이 동일 해야 합니다. 생 제어 편차를 방지 하기 위해 또 다른 방법은 생 컨트롤 (예: β-말라, Gapdh 와 18S rRNA 유전자)의 패널을 사용 하는 것입니다.
조사 하면 분자 시계에 PAMPs의 영향, 마우스 안락사는 splenocytes 이후에 도전 하루의 시간으로 적용 해야 합니다. Tlr 표현과 응답 이전 보였다 일 시간 종속 변형8,15, 따라서, 그것의 첨단에, TLR 응답을 때 하루 중 시간 발생할 수에 큰 영향을 설명 하는 시계입니다. 또한, 분자 시계 유전자의 표현 또한 splenocytes에서 하루 동안 변동 됩니다, 그리고 따라서, PAMP 도전 때문 시계 유전자 발현의 감소는 피크 식9시간 동안 검사 하는 경우 가장 중요 한 것. 이후 Dbp 와 레 브 erbα splenocytes에서 중요 한 식 봉우리를 설명 하기 위해 표시 되었습니다 빛 어두운 인근 비장 면역 세포 interphase 8,,923, 24 (ZT12), 현재 방법에 세포 고립 되었고이 유전자에 있는 감소를 감지에 큰 기회가 있기 위하여 ZT13에 도전. 반대로, 시계 식 증가 수 PAMP 대부분 관찰 될 것입니다 하루 중 시계 식 최저에서 한 번에 보고 하는 경우.
쥐는 야행성 동물 이기 때문에, 인간의 활동에 해당 빛 기간 동안 그들의 나머지 단계가입니다. 따라서, 이상적으로, 쥐 최소한의 트래픽과이 쥐의 circadian 리듬을 방해 수로 주간 소요를 감소 시키기 위하여 백색 소음 기계를 포함 하는 룸에 보관 됩니다. 또한, 실험 날짜 임박 케이지 변경 이루어져야 합니다. 어두운 기간 동안 (를 포함 하 여 동물의 안락사) 동물 방에 어떤 일 쥐의 리듬을 방해를 피하기 위하여 빨간 불에 실시 한다.
일주 리듬은 불린다 zeitgebers 환경 자극 (예를 들어, 빛 또는 음식)를 받게 됩니다. 주기 12 h 빛/12 h 어두운 경우, zeitgeber (즉, 빛) 24 시간 기간에 시계를 다시 설정 됩니다. 대부분 일주 리듬 circadian 동안 (즉, 일일 리듬 외부 큐가 없을 경우에 발생 하는), 그들은 진정한 circadian 리듬까지 그들은 대략 24 시간 시간을 일정 한 환경 조건에서 진동 표시 되었습니다 . 따라서, 다음 3 일전 샘플링에 대 한 지속적인 어둠의 동물을 들고 하지만, 위에서 설명한 대로 빛 어두운 주기에 연행 쥐 수반 것이 일정 조건 하에서 마우스를 사용 하 여이 절차를 수행 될 수 있습니다. 실험의이 유형은 불린다 어두운 다크 (DD) 실험과 샘플링의 시간 포인트 CT (circadian 시간) ZT 하지로 언급 것 이다.
이 메서드는 PAMPs splenocytes 내 시계 유전자 발현을 변경 하는 확인할 수 있습니다, 하는 동안 그것은 받지 않는다 계정에 어떻게 이러한 PAMPs 마스터 클록 또는 주변 시계는 몸 전체에 영향을. 비장 세포의 이종 인구로 구성 되어, 이후 개별 PAMPs 수 영향을 각 셀 형식을 다르게. 예를 들어 마우스 비장에 Tlr9 식 리듬 splenocytes, 대 식 세포, B 세포, 및 Dc15사이 다. 또한, Tlr4 Tlr1, Tlr3, Tlr6, Tlr7및 Tlr8 부착 splenocyte 인구에서 중요 한 일일 진동 표시 하지만 Tlr2 와 Tlr6 만 매일 경험 풍부한 비장 세포24에 진동입니다. 따라서, 개별 셀 형식에 대 한 도전의 결과, 조사 하기 위하여 셀 자기 셀 정렬, 앞서 설명한9,15 와 이후에 도전 통해 격리 될 수 있습니다. 또한, 비장 세포 인구 수 또한 역할 감도에서 특정 PAMP와 후속 영향 시계8에 매일 주기에 변화가 심합니다.
