Summary
Bu protokolü moleküler saat gen ekspresyonu alter patojen ilişkili moleküler desenleri bulmak için fare splenocytes kullanarak bir teknik anlatılmaktadır.
Abstract
Davranış-gen ekspresyonu sirkadiyen ritim fizyolojisi neredeyse tüm yönlerini düzenleyen. Burada, fare splenocytes moleküler desenleri (PAMPs) patojen ilişkili lipopolysaccharide (LPS), ODN1826 ve ısı öldürdü Listeria Monositogenez meydan ve moleküler üzerindeki etkileri sirkadiyen incelemek için bir metodoloji mevcut saat. Daha önce çalışmalar LPS etkisi a değişiklik-in vivo ve ex vivo yaklaşımlardan modelleri (Örneğin, fare, sıçan ve insan) bir ürün yelpazesine kullanarak moleküler saat inceleyerek üzerinde odaklanmıştır. Bu iletişim kuralı yalıtım ve saat gen ifade sonrası meydan kantitatif PCR ile değerlendirmek için meydan okuma splenocytes yanı sıra metodoloji açıklanmaktadır. Bu yaklaşım sadece etkisi mikrobiyal bileşenleri ifade saatin değiştirebilir moleküler saat diğer moleküller de ama değerlendirmek için kullanılabilir. Bu yaklaşım ayrı nasıl etkilediği PAMP Toll benzeri reseptör etkileşim saat ifade moleküler mekanizması kızdırmak için yararlanılabilir.
Introduction
Neredeyse tüm yönleri için 24 h salınımlarını fizyolojisi ve davranış orchestrates, ana saat memelilerde, suprachiasmatic çekirdek hipotalamus1,2içinde (SCN) yer alır. Bir organizma düzeyinde biyolojik süreçleri düzenleyen ek olarak, ana saatini de periferik hücresel saatler boyunca vücut3,4,5eşitler. En az üç birbirine translasyonel transkripsiyon geri besleme döngüleri moleküler saat makine oluşur ise, çekirdek dönemi (Per1-3), Cryptochrome (Cry1-2), Bmal1oluşur, ve saat genler6,7. Çekirdek moleküler saat doğru zamanlama sürdürmek, yanı sıra bazı yardımcı saat gen ürünleri (Örneğin, Rev erbα ve Dbp) da ifade olmayan genlerine düzenleyen, Yani, kontrollü genler (CCGs)6 saat , 7.
Fonksiyonel moleküler saatler çeşitli bağışıklık dokuları (Örneğin, dalak ve lenf bezleri)8 ve hücreleri (Örneğin, B hücreleri, dendritik hücreler, makrofajlar)8,9tarif edilmistir. Bu hücreler algılamak ve moleküler desenleri patojen ilişkili (PAMPs), doğuştan gelen bağışıklık tanıma reseptörleri Toll benzeri reseptörler (TLR)10gibi ile korunmuş mikrobiyal bileşenleri yanıt. Bugüne kadar 13 fonksiyonel TLRs, hangi bakteri hücre duvarı bileşenleri, kamçılı protein ve mikrobiyal nükleik asitler10gibi mikrobiyal bileşenleri tanımak tarif edilmistir. PAMP, lipopolysaccharide (LPS), gram-negatif bakteri TLR4 tarafından tanınan bir hücre duvarı bileşeni sirkadiyen ritim, organizma ve moleküler düzeyde değiştirmek için gösterilmiştir. Örneğin, LPS vivo içinde meydan etkinlik fareler11 tarafından ölçülen fotosentez benzeri faz gecikmeler indüklenen ve indirimli saat gen ekspresyonu SCN (sahne) ve in situ hibridizasyon ve kantitatif PCR ile belirlendiği gibi karaciğer yol açtı, sırasıyla, içinde12sıçanlar. Sonra bir vivo içinde sorun LPS ile qPCR ile ölçülen birkaç saat genlerin değişmiş ifade insan periferik kan lökosit13 ve deri altı yağ dokusu14 analizi ortaya koydu. Son olarak, insan makrofajlar ve fare peritoneal makrofajlar, ayrıca yol açtı ex vivo LPS sorunları qPCR14tarafından ölçülen saat ifade değiştirdi.
