Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Brug af musen Splenocytes at vurdere patogen-associeret molekylære mønster indflydelse på ur genekspression

Published: July 24, 2018 doi: 10.3791/58022

Summary

Denne protokol beskriver en teknik, ved hjælp af musen splenocytes for at opdage patogen-associeret molekylære mønstre, der ændrer molekylære ur genekspression.

Abstract

Fra adfærd til Gen-ekspression regulere døgnrytme næsten alle aspekter af fysiologi. Vi præsenterer her, en metode til at udfordre mus splenocytes med patogen-associeret molekylære mønstre (PAMPs) LPS (LPS), ODN1826 og varme-dræbte Listeria monocytogenes og undersøge deres indvirkning på den molekylære døgnrytmen ur. Tidligere har studier fokuseret på behandlingen af LP'ER indflydelse på den molekylære ur ved hjælp af en række i vivo og ex vivo tilgange fra et sortiment af modeller (f.eks. mus, rotte og menneskelige). Denne protokol beskriver isolation og udfordring af splenocytes, samt metoden til at vurdere ur gen udtryk efter udfordring via kvantitativ PCR. Denne fremgangsmåde kan bruges til at vurdere ikke kun indflydelse af mikrobielle komponenter på den molekylære ur men andre molekyler, der kan ændre udtrykket af uret. Denne tilgang kunne udnyttes til at drille hinanden den molekylære mekanisme af hvordan PAMP-Toll-lignende receptor interaktion påvirker ur udtryk.

Introduction

Master uret i pattedyr, der orchestrates 24 h svingninger for næsten alle aspekter af fysiologi og adfærd, er beliggende i suprachiasmatic kernen (SCN) i hypothalamus1,2. Ud over regulering af biologiske processer på et kropsligt niveau, synkroniserer master uret også perifere cellulære ure i hele kroppen3,4,5. Mens molekylære ur maskinen består af mindst tre sikringsanlæg transcriptional-translationel feedback loops, består kernen af periode (Per1-3), Cryptochrome (Cry1-2), Bmal1, og ur gener6,7. Udover opretholde den nøjagtige timing af core molekylære ur, nogle accessoriske ur genprodukter (fx, Rev-erbα og Dbp) også regulere udtryk for ikke-ur gener, dvs, uret kontrolleret gener (samlekortspil)6 , 7.

Funktionelle molekylære ure er blevet beskrevet i forskellige immun væv (f.eks, milt og lymfeknuder)8 og celler (f.eks. B celler, makrofager, dendritiske celler)8,9. Disse celler opdage og reagere på patogen-associeret molekylære mønstre (PAMPs), bevarede mikrobielle komponenter via medfødte immun anerkendelse receptorer som Toll-lignende receptorer (TLRs)10. Til dato, er blevet beskrevet 13 funktionelle TLRs, som anerkender mikrobielle bestanddele som bakterielle cellevæg komponenter, flagellaternes protein og mikrobielle nukleinsyrer10. PAMP, LPS (LPS), en cellevæg komponent af gram-negative bakterier genkendes af TLR4, har vist sig at ændre døgnrytmen på både kropsligt og molekylært niveau. For eksempel, i vivo udfordring af LPS induceret fotiske-lignende fase forsinkelser som målt ved aktivitet i mus11 og ført til reducerede ur genekspression i SCN og leveren som fastlagt i situ hybridisering og kvantitativ PCR, henholdsvis i rotter12. Efter en i vivo udfordring med LP'ER viste analyse af humant perifert blod leukocytter13 og subkutane fedtvæv14 ændrede udtryk for flere ur gener som målt via qPCR. Endelig, ex vivo LP'ER udfordringer af menneskelige makrofager og mus peritoneal makrofager, også førte til ændret ur udtryk som målt ved qPCR14.

