Summary
ويصف هذا البروتوكول تقنية باستخدام الماوس سبلينوسيتيس لاكتشاف أنماط الجزيئية المرتبطة بالعوامل الممرضة التي تغير التعبير الجيني الجزيئي على مدار الساعة.
Abstract
من السلوك للتعبير الجيني، تنظيم إيقاعات circadian تقريبا جميع جوانب علم وظائف الأعضاء. وهنا، نقدم منهجية لتحدي سبلينوسيتيس الماوس مع أنماط الجزيئية المرتبطة بالعوامل الممرضة (بامبس) lipopolysaccharide (LPS)، ODN1826، وقتل الحرارة الليستريه المستوحدة ، ودراسة أثرها على الجزيئية الإيقاعية على مدار الساعة. سابقا، وقد ركزت الدراسات على دراسة تأثير لبس على مدار الساعة الجزيئية باستخدام مجموعة متنوعة من النهج في فيفو و السابقين فيفو من مجموعة متنوعة نماذج (مثل الماوس وفار، والإنسان). ويصف هذا البروتوكول بالعزلة والتحدي سبلينوسيتيس، فضلا عن المنهجية لتقييم ساعة الجينات التعبير التحدي فيما بعد عن طريق PCR الكمي. يمكن استخدام هذا النهج لتقييم ليس فقط تأثير العناصر الجرثومية على مدار الساعة الجزيئية لكن الجزيئات الأخرى، فضلا عن أنه قد يغير التعبير على مدار الساعة. ويمكن استخدام هذا النهج في ندف أربا الآلية الجزيئية لكيفية تأثير تفاعل مستقبلات بمب-عدد القتلى-مثل التعبير على مدار الساعة.
Introduction
الساعة الرئيسية في الثدييات، الذي ينظم ذبذبات ح 24 لما يقرب من جميع الجوانب لعلم وظائف الأعضاء والسلوك، يقع داخل نواة suprachiasmatic (SCN)1،تحت المهاد2. وبالإضافة إلى تنظيم العمليات البيولوجية على المستوى العضوي، مزامنة الساعة الرئيسية أيضا الطرفية الساعات الخلوية في جميع أنحاء الجسم3،،من45. بينما تتألف الآلية الجزيئية على مدار الساعة من على الأقل ثلاث حلقات التغذية المرتدة النسخي متعدية المتشابكة، نواة تتكون من الفترة (Per1-3)، كريبتوتشرومي (Cry1-2)، Bmal1، و على مدار الساعة الجينات6،7. إلى جانب الحفاظ على دقة توقيت ساعة جزيئية أساسية، بعض منتجات الجينات المساعدة على مدار الساعة (مثلاً، القس-erbα و دبة) أيضا تنظيم الجينات غير على مدار الساعة، أي ساعة الجينات التي تسيطر عليها (ككجس)6 , 7.
وقد وصف الساعات الجزيئية الوظيفية في مختلف الأنسجة المناعية (مثلاً، الطحال والعقد الليمفاوية)8 والخلايا (مثلاً ب الخلايا، والخلايا الجذعية، الضامة)8،9. الكشف عن هذه الخلايا وتستجيب لمسببات الأمراض المرتبطة أنماط الجزيئية (بامبس)، المكونات الميكروبية مصانة، عن طريق مستقبلات الاعتراف المناعة الفطرية مثل عدد القتلى تشبه المستقبلات (TLRs)10. حتى الآن، وقد وصف 13 TLRs الوظيفية، التي تعترف بمكونات الميكروبية مثل مكونات جدار الخلية البكتيرية وفلاجلر البروتين والأحماض النووية الجرثومية10. لقد ثبت بمب، lipopolysaccharide (LPS)، مكون جدار الخلية للبكتيريا سلبية الغرام المعترف بها TLR4، إلى تغيير إيقاعات circadian على المستويين العضوي والجزيئية على حد سواء. على سبيل المثال، الناجم عن تأخر المرحلة مضاءة مثل مقاسا بنشاط في الفئران11 في فيفو التحدي للبس وأدت إلى انخفاض على مدار الساعة التعبير الجيني في اللجنة الفرعية للتغذية في الكبد كما تحددها التهجين في الموقع و PCR الكمي، على التوالي، في12من الفئران. بعد تحديا في فيفو مع لبس، كشف تحليل للدم المحيطي البشري الكريات البيضاء13 و14 من الأنسجة الدهنية تحت الجلد التعبير غيرت عدة الجينات على مدار الساعة الذي يقاس عن طريق قبكر. أخيرا، غيرت السابقين فيفو التحديات لبس الضامة البشرية والضامة البريتوني الماوس، أدت أيضا إلى التعبير على مدار الساعة مقاسا قبكر14.