Burada, biz PAMPs LPS, (sentetik oligonucleotides içeren bazlar CpG motifler) ODN1826, etkisini değerlendirmek için bir protokol tanımlamak ve TLR4, TLR9 ve TLR2, tarafından tanınan ısı öldürdü Listeria Monositogenez (HKLM), sırasıyla, Moleküler saat Gen ifadesinin içinde fare splenocytes. Protokol fare splenektomi, splenocyte yalıtım ve meydan okuma, RNA ayıklama, cDNA sentezi ve qPCR birkaç saat genlerin ifade değerlendirmek için içerir. Bu iletişim kuralı çok az hayvan ile bağışıklık hücreleri çok sayıda zamanında edinimi için izin verir veya daha sonra olabilir hücresel manipülasyon ex vivo çeşitli PAMPs ile meydan. Moleküler saat bağışıklık yanıtı8,15,16, çeşitli açılardan modüle gösterilmiştir, bu nedenle, moleküler saat çalışmasının büyük olasılıkla uygun zamana bağımlı varyasyonu zarar bağışıklık yanıtı. Sirkadiyen ritim kesintileri ciddi patolojiler17,18,19,20' ye neden olabilir beri Ayrıca, araştırmacılar splenocytes geniş bir yelpazede meydan okumak için ilgi olabilir moleküller ve saat onların etkisi değerlendirmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Çalışma sırasında hayvan bakım ve tedavi Ulusal Sağlık Enstitüleri ilkesiyle uyulması, kurumsal kılavuzlarınıza uygun olarak vardı ve Hartford Üniversitesi hayvan kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı Komitesi tarafından kabul edildi.
1. hayvanların sürüklenme
Not: 20 haftalık erkek B6129SF2/J fareler çalışmada kullanılır.
- Fareler (Standart genel gider beyaz ışık) 12 h ışık için trene binmek / 12 h karanlık döngüsü 2 hafta önce deney için.
Not: Burada zeitgeber zaman (ZT) 0 ışıkları ve ZT12, ışıkları tüm diğer çevresel faktörler (Örneğin, yiyecek, su ve oda sıcaklığında) tutarak karşılık gelen sabit 21.
2. aletleri, kültür orta ve meydan okuma orta hazırlanması
- Otoklav forseps ve diseksiyon makası. Buzlu mikroskop slaytlar alüminyum folyo ve basınçlı kap çiftlerini sarın.
- Kültür orta fetal Sığır serum (FBS) ekleyerek RPMI 1640 için % 10 son bir konsantrasyon için hazırlayın. Kültür ortamına aşağıdaki PAMPs ekleyerek 10 mL 50 mL tüpler ortamda meydan hazırlamak (RPMI % 10 ile FBS); LPS (5 µg/mL), ODN1826 (5 µg/mL), ısı-öldürdü Listeria Monositogenez (108 HKLM/mL), veya başka bir PAMP onun önerilen konsantrasyon.
- Sıcak kültür orta ve meydan okuma orta olarak 37 ° C'de bir su banyosu ve yaklaşık 70 mL steril fosfat tamponlu tuz (PBS, pH 7.2) Oda sıcaklığında tutmak.
- Kültür bir 10 mL pipet ve pipet yardım etmek için bir 50 mL tüp ve yer buz üzerinde kullanarak orta 10 mL ekleyin.
- Yaklaşık 30 mL % 70 etanol makas ve forseps mikrobiyal kontaminasyonu önlemek için kabı diseksiyon of a 100 mL kabı ve yer biter ekleyin.
- Lizis arabellek RNA izolasyon için 10 µL β-Mercaptoethanol (altında bir duman hood) ekleyerek arabellek RLT 50 mL tüp içinde her 1 mL hazır olun. Sadece gerekli (yaklaşık 1 x 106 hücreleri oluşur örnek başına 600 µL) olacak miktar olun.