Her, vi beskriver en protokol for at vurdere indflydelsen af PAMPs LP'ER, ODN1826 (syntetisk oligonukleotider indeholdende unmethylated CpG motiver), og varme-dræbte Listeria monocytogenes (HKLM), anerkendt af TLR4, TLR9 og TLR2, henholdsvis på molekylære ur genekspression i mus splenocytes. Protokollen indeholder mus splenektomi, splenocyte isolation og udfordring, RNA udvinding, cDNA syntese og qPCR for at vurdere udtryk for flere ur gener. Denne protokol giver mulighed for rettidig erhvervelse af et stort antal af immunceller med meget lille dyr eller cellulære manipulation, som derefter kan udfordret ex vivo med forskellige PAMPs. Den molekylære ur har vist sig at modulere forskellige aspekter af immunresponset8,15,16, derfor, forstyrrelse af den molekylære ur højst sandsynligt ville forringe den ordentlig tidsafhængig variation af den immunrespons. Hertil kommer, da forstyrrelser af døgnrytmen kan føre til alvorlige patologier17,18,19,20, kan det være af interesse for forskere at udfordre splenocytes med en bred vifte af molekyler og vurdere deres indflydelse på uret.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

I løbet af undersøgelsen, dyrs pleje og behandling overholdt National Institutes of Health policy, blev i overensstemmelse med institutionelle retningslinjer, og blev godkendt af University i Hartford animalske institutionelle dyrs pleje og brug udvalget.

1. medrivning af dyr

Bemærk: 20 uger gamle mandlige B6129SF2/J mus er anvendt i undersøgelsen.

  1. Entrain mus til en 12 h lys (standard overhead hvidt lys) / 12 h mørke cyklus for 2 uger før eksperimentet.
    Bemærk: Her zeitgeber tid (ZT) 0 svarer til lys på og ZT12 til lys slukket, samtidig med at alle andre miljømæssige faktorer (dvs., mad, vand og stuetemperatur) konstant 21.

2. udarbejdelse af instrumenter, næringssubstrat og udfordring Medium

  1. Autoklave pincet og dissekere saks. Wrap par af matteret objektglas i alufolie og autoklave.
  2. Forbered dyrkningsmediet ved at tilføje føtal bovint serum (FBS) til RPMI 1640 til en endelig koncentration på 10%. Forberede 10 mL af udfordring medium i 50 mL rør ved at tilføje de følgende PAMPs næringssubstratet (RPMI med 10% FBS); LP'ER (5 µg/mL), ODN1826 (5 µg/mL), Varme-dræbte Listeria monocytogenes (108 HKLM/mL), eller en anden PAMP i dets foreslåede koncentration.
  3. Varm næringssubstratet og udfordring medium til 37 ° C i et vandbad, og holde ca. 70 mL sterilt fosfatbufferet saltopløsning (PBS, pH 7,2) ved stuetemperatur.
  4. Der tilsættes 10 mL af næringssubstratet ved hjælp af en 10 mL pipette og pipette støtte til en 50 mL tube og sted på is.
  5. Tilføje ca. 30 mL ethanol 70% til et 100 mL baegerglas og sted enderne af dissekere saks og pincet i bægerglasset at undgå mikrobiel kontaminering.
  6. Forbered lysisbuffer for RNA isolering ved at tilføje 10 µL β-Mercaptoethanol (under et stinkskab) til hver 1 mL Buffer RLT i en 50 mL tube. Gør kun de beløb, der bliver nødvendige (600 µL pr. prøve, som består af ca 1 x 106 celler).
    Bemærk: Buffer RLT er en komponent af RNA udvinding kit, der understøtter binding af RNA til silica membran.