هنا، يمكننا وصف بروتوكول لتقييم تأثير "لبس بامبس"، ODN1826 (أونميثيلاتيد النوكليوتيد الاصطناعية التي تحتوي على زخارف البد)، وقتلت الحرارة الليستريه المستوحدة (HKLM)، المعترف بها TLR4 و TLR9 و TLR2، على التوالي، التعبير الجيني الجزيئي على مدار الساعة في سبلينوسيتيس الماوس. ويتضمن البروتوكول استئصال الماوس والعزلة سبلينوسيتي والتحدي والحمض النووي الريبي استخراج، كدنا التوليف و qPCR لتقييم العديد من الجينات على مدار الساعة. يسمح هذا البروتوكول للحصول في الوقت المناسب على عدد كبير من الخلايا المناعية مع القليل جداً من الحيوان أو التلاعب الخلوية، التي يمكن ثم طعن السابقين فيفو مع بامبس مختلف. لقد ثبت على مدار الساعة الجزيئية لتعدل مختلف جوانب الاستجابة المناعية8،،من1516، ولذلك توقف عقارب الساعة الجزيئية يضر على الأرجح الاختلاف تعتمد على الوقت المناسب الاستجابة المناعية. وبالإضافة إلى ذلك، نظراً لانقطاع إيقاعات circadian يمكن أن تؤدي إلى أمراض خطيرة17،18،،من1920، قد تكون ذات فائدة للباحثين لتحدي سبلينوسيتيس مع مجموعة واسعة من الجزيئات وتقييم تأثيرها على مدار الساعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أثناء الدراسة، ورعاية الحيوان ومعاملة الامتثال لسياسة "المعاهد الوطنية للصحة"، تم وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية، وأقرتها جامعة هارتفورد الحيوان رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة.
1-الرائعة للحيوانات
ملاحظة: تستخدم الفئران الذكور B6129SF2/ي عشرين أسبوع في الدراسة.
- الظلام 12 ح دورة لمدة أسبوعين قبل التجربة/انترين الفئران إلى ح 12 خفيفة (البيضاء الخفيفة النفقات العامة القياسية).
ملاحظة: هنا وقت زيتجيبير (ZT) 0 يناظر إلى ZT12 وأضواء على الأنوار، مع الحفاظ على جميع العوامل البيئية الأخرى (أي، من الغذاء والماء، ودرجة حرارة الغرفة) ثابت 21.
2-إعداد الصكوك والثقافة المتوسطة، والمتوسطة التحدي
- اﻷوتوكﻻف ملقط ومقص تشريح. التفاف أزواج من شرائح المجهر متجمد في رقائق الألومنيوم والاوتوكلاف.
- إعداد متوسطة الثقافة عن طريق إضافة المصل البقري الجنين (FBS) إلى RPMI 1640 بتركيز نهائي 10%. إعداد 10 مل متوسط التحدي في أنابيب 50 مل بإضافة بامبس التالية إلى متوسط الثقافة (ربمي مع 10% FBS)؛ لبس (5 ميكروغرام/مل)، ODN1826 (5 ميكروغرام/مل)، الحرارة-قتل الليستريه المستوحدة (108 HKLM/mL)، أو آخر بمب في تركيزه المقترح.
