Summary
Ce protocole décrit une technique utilisant des splénocytes de souris pour découvrir les modèles moléculaires associés aux pathogènes qui modifient l’expression des gènes horloge moléculaire.
Abstract
De comportement à l’expression des gènes, les rythmes circadiens réglementer presque tous les aspects de la physiologie. Nous présentons ici une méthodologie pour contester les splénocytes de souris avec les profils moléculaires associés aux pathogènes (PAMPs) lipopolysaccharide (LPS), ODN1826 et tués par la chaleur de Listeria monocytogenes et examiner leur effet sur le moléculaire circadienne horloge. Auparavant, les études ont porté sur l’examen de l’influence des LPS sur l’horloge moléculaire en utilisant une variété d’approches in vivo et ex vivo parmi un assortiment de modèles (p. ex., souris, rat et homme). Ce protocole décrit l’isolement et le défi de splénocytes, ainsi que la méthodologie pour évaluer l’horloge gene expression défi post par PCR quantitative. Cette approche peut être utilisée pour évaluer non seulement l’influence des composantes microbiennes sur l’horloge moléculaire mais aussi bien des autres molécules qui peut-être modifier l’expression de l’horloge. Cette approche pourrait être utilisée pour distinguer le mécanisme moléculaire de l’interaction de PAMP-Toll-like receptor influence qu’expression de l’horloge.
Introduction
L’horloge maître chez les mammifères, qui orchestre les oscillations de 24h pour presque tous les aspects de la physiologie et le comportement, est situé dans le noyau suprachiasmatic (SCN) de l’hypothalamus1,2. En plus de réglementer les processus biologiques au niveau organismique, l’horloge maître synchronise également les périphériques horloges cellulaires dans tout le corps3,4,5. Alors que le mécanisme de l’horloge moléculaire est constitué d’au moins trois boucles de rétroaction transcriptionnel traductionnel imbriquées, le noyau est composé de la période (PAR1-3), les cryptochromes (Cry1-2), les Bmal1, et horloge gènes6,7. Outre le maintien du moment précis de l’horloge moléculaire de base, certains produits de gène horloge auxiliaires (p. ex., Rev-erbα et Dbp) aussi régulent l’expression de gènes non-horloge, horloge soit contrôlé gènes (NGCC)6 , 7.
Les horloges moléculaires fonctionnels ont été décrites dans les différents tissus immunitaires (p. ex., la rate et des ganglions lymphatiques)8 et cellules (par exemple, B cellules, cellules dendritiques, macrophages)8,9. Ces cellules détecter et réagir aux micro-organismes pathogènes associés profils moléculaires (PAMPs), composants microbiens conservées, via des récepteurs de reconnaissance immunitaire innée comme les récepteurs Toll-like (TLRs)10. A ce jour, 13 TLR fonctionnelles ont été décrits, qui reconnaissent les constituants microbiens tels que les composants de la paroi cellulaire bactérienne, flagellaire protéines et acides nucléiques microbienne10. Le PAMP, lipopolysaccharide (LPS), un composant de la paroi cellulaire des bactéries à Gram négatif reconnu par TLR4, s’est avéré altérer les rythmes circadiens aux niveaux moléculaires et organismiques. Par exemple, en vivo défi de LPS induit par les retards de phase de type photique telle que mesurée par l’activité souris11 et conduit à horloge réduit l’expression des gènes dans le SCN et le foie, tel que déterminé par hybridation in situ et PCR quantitative, respectivement, chez les rats12. Après un défi en vivo avec LPS, analyse de sang périphérique humain leucocytes13 et du tissu adipeux sous-cutané14 ont révélé une expression altérée de plusieurs gènes de l’horloge tel que mesuré par l’intermédiaire de qPCR. Enfin, ex vivo défis LPS des macrophages humains et macrophages péritonéaux de souris, a également conduits à altération de l’expression de l’horloge tel que mesuré par qPCR14.