3. Splenocyte Isolation og udfordring

  1. Aflive mus til en bestemt zeitgeber tid via narkose ved at holde dem i deres oprindelige bur og tilføje CO2 til buret med en væskehastighed på 3 L/min. Fortsæt levere CO2 for 1 min efter vejrtrækningen stopper.
  2. Bekræfte død via cervikal dislokation ved at placere tommel- og pegefinger på hver side af halsen i bunden af kraniet. Alternativt, presse en stang i bunden af kraniet mens hurtigt trække (ved hjælp af anden hånden) til bunden af halen eller hind lemmer til at forårsage adskillelse af halshvirvel fra kraniet22.
  3. Spray mus trunk med 70% ethanol og tørres med et stykke køkkenrulle. Placer musen på sin ryg og lidt skævt ind på sin højre side. Skåret væk pels, ved hjælp af dissekere saks, langs musens venstre side, om halvvejs mellem for- og bagben.
  4. Brug af pincet, grab bughinden og omhyggeligt gøre et snit for ikke at beskadige milten. Fjerne milten med pincet og anbringes i en steril 50 mL tube indeholdende ca. 10 mL kultur medier på is. Gentag for de resterende dyr.
    Bemærk: Milt er farven på en nyre bønne, og det er længere og fladere end nyrerne.
  5. Overføre én milt med 2 mL af næringssubstratet til en lille steril petriskål.
    1. Homogeniseres milten ved slibning det mellem den matterede del af to sterile matteret dias. Hvis det er muligt, holde spørgsmål og celler i medium i løbet af homogenisering processen.
    2. Endnu en gang grundigt homogeniseret, afpipetteres 2 mL af næringssubstratet indeholdende splenocytes gennem en 40 µm nylon celle si i en 50 mL tube.
    3. Gentag trinene ovenfor for de resterende milt ved hjælp af nye par matteret dias, 50 mL rør med substratet, og cellen sier.
  6. Tilføje 8 mL koldt næringssubstrat til hver af de 50 mL rør indeholdende splenocytes for en samlet maengde paa 10 mL/tube. Bestemme antallet af celler pr. milliliter ved hjælp af en hemocytometer.
  7. Tilføje ca 1 x 106 celler/brønd til 6-og kultur plader. Føje celler til antallet af brønde, der svarer til antallet af forskellige PAMPs bruges til eksperimentet og omfatte en kontrol godt. Tilføj 3 mL af næringssubstratet eller 3 mL af udfordring medium til de respektive brønde.
  8. Inkuber plader ved 37 ° C i 5% CO2 til 3 h.
  9. Skrabe celler fra bunden af den godt bruge en 1.000 µL afpipetteres tip knyttet til en P1000 mikropipette. Overføre det medium, der indeholder de celler ved hjælp af den samme 1,000 µL afpipetteres tip til en 15 mL tube.
  10. Sammenpresse cellerne via centrifugering ved 167 x g i 5 min ved stuetemperatur. Fjern supernatanten og vaske den celle pellet med 5 mL PBS.
  11. Sammenpresse cellerne en anden gang på 167 x g i 5 min og Fjern supernatanten tilføjes celle pellet 600 µL af lysisbuffer for at lyse celler. Fortsæt til RNA isolering.

4. RNA isolering og cDNA syntese

  1. Isolere RNA fra splenocytes ved hjælp af RNA udvinding kit ifølge producentens instruktioner og udføre 'valgfri' på kolonnen DNA fordøjelsen.
  2. Før cDNA syntese, bestemmelse af RNA koncentration ved hjælp af Spektrofotometer microvolume for at bekræfte, at koncentrationen inden for optimal RNA rækkevidde (op til 2 µg) af cDNA syntese kit.
  3. Synthesize cDNA for hver af prøverne ved hjælp af reverse transkription kit ifølge producentens anvisninger. Anvendes 10 µL af RNA for hver af prøverne i en 20 µL samlede reaktion volumen. Ved afslutningen af en reverse transkription (thermocycler køre) tilsættes 20 μL H2O til hver reaktion.
  4. Konstruere den standard svungne ved hjælp af en P10 eller P20 mikropipette til pool mRNA fra et par kontrolprøver (f.eks. 5 µL fra 2 prøver for i alt 10 µL) ind i et 0,5 mL rør til at forberede cDNA.
    1. Tilsæt 10 µL 2 x reverse transkriptase master mix.
    2. Ved afslutningen af en reverse transkription, tilføjes 10 µL af H2O reaktion røret, der vil tjene som udgangspunkt koncentrationen ("1") i fortyndingsrække til standardkurven.
    3. Udføre en 10-fold fortyndingsrække (1 til 10-4) ved at tilføje 45 µL vand ved hjælp af en P100 eller P200 mikropipette i fire 0,5 mL rør udpeget 10-1, 10-2, 10-3og 10-4.
      1. Tilsæt 5 µL af den begyndende koncentration "1" i den første tube (10-1) ved hjælp af en P20 micropipettor, mix af pipettering op og ned flere gange, derefter overføre 5 µL af 10-1 røret ind i røret udpeget 10-2 og mix.
      2. Overføre 5 µL ved hjælp af en P20 mikropipette fra 10-2 rør ind i røret, der er udpeget 10-3 og bland. Overføre 5 µL ved hjælp af en P20 micropipettor fra 10-3 røret ind i røret, der er udpeget 10-4 og bland.

5. kvantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)

  1. Bestemme relative kvantitering af mRNA niveauer af qPCR. Inden for den eksperimentelle sat op, skal du vælge "Kvantitering - relativ standardkurven" og "TaqMan" kemi. Ændring reaktion volumen til 10 µL. angive de relevante oplysninger i plade layout (f.eks., mål gen, standardkurven, reporter, osv.).
  2. Forberede reaktionen, så det indeholder 0,5 µL af primer/sonden assay, 5 µL af gen expression master mix, 2 µL af H2O og 2,5 µL cDNA (10-100 ng).
    1. Forbered en master mix ved at multiplicere hver af de foregående reagenser (undtagen cDNA) ved antallet af reaktioner, og sørg for at medtage dem fra standardkurven, negative kontroller, udfører hver reaktion i to eksemplarer, og 2 ekstra reaktioner, der vil tegne pipettering variation.
    2. Med pipette overfoeres 7.5 µL af den forberedte master mix i forudbestemte brønde i en 96-brønd reaktion plade med en mikropipette eller en multikanalpipette. Afpipetteres 2,5 µL cDNA ind i de passende godt for ubekendte og standarder, og 2,5 µL af H2O i negative kontrolhullerne.
    3. Omfatte primer/sonden assays til forskellige molekylære ur gener, og også omfatte en analyse for en endogen kontrol (f.eks. β-actin).
  3. Bestemmelse af relativ udtryk værdier, beregnes den gennemsnitlige relative mængde for hver replikeres, så for hver prøve, opdele gennemsnitlige relative antallet for mål-gen af den gennemsnitlige relative mængde for β-actin.

6. den statistiske analyse

  1. Ved hjælp af statistisk analyse software, angive data i programmet under indstillingen kolonne statistik. Vælg en en-vejs ANOVA med den Dunnett post hoc test til at vurdere forskelle mellem middelværdier af ur genekspression efter PAMP udfordring versus kontrol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mus blev ofret på ZT13, splenocytes blev isoleret og udfordret ex vivo med PAMPs LP'ER, ODN1826 eller HKLM. Efter 3 h, RNA blev isoleret og qPCR blev brugt til at vurdere relative udtryk niveauer af de molekylære ur gener ur, Per2, Dbp, og Rev-erbα i forhold til uantastet kontrol celler. Efter PAMP udfordring var ur udtryk niveauer ikke væsentligt anderledes end udtryk i kontrol celler (fig. 1A). Per2 udtryk niveauer var markant forhøjet i celler udfordret med LPS og ODN1826 i forhold til uantastet kontrolelementer (figur 1B). LP'ER var den eneste PAMP at ændre Rev-erbα udtryk, som mRNA niveau var betydeligt lavere end i den ubestridte kontrol (figur 1C). Endelig blev betydeligt lavere mRNA niveauer observeret for Dbp efter udfordring med hver af PAMPs sammenlignet med kontrol (fig. 1D). Overensstemmelse med hvad har tidligere vist, ud af alle ur forbundet gener undersøges, Dbp udtryk har tendens til at blive hårdest ramt af PAMP udfordring23.

Figure 1
Figur 1 : Ændret ur genekspression i mus splenocytes efter ex vivo PAMP udfordring. Splenocytes blev isoleret på ZT13 og udfordret med LP'ER, ODN1826 eller HKLM. Relative ur mRNA niveau (normaliseret til β-actin) blev bestemt af qPCR 3 h efter udfordring. Hvert datapunkt repræsenterer udtryk niveau 1 dyr. Eksperimentelle betyder + SEM er givet. p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. De angivne udfordringer var signifikant forskellig fra kontrollen (uantastet celler) som en-vejs ANOVA med den Dunnett post hoc test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Inden for denne protokol, kan Spektrofotometer microvolume bruges til at kvantificere og vurdere renhedsgraden af RNA anvendes ved fastsættelsen af genekspression. Nukleinsyrer absorberer UV-lys på 260 nm, proteiner typisk absorbere lys på 280 nm, mens andre potentielle forurenende stoffer anvendes under ekstraktionsprocedure RNA (fx fenol) er påviselige på 230 nm. Derfor, ved at vurdere absorbans (A) ratio på 260/280 nm (RNA til protein) og 260/230 nm (RNA til ikke-proteinholdige kontaminanter) kvaliteten af RNA kan vurderes. Høj kvalitet RNA har en A260/280 forholdet mellem 1,8 – 2,1, som lavere nøgletal viser protein forurening. En ren RNA prøven vil have en A260/230 forholdet mellem 2.0.