- حارة الثقافة المتوسطة والمتوسطة التحدي إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي، وإبقاء حوالي 70 مل من الفوسفات العقيمة مخزنة المالحة (PBS، الرقم الهيدروجيني 7.2) في درجة حرارة الغرفة.
- أضف 10 مل من الثقافة المتوسطة باستخدام الماصة 10 مل وماصة المعونة إلى أنبوب 50 مل ومكان على الجليد.
- إضافة حوالي 30 مل إيثانول 70% 100 مل كوب ومكان ينتهي من تشريح المقص والملقط في الكأس لمنع التلوث بالجراثيم.
- إعداد المخزن المؤقت لتحلل لعزل الحمض النووي الريبي بإضافة 10 ميليلتر β-Mercaptoethanol (تحت غطاء دخان) لكل 1 مل من RLT المخزن المؤقت في أنبوب 50 مل. تجعل فقط المبلغ الذي سيكون المطلوب (600 ميليلتر كل عينة، الذي يتألف من نحو 1 × 106 خلايا).
ملاحظة: RLT المخزن المؤقت هو مكون من مجموعة أدوات استخراج الحمض النووي الريبي التي تدعم ربط الحمض النووي الريبي للغشاء والسليكا.
3-سبلينوسيتي العزلة والتحدي
- Euthanize الفئران في وقت معين زيتجيبير عن طريق الخدر بإبقائها في قفص الأصلي إضافة CO2 إلى القفص بمعدل تدفق 3 لتر/دقيقة متابعة توريد CO2 ل 1 دقيقة بعد توقف عن التنفس.
- تأكيد الوفاة عن طريق خلع عنق الرحم بوضع الإبهام والسبابة على جانبي الرقبة في قاعدة الجمجمة. بدلاً من ذلك، اضغط قضيب في قاعدة الجمجمة حين سحب بسرعة (باستخدام اليد الأخرى) قاعدة الذيل أو أطرافه هند تسبب فصل فقرات عنق الرحم من الجمجمة22.
- رش جذع الماوس مع الإيثانول 70% ويمسح بمنشفة ورقية. ضع الماوس على الظهر ويميل قليلاً إلى الجانب الأيمن. قص بعيداً الفراء، استخدام تشريح المقص، على طول الجانب الأيسر للماوس، حول في منتصف الطريق بين الأمامي والخلفي الساقين.
- استخدام الملقط، الاستيلاء على الصفاق وجعل شق حتى لا تتعرض للضرر الطحال بعناية. إزالة الطحال بالملقط ووضعه في أنبوب 50 مل عقيمة التي تحتوي على حوالي 10 مل وسائط الثقافة على الجليد. تكرار للحيوانات المتبقية.
ملاحظة: الطحال هو لون حبة الكلي، وأطول وتملق من الكلي. -
نقل الطحال واحدة مع 2 مل من الثقافة المتوسطة إلى طبق بتري معقم صغيرة.
- مجانسة الطحال بالطحن بين الجزء متجمد من شريحتين متجمد العقيمة. إذا كان ذلك ممكناً، الاحتفاظ بالمسألة والخلايا في الأجل المتوسط خلال عملية التذويب.
- تجانس مرة دقيق، بيبيت 2 مل من الثقافة المتوسطة المحتوية على سبلينوسيتيس من خلال 40 ميكرومتر نايلون خلية مصفاة في أنبوب 50 مل.
- كرر الخطوات المذكورة أعلاه للطحال المتبقية باستخدام أزواج جديدة من الشرائح متجمد، أنابيب 50 مل مع الثقافة المتوسطة، ومصافي الخلية.
- إضافة 8 مل من البرد الثقافة المتوسطة لكل من الأنابيب 50 مل تحتوي على سبلينوسيتيس لإجمالي حجم 10 مل/الأنبوبة. تحديد عدد الخلايا في المليلتر استخدام هيموسيتوميتير.