Nous décrivons ici un protocole pour évaluer l’influence du LPS PAMPs, ODN1826 (oligonucléotides synthétiques contenant unmethylated motifs CpG) et tués par la chaleur Listeria monocytogenes (HKLM), reconnu par le TLR4 et TLR9 TLR2, respectivement, sur expression du gène horloge moléculaire en splénocytes de souris. Le protocole inclut une splénectomie souris, isolement de splénocytes et défi, RNA extraction, synthèse de cDNA et qPCR afin d’évaluer l’expression de plusieurs gènes de l’horloge. Ce protocole permet l’acquisition rapide d’un grand nombre de cellules immunitaires avec très peu d’animaux ou manipulation cellulaire, qui peut ensuite être contestée ex vivo avec PAMPs différents. L’horloge moléculaire a été montré pour moduler les divers aspects de la réponse immunitaire8,15,16, donc, dérèglement de l’horloge moléculaire nuirait très probablement la bonne variation dépendant du temps de la réponse immunitaire. En outre, étant donné que les perturbations des rythmes circadiens peuvent conduire à des pathologies graves17,18,19,20, il peut être d’intérêt pour les chercheurs de contester les splénocytes avec un large éventail de molécules et d’évaluer leur influence sur l’horloge.
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Protocol
Au cours de l’étude, traitement et soins des animaux conformé politique National Institutes of Health, étaient conformes aux lignes directrices et ont été approuvés par la Commission Université de Hartford Animal animalier institutionnel et utilisation.
1. entraînement d’animaux
Remarque : La souris de vingt semaines mâle B6129SF2/J sont utilisés dans l’étude.
- Monter la souris pour un 12 h de lumière (lumière standard de généraux blanche) / cycle de 12 h d’obscurité pendant 2 semaines avant l’expérience.
NOTE : Temps zeitgeber (ZT) 0 correspond ici au feux et ZT12 aux lumières, tout en conservant tous les autres facteurs environnementaux (p. ex., aliments, eau et température ambiante) constant 21.
2. préparation des Instruments, milieu de Culture et de Medium Challenge
- Autoclave pinces et ciseaux de dissection. Envelopper les paires de lames de microscope givré en papier d’aluminium et autoclave.
- Préparer, milieu de culture en ajoutant sérum fœtal (SVF) RPMI 1640 à une concentration finale de 10 %. Préparer 10 mL de milieu de défi en tubes de 50 mL en ajoutant les PAMPs suivants au milieu de culture (RPMI avec 10 % FBS) ; LPS (5 µg/mL), ODN1826 (5 µg/mL), Listeria monocytogenes tués par la chaleur (108 HKLM/mL), ou un autre PAMP dans sa concentration suggérée.
- Chauffer le milieu de culture et de medium de défi à 37 ° C dans un bain d’eau et laissez environ 70 mL de solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,2) à température ambiante.
- Ajouter 10 mL de milieu de culture à l’aide d’une pipette 10 mL et l’aide de la pipette à un endroit et un tube de 50 mL sur la glace.
- Ajouter 30 mL d’éthanol à 70 % pour un 100 mL bécher et lieu extrémités des ciseaux et pinces de dissection dans le bécher pour éviter la contamination microbienne.
- Préparer, tampon de lyse pour l’ARN en ajoutant 10 µL de β-mercaptoéthanol (sous une hotte aspirante) à chaque 1 mL de tampon RLT dans un tube de 50 mL. Assurez-vous que le montant qui sera nécessaire (600 µL par exemple, qui se compose d’environ 1 x 106 cellules).
Remarque : Le tampon RLT est une composante de la kit d’extraction d’ARN qui prend en charge la liaison de l’ARN à la membrane de la silice.
3. splénocytes isolement et défi
- Euthanasier souris à un moment particulier zeitgeber via narcose de conserver dans leur cage originale et l’ajout de CO2 à la cage à un débit de 3 L/min. continuer à approvisionner le CO2 pendant 1 min après l’arrêt de la respiration.
- Confirmer la mort par dislocation cervicale en plaçant le pouce et l’index de chaque côté du cou à la base du crâne. Sinon, appuyez sur une tige à la base du crâne tout en tirant rapidement (à l’aide de l’autre main) la base de la queue ou les membres postérieurs provoque la séparation de la vertèbre cervicale le crâne22.
- Pulvériser le tronc de la souris avec l’éthanol à 70 % et essuyer avec une serviette en papier. Placez votre souris sur son dos et légèrement inclinée sur le côté droit. Couper la fourrure, à l’aide de dissection ciseaux, le long du côté gauche de la souris, sujet à mi-chemin entre l’avant et l’arrière des jambes.
- À l’aide de pinces, prenez le péritoine et faites une incision pour éviter d’endommager la rate. Enlever la rate avec une pince et la placer dans un tube stérile de 50 mL contenant environ 10 mL de milieu de culture sur la glace. Répétez pour les animaux restants.
Remarque : La rate est la couleur d’un haricot, et il est plus long et plus plat que le rein. -
Transférer une rate avec 2 mL de milieu de culture dans une petite boîte de Petri stérile.
- Homogénéiser la rate en broyant il entre la partie givrée de deux diapositives givrés stériles. Si possible, conservez les question et les cellules dans le milieu pendant le processus d’homogénéisation.
- Une fois soigneusement homogénéisé, pipette le 2 mL de milieu de culture contenant les splénocytes à travers un tamis de cellule 40 µm en nylon dans un tube de 50 mL.
- Répétez les étapes ci-dessus pour la rate restante à l’aide de nouvelles paires de glissières givrés, tubes de 50 mL avec milieu de culture et des crépines de la cellule.
- Ajoutez 8 mL de milieu de culture froide à chacun des tubes de 50 mL contenant les splénocytes pour un volume total de 10 mL/tube. Déterminer le nombre de cellules par millilitre utilisant un hémocytomètre.
- Ajouter environ 1 x 106 cellules/puits aux plaques 6 puits culture. Ajouter des cellules au nombre de puits qui correspondent au nombre de PAMPs différents utilisés pour l’expérience et inclure un contrôle bien. Ajouter 3 mL de milieu de culture ou 3 mL de milieu de défi aux puits respectifs.
- Incuber les plaques à 37 ° C à 5 % de CO2 pendant 3 h.
- Grattez les cellules du fond du bien en utilisant un embout 1 000 µL attaché à une micropipette P1000. Transférer le support contenant les cellules à l’aide de la même pointe de pipette 1 000 µL dans un tube de 15 mL.
- Pellet les cellules par centrifugation à 167 x g pendant 5 min à température ambiante. Retirez le surnageant et le culot cellulaire avec 5 mL de PBS de lavage.
- Les cellules de granule une seconde fois à 167 x g pendant 5 min, retirez le surnageant et ajouter 600 µL de tampon de lyse au culot cellulaire pour lyser les cellules. Passez à l’ARN.
4. les ARN et la synthèse de cDNA
- Isoler l’ARN de splénocytes en utilisant le kit d’extraction d’ARN conformément aux instructions du fabricant et d’effectuer la digestion de l’ADN sur colonne « facultative ».
- Avant la synthèse de cDNA, déterminer la concentration d’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre microvolume pour vérifier que la concentration est dans la fourchette optimale de RNA (jusqu'à 2 µg) de la trousse de la synthèse de cDNA.
- Synthétisent cDNA pour chacun des échantillons en utilisant le kit de transcription inverse selon les instructions du fabricant. Utiliser 10 µL d’ARN pour chacun des échantillons dans un volume de réaction totale de 20 µL. À la fin de la transcription inverse (thermocycleur exécuter) ajouter 20 μL H2O à chaque réaction.
- Construire la courbe standard à l’aide d’une micropipette P10 ou P20 pour mettre en commun les ARNm de quelques échantillons de contrôle (par exemple, 5 µL de 2 échantillons pour un total de 10 µL) dans un tube de 0,5 mL pour préparer l’ADNc.
- Ajouter 10 µL 2 x mélange principal de la transcriptase inverse.
- À la fin de la transcriptase inverse, ajouter 10 µL d’H2O dans le tube de réaction, qui servira à la concentration initiale (« 1 ») dans la série de dilution pour la courbe d’étalonnage.
- Exécuter une série de dilution de 10 fois (de 1 à 10-4) en ajoutant 45 µL d’eau à l’aide d’une micropipette P100 ou P200 dans quatre tubes de 0,5 mL désignés 10-1, 10-2, 10-3et 10-4.
- Ajouter 5 µL de la concentration initiale « 1 » dans le premier tube (10-1) à l’aide d’une micropipette P20, mélange de pipetage de haut en bas plusieurs fois, puis transférer 5 µL du tube dans le tube de 10-1 désigné 10-2 et mélanger.
- Transférer 5 µL à l’aide d’une micropipette P20 du tube 10-2 dans le tube désigné 10-3 et mélanger. Transférer 5 µL à l’aide d’une micropipette P20 du tube de 10-3 dans le tube désigné 10-4 et mélanger.
5. quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)
- Déterminer une quantification relative de l’ARNm par qPCR. Au sein de l’expérimental mis en place, sélectionnez « Analyse quantitative – Relative courbe Standard » et « TaqMan » chimie. Changer le volume réactionnel à 10 µL. Entrez les informations pertinentes dans le schéma (par exemple, gène cible, courbe d’étalonnage, journaliste, etc.).
- Préparer la réaction afin qu’il contienne 0,5 µL d’obtenir un apprêt/sonde, 5 µL du mélange principal de gene expression, 2 µL de H2O et 2,5 µL d’ADNc (10 – 100 ng).
- Préparer un mélange maître en multipliant chacune des réactifs précédents (sauf l’ACEQ) par le nombre de réactions, en veillant à inclure ceux de la courbe d’étalonnage, les témoins négatifs, effectuant chaque réaction en deux exemplaires et 2 réactions supplémentaires qui représenteront variation de pipetage.
- Pipette 7,5 µL du mélange maître préparé dans les puits prédéterminés dans une plaque de 96 puits réaction avec une micropipette ou une pipette multicanaux. Pipette 2,5 µL de l’ADNc dans le puits correspondant pour les inconnues et les normes et 2,5 µL d’H2O dans les puits de contrôle négatif.
- Inclure des essais de primer/sonde de différents gènes de l’horloge moléculaire et comprennent également un test pour un contrôle endogène (par exemple, le β-actine).
- Afin de déterminer les valeurs de l’expression relative, calculer la quantité relative moyenne pour chaque répétition, puis, pour chaque échantillon, divisez la quantité relative moyenne pour le gène ciblé par la quantité relative moyenne de β-actine.
6. analyse statistique
- À l’aide du logiciel d’analyse statistique, entrer des données dans le programme de l’option de statistiques de colonne. Sélectionnez une ANOVA à avec le test post-hoc de le Dunnett afin d’évaluer les différences entre les valeurs moyennes de l’expression génique horloge après provocation PAMP versus le contrôle.
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Representative Results
Souris ont été sacrifiées à ZT13, splénocytes ont été isolés et contesté ex vivo avec le LPS PAMPs, ODN1826 ou HKLM. Après 3 h, l’ARN a été isolé et qPCR a été utilisé pour évaluer les niveaux de l’expression relative des gènes moléculaires horloge Clock, Per2, Dbp et Rev-erbα par rapport aux cellules témoins non contestée. Après une provocation PAMP, niveaux d’expression horloge n’étaient pas sensiblement différentes de celle expression dans les cellules de contrôle (Figure 1A). Niveaux d’expression Per2 étaient significativement élevées dans les cellules a contesté avec LPS et ODN1826 par rapport aux contrôles incontestés (Figure 1B). LPS a été le seul PAMP pour modifier l’expression de Rev-erbα , comme les niveaux d’ARNm ont été significativement plus faible que chez les témoins incontestés (Figure 1C). Enfin, significativement plus faible taux d’ARNm ont été observés de Dbp après défi avec chacun des PAMPs par rapport aux contrôles (Figure 1D). Conformément à ce qui a été précédemment démontré, parmi tous les gènes de l’horloge lié examinés, Dbp expression tend à être plus touchées par PAMP défi23.
Figure 1 : Expression des gènes altérés horloge en splénocytes de souris après une provocation ex vivo PAMP. Splénocytes ont été isolées à ZT13 et contesté avec LPS, ODN1826 ou HKLM. Les niveaux d’ARNm horloge relative (normalisées à β-actine) ont été déterminées par qPCR 3 h après une provocation. Chaque point de données représente le niveau d’expression de 1 animal. Moyenne expérimentale + SEM est donné. p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Les difficultés indiquées étaient significativement différentes de la commande (cellules non contestés) selon les directives de l’ANOVA à avec les post-hoc test de Dunnett. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Dans ce protocole, un spectrophotomètre microvolume permet de quantifier et d’évaluer la pureté de l’ARN étant utilisé dans la détermination de l’expression des gènes. Acides nucléiques absorber les ultraviolets à 260 nm, en général, les protéines absorbent la lumière à 280 nm, tandis que d’autres contaminants potentiels utilisés pendant le processus d’extraction RNA (p. ex., phénol) sont détectables à 230 nm. Par conséquent, en évaluant l’absorbance (A) ratio 260/280 nm (ARN de protéine) et 260/230 nm (ARN à des contaminants non protéique) la qualité de l’ARN peut être évaluée. Haute qualité RNA a un ratio de A260/280 entre 1,8 et 2,1, comme des rapports plus faibles indiquer la contamination de la protéine. Un échantillon de RNA pur aura un ratio A260/230 du 2.0.
