Summary
このプロトコルでは、マウスの脾細胞を使用して分子時計遺伝子発現を変更、病原体関連分子パターンを発見する手法について説明します。
Abstract
遺伝子発現への動作は、概日リズムは、生理学のほぼすべての側面を調節します。ここでは、病原体関連分子パターン (PAMPs) リポ多糖 (LPS)、ODN1826、熱殺されたリステリア菌とマウス脾細胞に挑戦し、概日リズムの分子の影響を検証する手法を提案します。時計。以前は、研究はさまざまなモデル (例えばマウス、ラットおよび人間) の品揃えから体内と体外のアプローチを使用して分子時計に LPS の影響を調べることに焦点を当てています。このプロトコルでは、分離と定量的 PCR によって時計遺伝子発現後挑戦を評価する方法論と同様に、脾細胞の挑戦をについて説明します。このアプローチは、だけでなく時計の表現を変えることができると同様に他の分子が、分子時計に微生物成分の影響を評価するために使用することができます。このアプローチは、時計式に影響を与える種緑化トール様受容体相互作用の分子機構をいじめる離れて利用できます。
Introduction
生理学および行動のほぼすべての側面の 24 h 振動を調整、哺乳類で、マスターのクロックは視床下部1,2の視交叉上核 (SCN) 内にあります。個体レベルでの生物学的プロセスを制御する、に加えてマスター時計はまた体3,4,5を通じて末梢細胞時計を同期します。コアは、期間(Per1 3)、クリプト(Cry1 2)、 Bmal1で構成されています一方、分子時計の機械は少なくとも 3 つの連動転写翻訳フィード バック ループから成っている、時計遺伝子6,7.コア分子時計の正確なタイミングを維持する以外にもいくつかの補助的な時計遺伝子産物 (例えば、試とDbp) はまた非時計遺伝子の発現を調節する、すなわち、時計被制御遺伝子 (CCGs)6,7。
機能分子時計は、様々 な免疫組織 (例えば、脾臓およびリンパ節)8と細胞 (例えば、 B 細胞、樹状細胞、マクロファージ)8,9に記載されています。これらの細胞は検出し、病原体関連分子パターン (PAMPs)、Toll 様受容体 (Tlr)10などの自然免疫認識受容体を介して、保存された微生物のコンポーネントに対応します。これまで、細菌の細胞壁構成成分、べん毛タンパク質は、微生物の核酸10など微生物の成分を認識する、13 の機能的な Tlr が記載されています。種緑化、リポ多糖 (LPS)、TLR4、によって認識されるグラム陰性菌の細胞壁の成分は、生物・分子レベルでの概日リズムを変更する示されています。たとえば、組合の生体内で挑戦の閃光のような位相遅延マウス11の活動によって測定されると SCN と肝臓の in situハイブリダイゼーションおよび量的な PCR によって決定される減らされた時計遺伝子発現につながったそれぞれのラットの12を実行します。組合の指定する生体内で挑戦後、ひと末梢血白血球13と皮下脂肪14の分析は、qPCR を介して測定としていくつかの時計遺伝子の発現の変化を明らかにしました。最後に、ヒトのマクロファージともにつながったマウス腹腔マクロファージの LPS 挑戦前のヴィヴォ時計式 qPCR14によって測定されるように変更。
ここでは、ODN1826 (を含む総合的なオリゴヌクレオチド非メチル化 CpG モチーフ)、PAMPs LPS の影響を評価するためのプロトコルについて述べると熱殺されたリステリア菌(HKLM)、TLR4、TLR9、TLR2、認識にそれぞれ、マウス脾細胞における分子時計遺伝子発現。マウス脾臓摘出術、卵白アルブミンの分離とチャレンジ、RNA 抽出、cDNA 合成、qPCR いくつか時計遺伝子の発現を評価するために、プロトコルが含まれます。このプロトコルは、非常に小さな動物に免疫細胞の数が多いのタイムリーな取得またはすることができますし、携帯電話の操作は前のヴィヴォ様々 な PAMPs と挑戦します。免疫応答8,15,16のさまざまな側面を調節する分子時計が示されている、したがって、分子時計の破壊の適切な時間に依存した変動損なう可能性が高く、免疫応答。さらに、概日リズムの混乱は深刻な病態17,18,,1920につながることができます、のでそれがあります脾細胞の広い範囲に挑戦する研究者にとっての分子時計への影響を評価します。
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Protocol
調査中, 動物のケアと治療国立衛生研究ポリシー遵守制度のガイドラインに従って, ハートフォード大学動物施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。
1. 動物の同調
メモ: 20 週齢雄 B6129SF2/J マウスの研究で使用します。
- マウスに 12 h 光 (標準的なオーバーヘッド白色光) を同調/12 h 暗いサイクル実験開始前 2 週間。
注: ここで同調因子タイム (ZT) 0 に対応して点灯し、ZT12 消灯、すべての他の環境要因 (すなわち食糧、水および部屋の温度) を維持しながら定数21。
2. 楽器、培地、およびチャレンジ中の準備
- オートクレーブ鉗子と解剖はさみ。アルミ箔とオートクレーブの曇らされた顕微鏡スライドのペアをラップします。
- ウシ胎児血清 (FBS) を追加することで培地を準備すると、10% の最終的な集中を RPMI 1640。次の PAMPs を培養培地に追加することによって 50 mL チューブに挑戦中の 10 mL を準備 (10% RPMI FBS);LP (5 μ g/mL)、ODN1826 (5 μ g/mL)、リステリア菌を熱殺された (108 HKLM/mL)、または、推奨濃度別種緑化。
- 暖かい培地と水のお風呂で 37 ° C にチャレンジ中、室温で約 70 mL の滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS、pH 7.2) を維持します。
- 10 mL の培地 10 mL のピペット、ピペット 50 mL のチューブに援助を使用して氷の上を追加します。
- 微生物汚染を防ぐためにビーカーにハサミ、鉗子を解剖の両端を 100 mL ビーカーと場所に 70% のエタノールの約 30 mL を追加します。
- 50 mL のチューブでバッファー RLT すべて 1 mL に 10 μ L β-メルカプトエタノール (ドラフト) の下を追加することにより RNA の隔離のための換散バッファーを準備します。必要な (約 1 × 106細胞から成っているサンプルあたり 600 μ) となる量だけを作る。
注: バッファー RLT、シリカ膜への RNA のバインディングをサポートする RNA 抽出キットのコンポーネントです。
3. 卵白アルブミンの分離と挑戦
- 彼らの元のケージでそれらを維持流量 3 L/分続行呼吸停止後 1 分の CO2を供給でケージに CO2を追加することによって麻酔を介して特定の同調因子でもマウスを安楽死させます。
- 頭蓋骨の付け根首の両側に親指と人差し指を置くことによって頚部転位による死を確認します。尾または頭蓋骨22から頚椎の分離を引き起こし後肢の基部 (他の手を使用して) すぐに引きながら、または、頭蓋底の棒を押します。
- 70% のエタノールとペーパー タオルで拭くとマウス トランクをスプレーします。そのバックとその右側にわずかに傾いたにマウスを配置します。毛皮を切り取る、解剖を使用してはさみ、マウスの左側に沿ってについて途中でフロントと後ろ脚の間。
- 鉗子を使用すると、腹膜をつかんで慎重に脾臓を損傷しないように切開を行います。鉗子で脾臓を取り外し、培地の氷の約 10 ml 滅菌 50 mL チューブに入れます。残りの家畜を繰り返します。
注: 脾臓腎臓豆の色である、それは長く、腎臓よりも平坦。 -
小さな滅菌シャーレに培養液 2 mL で 1 つ脾臓を転送します。
- 2 つの滅菌曇らされたスライドのつや消し部分の間研削によって脾臓を均質化します。均質化過程で培地で問題と細胞を維持、可能であれば。
- 一度徹底的に均質化、50 mL のチューブに 40 μ m ナイロン携帯こし器を通って脾細胞を含む培地の 2 mL ピペットで移しなさい。
- 培地、細胞ストレーナーと曇らされたスライドの新しいペア、50 mL の管を使用して残りの脾臓の上記の手順を繰り返します。
- 各 10 mL/チューブの合計ボリュームの脾細胞を含む 50 mL チューブに冷たい培養液 8 mL を追加します。診断の 1 ミリリットルあたりのセルの数を決定します。
- 6 ウェル培養皿に約 1 × 106細胞/ウェルを追加します。細胞を実験に使用されている異なる PAMPs の数に対応し、コントロールを含める井戸の数も追加します。それぞれの井戸に培地のまたは挑戦中の 3 mL 3 mL を追加します。
- 37 ° c 3 時間 5% CO2で板を孵化させなさい。
- まあ使用して P1000 のピペットに添付 1,000 μ L ピペット先端部の底から細胞をこすり取る。15 mL チューブに同じ 1,000 μ L ピペット チップを用いた細胞を含む培地を転送します。
- 167 x g室温で 5 分間遠心分離して細胞をペレットします。上澄みを除去し、5 mL の PBS のセル餌を洗浄します。
- ペレットのセル 167 x gで 5 分間の 2 回、上清を除去、細胞ペレットに細胞を溶解するために換散バッファーの 600 μ L を追加します。RNA の隔離に進みます。
4. RNA の隔離と cDNA の統合
- 製造元の指示に従って RNA 抽出キットを使用して脾細胞からの RNA を隔離し、'オプション' の列に DNA 消化を実行します。
- CDNA 合成前に cDNA 合成キットの濃度が最適な RNA 範囲 (最大 2 μ g) 内にあることを確認する微量分光光度計を用いた RNA 濃度を決定します。
- 製造元の指示に従って逆のトランスクリプション キットを使用してサンプルの各合成 cDNA。20 μ L の全反応量のサンプルの各 RNA の 10 μ L を使用します。逆のトランスクリプション (たち実行) の完了時に 20 μ L を追加 H2O 各反応にします。
- P10、P20 マイクロ ピペットを使用して cDNA を準備する 0.5 mL チューブにいくつかのコントロールのサンプル (10 μ L の合計のための 2 サンプルから例えば5 μ L) から mRNA をプールする標準的なカーブを作成します。
- 10 μ L 2 x の逆転写酵素のマスターの組合せを追加します。
- 逆のトランスクリプションの完了時に標準曲線の希釈系列で開始濃度 (「1」) となる反応管に H2O の 10 μ L を追加します。
- 10 倍希釈系列 (1 に 10-4) を実行するには、10-410-3、10-210-1に示される 4 つの 0.5 mL チューブに P100、P200 ピペットを用いた水の 45 μ L を追加します。
- P20 micropipettor、上下にピペッティングしてミックスを使用して、最初の管 (10-1) に「1」の開始の集中の 5 μ l 添加、数回、チューブに 10-1チューブから転送 5 μ L 指定 10-2とミックス。
- 10-3を指定管に 10-2管から P20 マイクロ ピペットを使用して 5 μ L を転送し、ミックスします。10-4を指定管に 10-3チューブから P20 micropipettor を使用して 5 μ L を転送し、ミックスします。
5. 量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR)
- QPCR による相対定量の mRNA のレベルを決定します。実験セット内で「定量-相対標準曲線」と"TaqMan"化学を選択します。10 μ L を反応ボリュームの変更は、プレート レイアウト(例えば、ターゲット遺伝子、標準曲線、記者等)に関連情報を入力します。
- プライマー ・ プローブ測定の 0.5 μ L、遺伝子表現マスター ミックスの 5 μ L、H2O 2 μ L と 2.5 が含まれるように反応を準備 (10-100 ng) の cDNA の μ L。
- 反応を標準曲線からのそれらを含めて各反応を実行する重複するいると、2 の余分な反応否定的なコントロールの数によって (cDNA) を除く上記の試薬をそれぞれ乗じてマスター ミックスを調製します。ピペッティングのバリエーション。
- ピペット 7.5 μ L ピペットやマルチ チャンネル ピペットの 96 ウェル リアクション プレートの前もって決定された井戸に準備のマスターの組合せの。ピペットの未知数および標準、適切な井戸に cDNA の 2.5 μ L と 2.5 μ L H2O 陰性対照の井戸に。
- 様々 な分子時計遺伝子のプライマー ・ プローブの試金が含まれても、内因性制御 (例えば、β-アクチン) の試金。
- 相対式の値を決定するために各複製の平均の相対的な量を計算し、各サンプルでは、 β-アクチンの平均の相対的な量によって標的遺伝子の平均の相対的な量を分割します。
6. 統計解析
- 統計解析ソフトウェアを使用して、列統計情報オプションでプログラムにデータを入力します。Dunnett の事後テストと対照種緑化チャレンジ後時計遺伝子発現の平均値の違いを評価するために一方向の分散分析を選択します。
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Representative Results
マウスが ZT13 で犠牲になった、脾細胞が隔離され前のヴィヴォPAMPs LP、ODN1826、または HKLM に挑戦します。3 h 後 RNA が分離され、qPCR 比類のない制御の細胞と比較して試、 Dbp、 Per2時計分子時計遺伝子の相対発現レベルを評価するために使用されました。種緑化挑戦後、時計式レベルは制御の細胞 (図 1A) の式よりも大幅に異なるでした。Per2式有意に高値細胞の LPS と比類のないコントロール (図 1B) と比較した場合の ODN1826 に挑戦します。組合が試式を変更する唯一の種緑化 mrna いた比類のないコントロール (図 1C) よりも有意に低かった。最後に、大幅低い mRNA レベル観察されたDbpの PAMPs コントロール (図 1D) と比較した場合のそれぞれのチャレンジの後。何予め示されている、すべての関連付けられている時計遺伝子を調べたところ、 Dbp式種緑化チャレンジ23によって最も影響を受ける傾向があるからと一致します。
図 1: 種緑化挑戦前のヴィヴォ後マウス脾細胞の変えられた時計遺伝子発現します。脾細胞は ZT13 で隔離され、LP を ODN1826、または HKLM に挑戦します。(Β-アクチンに正規化) 相対するクロックの mRNA のレベルは、チャレンジ後 qPCR 3 h に定められました。各データ ポイントは、1 動物の表現レベルを表します。実験的意味 + SEM が与えられます。p < 0.05 * *p < 0.01 * * *p < 0.001。指定された課題は、Dunnett の事後検定と分散分析に従ってコントロール (比類のない細胞) と大きく異なっていました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルでは、定量化し、遺伝子の発現を決定する際に使用されている RNA の純度を評価する微量分光光度計を使用できます。核酸は 260 で紫外線を吸収する nm、蛋白質は通常 280 で光を吸収する nm、RNA 抽出プロシージャ (例えばフェノール) 中に使用される他の潜在的な汚染物質が 230 で検出可能な nm。したがって、吸光度 260/280 (、) の比を評価することにより nm (蛋白質に RNA) および 230/260 nm (非蛋白質の汚染物に RNA)、RNA の品質を評価することができます。高品質の RNA が蛋白質の汚染を示す低い比率として、1.8-2.1 の A260/280 比率。純粋な RNA サンプルでお越しの際にも 2.0 の A260/230 比。
ターゲット遺伝子 (すなわち、Per2, 時計, 試とDbp) の相対的な表現を決定する際、内因性制御遺伝子 (式のレベルはサンプル間違いはありません遺伝子) も選択する必要があります。ターゲット遺伝子の相対発現し、内因性制御遺伝子の発現に正規化されます。原料 (脾細胞数)、逆転写酵素の効率の変化、RNA の劣化などのさまざまな料金の違いは、内因性制御遺伝子 (β-アクチンこのプロトコル) での修正予定です。しかし、内因性制御遺伝子の発現を調べている治療で変更しないことを確認することをお勧めします。これは、同じ数のセル (対非-治療) の複数の複製からβ-アクチンレベルを評価することによって実現できます。理論的には、 β-アクチンレベルが同一である必要があります。内因性制御変化を防ぐための別のアプローチは、内因性制御 (例えば、β-アクチン Gapdhと 18 s rRNA 遺伝子) のパネルを使用することでしょう。
PAMPs の分子時計への影響を検討する際、安楽死させてマウス脾細胞は、その後に挑戦した日の時間が考慮する必要があります。Tlr発現と応答性以前の時刻依存変化8,15TLR の応答がその最盛期には、日の時間可能性がありますしたがってに大きく影響を実証する示されている、時計。さらに、脾細胞で一日中分子時計遺伝子の発現が変動するも、したがって、種緑化の課題のための時計遺伝子発現の減少はピーク式9の時に調べた場合最も重要なでしょう。Dbpと試脾細胞の重要な式のピークを示すことが示されているので、中間期の光暗い中脾免疫細胞8,9,23, 24 (ZT12) は、現在のメソッドでセルが分離・これらの遺伝子の減少の検出に大きなチャンスがあるために ZT13 で挑戦します。逆に、時計の発現を高めることができる種緑化が観察される最も可能性の高い場合は時計式が最低のときの日の時間を見てします。
マウスは夜行性動物であるので、彼らの残りの段階は人間の活動に対応する光の期間中です。そのため、理想的には、マウスは最小限のトラフィックとこれはマウスの概日リズムを混乱させることができるよう、昼間の妨害を減らすためにホワイト ノイズのマシンが含まれている 1 つの部屋に収納されます。さらに、実験の日付の前にケージの変更を行ってください。暗期 (動物の安楽死を含む) 動物の部屋ですべての作業は、マウスのリズムを中断することを避けるために赤い光の下で行われなければなりません。
概日リズムは環境刺激 (例えば、光または食品) zeitgebers を呼ばれているにさらされます。暗い 12 h 光/12 h の場合サイクル、同調因子 (すなわち光) 時計を 24 時間にリセットします。ほとんどの概日リズムは概日間 (すなわち、毎日リズム外部キューの有無で発生する)、彼らは一定の環境条件の下でおおよそ 24 時間で振動する示されているまでは真の概日リズム.したがって、サンプリングの前に 3 日間の暗黒条件下において動物を保持しかし、上記のように明暗サイクルに連行マウスを伴なう一定条件下でマウスを使用してこの手順を実行することができます。このタイプの実験は、暗い暗い (DD) 実験時点でサンプリングと CT (日周期)、ない ZT と呼ばれると呼ばれます。
このメソッドは、脾細胞内で遺伝子の発現を変える PAMPs を識別できます、一方それに入れないアカウント マスターク ロックや体全体の末梢時計のこれらの PAMPs の影響。脾臓は、異種細胞集団から構成されている、個々 PAMPs 異なるセル タイプごとの影響でした。たとえば、脾細胞、マクロファージ、B 細胞、Dc15間Tlr9式リズム マウス脾臓内で異なります。また、 Tlr7、 Tlr6 Tlr4 Tlr3 Tlr1や Tlr8付着生人口に重要な毎日の振動を表示が、 Tlr2とTlr6のみ毎日の経験濃縮脾マクロファージ24で振動します。したがって、個々 のセルの種類上の課題の結果を調査するために、細胞が独立磁気細胞選別、前述の9,15とし、その後挑戦して可能性があります。さらに、脾細胞集団がまた役割を果たす感度の特定種緑化とその後の影響にクロック8毎日のサイクルで変動します。
このメソッドでは、免疫細胞 B 細胞 (〜 58%)、T 細胞 (~ 21%)、樹状細胞 (~ 5%)、マクロファージ (~ 4%)25の主を含む多数の分離ができます。多数のセルは、PAMPs の単一の実験で様々 な脾細胞に挑戦する機会を提供します。生分離手順はとても簡単、実行するが不可欠であるために、分子時計を調べるとき最小限動物または細胞操作と (によって動物の数) は、数分以内に完了できる前述のように、これらのアクションは、時計、クロック制御遺伝子のタイミングを破壊できます。結果この手順であった間の意義として、再現性の高い挑戦し、比類のない細胞がわずか 3 動物と達成された結果は、以前に公開された作品23 (図 1) と一致しました。グループごとのペット数を増やす可能性がありますが明らかにしたことチャレンジ グループと制御 (例えば、 ODN 1826 と試) の統計的に有意な違いに留意。
前進、このプロトコルのみ種緑化チャレンジ後時計遺伝子発現に対する急性の影響に対処しながら、それはさらに調査のため原則の証拠を提供できます。TLR - 種緑化に関する分子メカニズムを解読するモデルとしてこのアッセイを使用できるなど、相互作用と分子時計に影響します。分子時計 (すなわち、さまざまな時間帯の投稿チャレンジ後の式を評価する) の経時実験によって決定できる種緑化の挑戦後に回復するためにかかる時間の長さを決定するのにも使えます。前述のように、その後の実験は特定の生細胞集団の種緑化チャレンジを調べる実行でした。いくつかの病原体は、感染時に複数の Tlr を刺激する、ので、このプロトコルを使用して、時計遺伝子発現の相乗効果がある複数 PAMPs と挑戦を調査する興味深いでしょう。
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Disclosures
著者は、何を開示します。
Acknowledgments
この作業によって支えられた教員研究費ハートフォード大学の教養と科学学部長のオフィスから。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Frosted slides | Fisher | 12-550-343 | |
| Cell strainers | Fisher | 22363547 | |
| Lipopolysaccharide | InvivoGen | ltrl-eklps | |
| ODN1826 | InvivoGen | Tlrl-1826-1 | |
| HKLM | InvivoGen | Tlrl-hklm | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| PBS | Gibco | 20012-043 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 or 74106 | |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| 6-well cell culture plate | Denville | T1006 | |
| 50 mL tubes | Corning | 352070 | |
| 15 mL tubes | Corning | 352097 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher | 4368814 | |
| TaqMan Gene Expression Assays b-actin | ThermoFisher | Mm00607939_s1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Per2 | ThermoFisher | Mm00478113_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Rev-erba | ThermoFisher | Mm00520708_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Bmal1 | ThermoFisher | Mm00500226_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Dbp | ThermoFisher | Mm00497539_m1 | |
| qPCR machine StepOnePlus | ThermoFisher | ||
| TaqMan Gene Expression Master Mix | ThermoFisher | 4369016 | |
| MicroAmp Fast 96-well reaction plate (0.1 mL) | ThermoFisher | 4346907 | |
| Statistical Analysis Software | Prism 7.0a |
References
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