- إضافة حوالي 1 × 106 خلايا/بئر إلى لوحات الثقافة 6-جيدا. إضافة خلايا إلى عدد الآبار التي تتوافق مع عدد بامبس المختلفة المستخدمة للتجربة وتشمل عنصر تحكم أيضا. إضافة مل 3 متوسطة الثقافة أو 3 مل من التحدي المتوسطة إلى الآبار الخاصة بكل منها.
- احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية في 5% CO2 لح 3.
- تتخلص الخلايا من الجزء السفلي من جيدا باستخدام تلميح بيبيت ميليلتر 1,000 يعلق على ميكروبيبيتي P1000. نقل المتوسطة التي تحتوي على الخلايا باستخدام نفس تلميح بيبيت 1,000 ميليلتر لأنبوب 15 مل.
- بيليه الخلايا عن طريق استخدام الطرد المركزي في 167 س ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة المادة طافية وتغسل بيليه الخلية مع 5 مل من برنامج تلفزيوني.
- بيليه الخلايا مرة ثانية في العاشر 167 ز لمدة 5 دقائق وإزالة المادة طافية، وإضافة 600 ميليلتر من تحلل المخزن المؤقت إلى بيليه الخلية لكي الخلايا. ثم انتقل إلى عزل الحمض النووي الريبي.
4-الجيش الملكي النيبالي العزلة وكدنا التوليف
- عزل الحمض النووي الريبي من سبلينوسيتيس باستخدام أدوات استخراج الحمض النووي الريبي وفقا لإرشادات الشركة المصنعة وأداء هضم الحمض النووي في العمود 'اختياري'.
- قبل توليف كدنا، تحديد تركيز الجيش الملكي النيبالي باستخدام جهاز المطياف الضوئي ميكروفولومي للتحقق من أن التركيز داخل النطاق الأمثل الحمض النووي الريبي (تصل إلى 2 ميكروغرام) من مجموعة أدوات التوليف كدنا.
- Synthesize كدنا لكل من العينات باستخدام مجموعة النسخ العكسي وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. استخدام 10 ميليلتر من الحمض النووي الريبي لكل من العينات في حجم رد فعل مجموع 20 ميليلتر. وعند اكتمال النسخ العكسي (ثيرموسيكلير تشغيل) إضافة 20 ميكروليتر ح2س لكل رد فعل-
- بناء التقويس القياسية باستخدام ميكروبيبيتي P10 أو P20 لتجمع مرناً من بضع عينات التحكم (مثلاً 5 ميليلتر من عينات 2 لما مجموعة 10 ميليلتر) في أنبوب 0.5 مل للإعداد كدنا.
- إضافة 10 ميليلتر 2 x ميكس الرئيسي المنتسخة العكسية.
- عند اكتمال النسخ العكسي، إضافة 10 ميليلتر من ح2س إلى أنبوب رد الفعل، التي ستكون بمثابة تركيز انطلاق ("1") في سلسلة تمييع للمنحنى المعياري.
- تنفيذ سلسلة تمييع الوقت (1 إلى 10-4) بإضافة 45 ميليلتر من الماء باستخدام ميكروبيبيتي P100 أو P200 إلى أربعة أنابيب 0.5 مل المعينة 10-1، 10-2، 10-3و 10-4.
- إضافة 5 ميليلتر من تركيز انطلاق "1" في الأنبوب الأول (10-1) استخدام ميكروبيبيتور P20، مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً عدة مرات، ثم نقل 5 ميليلتر من أنبوبة 10-1 في الأنبوب المعينة 10-2 ومزيج.
- نقل 5 ميليلتر استخدام ميكروبيبيتي P20 من أنبوبة 10-2 في أنبوب المعينة 10-3 ومزيج. نقل 5 ميليلتر استخدام ميكروبيبيتور P20 من أنبوبة 10-3 في أنبوب المعينة 10-4 ومزيج.