Not: Arabellek RLT silika membran için RNA bağlamayı destekler RNA ekstraksiyon kiti bir bileşenidir.
3. Splenocyte yalıtım ve meydan okuma
- Onları kendi özgün kafeste tutma ve 3 L/dak 1 dk. için CO2 durur nefes sonra tedarik devam akış hızında kafesine CO2 ekleyerek narkoz üzerinden belirli zeitgeber zaman fareler ötenazi.
- Servikal yerinden çıkması ile ölüm kafatası tabanında boynun iki tarafında başparmak ve işaret parmağı yerleştirerek onaylayın. Alternatif olarak, kafatası tabanında bir çubuk (Öte yandan kullanarak) hızlı bir şekilde kablolarıylaberaber kuyruk veya servikal vertebra ayrılması kafatası22neden arka bacaklarda Bankası basın.
- Fare gövde ile % 70 etanol ve kağıt havlu ile silin sprey. Üstünde onun sırt ve biraz eğik sağ yan üzerine fareyi getirin. Kürk kes gitsin, anatomi kullanarak, fare sol tarafında hakkında yarım ön ve arka bacakları makas.
- Forseps kullanarak, Karın zarını kapmak ve dikkatle dalak zarar için bir kesik yapın. Forseps ile dalak çıkarın ve Kültür medya buz üzerinde yaklaşık 10 mL içeren bir steril 50 mL tüp içine yerleştirin. Kalan hayvanlar için yineleyin.
Not: Dalak bir börülce rengidir ve daha uzun ve böbrek daha düz. -
Kültür Orta 2 mL ile bir dalak için küçük steril Petri kabına aktarın.
- Dalak iki steril buzlu slayt buzlu kısmı arasında taşlama tarafından lunaparkçı. Mümkünse, sorun ve hücreleri ortamda homojenizasyon işlemi sırasında tut.
- Bir kez iyice homojenize damlalıklı kültür splenocytes 50 mL tüp içine 40 µm naylon hücre süzgeç aracılığıyla içeren Orta 2 mL.
- Buzlu slaytları yeni çift, 50 mL tüpler kültür orta ve hücre Süzgeçler kullanarak kalan dalağı için yukarıdaki adımları yineleyin.
- Her splenocytes için toplam hacmi 10 mL/tüp içeren 50 mL tüpler 8 mL soğuk kültür ortamının ekleyin. Bir hemasitometre kullanarak mililitre başına hücre sayısını belirleyin.
- Yaklaşık 1 x 106 hücreler/iyi 6-şey kültür tabakaları bana ekleyin. Hücreleri de deney için kullanılan farklı PAMPs sayısına karşılık gelen ve bir denetim dahil kuyu sayısını ekleyin. 3 mL kültür ortamının veya meydan okuma orta 3 mL ilgili wells için ekleyin.
- Plakayı %5 CO2 3 h için 37 ° C'de kuluçkaya.
- Hücreleri de P1000 micropipette bağlı bir 1000 µL damlalıklı ucu kullanarak alt kazı. 15 mL tüp için aynı 1.000 µL damlalıklı ucu kullanarak hücreleri içeren orta aktarın.
- Santrifüjü 167 x g oda sıcaklığında 5 min için de üzerinden hücreleri cips. Süpernatant kaldırmak ve hücre Pelet 5 mL de PBS ile yıkayın.
- Hücreleri 167 x g de ikinci kez 5 min için cips, süpernatant kaldırın ve hücreleri parçalayıcı için hücre Pelet lizis arabelleği 600 µL ekleyin. Sonra RNA izolasyon için ilerlemek.
4. RNA izolasyon ve cDNA sentezi
- Splenocytes RNA ekstraksiyon kiti üreticinin yönergelerine uygun kullanarak gelen RNA yalıtmak ve 'isteğe bağlı' sütun üzerinde DNA sindirim gerçekleştirin.
- CDNA sentez önce RNA konsantrasyonu konsantrasyonu en uygun RNA aralığı (en çok 2 µg) içinde olduğunu doğrulamak için bir microvolume spektrofotometre kullanarak cDNA sentez Kit'in belirlemek.