이 메서드는 주로 B 세포 (~ 58%), T 세포 (~ 21%), 수지상 세포 (~ 5%), 대 식 세포 (~ 4%)25를 구성 하는 면역 세포의 많은 수의 격리에 대 한 수 있습니다. 셀의 다 수 splenocytes PAMPs 다양 한 하나의 실험에 도전 하는 기회를 제공 한다. Splenocyte 격리 절차는 매우 쉽게 수행, 완료 될 수 있다 (동물의 수에 따라 다름), 분 이내에 그리고 최소한의 동물 또는 세포 조작 때문에 분자 시계를 조사할 때 필수입니다 위에서 언급 한 이러한 작업은 시계 제어 유전자 뿐 아니라 클록의 타이밍을 방해할 수 있습니다. 결과이 절차 사이 의미 높은 재현 했다 도전 하 고 당된 셀 3 동물을 가진 달성 했다 결과 이전에 게시 작품23 (그림 1)과 일치 했다. 그룹 당 동물의 수를 증가 수 있습니다 밝혀 통계적으로 유의 한 차이 도전 그룹 및 제어 (예: ODN 1826 및 레 브-erbα)을 주목 한다.
이동 앞으로,이 프로토콜만 시계 유전자 발현 PAMP 도전 후에 급성 효과 해결 하는 동안, 그것은 추가 조사를 위해 원리의 증거를 제공할 수 있습니다. 예를 들어이 분석 결과로 사용 될 수 있는 모델 TLR-PAMP 관련 분자 메커니즘을 해독 상호 작용 하 고 어떻게 그것은 분자 시계 영향. 그것은 또한 분자 시계 시간 과정 실험 (즉, 다양 한 번 도전을 게시 후 식 평가)를 실시 하 여 결정 될 수 있습니다. 있는 PAMP 도전 후 복구를 하는 데 걸리는 시간의 길이 결정 하기 위해 사용 될 수 있습니다. 위에서 설명 했 듯이, 후속 실험 PAMP 도전 특정 splenocyte 세포 인구에 검사를 수행 수 있습니다. 여러 병원 균 감염 시 여러 TLRs 자극, 이후 그것은이 프로토콜을 사용 하 여 시계 유전자 발현에 시너지 효과가 여러 PAMPs에 도전 하는 경우 조사 흥미로울 것입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 상관이 있다.
Acknowledgments
이 작품에 의해 지원 되었다 하트포드의 대학에서 대학 예술과 과학의 학장의 사무실에서 교수 연구 보조금.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Frosted slides | Fisher | 12-550-343 | |
| Cell strainers | Fisher | 22363547 | |
| Lipopolysaccharide | InvivoGen | ltrl-eklps | |
| ODN1826 | InvivoGen | Tlrl-1826-1 | |
| HKLM | InvivoGen | Tlrl-hklm | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| PBS | Gibco | 20012-043 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 or 74106 | |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| 6-well cell culture plate | Denville | T1006 | |
| 50 mL tubes | Corning | 352070 | |
| 15 mL tubes | Corning | 352097 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher | 4368814 | |
| TaqMan Gene Expression Assays b-actin | ThermoFisher | Mm00607939_s1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Per2 | ThermoFisher | Mm00478113_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Rev-erba | ThermoFisher | Mm00520708_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Bmal1 | ThermoFisher | Mm00500226_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Dbp | ThermoFisher | Mm00497539_m1 | |
| qPCR machine StepOnePlus | ThermoFisher | ||
| TaqMan Gene Expression Master Mix | ThermoFisher | 4369016 | |
| MicroAmp Fast 96-well reaction plate (0.1 mL) | ThermoFisher | 4346907 | |
| Statistical Analysis Software | Prism 7.0a |
References
- Bell-Pedersen, D., et al. Circadian rhythms from multiple oscillators: lessons from diverse organisms. Nat. Rev. Genet. 6, 544-556 (2005).
