Summary
Este protocolo descreve uma técnica usando splenocytes rato para descobrir padrões moleculares associados patógeno que alteram a expressão de gene do relógio molecular.
Abstract
De comportamento de expressão gênica, ritmos circadianos regulam quase todos os aspectos da fisiologia. Aqui, apresentamos uma metodologia para desafiar splenocytes de rato com o lipopolissacarídeo (PAMPs) de padrões moleculares associados patógeno (LPS), ODN1826 e calor-matou Listeria monocytogenes e examinar seu efeito sobre o molecular circadian pulso de disparo. Anteriormente, estudos têm focado a analisar a influência dos LPS do relógio molecular, usando uma variedade de abordagens in vivo e ex vivo de uma variedade de modelos (por exemplo, rato, rato e humanos). Este protocolo descreve a isolação e o desafio de splenocytes, bem como a metodologia para avaliar a expressão de gene de relógio pós-desafio através de PCR quantitativo. Esta abordagem pode ser usada para avaliar não só a influência de componentes microbianos do relógio molecular mas também outras moléculas que podem alterar a expressão do relógio. Esta abordagem poderia ser utilizada para arreliar distante o mecanismo molecular de como interação de PAMP-Toll-like receptor influencia a expressão do relógio.
Introduction
O pulso de disparo mestre em mamíferos, que coordena as oscilações de 24h para quase todos os aspectos da fisiologia e comportamento, está localizado dentro do núcleo supraquiasmático (SCN) do hipotálamo1,2. Além de processos biológicos a nível de regulação, o pulso de disparo mestre também sincroniza periféricos relógios celulares em todo o corpo,3,4,5. Enquanto as máquinas de relógio molecular consiste de pelo menos três loops de feedback transcriptional-translacional interligadas, o núcleo é composto do período (Per1-3), prevenção (Cry1-2), Bmal1, e relógio genes6,7. Além de manter a altura exata do relógio molecular núcleo, alguns produtos de genes do relógio auxiliares (por exemplo, Rev-erbα e Dbp) também regulam a expressão de genes não-tempo, ou seja, clock genes controlados (CCGs)6 , 7.
Funcionais relógios moleculares têm sido descritos em vários tecidos imune (por exemplo, baço e linfonodos)8 e células (por exemplo, B células, as células dendríticas, macrófagos)8,9. Estas células detectam e respondem a padrões moleculares associados patógeno (PAMPs), componentes microbianos conservadas, via receptores de reconhecimento imune inata como receptores Toll-like (TLRs)10. Até à data, têm sido descritos 13 TLRs funcionais, que reconhecem constituintes microbianos, como componentes da parede celular bacteriana, flagelar proteínas e ácidos nucleicos microbial10. O PAMP, lipopolissacarídeo (LPS), um componente da parede celular de bactérias Gram-negativas, reconhecido por TLR4, foi mostrado para alterar o ritmo circadiano nos níveis de organismos e moleculares. Por exemplo, na vivo desafio de LPS induzido atrasos fótica-como fase medido pela atividade em ratos11 e levou à expressão do gene relógio reduzida no SCN e no fígado, conforme determinado pela hibridação in situ e PCR quantitativo, respectivamente, em ratos,12. Depois de um desafio na vivo com LPS, análise de leucócitos do sangue periférico humano13 e tecido adiposo subcutâneo14 revelou expressão alterada de vários genes de relógio, medido através de qPCR. Por último, ex vivo desafios LPS de macrófagos humanos e macrófagos peritoneais de rato, também levados a alteraram a expressão relógio medida pelo qPCR14.
Aqui, descrevemos um protocolo para avaliar a influência dos PAMPs LPS, ODN1826 (oligonucleotídeos sintéticos contendo unmethylated motivos CpG) e matou o calor Listeria monocytogenes (HKLM), reconhecido por TLR4 e TLR9 TLR2, respectivamente, na expressão gênica de relógio molecular em splenocytes de rato. O protocolo inclui esplenectomia rato, isolamento de splenocyte e desafio, RNA extração, síntese do cDNA e qPCR para avaliar a expressão de vários genes do relógio. Este protocolo permite a aquisição atempada de um grande número de células do sistema imunológico com muito pouco animal ou manipulação celular, que pode então ser desafiado ex vivo com diversos PAMPs. O relógio molecular tem sido mostrado para modular a vários aspectos da resposta imune8,15,16, portanto, interrupção do relógio molecular provavelmente iria prejudicar a adequada variação dependente do tempo da resposta imune. Além disso, uma vez que as perturbações do ritmo circadiano podem levar a graves patologias17,18,19,20, pode ser de interesse para os investigadores desafiar splenocytes com uma ampla gama de moléculas e avaliar sua influência sobre o relógio.