Ved fastsættelsen af den relative udtryk for et mål gen (dvs., Per2, ur, Rev-erbα, og Dbp), en endogen kontrol gen (et gen i som udtryk niveauer ikke afviger mellem prøver) skal også være valgt. Relative udtryk af target-genet er derefter normaliseret til ekspression af endogen kontrol-genet. Forskelle i råvare (antal splenocytes), variation i reverse transkriptase effektivitet, varierende priser af RNA nedbrydning, osv., vil blive rettet til af endogen kontrol gen (β-actin i denne protokol). Det er dog klogt at kontrollere behandlingen undersøges ikke ændrer udtryk for endogen kontrol-genet. Dette kan opnås ved at vurdere β-actin niveauer fra flere replikater af et lige antal celler (behandling vs. ikke-behandling). I teorien, bør deres β-actin niveauer være identiske. En anden tilgang til at vogte endogen kontrol variation ville være at bruge et panel af endogene kontrolelementer (f.eks. β-actin, Gapdh, og 18S rRNA gen).

Når du undersøger PAMPs indvirkning på den molekylære ur, skal tid af dagen, når musene er euthanized og splenocytes er efterfølgende udfordret tages i betragtning. TLR udtryk og lydhørhed har tidligere vist at demonstrere gang-i-dag afhængige variation8,15, derfor en tid af dagen, når TLR lydhørhed er på sit højdepunkt, kunne resultere i en større indflydelse på den ur. Desuden udtryk for molekylære ur gener vil også svinge hele dagen i splenocytes, en reduktion af ur genekspression på grund af PAMP udfordring vil derfor være mest betydningsfulde hvis undersøgt i løbet af peak udtryk9. Da Dbp og Rev-erbα har vist sig at påvise betydelige udtryk bjergtoppe i splenocytes og milt immunceller omkring lys-mørke interphase 8,9,23, 24 (ZT12), i den aktuelle metode, celler blev isoleret og udfordret på ZT13 for at have en større chance for at opdage en reduktion i disse gener. Omvendt, en PAMP, der kunne øge ur udtryk, sandsynligvis ville blive overholdt hvis man ser på et tidspunkt af dagen, hvor uret udtryk er på sit laveste.

Da mus er natdyr, er deres hvilefasen i den lyse periode, hvilket svarer til menneskelig aktivitet. Derfor ideelt, vil mus være anbragt i et rum med minimal trafik og en, der indeholder en hvid støj maskine for at reducere dagtimerne forstyrrelser, da dette kan afbryde døgnrytmen af mus. Bur ændringer bør desuden gøres godt inden datoen, eksperiment. Enhver form for arbejde i den animalske værelse (herunder eutanasi af dyr) mørk periode, bør foretages under rødt lys for at undgå at forstyrre rytmer af mus.

Døgnets rytmer er udsat for miljømæssige stimuli (fx lys eller fødevarer), som kaldes zeitgebers. I tilfælde af en 12 h lys/12 h mørke cyklus, zeitgeber (dvs. lys), nulstilles uret til en 24-timers periode. Mens de fleste temperaturprofil rytmer er døgnrytmen (dvs. daglige rytmer, der forekomme i fravær af en ekstern cue), de er ikke sandt døgnrytmen, indtil de har vist sig at svinge med en omtrentlig 24 h periode under konstant miljøforhold . Derfor, denne procedure kan udføres ved hjælp af mus konstant betingelser, hvilket ville medføre Training mus til lys-mørke cyklus, som beskrevet ovenfor, men derefter holder dyrene i konstant mørke i 3 dage før prøvetagning. Denne type af eksperimentet er nævnt som en mørk-mørk (DD) eksperimentere og tidspunkt for prøvetagning vil blive omtalt som CT (døgnrytmen tid), ikke ZT.

Mens denne metode kan identificere PAMPs, der ændrer ur genekspression inden for splenocytes, det ikke tage i betragtning hvordan disse PAMPs påvirke master ur eller perifere ure i hele kroppen. Da milten består af en heterogen population af celler, kunne individuelle PAMPs påvirke hver celletype forskelligt. For eksempel, varierer Tlr9 udtryk rytmer i mus milten mellem splenocytes, makrofager, B-celler og DCs15. Derudover Tlr1, Tlr3, Tlr4, Tlr6, Tlr7,og Tlr8 vises betydelig daglige svingninger i befolkningens vedhængende splenocyte men kun Tlr2 og Tlr6 oplever dagligt svingninger i beriget milt makrofager24. Derfor, for at undersøge resultatet af en udfordring på enkelte celletyper, celler kan isoleres via magnetiske celle sortering, som tidligere beskrevet9,15 , og derefter efterfølgende udfordret. Derudover svinger milt cellen befolkningen over den daglige cyklus, som kunne også spille en rolle i følsomhed til en bestemt PAMP og efterfølgende indvirkning på klokken8.