- Synthesize cDNA her üreticinin yönergelerine uygun ters transkripsiyon seti kullanarak örnekleri için. RNA'ın 10 µL her 20 µL toplam reaksiyon birimindeki örnekleri için kullanın. Ters transkripsiyon (thermocycler çalıştırmak) bitiminde 20 μL Ekle H2O her tepki için.
- Standart eğri cDNA hazırlamak için 0.5 mL tüp içine birkaç denetim örneklerinden (Örneğin, 5 10 µL toplamda 2 örneklerinden µL) mRNA havuzu için bir P10 veya P20 micropipette kullanarak oluşturun.
- 10 µL 2 x transkriptaz ana karışımı ekleyin.
- Ters transkripsiyon bitiminde, standart eğri seyreltme serisinde başlangıç konsantrasyonu ("1") görev yapacak tepki tüp H2O 10 µL ekleyin.
- 10 kat seyreltme serisi (1-10-4) 45 µL P100 veya P200 micropipette 10-1, 10-2, 10-3ve 10-4dört 0.5 mL tüpler içine kullanarak su ekleyerek gerçekleştirin.
- 5 µL P20 micropipettor, yukarı ve aşağı pipetting tarafından mix kullanarak başlangıç konsantrasyon "1" (10-1) ilk tüp içine eklemek birkaç kez, sonra transfer 5 µL tüp içine 10-1 tüp belirlenmiş 10-2 ve karışımı.
- 5 µL P20 micropipette 10-2 tüp 10-3 özel tüp kullanarak transfer ve karıştırın. 5 µL P20 micropipettor 10-3 tüp 10-4 özel tüp kullanarak transfer ve karıştırın.
5. kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR)
- MRNA düzeylerinin göreli Nefelometri qPCR tarafından belirler. İçinde deneysel Kur'u "Nefelometri - göreli standart eğri" ve "TaqMan" Kimya seçin. Değişiklik tepki birime 10 µL. plaka düzenine (Örneğin, hedef gen, standart eğri, muhabir, vb) ilgili bilgileri girin.
- İçerdiği 0.5 µL astar/sonda testin, gen ifade ana karışımı 5 µL, H2O 2 µL ve 2.5 tepki hazırlıkları µL cDNA (10-100 ng).
- Bu standart eğri eklediğinizden emin reaksiyonlar, negatif denetimleri, her tepki performans yinelenen ve hesap olacaktır 2 İlave reaksiyonlar sayısına göre her biri önceki reaktifleri (hariç cDNA) çarparak ana bir karışım hazırlamak Pipetting değişim için.
- Damlalıklı 7.5 µL bir 96-iyi tepki plaka bir micropipette veya bir çok kanallı pipet ile önceden belirlenmiş kuyu içine Ana hazırlanan karışımı. Damlalıklı cDNA bilinmeyenli ve standartları için uygun kuyunun içine 2.5 µL ve H2O negatif kontrol kuyu içine 2.5 µL.
- Çeşitli moleküler saat genler için astar/sonda deneyleri ve aynı zamanda bir tahlil için bir endojen denetimi (Örneğin, β-aktin) içerir.
- Göreli ifade değerleri belirlemek için her çoğaltma için Ortalama göreli miktarını hesaplamak sonra her örnek için hedef gen için Ortalama göreli miktarı ile β-aktiniçin Ortalama göreli miktarı bölün.
6. istatistiksel analiz
- İstatistiksel analiz yazılımı kullanarak, veri sütun istatistikleri seçeneği altında programa girin. Bir tek yönlü ANOVA saat Gen ifadesinin denetimi karşı PAMP meydan sonra ortalama değerleri arasındaki farklar değerlendirmek için Dunnett'ın öğleden hoc testi ile seçin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fareler ZT13 kurban edildi, splenocytes izole edildi ve ex vivo PAMPs LPS, ODN1826 veya HKLM meydan. 3 h sonra RNA izole edildi ve qPCR saat, Per2, Dbp ve Rev-erbα tartışmasız denetim hücrelere kıyasla moleküler saat genlerin göreli ifade düzeylerini değerlendirmek için kullanılır. PAMP meydan sonra saat ifade düzeyleri kontrol hücreleri (Şekil 1A) ifadesinde önemli ölçüde farklı değildi. Per2 ifade düzeyleri önemli ölçüde LPS ve tartışmasız denetimlere (Şekil 1B) karşılaştırıldığında ODN1826 meydan hücrelerdeki yüksek. LPS Rev-erbα ifade, değiştirmek için tek PAMP mRNA düzeyleri önemli ölçüde tartışmasız denetimleri (Şekil 1C) daha düşük olduğu gibi oldu. Son olarak, önemli ölçüde daha düşük mRNA düzeyleri Dbp için meydan okuma ile her zaman denetimlere (Şekil 1D) göre PAMPs sonra tespit edildi. Ne daha önce tüm incelendiğinde, ilişkili genlerine Dbp ifade eğilimi en PAMP challenge23tarafından etkilendiği gösterilmiştir ile tutarlı.
Resim 1 : Ex vivo PAMP meydan sonra fare splenocytes içinde değiştirilmiş saat gen ekspresyonu. Splenocytes ZT13 izole edildi ve LPS, ODN1826 veya HKLM ile meydan. Göreli saati mRNA düzeyleri (β-aktin için normalleştirilmiş) qPCR 3 h tarafından meydan sonra belirlenmiştir. Her veri noktası için 1 hayvan ifade düzeyini temsil eder. Deneysel ortalama + SEM verilir. p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Belirtilen sorunlar denetimden (tartışmasız hücreleri) Dunnett'ın öğleden hoc testi ile tek yönlü ANOVA göre önemli ölçüde farklı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokolde, microvolume spektrofotometre ölçmek ve gen ekspresyonu belirlemede kullanılan RNA saflığı değerlendirmek için kullanılabilir. Nükleik asitler absorbe UV ışığı 260 nm, proteinler genellikle 280 ışığı absorbe bir RNA çıkarma işlemi (Örneğin, fenol) sırasında kullanılan diğer potansiyel kirletici 230 tespit olmakla birlikte nm, nm. Bu nedenle, absorbans (bir) oranında 260/280 değerlendirme tarafından nm (RNA protein) ve 260/230 nm (protein olmayan kirletici için RNA) RNA kalitesini tespit edilebilir. Yüksek kaliteli RNA 1.8-2.1, olarak daha düşük oranları arasındaki bir A260/280 oranı protein kontaminasyonu göstermek vardır. Saf bir RNA örnek 2.0 bir A260/230 oranına sahip olması.
(Yani, Per2, saati, Rev-erbα ve Dbp), bir hedef geni göreceli ifade belirlerken bir endojen denetim gen (hangi ifadede düzeyleri farklı değildir örnekleri arasında bir gen) da seçilmiş olması gerekir. Göreceli hedef Gen ifadesinin ardından endojen denetim gen ifade için normalleştirilmiş. Başlangıç materyali (splenocytes sayısı), varyasyon transkriptaz verimlilik, RNA bozulması, vb, değişen oranlarda farklılıkları için endojen denetim gen (β-aktin bu protokolü) tarafından düzeltilecektir. Ancak, muayene ediliyor tedavi endojen denetim gen ifadesi değiştirmez doğrulamak akıllıca olacaktır. Bu hücreler (tedavi vs sigara-tedavisi) eşit sayıda birkaç çoğaltır düzeylerinden β-aktin değerlendirmek tarafından gerçekleştirilebilir. Teorik olarak, β-aktin düzeyleri aynı olmalıdır. Endojen denetim varyasyon karşı korumak için başka bir yaklaşım endojen denetimleri (Örneğin, β-aktin, Gapdh ve 18S rRNA gen) oluşan bir panel kullanmak olacaktır.
Moleküler saat PAMPs etkisi incelerken, ne zaman are euthanized fareler ve splenocytes daha sonra meydan saati dikkate alınması gerekir. TLR ifade ve yanıt verme hızını daha önce gösterildi zaman günün bağımlı değişim8,15, bu nedenle, TLR yanıt zirvede, ne zaman günün bir saatini sonucu üzerinde büyük bir etkisi olarak göstermek için saat. Ayrıca, moleküler saat genlerin ifade de splenocytes gün boyunca dalgalanma olacaktır, bu nedenle, saat gen ekspresyonu PAMP sorun nedeniyle bir azalma tepe ifade9saat sırasında incelendiğinde en önemli olacaktır. Beri DBP ve Rev-erbα gösterilmiştir splenocytes önemli ifade Peaks'e göstermek için ve dalak bağışıklık hücreleri koyu çevresinde Interphase 8,9,23, 24 (ZT12), geçerli yöntemde, hücreleri izole ve bu genlerin bir azalma tespit daha büyük bir şansı var amacıyla ZT13 meydan. Buna karşılık, saat ifade, artış olabilir bir PAMP olasılıkla gözlenen Eğer günün saat ifade, en düşük fiyat ne zaman bir zamanda seyir.
Fareler gece hayvan olduğundan, onların geri kalan insan faaliyetleri için karşılık gelen ışık süresi içinde aşamasıdır. Bu nedenle, ideal olarak, fareler en az trafik ve bu farelerin sirkadiyen ritim kesintiye uğratabilir gündüz bozuklukları azaltmak için-ses makinesi içeren bir bir oda olabilir muhafaza. Ayrıca, kafes değişiklikleri de deney tarihi öncesinde yapılmalıdır. Herhangi bir çalışma (ötenazi hayvanlar dahil) hayvan Oda karanlık dönemde yürütülen kırmızı ışık altında fareler ritimlerin etkilemesini önlemek için.
Diurnal ritim hangi zeitgebers olarak adlandırdığı çevresel uyaranlara (Örneğin, ışık veya gıda), tabi tutulmaktadır. Söz konusu olduğunda bir 12 saat ışık/12 h karanlık döngüsü, zeitgeber (Yani, ışık) için 24 saat süre saatini sıfırlar. Çoğu diurnal ritim sirkadiyen olmakla birlikte (harici bir işaret olmaması durumunda ortaya çıkanYani, günlük ritimleri), onlar sürekli çevresel koşullar altında bir yaklaşık 24 saat süre ile salınım gösterilen kadar onlar gerçek sirkadiyen ritim değildir . Bu nedenle, bu yordam entraining fareler koyu döngüsü için sonra hayvanlar sürekli karanlıkta örnekleme önce 3 gündür tutan ama yukarıda açıklandığı gibi gerektirecektir istiyorsunuz sürekli koşullar altında fare kullanarak gerçekleştirilebilir. Bu tür bir deney için karanlık karanlık bir (DD) deneme ve örnekleme süresi noktası CT (sirkadiyen saat), değil ZT anılacaktır denir.
Bu yöntem-ebilmek tanımak saat gen ekspresyonu splenocytes içinde alter PAMPs iken, o bu PAMPs ana saat veya vücut boyunca periferik saatler etkilemesi göz önünde bulundurur değil. Dalak hücre türdeş olmayan nüfusu oluşmaktadır yana bireysel PAMPs her hücre tipi farklı etkileyebilir. Örneğin, Tlr9 ifade ritimler fare dalak splenocytes, makrofajlar, B hücreleri ve DCs15arasında değişir. Ayrıca, Tlr1, Tlr3, Tlr4, Tlr6, Tlr7ve Tlr8 bir yapisan splenocyte nüfus önemli günlük salınımlar görüntülenmez ancak günlük deneyim sadece Tlr2 ve Tlr6 salınımlarını zenginleştirilmiş dalak Makrofajlar24. Bu nedenle, tek tek hücre tipleri üzerinde bir meydan okuma sonucu araştırmak için hücreleri manyetik hücre,9,15 daha önce açıklanan ve daha sonra meydan gibi sıralama ile izole olabilir. Ayrıca, dalak hücre nüfus da bir rol duyarlılık içinde belirli PAMP ve sonraki etkisi üzerinde8saat oynayabilir günlük döngüsü içinde değişiklik gösterir.
Bu yöntem çok sayıda B hücreleri (~ %58), T hücreleri (~ %21), dendritik hücreler (~ %5) ve makrofajlar (~ % 4)25ağırlıklı oluşur bağışıklık hücreleri yalıtım için sağlar. Hücreleri çok sayıda PAMPs çeşitli tek denemede splenocytes meydan okumak için fırsat sağlar. Splenocyte yalıtım yordam çok kolaydır gerçekleştirmek için (hayvan sayısına bağlı olarak) dakika içinde ve moleküler saat çünkü incelerken gerekli olan en az hayvan veya hücresel manipülasyon ile tamamlanabilir yukarıda da belirtildiği Bu eylemler zamanlama saati hem de saat denetimli genlere bozabilir. Bu yordam için son derece önem arasında olarak tekrarlanabilir sonuçlar meydan ve tartışmasız hücreleri ile sadece üç hayvan elde ve sonuçları daha önce yayımlanmış çalışma23 ile (Şekil 1) tutarlı edildi. Bu hayvanlar grubu başına artan bir meydan okuma grubu ve denetim (Örneğin, ODN 1826 ve Rev-erbα) arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar ortaya unutulmamalıdır.
Bu protokolü yalnızca saat gen ekspresyonu PAMP meydan sonra akut etkisi adresleri ise ileride, bu ilke daha fazla araştırma yapılması için kanıtlamak. Örneğin, bu tahlil bir model olarak moleküler mekanizmaları ile ilgili TLR - PAMP deşifre için kullanılabilir etkileşim ve nasıl moleküler saat etkiler. Bir zaman ders (değişen kez meydan deftere naklettikten sonra ifade değerlendirirkenyani ) deney tarafından belirlenen bir PAMP meydan okuma sonra kurtarmak moleküler saat için geçen süreyi belirlemek için de kullanılabilir. Yukarıda belirtildiği gibi sonraki deneyler PAMP sorunu belirli splenocyte hücre popülasyonlarının üzerinde incelemek için gerçekleştirilebilir. Birkaç patojenlerin enfeksiyon üzerine birden çok TLRs teşvik beri ile birden fazla PAMPs zorlu saat gen ekspresyonu sinerjik etkisi varsa araştırmak için bu iletişim kuralını kullanmanız için ilginç olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazar ifşa etmek hiçbir şey vardır.
Acknowledgments
Bu eser tarafından desteklenmiştir fakülte araştırma hibe Hartford Üniversitesi, üniversite Sanatlar ve Bilimler Dekan'ın ofisinden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Frosted slides | Fisher | 12-550-343 | |
| Cell strainers | Fisher | 22363547 | |
| Lipopolysaccharide | InvivoGen | ltrl-eklps | |
| ODN1826 | InvivoGen | Tlrl-1826-1 | |
| HKLM | InvivoGen | Tlrl-hklm | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| PBS | Gibco | 20012-043 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 or 74106 | |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| 6-well cell culture plate | Denville | T1006 | |
| 50 mL tubes | Corning | 352070 | |
| 15 mL tubes | Corning | 352097 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher | 4368814 | |
| TaqMan Gene Expression Assays b-actin | ThermoFisher | Mm00607939_s1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Per2 | ThermoFisher | Mm00478113_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Rev-erba | ThermoFisher | Mm00520708_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Bmal1 | ThermoFisher | Mm00500226_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Dbp | ThermoFisher | Mm00497539_m1 | |
| qPCR machine StepOnePlus | ThermoFisher | ||
| TaqMan Gene Expression Master Mix | ThermoFisher | 4369016 | |
| MicroAmp Fast 96-well reaction plate (0.1 mL) | ThermoFisher | 4346907 | |
| Statistical Analysis Software | Prism 7.0a |
References
- Bell-Pedersen, D., et al. Circadian rhythms from multiple oscillators: lessons from diverse organisms. Nat. Rev. Genet. 6, 544-556 (2005).
- Mohawk, J. A., Green, C. B., Takahashi, J. S. Central and Peripheral Circadian Clocks in Mammals. Annu. Rev. Neurosci. 35, 445-462 (2012).
- Balsalobre, A., Damiola, F., Schibler, U. A serum shock induces circadian gene expression in mammalian tissue culture cells. Cell. 93, 929-937 (1998).
- Yoo, S. -H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 5339-5346 (2004).
- Yamazaki, S. Resetting Central and Peripheral Circadian Oscillators in Transgenic Rats. Science. 288, 682-685 (2000).
- Lowrey, P. L., Takahashi, J. S. Genetics of circadian rhythms in mammalian model organisms. Adv. Genet. 74, 175-230 (2011).
- Curtis, A. M., Bellet, M. M., Sassone-Corsi, P., O'Neill, L. A. J. Circadian Clock Proteins and Immunity. Immunity. 40, 178-186 (2014).
- Keller, M., et al. A circadian clock in macrophages controls inflammatory immune responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21407-21412 (2009).
- Silver, A. C., Arjona, A., Hughes, M. E., Nitabach, M. N., Fikrig, E. Circadian expression of clock genes in mouse macrophages, dendritic cells, and B cells. Brain. Behav. Immun. 26, 407-413 (2012).
- Kawai, T., Akira, S. The role of pattern-recognition receptors in innate immunity update on Toll-like receptors. Nat. Publ. Gr. 11, 373-384 (2010).
- Marpegán, L., Bekinschtein, T. A., Costas, M. A., Golombek, D. A. Circadian responses to endotoxin treatment in mice. J. Neuroimmunol. 160, 102-109 (2005).
- Okada, K., et al. Injection of LPS Causes Transient Suppression of Biological Clock Genes in Rats. J. Surg. Res. 145, 5-12 (2008).
- Haimovich, B., et al. In vivo endotoxin synchronizes and suppresses clock gene expression in human peripheral blood leukocytes. Crit. Care Med. 38, 751-758 (2010).
- Curtis, A. M., et al. Circadian control of innate immunity in macrophages by miR-155 targeting Bmal1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 7231-7236 (2015).
- Silver, A. C., Arjona, A., Walker, W. E., Fikrig, E. The Circadian Clock Controls Toll-like Receptor 9-Mediated Innate and Adaptive Immunity. Immunity. , (2012).
- Gibbs, J. E., et al. The nuclear receptor REV-ERB α mediates circadian regulation of innate immunity through selective regulation of inflammatory cytokines. PNAS. 109, 582-587 (2012).
- Zee, P. C., Attarian, H., Videnovic, A. Circadian rhythm abnormalities. Contin. Lifelong Learn. Neurol. 19, 132-147 (2013).
- Bovbjerg, D. H. Circadian disruption and cancer: sleep and immune regulation. Brain. Behav. Immun. 17, 48-50 (2003).
- Fu, L., Lee, C. C. The circadian clock: pacemaker and tumour suppressor. Nat. Rev. Cancer. 3, 350-361 (2003).
- Germain, A., Kupfer, D. J. CIRCADIAN RHYTHM DISTURBANCES IN DEPRESSION. Hum. Psychopharmacol. 23, 571-585 (2008).
- Basic Mouse Care and Maintenance. JoVE. , Cambridge, MA. JoVE Science Education Database (2018).
- Leary, S., et al. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals : 2013 Edition. AVMA. , (2013).
- Silver, A. C. Pathogen-associated molecular patterns alter molecular clock gene expression in mouse splenocytes. PLoS One. , 12-15 (2017).
- Silver, A. C., et al. Daily oscillations in expression and responsiveness of Toll-like receptors in splenic immune cells. Heliyon. , 00579 (2018).
- Flow-cytometric Anal. 11 strains mice. MPDJaxpheno6. Mouse Phenome Database web Resour. (RRIDSCR_003212). Jackson Lab. , Bar Harb. Maine USA. Available from: https//phenome.jax.org (2018).