Lors de la détermination de l’expression relative d’un gène cible (c'est-à-dire Per2, horloge, Rev-erbα et Dbp), un gène contrôle endogène (un gène dans quelle expression niveaux ne diffèrent pas entre les échantillons) doit également être activée. Relative expression du gène cible est ensuite normalisée de l’expression du gène contrôle endogène. Différences de matériau de départ (nombre de splénocytes), variation de l’efficacité de la transcriptase inverse, différents taux de dégradation de l’ARN, etc., seront corrigés pour par le gène contrôle endogène (β-actine dans le présent protocole). Toutefois, il est sage de vérifier que le traitement en cours d’examen ne modifie pas l’expression du gène contrôle endogène. Cela est possible par l’évaluation des niveaux β-actine de plusieurs répétitions d’un nombre égal de cellules (traitement vs absence de traitement). En théorie, leur taux β-actine doit être identiques. Une autre approche pour se prémunir contre les variations de contrôle endogène serait d’utiliser un panneau de contrôles endogènes (gène,par exemple, le β-actine, Gapdh et 18 s rRNA).
Lorsqu’on examine l’impact des PAMPs sur l’horloge moléculaire, l’heure de la journée quand les souris sont euthanasiés et splénocytes sont subséquemment contestés doit prendre en considération. Expression de TLR et réactivité a déjà démontré à démontrer la variation de charge time-of-day8,15, donc, une heure de la journée où la réactivité TLR est à son apogée, pourrait entraîner une plus grande influence sur la horloge. En outre, l’expression de gènes de l’horloge moléculaire fluctueront également tout au long de la journée en splénocytes, par conséquent, une réduction de l’expression génique horloge en raison du défi PAMP serait plus significative si examinés au cours de l’heure de pointe expression9. Puisque le Dbp et le Rev-erbα ont été présentées pour démontrer les pics d’expression significative en splénocytes et spléniques cellules immunitaires autour de la lumière-obscurité interphase 8,9,23, 24 (ZT12), dans la méthode actuelle, les cellules ont été isolées et contestées à ZT13 afin d’avoir plus de chance de détecter une réduction de ces gènes. À l’inverse, un PAMP pouvant accroître horloge expression, serait très probablement observé si la recherche à la fois de la journée quand l’expression de l’horloge est à son plus bas niveau.
Étant donné que les souris sont des animaux nocturnes, leur phase de repos est au cours de la période de lumière, ce qui correspond à l’activité humaine. Par conséquent, dans l’idéal, souris seront logés dans une chambre avec un trafic minimal et l’autre contenant une machine à bruit blanc afin de réduire les perturbations pendant la journée comme cela pourrait perturber les rythmes circadiens des souris. En outre, les changements de cage doivent être faits bien avant la date de l’expérience. Tout travail dans la salle animale (y compris l’euthanasie des animaux) au cours de la période d’obscurité, doit être menée sous lumière rouge afin de ne pas perturber les rythmes des souris.
Rythmes diurnes sont soumis à des stimuli environnementaux (par exemple, la lumière ou des aliments), qui sont appelés zeitgebers. Dans le cas d’un h de lumière/12 12 h obscurité cycle, le zeitgeber (c.-à-d., la lumière) réinitialise l’horloge à une période de 24h. Alors que la plupart des rythmes diurnes sont rythme circadiens (c'est-à-dire quotidienne des rythmes qui se produisent en l’absence d’un signal externe), ils ne sont pas les rythmes circadiens vrais jusqu'à ce qu’ils auraient dû être divulgués à osciller avec une période d’environ 24 heures dans des conditions environnementales constantes . Par conséquent, cette procédure peut être effectuée à l’aide de la souris dans des conditions constantes, ce qui impliquent une souris embarquement au cycle lumière-obscurité comme décrit ci-dessus, mais puis maintenant les animaux dans l’obscurité totale pendant 3 jours avant l’échantillonnage. Ce type d’expérience est dénommé expérimenter une sombre-dark (DD) et le point dans le temps d’échantillonnage serait considérée comme CT (temps de rythme circadien), pas de ZT.
Bien que cette méthode peut identifier les PAMPs qui modifient l’expression des gènes au sein de splénocytes horloge, il ne tient pas compte comment ces PAMPs affectent l’horloge maître ou horloges périphériques dans tout le corps. Étant donné que la rate est composée d’une population hétérogène de cellules, PAMPs individuels pourraient avoir une incidence chaque type de cellule différemment. Par exemple, rythmes expression Tlr9 dans la rate de souris diffèrent entre les splénocytes, macrophages, cellules B et DCs15. En outre, Tlr1 Tlr3, Tlr4, Tlr6, Tlr7et chaque Tlr8 importantes oscillations quotidiennes dans une population de splénocytes adhérentes mais seulement Tlr2 et Tlr6 à vivre au quotidien oscillations dans les macrophages spléniques enrichi24. Par conséquent, afin d’enquêter sur le résultat d’un défi sur les types de cellules individuelles, cellules pourraient être isolés par tri cellulaire magnétique, comme décrit précédemment9,15 et puis par la suite contesté. En outre, la population de cellules spléniques fluctue au cours du cycle journalier, qui pourrait également jouer un rôle dans la sensibilité PAMP particulier et un impact ultérieur sur l' horloge8.
Cette méthode permet l’isolement d’un grand nombre de cellules immunitaires qui se composent principalement de (~ 58 %) des cellules B, (~ 21 %) des cellules T, cellules dendritiques (~ 5 %) et macrophages (~ 4 %),25. Le grand nombre de cellules fournit l’occasion de contester les splénocytes avec une variété de PAMPs dans une expérience simple. La technique d’isolation de splénocytes est très facile à réaliser, peut être complété quelques minutes (selon le nombre d’animaux) et avec une manipulation minimale animale ou cellulaire, qui est essentielle, lorsqu’on examine l’horloge moléculaire parce que comme mentionné ci-dessus, ces actions peuvent perturber la synchronisation de l’horloge, mais aussi les gènes contrôlés par horloge. Les résultats pour cette procédure ont été hautement reproductible, comme signification entre contestés et incontesté de cellules a été atteint avec seulement trois animaux et les résultats concordaient avec les travaux déjà publiés23 (Figure 1). Il est à noter que la multiplication des animaux par groupe aurait pu révéler des différences statistiquement significatives entre un groupe de défi et de contrôle (par exemple, ODN 1826 et Rev-erbα).
Aller de l’avant, tandis que le présent protocole ne porte que sur les effets aigus sur l’expression génique horloge après provocation PAMP, il pourrait fournir la preuve de principe pour complément d’enquête. Par exemple, ce test pourrait servir comme modèle pour décrypter les mécanismes moléculaires au sujet de TLR - PAMP interaction et comment elle influence l’horloge moléculaire. Il pourrait également être utilisé pour déterminer la longueur du temps que nécessaire pour que l’horloge moléculaire à récupérer après une faute PAMP, qui peut être déterminée en effectuant une expérience temporelle (p. ex., évaluer l’expression de divers moments après défi). Comme mentionné ci-dessus, les expériences ultérieures pourraient être exécutés pour examiner le défi PAMP sur les populations de cellules spécifiques de splénocytes. Étant donné que plusieurs pathogènes stimulent plusieurs TLR infectées, il serait intéressant d’utiliser ce protocole pour vérifier si difficile avec les PAMPs multiples ont un effet synergique sur l’expression génique horloge.
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Disclosures
L’auteur n’a rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions de recherche de la faculté du Bureau du Collège des Arts et Sciences Dean à l’Université de Hartford.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Frosted slides | Fisher | 12-550-343 | |
| Cell strainers | Fisher | 22363547 | |
| Lipopolysaccharide | InvivoGen | ltrl-eklps | |
| ODN1826 | InvivoGen | Tlrl-1826-1 | |
| HKLM | InvivoGen | Tlrl-hklm | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| PBS | Gibco | 20012-043 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 or 74106 | |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| 6-well cell culture plate | Denville | T1006 | |
| 50 mL tubes | Corning | 352070 | |
| 15 mL tubes | Corning | 352097 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher | 4368814 | |
| TaqMan Gene Expression Assays b-actin | ThermoFisher | Mm00607939_s1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Per2 | ThermoFisher | Mm00478113_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Rev-erba | ThermoFisher | Mm00520708_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Bmal1 | ThermoFisher | Mm00500226_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Dbp | ThermoFisher | Mm00497539_m1 | |
| qPCR machine StepOnePlus | ThermoFisher | ||
| TaqMan Gene Expression Master Mix | ThermoFisher | 4369016 | |
| MicroAmp Fast 96-well reaction plate (0.1 mL) | ThermoFisher | 4346907 | |
| Statistical Analysis Software | Prism 7.0a |
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