Denne metode giver mulighed for dyrkning af et stort antal af immunceller, der består overvejende af B-celler (~ 58%), T-celler (~ 21%), dendritiske celler (~ 5%) og makrofager (~ 4%)25. Det store antal celler giver mulighed for at udfordre splenocytes med en række PAMPs i et enkelt eksperiment. Proceduren splenocyte isolation er meget nem for at udføre, kan være afsluttet inden for få minutter (afhængig af antallet af dyr), og med minimal animalsk eller cellulære manipulation, som er afgørende, når den undersøger den molekylære ur fordi som nævnt ovenfor, disse handlinger kan forstyrre timingen af ur samt ur-kontrollerede gener. Resultaterne for denne procedure var højt reproducerbar, som betydning mellem udfordret og uantastet celler blev opnået med bare tre dyr og resultaterne var i overensstemmelse med tidligere offentliggjorte arbejde23 (figur 1). Det skal bemærkes, at øge antallet af dyr pr. gruppe kunne have afsløret statistisk signifikante forskelle mellem en udfordring gruppe og kontrol (fx ODN 1826 og Rev-erbα).

Går fremad, mens denne protokol kun omhandler akutte virkninger på ur genekspression efter PAMP udfordring, kunne det give bevis for princippet om yderligere undersøgelse. For eksempel dette assay kan anvendes som en model til at dechifrere de molekylære mekanismer vedrørende TLR - PAMP interaktion og hvordan det påvirker den molekylære ur. Det kunne også bruges til at bestemme længden af tid, det tager for den molekylære ur til at gendanne efter en PAMP udfordring, hvilket kan fastslås ved at foretage et tidsforløb eksperiment (dvs. vurdere udtryk efter varierende gange post udfordring). Som nævnt ovenfor, kunne efterfølgende forsøg udføres for at undersøge PAMP udfordring på specifikke splenocyte cellepopulationer. Da flere patogener stimulere flere TLRs efter infektion, ville det være interessant at bruge denne protokol til at undersøge hvis udfordrende med flere PAMPs har en synergistisk effekt på clock genekspression.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatteren har intet at videregive.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af fakultetets forskning tilskud fra College of Arts og videnskaber Deans kontor på University Hartford.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Frosted slides Fisher 12-550-343
Cell strainers Fisher 22363547
Lipopolysaccharide  InvivoGen ltrl-eklps
ODN1826 InvivoGen Tlrl-1826-1
HKLM InvivoGen Tlrl-hklm
RPMI 1640 Gibco 11875-093
PBS Gibco 20012-043
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 or 74106
RNase-Free DNase Set Qiagen 79254
6-well cell culture plate Denville T1006
50 mL tubes Corning 352070
15 mL tubes Corning 352097
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit ThermoFisher 4368814
TaqMan Gene Expression Assays b-actin ThermoFisher Mm00607939_s1
TaqMan Gene Expression Assays Per2 ThermoFisher Mm00478113_m1
TaqMan Gene Expression Assays Rev-erba ThermoFisher Mm00520708_m1
TaqMan Gene Expression Assays Bmal1 ThermoFisher Mm00500226_m1
TaqMan Gene Expression Assays Dbp ThermoFisher Mm00497539_m1
qPCR machine StepOnePlus ThermoFisher
TaqMan Gene Expression Master Mix ThermoFisher 4369016
MicroAmp Fast 96-well reaction plate (0.1 mL) ThermoFisher 4346907
Statistical Analysis Software Prism 7.0a