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Protocol
Durante o estudo, tratamento e cuidados com animais cumprido com a política do National Institutes of Health, estavam em conformidade com as orientações institucionais e foram aprovados pelo Comitê de uso e cuidado Animal institucional Animal Universidade de Hartford.
1. o arrastamento de animais
Nota: Vinte semanas masculino B6129SF2/J os ratos são usados no estudo.
- Arrastar os ratos para um 12 h luz (padrão sobrecarga luz branca) / ciclo de 12h escuro durante 2 semanas antes do experimento.
Nota: Aqui tempo zeitgeber (ZT) 0 corresponde a luzes acesas e ZT12 de luzes apagadas, mantendo todos os outros fatores ambientais (ou seja, comida, água e temperatura) constante 21.
2. preparação dos instrumentos, meio de cultura e meio de desafio
- Autoclave fórceps e a tesoura de dissecação. Enrole pares de corrediças do microscópio fosco em folha de alumínio e autoclave.
- Prepare o meio de cultura por adição de soro fetal bovino (FBS) para RPMI 1640 para uma concentração final de 10%. Prepare-se 10 mL de meio de desafio em tubos de 50 mL, adicionando os seguintes PAMPs ao meio de cultura (RPMI com 10% FBS); LPS (5 µ g/mL), ODN1826 (5 µ g/mL), calor-matou Listeria monocytogenes (108 HKLM/mL), ou outro PAMP em sua concentração sugerida.
- Aquecer o meio de cultura e meio de desafio a 37 ° C em banho-maria e manter cerca de 70 mL de soro fisiológico estéril tamponado de fosfato (PBS, pH 7,2) à temperatura ambiente.
- Adicione 10 mL de meio de cultura usando uma pipeta de 10 mL e pipeta ajuda para um tubo de 50 mL e lugar no gelo.
- Adicione aproximadamente 30 mL de etanol a 70% para fins de copo e coloque um 100ml de tesoura e pinça de dissecação no copo medidor para evitar a contaminação microbiana.
- Prepare-se do lysis para isolamento de RNA adicionando 10 µ l de β-mercaptoetanol (sob uma coifa) para cada 1 mL de tampão RLT em um tubo de 50 mL. Faça apenas a quantidade que será necessária (600 µ l por amostra, que consiste em aproximadamente 1 x 106 células).
Nota: O Buffer RLT é um componente do kit de extração de RNA que suporta a ligação do RNA para a membrana de silicone.
3. Splenocyte isolamento e desafio
- Eutanásia em ratos a um momento de particular zeitgeber através de narcose por mantê-los em sua gaiola original e adição de CO2 para a gaiola, a uma taxa de fluxo de 3 L/min. Continue fornecendo CO2 por 1 min após a respiração para.
- Confirme a morte através do deslocamento cervical, colocando o polegar e o dedo indicador em ambos os lados do pescoço na base do crânio. Alternativamente, pressione uma haste na base do crânio enquanto puxa rapidamente (usando a outra mão) a base da cauda ou membros posteriores para causar a separação das vértebras cervicais do crânio22.
- Pulverize o tronco de rato com etanol a 70% e limpe com uma toalha de papel. Posicione o mouse na sua traseira e ligeiramente inclinada para o seu lado direito. Cortar o pelo, usar dissecando tesoura, ao longo do lado esquerdo do mouse, sobre no meio do caminho entre a frente e pernas traseiras.
- Usando a pinça, pegue o peritônio e cuidadosamente fazer uma incisão para não danificar o baço. Remover o baço com pinça e coloque em um tubo estéril 50 mL contendo cerca de 10 mL de meio de cultura no gelo. Repita para os restantes animais.
Nota: O baço é a cor de um grão de feijão, e é mais longo e mais plana do que o rim. -
Transferi um baço com 2 mL de meio de cultura para uma pequena placa de Petri estéril.
- Homogeneizar o baço por moagem é entre a parte geada de dois slides foscas estéril. Se possível, manter a questão e células no meio durante o processo de homogeneização.
- Uma vez completamente homogeneizado, pipeta de 2 mL de meio de cultura contendo os splenocytes através de um filtro de célula de nylon µm 40 em um tubo de 50 mL.
- Repita as etapas acima para os restantes baços usando novos pares de slides geados, tubos de 50 mL com meio de cultura e filtros de célula.
- Adicione 8 mL de meio de cultura de frio a cada um dos tubos de 50 mL contendo os splenocytes para um volume total de 10 mL/tubo. Determine o número de células por mililitro, usando um hemocytometer.
- Adicione aproximadamente 1 x 106 células/poço para placas 6-poço de cultura. Adicione células ao número de poços que correspondem ao número de diferentes PAMPs sendo usado para o experimento e incluir um controle bem. Adicione 3 mL de meio de cultura ou 3 mL de meio de desafio aos respectivos poços.
- Incube as placas a 37 ° C em 5% de CO2 por 3 h.
- Raspe as células da parte inferior do bem, usando a ponta da pipeta 1.000 µ l anexado a uma micropipeta P1000. Transferi a mídia que contém as células com a mesma ponta da pipeta µ l 1.000 para um tubo de 15 mL.
- Granule as células através de centrifugação a 167 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Remover o sobrenadante e lavar o centrifugado com 5 mL de PBS.
- As células de pelotas uma segunda vez a 167 x g por 5 min, retire o sobrenadante e adicionar 600 µ l de tampão de Lise para o centrifugado para lisar as células. Em seguida proceda ao isolamento de RNA.
4. RNA isolamento e síntese de cDNA
- Isolar o RNA do splenocytes usando o kit de extração de RNA de acordo com as instruções do fabricante e realizar a digestão de DNA na coluna 'opcional'.
- Antes da síntese do cDNA, determine a concentração de RNA usando um espectrofotômetro microvolume para verificar se a concentração está dentro da faixa ideal de RNA (até 2 µ g) do kit de síntese do cDNA.
- Synthesize cDNA para cada uma das amostras usando o kit de transcrição reversa de acordo com as instruções do fabricante. Use 10 µ l de RNA para cada uma das amostras em um volume de reação total de 20 µ l. Após a conclusão da transcrição reversa (thermocycler executado) adicionar 20 μL H2O para cada reação.
- Construa a curva padrão usando uma micropipeta P10 ou P20 para piscina mRNA de algumas amostras de controlo (por exemplo, 5 µ l de 2 amostras num total de 10 µ l) em um tubo de 0,5 mL para preparar o cDNA.
- Adicione 10 µ l 2 x mestre mistura transcriptase reversa.
- Após a conclusão da transcrição reversa, adicione 10 µ l de H2O para o tubo de reação, que servirá como a concentração inicial ("1") da série de diluição para a curva padrão.
- Execute uma série de diluições de 10 vezes (de 1 a 10-4) adicionando 45 µ l de água utilizando uma micropipeta P100 ou P200 em quatro tubos de 0,5 mL, designados de 10-1, 10-2, 10-3e 10-4.
- Adicionar 5 µ l da concentração inicial "1" no primeiro tubo (10-1) utilizando um micropepitador P20, mistura pipetando para cima e para baixo várias vezes, então transferência 5 µ l do tubo de 10-1 para o tubo designado 10-2 e misture.
- Transferência de 5 µ l utilizando uma micropipeta P20 do tubo de 10-2 no tubo designado 10-3 e misturar. Transferência de 5 µ l utilizando um micropepitador P20 do tubo de 10-3 no tubo designado 10-4 e misture.
5. quantitativo reação em cadeia da polimerase (qPCR)
- Determine a quantificação relativa dos níveis de mRNA por qPCR. Dentro do conjunto experimental acima, selecione "Quantificação – curva padrão relativo" e "TaqMan" química. Alterar o volume de reação de 10 µ l. Insira as informações relevantes para o layout da placa (por exemplo, gene alvo, curva de calibração, repórter, etc.).