5-الكمية تفاعل البوليميراز المتسلسل (qPCR)
- تحديد كوانتيتيشن النسبي لمستويات مرناً ب qPCR. ضمن المجموعة التجريبية أعلى، حدد الكيمياء "كوانتيتيشن – النسبي المنحنى المعياري" و "تكمان". تغير حجم رد فعل إلى 10 ميليلتر. أدخل المعلومات ذات الصلة في تخطيط لوحة (مثلاً، الجينات المستهدفة، والمنحنى المعياري، مراسل، إلخ).
- إعداد رد فعل حيث يحتوي على 0.5 ميليلتر من التحليل التمهيدي/المسبار، 5 ميليلتر من مزيج الرئيسي التعبير الجيني، 2 ميليلتر من ح2س و 2.5 ميليلتر كدنا (10 – 100 نانوغرام).
- إعداد مزيج رئيسي بضرب كل من الكواشف السابقة (باستثناء كدنا) بالعدد من ردود الفعل، مع التأكد من أن تدرج تلك من المنحنى المعياري، عناصر سلبية، أداء كل رد فعل في التكرارات، وردود فعل إضافية 2 التي سيتم حساب لتباين بيبيتينج.
- بيبيت 7.5 ميليلتر مزيج الرئيسي استعداد في آبار محددة سلفا في لوحة رد 96-جيدا مع ميكروبيبيتي أو ماصة متعددة القنوات. بيبيت 2.5 ميليلتر من كدنا في البئر المجهولة والمعايير المناسبة، وميليلتر 2.5 من ح2س في آبار المراقبة السلبية.
- تشمل التحقيق التمهيدي/فحوصات لمختلف المورثات الجزيئية على مدار الساعة، ويشمل أيضا تحليل لعنصر تحكم ذاتية (مثلاً، β-أكتين).
- من أجل تحديد قيم التعبير النسبي، وحساب متوسط الكمية النسبية لكل تكرار، ثم لكل عينة، تقسيم متوسط الكمية النسبية للجينات المستهدفة بمتوسط الكمية النسبية ل β-أكتين.
6. التحليل الإحصائي
- استخدام برنامج التحليل الإحصائي، إدخال البيانات في البرنامج ضمن الخيار إحصائيات العمود. حدد ANOVA أحادي اتجاه مع الاختبار دونيت المخصص بعد تقييم الفروق بين قيم المتوسط الحسابي للتعبير الجيني ساعة بعد التحدي بمب مقابل عنصر التحكم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
كانت التضحية الفئران في ZT13، سبلينوسيتيس كانت معزولة وتحدي السابقين فيفو بلبس بامبس، ODN1826، أو HKLM. بعد ح 3، تم عزل الحمض النووي الريبي، وكان يستخدم qPCR لتقييم مستويات التعبير النسبي للجينات الجزيئية على مدار الساعة على مدار الساعة، Per2، دبة، و القس erbα مقارنة مع الخلايا التحكم دون منازع. بعد التحدي بمب، مستويات التعبير على مدار الساعة لم تكن تختلف اختلافاً كبيرا من التعبير في الخلايا التحكم (الشكل 1أ). مستويات التعبير Per2 كانت مرتفعة إلى حد كبير في الخلايا وتحدي مع لبس و ODN1826 بالمقارنة مع الضوابط دون منازع (الشكل 1ب). وكان لبس بمب فقط لتغيير التعبير القس erbα ، مستويات مرناً كانت أقل بكثير من الضوابط دون منازع (الشكل 1ج). وأخيراً، إلى حد كبير أقل مرناً لوحظت مستويات دبة بعد التحدي مع كل من بامبس عند مقارنتها بعناصر التحكم (الشكل 1د). وتمشيا مع ما سبق ثبت، من أصل جميع الجينات على مدار الساعة المرتبطة درست، افرجا التعبير يميل إلى أن يكون الأكثر تأثرا ب التحدي بمب23.
الشكل 1 : ساعة تغير التعبير الجيني في سبلينوسيتيس الماوس بعد السابقين فيفو التحدي بمب. كانت معزولة في ZT13 سبلينوسيتيس وتحدي مع لبس "أو" ODN1826 "أو" HKLM. كانت تحددها مستويات مرناً نسبيا على مدار الساعة (تطبيع إلى β-أكتين) قبكر ح 3 بعد التحدي. وتمثل كل نقطة بيانات مستوى التعبير للحيوان 1. وترد يعني تجريبية + وزارة شؤون المرأة. ف < 0.05، * *ف < 0.01، * * *ف < 0.001. التحديات المشار إليها قد تختلف اختلافاً كبيرا عن عنصر التحكم (الخلايا دون منازع) حسب ANOVA اتجاه واحد مع الاختبار المخصصة بعد دونيت. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ضمن هذا البروتوكول، يمكن استخدامها جهاز المطياف الضوئي ميكروفولومي قياس وتقييم نقاء الجيش الملكي النيبالي المستخدمة في تحديد التعبير الجيني. امتصاص الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة في 260 من الأحماض النووية شمال البحر الأبيض المتوسط، البروتينات عادة تمتص الضوء في 280 نانومتر، بينما الملوثات المحتملة الأخرى المستخدمة أثناء إجراء استخراج الحمض النووي الريبي (مثل الفينول) قابلة للاكتشاف في 230 نيوتن متر. لذلك، بتقييم امتصاص (أ) نسبة في 260/280 نانومتر (الحمض النووي الريبي للبروتين) و 260/230 نيوتن متر (الحمض النووي الريبي للملوثات غير البروتين) يمكن تقييم نوعية الجيش الملكي النيبالي. رنا ذات جودة عالية بنسبة A260/280 بين 1.8-2.1، كنسب أقل تشير إلى تلوث البروتين. وسيكون عينة الحمض النووي الريبي نقية نسبة A260/230 من 2.0.
عند تحديد التعبير النسبي للجينات المستهدفة (أي، Per2، على مدار الساعة، والقس-erbα، و افرجا)، جينات الرقابة ذاتية يجب أيضا تحديد (جين في التعبير الذي لا تختلف مستويات بين العينات). ثم هو تطبيع التعبير النسبي من الجينات المستهدفة للتعبير عن الجين الرقابة الذاتية. سيتم تصحيح الاختلافات في انطلاق المواد (رقم سبلينوسيتيس)، الاختلاف في كفاءة المنتسخة العكسية، وتباين معدلات تدهور الجيش الملكي النيبالي، إلخ، لمن الجينات الرقابة الذاتية (β-أكتين في هذا البروتوكول). ومع ذلك، أنه من الحكمة للتأكد من أن المعاملة التي يجري بحثها لا يغير من التعبير عن الجينات الرقابة الذاتية. يمكن أن يتحقق هذا بتقييم مستويات β أكتين من replicates عدة من عدد متساو من الخلايا (العلاج مقابل عدم-العلاج). ومن الناحية النظرية، ينبغي أن تكون مستويات β-أكتين متطابقة. نهج آخر للاحتراس من الرقابة الذاتية الاختلاف سيكون لاستخدام فريق ضوابط الذاتية (مثلاً، β-أكتين، جابده، و 18S مورثة الرنا الريباسي).