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bell-Pedersen, D., et al. Circadian rhythms from multiple oscillators: lessons from diverse organisms. Nat. Rev. Genet. 6, 544-556 (2005).
  2. Mohawk, J. A., Green, C. B., Takahashi, J. S. Central and Peripheral Circadian Clocks in Mammals. Annu. Rev. Neurosci. 35, 445-462 (2012).
  3. Balsalobre, A., Damiola, F., Schibler, U. A serum shock induces circadian gene expression in mammalian tissue culture cells. Cell. 93, 929-937 (1998).
  4. Yoo, S. -H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 5339-5346 (2004).
  5. Yamazaki, S. Resetting Central and Peripheral Circadian Oscillators in Transgenic Rats. Science. 288, 682-685 (2000).
  6. Lowrey, P. L., Takahashi, J. S. Genetics of circadian rhythms in mammalian model organisms. Adv. Genet. 74, 175-230 (2011).
  7. Curtis, A. M., Bellet, M. M., Sassone-Corsi, P., O'Neill, L. A. J. Circadian Clock Proteins and Immunity. Immunity. 40, 178-186 (2014).
  8. Keller, M., et al. A circadian clock in macrophages controls inflammatory immune responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21407-21412 (2009).
  9. Silver, A. C., Arjona, A., Hughes, M. E., Nitabach, M. N., Fikrig, E. Circadian expression of clock genes in mouse macrophages, dendritic cells, and B cells. Brain. Behav. Immun. 26, 407-413 (2012).
  10. Kawai, T., Akira, S. The role of pattern-recognition receptors in innate immunity update on Toll-like receptors. Nat. Publ. Gr. 11, 373-384 (2010).
  11. Marpegán, L., Bekinschtein, T. A., Costas, M. A., Golombek, D. A. Circadian responses to endotoxin treatment in mice. J. Neuroimmunol. 160, 102-109 (2005).
  12. Okada, K., et al. Injection of LPS Causes Transient Suppression of Biological Clock Genes in Rats. J. Surg. Res. 145, 5-12 (2008).
  13. Haimovich, B., et al. In vivo endotoxin synchronizes and suppresses clock gene expression in human peripheral blood leukocytes. Crit. Care Med. 38, 751-758 (2010).
  14. Curtis, A. M., et al. Circadian control of innate immunity in macrophages by miR-155 targeting Bmal1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 7231-7236 (2015).
  15. Silver, A. C., Arjona, A., Walker, W. E., Fikrig, E. The Circadian Clock Controls Toll-like Receptor 9-Mediated Innate and Adaptive Immunity. Immunity. , (2012).
  16. Gibbs, J. E., et al. The nuclear receptor REV-ERB α mediates circadian regulation of innate immunity through selective regulation of inflammatory cytokines. PNAS. 109, 582-587 (2012).
  17. Zee, P. C., Attarian, H., Videnovic, A. Circadian rhythm abnormalities. Contin. Lifelong Learn. Neurol. 19, 132-147 (2013).
  18. Bovbjerg, D. H. Circadian disruption and cancer: sleep and immune regulation. Brain. Behav. Immun. 17, 48-50 (2003).
  19. Fu, L., Lee, C. C. The circadian clock: pacemaker and tumour suppressor. Nat. Rev. Cancer. 3, 350-361 (2003).
  20. Germain, A., Kupfer, D. J. CIRCADIAN RHYTHM DISTURBANCES IN DEPRESSION. Hum. Psychopharmacol. 23, 571-585 (2008).
  21. Basic Mouse Care and Maintenance. JoVE. , Cambridge, MA. JoVE Science Education Database (2018).
  22. Leary, S., et al. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals : 2013 Edition. AVMA. , (2013).
  23. Silver, A. C. Pathogen-associated molecular patterns alter molecular clock gene expression in mouse splenocytes. PLoS One. , 12-15 (2017).
  24. Silver, A. C., et al. Daily oscillations in expression and responsiveness of Toll-like receptors in splenic immune cells. Heliyon. , 00579 (2018).
  25. Flow-cytometric Anal. 11 strains mice. MPDJaxpheno6. Mouse Phenome Database web Resour. (RRIDSCR_003212). Jackson Lab. , Bar Harb. Maine USA. Available from: https//phenome.jax.org (2018).

Tags

Genetik sag 137 molekylære ur døgnrytmen LPS ODN1826 Varme-dræbte Listeria monocytogenes Splenocytes Toll-lignende receptorer mønstergenkendelse receptorer patogen-associeret molekylære mønstre Immunologi
Brug af musen Splenocytes at vurdere patogen-associeret molekylære mønster indflydelse på ur genekspression
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Silver, A. C. The Use of MouseMore

Silver, A. C. The Use of Mouse Splenocytes to Assess Pathogen-associated Molecular Pattern Influence on Clock Gene Expression. J. Vis. Exp. (137), e58022, doi:10.3791/58022 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter