Summary
Denne protokollen beskriver en teknikk som bruker musen splenocytes for å oppdage patogen-forbundet molekylær mønster som endrer molekylær klokke genuttrykk.
Abstract
Fra virkemåter genuttrykk regulere biologiske rytmer nesten alle aspekter av fysiologi. Her presenterer vi en metodikk for å utfordre musen splenocytes med patogen-forbundet molekylær mønster (PAMPs) lipopolysakkarid (LPS), ODN1826 og varme-drepte Listeria monocytogenes og undersøke deres effekt på den molekylære circadian klokke. Tidligere har studier fokusert på å undersøke påvirkning av LPS på molekylær klokke med en rekke i vivo og ex vivo tilnærminger fra et utvalg av modeller (f.eks mus, rotte og menneskelige). Denne protokollen beskriver isolasjon og utfordringen med splenocytes, samt metodikken å vurdere klokke genet uttrykk etter utfordring via kvantitative PCR. Denne fremgangsmåten kan brukes til å vurdere ikke bare påvirker mikrobiell komponenter i molekylær klokke men andre molekyler som kan endre uttrykk for klokken. Denne tilnærmingen kan utnyttes for å erte hverandre molekylær mekanisme hvor PAMP-Toll-like reseptor interaksjon påvirker klokke uttrykk.
Introduction
Master klokken i pattedyr, som orkestrerer 24 h svingninger for nesten alle aspekter av fysiologi og atferd, ligger suprachiasmatic kjernen (SCN) i hypothalamus1,2. I tillegg til å regulere biologiske prosesser på organismebiologi nivå, synkroniserer master klokken også eksterne mobilnettet klokker hele kroppen3,4,5. Mens molekylær klokke maskiner består av minst tre sammenflettede transcriptional-translasjonsforskning tilbakemeldingssløyfer, består kjernen av perioden (Per1-3), Cryptochrome (Cry1-2), Bmal1, og klokke gener6,7. I tillegg til å opprettholde nøyaktige tidspunktet for kjernen molekylær klokke, noen hjelpeutstyr klokke genet produkter (f.eks Rev-erbα og Dbp) også regulere uttrykk for ikke-klokke genene, dvs. klokke kontrollert gener (CCGs)6 , 7.
Funksjonell molekylær klokker er beskrevet i ulike immun vev (f.eks milten og lymfeknutene)8 og celler (f.eks B celler, dendrittiske celler, makrofager)8,9. Disse cellene gjenkjenner og svare på patogen-forbundet molekylær mønster (PAMPs), konservert mikrobiell komponenter, via medfødte immunsystemet anerkjennelse reseptorer som Toll-like reseptorer (TLRs)10. Hittil har er 13 funksjonelle TLRs beskrevet, som gjenkjenner mikrobiell bestanddeler som bakteriell cellevegg komponenter, flagellar protein og mikrobiell nukleinsyrer10. PAMP, lipopolysakkarid (LPS), en cellevegg komponent av gram-negative bakterier anerkjent av TLR4, har vist seg å endre døgnrytme på både organismebiologi og molekylære. For eksempel i vivo utfordringen med LPS indusert photic-lignende fase forsinkelser målt ved aktivitet i mus11 og førte til redusert klokke genuttrykk i SCN og lever som i situ hybridisering og kvantitative PCR, i rotter12. Etter en i vivo utfordring med LPS avdekket analyse av menneskelig perifert blod leukocytter13 og underhud fettvev14 endret uttrykk for flere klokke gener målt via qPCR. Til slutt, ex vivo LPS utfordringer av menneskelig makrofager og mus peritoneal makrofager, førte også til forandret klokken uttrykk målt ved qPCR14.
Her beskriver vi en protokoll for å vurdere påvirkning av PAMPs LPS, ODN1826 (syntetisk oligonucleotides som inneholder unmethylated CpG motiver), og varme-drepte Listeria monocytogenes (HKLM), anerkjent av TLR4, TLR9 og TLR2, henholdsvis på molekylær klokke byggkorn under musen splenocytes. Protokollen inneholder musen splenectomy splenocyte isolasjon og utfordring, RNA utvinning, cDNA syntese og qPCR å vurdere uttrykk for flere klokke gener. Denne protokollen gir betimelig oppkjøpet av et stort antall immunceller med lite dyr eller cellular manipulasjon, som deretter kan utfordret ex vivo med ulike PAMPs. Molekylær klokken har blitt vist å modulere ulike aspekter av immunrespons8,15,16, derfor forstyrrelse av molekylære klokken ville mest sannsynlig svekke riktig tidsavhengige varianten av den immunrespons. I tillegg siden forstyrrelser av døgnrytme kan føre til alvorlige patologi17,18,19,20, kan det være av interesse for forskere å utfordre splenocytes med en rekke molekyler og vurdere deres innflytelse på klokken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Under studien, dyr omsorg og behandling overholdt National Institutes of Health policy ble institusjonelle retningslinjer og ble godkjent av University i Hartford Animal institusjonelle dyr omsorg og bruk komiteen.
1. entrainment dyr
Merk: Tjue uke gamle mannlige B6129SF2/J mus brukes i studien.
- Entrain mus til en 12 h lys (standard overhead hvitt lys) / 12 h mørke syklus for 2 uker før eksperimentet.
Merk: Her zeitgeber tid (ZT) 0 tilsvarer lysene på og ZT12 lys, mens alle andre miljømessige faktorer (dvs. mat, vann og romtemperatur) konstant 21.
2. forberedelse av instrumenter og kultur Medium utfordring Medium
- Autoclave tang og dissecting saks. Pakk par frostet objektglass i aluminiumsfolie og autoclave.
- Forberede kultur medium ved å legge til fosterets bovin serum (FBS) å RPMI 1640 til en siste konsentrasjon på 10%. Forberede 10 mL av utfordringen medium i 50 mL rør ved å legge til følgende PAMPs til kultur medium (RPMI med 10% FBS); LPS (5 µg/mL), ODN1826 (5 µg/mL), varme-drepte Listeria monocytogenes (108 HKLM/mL), eller en annen PAMP i sin foreslåtte konsentrasjon.
- Varme kultur medium og utfordring middels til 37 ° C i et vannbad, og holde ca 70 mL steril fosfat bufret saltvann (PBS, pH 7.2) i romtemperatur.
- Legge til 10 mL av kultur medium med en 10 mL pipette og pipette bistand til en 50 mL og plasser på isen.
- Legge til ca 30 mL med 70% etanol en 100 mL kanne og sted endene av dissekere saks og tang i begeret å unngå mikrobiell forurensning.
- Forberede lyseringsbuffer RNA isolering ved å legge 10 µL β-Mercaptoethanol (under avtrekksvifte) å hver 1 mL av Buffer RLT i en 50 mL tube. Gjør bare beløpet som vil være nødvendig (600 µL per prøve, som består av ca 1 x 106 celler).
Merk: Buffer RLT er en komponent av RNA utvinning kit som støtter binding av RNA til silica membranen.
3. Splenocyte isolasjon og utfordring
- Euthanize mus samtidig bestemt zeitgeber via narkose ved å holde dem i deres opprinnelige bur og legge til CO2 å byrået på en strømningshastighet på 3 L/min. fortsette å forsyne CO2 for 1 min etter puste stopper.
- Bekreft livsfarlig cervical forvridning ved å plassere tommelen og pekefingeren på hver side av halsen på bunnen av skallen. Eventuelt trykke en stang på bunnen av skallen mens raskt trekke (bruker derimot) til bunnen av halen eller bakbeina til separasjon av cervical ryggsøylen fra skallen22.
- Spray musen bagasjerommet med 70% etanol og tørk med papirhåndkle. Plass musen på baksiden og litt skråstilt på høyre side. Klippe bort pelsen, bruker dissekere saks, musen er venstre, om halvveis mellom for- og baksiden ben.
- Ved hjelp av pinsett, grip peritoneum og nøye gjøre et snitt for ikke å skade milten. Fjerne milt med tang og plasser i en steril 50 mL tube med ca 10 mL av kultur medier på is. Gjenta for gjenværende dyrene.
Merk: Milten er fargen på en nyre bønne, og det er lengre og flatere enn nyrene. -
Overføre en milt med 2 mL kultur medium til en liten sterilt Petriskål.
- Homogenize milten av sliping det mellom frostet delen av to sterile frostet lysbilder. Hvis mulig, holde problemet og celler i medium under homogenisering prosessen.
- Når grundig homogenisert, Pipetter den 2 mL kultur medium som inneholder splenocytes gjennom en 40 µm nylon celle sil i en 50 mL tube.
- Gjenta trinnene ovenfor for de gjenværende spleens med nye par frostet lysbilder, 50 mL rør med kultur medium, og cellen siler.
- Legge til 8 mL kaldt kultur medium til hver av 50 mL rør som inneholder splenocytes for et totalt volum på 10 mL/t. Bestemme antall celler per milliliter ved hjelp av en hemocytometer.
- Legge til ca 1 x 106 celler/godt til 6-brønnen plater. Legge til celler i antall brønner som tilsvarer antall forskjellige PAMPs brukes for eksperimentet og inkluderer en kontroll godt. Legge til 3 mL av kultur medium eller 3 mL utfordring medium i de respektive brønnene.
- Inkuber platene på 37 ° C i 5% CO2 for 3t.
- Skrape cellene fra bunnen av det godt med en 1000 µL Pipetter tips knyttet til P1000 brønnene. Overføre mediet som inneholder celler med samme 1000 µL Pipetter spissen slik 15 mL.
- Pellets celler via sentrifugering 167 x g i 5 minutter ved romtemperatur. Fjerne nedbryting og vask celle pellets med 5 mL PBS.
- Pellets cellene en gang 167 x g for 5 min, fjerne nedbryting og legge 600 µL av lyseringsbuffer til celle pellet for å lyse cellene. Deretter Fortsett å RNA isolasjon.
4. RNA isolasjon og cDNA syntese
- Isolere RNA fra splenocytes ved hjelp av RNA utvinning kit i henhold til produsentens instruksjoner og utføre 'ekstra' på kolonner DNA fordøyelsen.
- Før cDNA syntese, Bestem RNA konsentrasjon bruker et microvolume spektrofotometer for å bekrefte at konsentrasjonen i det optimale RNA området (opptil 2 µg) av cDNA syntese kit.
- Syntetisere cDNA for hver av prøvene ved hjelp av omvendt transkripsjon kit i henhold til produsentens instruksjoner. Bruk 10 µL av for hvert av eksemplene i et 20 µL totale reaksjon volum. Ved ferdigstillelse av omvendt transkripsjon (thermocycler kjøre) legge 20 μL H2O til hver reaksjon.
- Konstruere den standard kurvet bruker P10 eller P20 brønnene for å samle mRNA fra noen kontroll prøver (f.eks 5 µL fra 2 prøver totalt 10 µL) i en 0,5 mL tube å forberede til cDNA.
- Legge til 10 µL 2 x revers transkriptase master mix.
- Omvendt transkripsjon er ferdig, legge til 10 µL av H2O reaksjon røret, som vil tjene som starter konsentrasjonen ("1") i fortynning serie for standardkurven.
- Utføre en 10 ganger fortynning serie (1 til 10-4) ved å legge til 45 µL av vann med P100 eller P200 brønnene i fire 0,5 mL rør utpekt 10-1, 10-2, 10-3og 10-4.
- Legge til 5 µL av Start konsentrasjonen "1" i første røret (10-1) bruker en P20 micropipettor, blandingen av pipettering opp og ned flere ganger, deretter overføre 5 µL fra 10-1 røret inn i røret utpekt 102 og blanding.
- Overføre 5 µL bruker P20 brønnene fra 10-2 røret inn i røret utpekt 10-3 og blande. Overføre 5 µL bruker en P20 micropipettor fra 10-3 røret inn i røret utpekt 10-4 og bland.
5. kvantitativ polymerasekjedereaksjons (qPCR)
- Bestemme relative kvantifisering av mRNA nivåer av qPCR. I eksperimentelle satt opp, kan du velge "Kvantifisering - Relative standardkurve" og "TaqMan" kjemi. Endre reaksjon volumet til 10 µL. Angi aktuelle opplysninger i oppsettet plate (f.eksmålet genet standardkurve, reporter, etc.).
- Forberede reaksjonen slik at den inneholder 0,5 µL av primer/sonde analysen, 5 µL av gene expression master mix, 2 µL av H2O og 2.5 µL av cDNA (10-100 ng).
- Forberede en master blanding ved å multiplisere hver av foregående reagenser (unntatt cDNA) på antall reaksjoner, husk å sette de fra standardkurven, negative kontroller, utføre hver reaksjon i duplikat, og 2 ekstra reaksjoner som utgjør for pipettering variasjon.
- Pipetter 7.5 µL av forberedt master mix i forhåndsbestemt brønner i en 96-brønns reaksjon plate med brønnene eller en flerkanals pipette. Pipetter 2,5 µL av cDNA inn i aktuelle brønnen for ukjente og standarder og 2,5 µL av H2O i negativ kontroll brønnene.
- Inkluderer primer/sonde analyser for ulike molekylær klokke gener og inkluderer også en analysen for en endogen kontroll (f.eks β-utgangen).
- For å bestemme relative uttrykk verdier, beregne mener relative antallet for hver replikere, så for hver prøve, dele mener relative antallet for målet genet av mener relative antallet for β-utgangen.
6. statistisk analyse
- Bruker statistisk analyse software, skrive inn data i programmet under alternativet kolonnen statistikk. Velg en enveis VARIANSANALYSE med Dunnett's post hoc test å vurdere forskjellene mellom mener verdier av klokken genuttrykk etter PAMP utfordring versus kontrollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mus ble ofret ved ZT13, splenocytes ble isolert og utfordret ex vivo PAMPs LPS, ODN1826 eller HKLM. Etter 3 h, RNA ble isolert og qPCR ble brukt til å vurdere relativ uttrykk nivåer av molekylær klokke genene klokke, Per2, Dbp, og Rev-erbα sammenlignet med uimotsagt kontroll celler. Etter PAMP utfordring var klokken uttrykk nivåer ikke vesentlig annerledes enn uttrykk i kontroll cellene (figur 1A). Per2 uttrykk nivåer var betydelig opphøyet i celler utfordret med plater og ODN1826 sammenlignet med uimotsagt kontroller (figur 1B). LPS var den eneste PAMP endre Rev-erbα uttrykk som mRNA nivåer var betydelig lavere enn i uimotsagt kontrollene (figur 1C). Til slutt, betydelig lavere mRNA nivåer ble observert for Dbp etter utfordring med hver av PAMPs sammenlignet med kontrollene (figur 1D). Konsistent med hva har tidligere vist, av alle klokke forbundet genene undersøkt, Dbp uttrykk tendens til å være mest berørt av PAMP utfordring23.
Figur 1 : Endret klokke byggkorn under musen splenocytes etter ex vivo PAMP utfordring. Splenocytes ble isolert på ZT13 og utfordret med LPS, ODN1826 eller HKLM. Relativ klokke mRNA nivåer (normalisert til β-utgangen) ble fastsatt av qPCR 3t etter utfordring. Hvert datapunkt representerer uttrykk nivå for 1 dyr. Eksperimentell betyr + SEM er gitt. p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. De angitte utfordringene var signifikant forskjellig fra kontrollen (uimotsagt celler) som veis VARIANSANALYSE med Dunnett's post hoc test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokollen, kan et microvolume spektrofotometer brukes å kvantifisere og vurdere renheten av RNA brukes ved genuttrykk. Nukleinsyrer absorbere UV-lys på 260 nm, proteiner vanligvis absorberer lys på 280 nm, mens andre mulige forurensninger under en RNA utvinning prosedyre (f.eks fenol) er synlig på 230 nm. Derfor ved å vurdere absorbansen (A) forholdet på 260/280 nm (RNA protein) og 260/230 nm (RNA til ikke-protein forurensninger) kvaliteten på RNA kan vurderes. Høy kvalitet RNA har en A260/280 forholdet mellom 1.8-2.1, som laveste angi protein forurensning. En ren RNA prøve vil ha en A260/230 forholdet mellom 2.0.