- Mohawk, J. A., Green, C. B., Takahashi, J. S. Central and Peripheral Circadian Clocks in Mammals. Annu. Rev. Neurosci. 35, 445-462 (2012).
- Balsalobre, A., Damiola, F., Schibler, U. A serum shock induces circadian gene expression in mammalian tissue culture cells. Cell. 93, 929-937 (1998).
- Yoo, S. -H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 5339-5346 (2004).
- Yamazaki, S. Resetting Central and Peripheral Circadian Oscillators in Transgenic Rats. Science. 288, 682-685 (2000).
- Lowrey, P. L., Takahashi, J. S. Genetics of circadian rhythms in mammalian model organisms. Adv. Genet. 74, 175-230 (2011).
- Curtis, A. M., Bellet, M. M., Sassone-Corsi, P., O'Neill, L. A. J. Circadian Clock Proteins and Immunity. Immunity. 40, 178-186 (2014).
- Keller, M., et al. A circadian clock in macrophages controls inflammatory immune responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21407-21412 (2009).
- Silver, A. C., Arjona, A., Hughes, M. E., Nitabach, M. N., Fikrig, E. Circadian expression of clock genes in mouse macrophages, dendritic cells, and B cells. Brain. Behav. Immun. 26, 407-413 (2012).
- Kawai, T., Akira, S. The role of pattern-recognition receptors in innate immunity update on Toll-like receptors. Nat. Publ. Gr. 11, 373-384 (2010).
- Marpegán, L., Bekinschtein, T. A., Costas, M. A., Golombek, D. A. Circadian responses to endotoxin treatment in mice. J. Neuroimmunol. 160, 102-109 (2005).
- Okada, K., et al. Injection of LPS Causes Transient Suppression of Biological Clock Genes in Rats. J. Surg. Res. 145, 5-12 (2008).
- Haimovich, B., et al. In vivo endotoxin synchronizes and suppresses clock gene expression in human peripheral blood leukocytes. Crit. Care Med. 38, 751-758 (2010).
- Curtis, A. M., et al. Circadian control of innate immunity in macrophages by miR-155 targeting Bmal1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 7231-7236 (2015).
- Silver, A. C., Arjona, A., Walker, W. E., Fikrig, E. The Circadian Clock Controls Toll-like Receptor 9-Mediated Innate and Adaptive Immunity. Immunity. , (2012).
- Gibbs, J. E., et al. The nuclear receptor REV-ERB α mediates circadian regulation of innate immunity through selective regulation of inflammatory cytokines. PNAS. 109, 582-587 (2012).
- Zee, P. C., Attarian, H., Videnovic, A. Circadian rhythm abnormalities. Contin. Lifelong Learn. Neurol. 19, 132-147 (2013).
- Bovbjerg, D. H. Circadian disruption and cancer: sleep and immune regulation. Brain. Behav. Immun. 17, 48-50 (2003).
- Fu, L., Lee, C. C. The circadian clock: pacemaker and tumour suppressor. Nat. Rev. Cancer. 3, 350-361 (2003).
- Germain, A., Kupfer, D. J. CIRCADIAN RHYTHM DISTURBANCES IN DEPRESSION. Hum. Psychopharmacol. 23, 571-585 (2008).
- Basic Mouse Care and Maintenance. JoVE. , Cambridge, MA. JoVE Science Education Database (2018).
- Leary, S., et al. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals : 2013 Edition. AVMA. , (2013).
- Silver, A. C. Pathogen-associated molecular patterns alter molecular clock gene expression in mouse splenocytes. PLoS One. , 12-15 (2017).
- Silver, A. C., et al. Daily oscillations in expression and responsiveness of Toll-like receptors in splenic immune cells. Heliyon. , 00579 (2018).
- Flow-cytometric Anal. 11 strains mice. MPDJaxpheno6. Mouse Phenome Database web Resour. (RRIDSCR_003212). Jackson Lab. , Bar Harb. Maine USA. Available from: https//phenome.jax.org (2018).