- Preparar a reação, para que ele contém 0,5 µ l do ensaio da primeira demão/sonda, 5 µ l de mistura mestre de expressão de gene, 2 µ l de H2O e 2,5 µ l de cDNA (10-100 ng).
- Preparar uma mistura de mestre multiplicando cada um dos reagentes anteriores (exceto o cDNA) pelo número de reações, certificando-se de incluir aqueles da curva padrão, controles negativos, realizando cada reação em duplicata e 2 reações extras que serão responsáveis para variação de pipetagem.
- Pipeta de 7,5 µ l da mistura preparada mestre em poços pré-determinado em uma placa de 96 poços de reação com uma micropipeta ou uma pipeta multicanal. Pipetar 2,5 µ l de cDNA no bem apropriado para as incógnitas e os padrões e 2,5 µ l de H2O para os poços de controle negativo.
- Incluir ensaios de primer/sonda para vários genes do relógio molecular e também incluem um ensaio para um controle endógeno (por exemplo, β-actina).
- A fim de determinar os valores de expressão relativa, calcular a quantidade relativa média para cada replicar, em seguida, para cada amostra, dividir a quantidade relativa média para o gene alvo pela quantidade relativa média para β-actina.
6. análise estatística
- Usando o software de análise estatística, inserir dados no programa sob a opção de estatísticas de coluna. Selecione uma ANOVA One-Way com teste post hoc de Dunnett para avaliar as diferenças entre os valores médios da expressão do gene relógio após desafio PAMP contra o controle.
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Representative Results
Os ratos foram sacrificados em ZT13, splenocytes foram isoladas e desafiou ex vivo com o LPS PAMPs, ODN1826 ou HKLM. Depois de 3 h, RNA foi isolado, e qPCR foi usada para avaliar os níveis de expressão relativa dos genes relógio molecular relógio, Per2, Dbp e Rev-erbα em comparação com células de controle sem contestação. Após o desafio PAMP, níveis de expressão de relógio não foram significativamente diferentes do que a expressão nas células de controle (Figura 1A). Níveis de expressão Per2 foram significativamente elevados em células desafiadas com LPS e ODN1826 quando comparados aos controles incontestadas (Figura 1B). LPS foi a única PAMP para alterar a expressão de Rev-erbα , como os níveis do mRNA foram significativamente menores do que nos controles incontestadas (Figura 1C). Por último, significativamente menores níveis de mRNA foram observados para Dbp após desafio com cada um dos PAMPs quando comparados aos controles (Figura 1D). Consistente com o que tem sido mostrado anteriormente, fora de todos os genes do relógio associado examinados, Dbp expressão tende a ser mais afetadas pela PAMP desafio23.
Figura 1 : Expressão de gene alterado relógio no rato splenocytes após ex vivo desafio PAMP. Splenocytes foram isolados em ZT13 e desafiados com LPS, ODN1826 ou HKLM. Os níveis de mRNA de relógio relativo (normalizados de β-actina) foram determinados por qPCR 3h após o desafio. Cada ponto de dados representa o nível de expressão para 1 animal. Quer dizer experimental + SEM é dadas. p < 0.05, * *p < 0,01, * * *p < 0,001. Os desafios indicados foram significativamente diferentes do controle (células incontestadas) como por ANOVA One-Way com teste post hoc de Dunnett. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste protocolo, um espectrofotômetro microvolume pode ser usado para quantificar e avaliar a pureza do RNA sendo usado para determinar a expressão do gene. Ácidos nucleicos absorvem UV luz em 260 nm, proteínas normalmente absorvem luz em 280 nm, enquanto outros contaminantes potenciais usados durante um procedimento de extração de RNA (por exemplo, fenol) são detectáveis em 230 nm. Portanto, avaliando a absorvância (A) relação em 260/280 nm (RNA à proteína) e 260/230 nm (RNA de contaminantes não proteico) a qualidade do RNA pode ser avaliada. RNA de alta qualidade tem uma relação de A260/280 entre 1,8 – 2.1, como rácios inferiores indicam contaminação de proteína. Uma amostra pura de RNA terá uma relação de A260/230 de 2.0.
Ao determinar a expressão relativa de um gene alvo (i.e., Per2, relógio, Rev-erbα e Dbp), um gene de controle endógeno (um gene no qual expressão níveis não diferem entre amostras) também deve ser selecionado. Expressão relativa do gene alvo então é normalizado para a expressão do gene controle endógeno. Diferenças de matéria-prima (número de splenocytes), variação na eficiência de transcriptase reversa, diferentes taxas de degradação de RNA, etc, serão corrigidas pelo gene controle endógeno (β-actina neste protocolo). No entanto, é aconselhável verificar que o tratamento a ser examinado não altera a expressão do gene controle endógeno. Isso pode ser feito através da avaliação de níveis β-actina de várias repetições de um número igual de células (tratamento versus não-tratamento). Em teoria, seus níveis β-actina devem ser idênticos. Outra abordagem para se proteger contra variação de controle endógena seria usar um painel de controles endógenos (por exemplo, β-actina, Gapdh e 18S rRNA do gene).
Ao examinar o impacto de PAMPs no relógio molecular, a hora do dia, quando os ratos são sacrificados e splenocytes posteriormente são desafiados deve ser tida em conta. Expressão de TLR e capacidade de resposta anteriormente foi mostrado para demonstrar a variação dependentes de tempo do dia8,15, portanto, uma hora do dia quando a responsividade TLR está no auge, pode resultar em uma maior influência sobre o pulso de disparo. Além disso, a expressão de genes do relógio molecular também irá flutuar durante todo o dia no splenocytes, portanto, uma redução da expressão do gene relógio devido ao desafio PAMP seria mais significativa se analisado durante o tempo de pico de expressão9. Desde que a Dbp e Rev-erbα têm sido mostrados para demonstrar a picos de expressão significativa no splenocytes e células do sistema imunológico esplênica em torno do claro-escuro interphase 8,9,23, 24 (ZT12), no método atual, as células foram isoladas e desafiadas no ZT13 para poder ter uma maior chance de detectar uma redução nestes genes. Inversamente, um PAMP que pode aumentar a expressão do relógio, seria mais provável ser observado se olhando para uma hora do dia, quando a expressão relógio está mais baixo.
Desde que os ratos são animais noturnos, a sua fase de descanso é durante o período de luz, o que corresponde a atividade humana. Portanto, idealmente, os ratos serão alojados em uma sala com tráfego mínimo e que contém uma máquina de ruído branco, a fim de reduzir as perturbações durante o dia como isso poderia atrapalhar o ritmo circadiano dos ratos. Além disso, as alterações da gaiola devem ser feitas bem antes da data do experimento. Qualquer trabalho na sala de animais (incluindo a eutanásia dos animais) durante o período escuro, deve ser conduzida sob luz vermelha, a fim de não perturbar os ritmos dos ratos.
Ritmos diurnos são submetidos a estímulos ambientais (por exemplo, a luz ou comida), que são chamados zeitgebers. No caso de um 12 h luz/12h escuro ciclo, o zeitgeber (i.e., luz) redefine o relógio a um período de 24h. Enquanto a maioria dos ritmos diurnos são circadianos (ou seja, diária ritmos que ocorrem na ausência de um sinal externo), eles não são verdadeiros ritmos circadianos até que eles foram mostrados para oscilar com um período aproximado de 24 h sob condições ambientais constantes . Portanto, este procedimento pode ser realizado usando ratos sob condições constantes, o que implicariam ratos arrasta para o ciclo claro-escuro, como descrito acima, mas em seguida, segurando os animais na escuridão constante durante 3 dias antes da amostragem. Este tipo de experimento é conhecido como experimento de um escuro-escuro (DD) e ponto de amostragem de tempo seria conhecido como CT (tempo circadiano), não ZT.
Enquanto este método pode identificar que alteram a expressão de gene relógio dentro splenocytes PAMPs, ele não leva em conta como Estes PAMPs afetam o pulso de disparo mestre ou periféricos relógios por todo o corpo. Desde que o baço é composto por uma população heterogênea de células, PAMPs individuais poderiam impactar de forma diferente cada tipo de célula. Por exemplo, ritmos de expressão Tlr9 no baço do mouse diferem entre splenocytes, macrófagos, células B e DCs15. Além disso, Tlr1 Tlr3, Tlr4, Tlr6, Tlr7e Tlr8 exibido significativas oscilações diárias em uma população de splenocyte aderente mas apenas Tlr2 e Tlr6 experiência diariamente oscilações em macrófagos no baço enriquecido24. Portanto, a fim de investigar o resultado de um desafio em tipos de células individuais, células podem ser isoladas através de célula magnética classificação, como descrito anteriormente9,15 e então posteriormente desafiados. Além disso, a população celular esplênica flutua durante o ciclo diário, que poderia também desempenhar um papel na sensibilidade para um particular PAMP e subsequente impacto sobre o relógio8.
Este método permite o isolamento de um grande número de células do sistema imunológico que consistem predominantemente de células (~ 58%) B, (~ 21%) de células T, células dendríticas (~ 5%) e macrófagos (~ 4%)25. O grande número de células fornece a oportunidade de desafiar splenocytes com uma variedade de PAMPs em uma única experiência. O procedimento de isolamento de splenocyte é muito fácil de executar, pode ser concluída dentro de minutos (dependendo do número de animais) e com mínima manipulação animal ou celular, que é essencial quando examinar o relógio molecular, porque como mencionado acima, Estas acções podem interromper o momento do relógio, bem como os genes controlado por relógio. Os resultados para este procedimento foram altamente reprodutível, como significado entre desafiaram e incontestadas células foi conseguido com apenas três animais e os resultados foram consistentes com o trabalho anteriormente publicado23 (Figura 1). Note-se que aumentar o número de animais por grupo pode revelaram diferenças estatisticamente significativas entre um grupo de desafio e controle (por exemplo, ODN 1826 e Rev-erbα).
Movendo-se para a frente, enquanto este protocolo aborda apenas os efeitos agudos na expressão gênica de relógio após desafio PAMP, ele poderia fornecer prova do princípio para maiores investigações. Por exemplo, este ensaio pode ser usado como um modelo para decifrar os mecanismos moleculares sobre TLR - PAMP interação e como isso influencia o relógio molecular. Ele também pode ser usado para determinar o comprimento de tempo que leva para o relógio molecular para se recuperar após um desafio PAMP, que pode ser determinado através da realização de um experimento de tempo-curso (ou seja, avaliar a expressão depois de tempos variados post desafio). Como mencionado acima, experimentos subsequentes podem ser executados para examinar o desafio PAMP em populações de células específicas splenocyte. Uma vez que vários agentes patogénicos estimulam vários TLRs ao ser infectado, seria interessante usar esse protocolo para investigar se desafiando com múltiplos PAMPs têm um efeito sinérgico na expressão gênica de relógio.
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Disclosures
O autor não tem nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela pesquisa de faculdade concede do escritório da faculdade de artes e Ciências do reitor na Universidade de Hartford.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Frosted slides | Fisher | 12-550-343 | |
| Cell strainers | Fisher | 22363547 | |
| Lipopolysaccharide | InvivoGen | ltrl-eklps | |
| ODN1826 | InvivoGen | Tlrl-1826-1 | |
| HKLM | InvivoGen | Tlrl-hklm | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| PBS | Gibco | 20012-043 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 or 74106 | |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| 6-well cell culture plate | Denville | T1006 | |
| 50 mL tubes | Corning | 352070 | |
| 15 mL tubes | Corning | 352097 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher | 4368814 | |
| TaqMan Gene Expression Assays b-actin | ThermoFisher | Mm00607939_s1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Per2 | ThermoFisher | Mm00478113_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Rev-erba | ThermoFisher | Mm00520708_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Bmal1 | ThermoFisher | Mm00500226_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Dbp | ThermoFisher | Mm00497539_m1 | |
| qPCR machine StepOnePlus | ThermoFisher | ||
| TaqMan Gene Expression Master Mix | ThermoFisher | 4369016 | |
| MicroAmp Fast 96-well reaction plate (0.1 mL) | ThermoFisher | 4346907 | |
| Statistical Analysis Software | Prism 7.0a |
References
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