Ved beregning av relativ uttrykket med et mål (dvs. Per2, klokke, Rev-erbα, og Dbp), en endogen kontroll genet (et gen i som uttrykk nivåer ikke skiller mellom prøvene) må også være valgt. Relativ uttrykk for målet genet er deretter normalisert uttrykk av endogene kontroll genet. Forskjeller i utgangsmaterialet (antall splenocytes), variasjon i revers transkriptase effektivitet, varierende priser av RNA fornedrelse, etc., korrigeres av endogene kontroll genet (β-utgangen i denne protokollen). Imidlertid er det lurt å kontrollere at behandling undersøkt ikke endrer uttrykket av endogene kontroll genet. Dette kan gjøres ved å vurdere β-utgangen nivåer fra flere gjenskapninger av samme antall celler (behandling vs behandling). I teorien bør β-utgangen nivåene være identiske. En annen tilnærming for å beskytte mot endogene kontroll variant vil være å bruke et panel av endogene kontroller (f.eks β-utgangen, Gapdh, og 18S rRNA gen).
Når undersøke virkningen av PAMPs på molekylær klokke, må tid på dagen når mus er euthanized og splenocytes er senere utfordret tas i betraktning. TLR uttrykk og hastighet har tidligere vist å demonstrere tid-til-dag avhengige variant8,15, derfor et tidspunkt når TLR respons er på topp og kan resultere i større innflytelse på den klokke. Videre uttrykk for molekylær klokke gener vil også variere hele dagen i splenocytes, derfor en reduksjon av klokken genuttrykk på grunn av PAMP utfordringen være viktigste hvis undersøkt i løpet av topp uttrykk9. Siden Dbp og Rev-erbα har vist seg å demonstrere betydelige uttrykket topper i splenocytes og splenic immunceller rundt lys-mørk interphase 8,9,23, 24 (ZT12), i det aktuelle metoden, celler isolert og utfordret på ZT13 for å ha en større sjanse til å oppdage en reduksjon i disse genene. Derimot en PAMP som kan øke klokke uttrykk, vil mest sannsynlig være observert hvis ser på et tidspunkt når klokken uttrykk er lavest.
Siden mus er nattdyr dyr, er deres resten fase i lys perioden, som tilsvarer menneskelig aktivitet. Derfor ideelt vil mus bli plassert i et rom med minimal trafikk og som inneholder en hvit støy maskin for å redusere dagtid forstyrrelser som dette kan forstyrre den biologiske rytmer av mus. Videre bør bur endringer gjøres forveien eksperiment datoen. Arbeid i dyr rommet (inkludert euthanasia av dyrene) under mørke perioden bør utføres under rødt lys for å unngå forstyrre rytmene av musene.
Dagaktive rytmer er utsatt på miljømessige stimuli (f.eks lys eller mat), som kalles zeitgebers. I tilfelle av en 12 h lys/12 h mørke syklus, zeitgeber (dvs. lys) tilbakestiller klokken til en 24-timers periode. Mens de fleste dagaktive rytmer circadian (dvs. daglig rytmer som oppstår i fravær av en ekstern kø), de er ikke ekte døgnrytme før de har vist å svinge med en omtrentlig 24-timers periode under konstant miljøforhold . Derfor kan denne fremgangsmåten utføres ved hjelp av mus under konstant forhold som ville innebære entraining mus til lys og mørke syklus som beskrevet ovenfor, men deretter holde dyrene i konstant mørke for 3 dager før prøvetaking. Denne typen eksperiment er omtalt som en mørk-mørk (DD) eksperimenter og tidspunkt for prøvetaking vil bli referert til som CT (circadian tid), ikke ZT.
Mens denne metoden kan identifisere PAMPs endre klokken genuttrykk innen splenocytes, tar det ikke hensyn til hvordan disse PAMPs påvirke master klokken eller eksterne klokker i hele kroppen. Siden milten består av en heterogen befolkning av celler, kan personlige PAMPs påvirke hver celle type annerledes. For eksempel forskjellige Tlr9 uttrykk rytmer i musen milten splenocytes, makrofager, B-celler og DCs15. I tillegg, Tlr1, Tlr3, Tlr4, Tlr6, Tlr7,og Tlr8 vises betydelig daglige svingninger i en tilhenger splenocyte befolkning, men bare Tlr2 og Tlr6 erfaring daglig svingninger i beriket splenic makrofager24. Derfor, for å undersøke resultatet av en utfordring på individuelle celletyper, celler kan være isolert via magnetisk celle sortering, som beskrevet tidligere9,15 , og deretter senere utfordret. I tillegg varierer splenic celle befolkningen over daglige syklusen, som kan også spille en rolle i sensitivitet til en bestemt PAMP og påfølgende innvirkning på klokken8.
Denne metoden gir isolasjon av et stort antall immunceller som består hovedsakelig av B-celler (~ 58%), T-celler (~ 21%), dendrittiske celler (~ 5%) og makrofager (~ 4%)25. Det store antallet celler gir mulighet til å utfordre splenocytes med en rekke PAMPs i et enkelt eksperiment. Splenocyte isolasjon prosedyren er svært enkel for å utføre, kan være ferdig innen minutter (avhengig av antall dyr), og med minimal dyr eller cellular manipulasjon, som er essensielt når undersøke molekylær klokken fordi som nevnt ovenfor, disse handlingene kan forstyrre tidspunktet for klokken samt klokke-kontrollerte gener. Resultatene for denne prosedyren var svært reproduserbare, som betydning mellom utfordret og ubestridt celler ble oppnådd med bare tre dyr og resultatene var i samsvar med tidligere utgitte verk23 (figur 1). Det bør bemerkes at øke antall dyr per gruppe kan ha avslørt statistisk betydelige forskjeller mellom en utfordring gruppe og kontroll (f.eks ODN 1826 og Rev-erbα).
Flytte fremover, mens denne protokollen adresser bare de akutte virkningene på klokken genuttrykk etter PAMP utfordring, kan det gi bevis på prinsippet for videre etterforskning. For eksempel denne analysen kan brukes som en modell for å dechiffrere molekylære mekanismer om TLR - PAMP samhandling og hvordan det påvirker den molekylær klokken. Det kan også brukes til å fastslå hvor lang tid det tar for molekylær klokken å komme seg etter en PAMP utfordring, som kan bestemmes ved å gjennomføre en tid-retters eksperiment (dvs. vurdere uttrykk etter varierende ganger innlegget utfordring). Som nevnt ovenfor, kan senere eksperimenter utføres for å undersøke PAMP utfordring på bestemte splenocyte celle populasjoner. Siden flere patogener stimulere flere TLRs på infeksjon, ville det være interessant å bruk denne protokollen til å undersøke om utfordrende med flere PAMPs har en synergistisk effekt på klokken genuttrykk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av fakultet forskning tilskudd fra College av kunst og vitenskap Dekanus kontor på University i Hartford.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Frosted slides | Fisher | 12-550-343 | |
| Cell strainers | Fisher | 22363547 | |
| Lipopolysaccharide | InvivoGen | ltrl-eklps | |
| ODN1826 | InvivoGen | Tlrl-1826-1 | |
| HKLM | InvivoGen | Tlrl-hklm | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| PBS | Gibco | 20012-043 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 or 74106 | |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| 6-well cell culture plate | Denville | T1006 | |
| 50 mL tubes | Corning | 352070 | |
| 15 mL tubes | Corning | 352097 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher | 4368814 | |
| TaqMan Gene Expression Assays b-actin | ThermoFisher | Mm00607939_s1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Per2 | ThermoFisher | Mm00478113_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Rev-erba | ThermoFisher | Mm00520708_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Bmal1 | ThermoFisher | Mm00500226_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Dbp | ThermoFisher | Mm00497539_m1 | |
| qPCR machine StepOnePlus | ThermoFisher | ||
| TaqMan Gene Expression Master Mix | ThermoFisher | 4369016 | |
| MicroAmp Fast 96-well reaction plate (0.1 mL) | ThermoFisher | 4346907 | |
| Statistical Analysis Software | Prism 7.0a |
References
- Bell-Pedersen, D., et al. Circadian rhythms from multiple oscillators: lessons from diverse organisms. Nat. Rev. Genet. 6, 544-556 (2005).
- Mohawk, J. A., Green, C. B., Takahashi, J. S. Central and Peripheral Circadian Clocks in Mammals. Annu. Rev. Neurosci. 35, 445-462 (2012).
- Balsalobre, A., Damiola, F., Schibler, U. A serum shock induces circadian gene expression in mammalian tissue culture cells. Cell. 93, 929-937 (1998).
- Yoo, S. -H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 5339-5346 (2004).
- Yamazaki, S. Resetting Central and Peripheral Circadian Oscillators in Transgenic Rats. Science. 288, 682-685 (2000).
- Lowrey, P. L., Takahashi, J. S. Genetics of circadian rhythms in mammalian model organisms. Adv. Genet. 74, 175-230 (2011).
- Curtis, A. M., Bellet, M. M., Sassone-Corsi, P., O'Neill, L. A. J. Circadian Clock Proteins and Immunity. Immunity. 40, 178-186 (2014).
- Keller, M., et al. A circadian clock in macrophages controls inflammatory immune responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21407-21412 (2009).
- Silver, A. C., Arjona, A., Hughes, M. E., Nitabach, M. N., Fikrig, E. Circadian expression of clock genes in mouse macrophages, dendritic cells, and B cells. Brain. Behav. Immun. 26, 407-413 (2012).
- Kawai, T., Akira, S. The role of pattern-recognition receptors in innate immunity update on Toll-like receptors. Nat. Publ. Gr. 11, 373-384 (2010).
- Marpegán, L., Bekinschtein, T. A., Costas, M. A., Golombek, D. A. Circadian responses to endotoxin treatment in mice. J. Neuroimmunol. 160, 102-109 (2005).
- Okada, K., et al. Injection of LPS Causes Transient Suppression of Biological Clock Genes in Rats. J. Surg. Res. 145, 5-12 (2008).
- Haimovich, B., et al. In vivo endotoxin synchronizes and suppresses clock gene expression in human peripheral blood leukocytes. Crit. Care Med. 38, 751-758 (2010).
- Curtis, A. M., et al. Circadian control of innate immunity in macrophages by miR-155 targeting Bmal1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 7231-7236 (2015).
- Silver, A. C., Arjona, A., Walker, W. E., Fikrig, E. The Circadian Clock Controls Toll-like Receptor 9-Mediated Innate and Adaptive Immunity. Immunity. , (2012).
- Gibbs, J. E., et al. The nuclear receptor REV-ERB α mediates circadian regulation of innate immunity through selective regulation of inflammatory cytokines. PNAS. 109, 582-587 (2012).
- Zee, P. C., Attarian, H., Videnovic, A. Circadian rhythm abnormalities. Contin. Lifelong Learn. Neurol. 19, 132-147 (2013).
- Bovbjerg, D. H. Circadian disruption and cancer: sleep and immune regulation. Brain. Behav. Immun. 17, 48-50 (2003).
- Fu, L., Lee, C. C. The circadian clock: pacemaker and tumour suppressor. Nat. Rev. Cancer. 3, 350-361 (2003).
- Germain, A., Kupfer, D. J. CIRCADIAN RHYTHM DISTURBANCES IN DEPRESSION. Hum. Psychopharmacol. 23, 571-585 (2008).
- Basic Mouse Care and Maintenance. JoVE. , Cambridge, MA. JoVE Science Education Database (2018).
- Leary, S., et al. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals : 2013 Edition. AVMA. , (2013).
- Silver, A. C. Pathogen-associated molecular patterns alter molecular clock gene expression in mouse splenocytes. PLoS One. , 12-15 (2017).
- Silver, A. C., et al. Daily oscillations in expression and responsiveness of Toll-like receptors in splenic immune cells. Heliyon. , 00579 (2018).
- Flow-cytometric Anal. 11 strains mice. MPDJaxpheno6. Mouse Phenome Database web Resour. (RRIDSCR_003212). Jackson Lab. , Bar Harb. Maine USA. Available from: https//phenome.jax.org (2018).