وعند دراسة تأثير بامبس على مدار الساعة الجزيئية، الوقت من اليوم عندما يتم euthanized الفئران وبعد ذلك تحدي سبلينوسيتيس يجب أن تؤخذ في الاعتبار. سابقا قد تبين التعبير Tlr واستجابتها لإثبات اختلاف الوقت من اليوم تعتمد8،15، ولذلك وقت من اليوم عندما يتم الاستجابة TLR في ذروته، يمكن أن يسفر عن تأثير أكبر على على مدار الساعة. وعلاوة على ذلك، كما سوف تتقلب الجينات الجزيئية على مدار الساعة طوال اليوم في سبلينوسيتيس، ولذلك، سيكون من أهم إذا درست خلال فترة ذروة التعبير9الحد تعبير الجيني على مدار الساعة بسبب التحدي بمب. منذ دبة و القس erbα قد ثبت أن تثبت قمم التعبير كبيرة في سبلينوسيتيس والطحال الخلايا المناعية حول الضوء--الظلام الطور البيني 8،9،23، 24 (ZT12)، في الأسلوب الحالي، تم عزل الخلايا والطعن في ZT13 من أجل الحصول على فرصة أكبر في الكشف عن إجراء تخفيض في هذه الجينات. على العكس من ذلك، على الأرجح أن تراعي بمب التي يمكن أن تزيد من التعبير على مدار الساعة، وإذا كان يبحث في وقت يوم عندما يكون التعبير على مدار الساعة في أدنى مستوياته.
منذ الفئران الحيوانات ليلية، مرحلة الراحة أثناء فترة الضوء، الذي يتوافق مع النشاط البشري. ولذلك، سوف يضم من الناحية المثالية، من الفئران في غرفة مع الحد الأدنى من حركة المرور ويحتوي على آلة الضوضاء البيضاء بغية الحد من الاضطرابات خلال النهار كهذا يمكن أن يعطل إيقاعات circadian من الفئران. وعلاوة على ذلك، ينبغي القيام بتغييرات القفص قبل موعد التجربة. ينبغي أن تجري أي عمل في قاعة الحيوانات (بما في ذلك القتل الرحيم للحيوانات) خلال الفترة المظلمة، تحت الضوء الأحمر لتفادي الإخلال بايقاعات الفئران.
إيقاعات الدافيء يتعرضون للمحفزات البيئية (مثل الضوء أو الغذاء)، التي تسمى زيتجيبيرس. وفي حالة ح 12 ضوء/12 ح الظلام دورة، زيتجيبير (أي الضوء) يعيد عقارب الساعة لمدة 24 ساعة. بينما معظم إيقاعات الدافيء الإيقاعية (أي، اليومية إيقاعات التي تحدث في غياب جديلة الخارجية)، فليست حقيقية circadian إيقاعات حتى قد ثبت أن يتذبذب مع فترة تقريبية 24 ساعة تحت ظروف بيئية ثابتة . ولذلك يمكن تنفيذ هذا الإجراء باستخدام الفئران تحت ظروف ثابتة، مما يستتبع للزوبان الفئران إلى دائرة الضوء الظلام كما هو موضح أعلاه، لكن ثم الضغط الحيوانات في ظلام دائم لمدة 3 أيام قبل أخذ العينات. هذا النوع من التجربة هو يشار إلى تجربة الظلام--ظلام (دد) والنقطة الزمنية لأخذ العينات وسوف يشار إليها باسم CT (الإيقاعية الوقت)، لا ZT.
وبينما يمكن تحديد هذا الأسلوب بامبس التي تغير التعبير الجيني على مدار الساعة داخل سبلينوسيتيس، أنها لا تراعي كيف تؤثر هذه بامبس الساعة الرئيسية أو الساعات الطرفية في جميع أنحاء الجسم. بامبس الفردية منذ الطحال تتكون من عدد السكان غير متجانسة من الخلايا، يمكن أن يؤثر كل نوع من الخلايا بطريقة مختلفة. على سبيل المثال، تختلف إيقاعات التعبير Tlr9 في الطحال الماوس بين سبلينوسيتيس والضامة وخلايا ب ووحدات تحكم المجال Dc15. بالإضافة إلى ذلك، Tlr1، Tlr3، Tlr4، Tlr6، Tlr7،و Tlr8 عرض التذبذبات اليومية كبيرة في سكان سبلينوسيتي ملتصقة لكن فقط Tlr2 و Tlr6 الخبرة اليومية التذبذبات في الضامة الطحال المخصب24. ولذلك، من أجل التحقيق في نتائج تحديا على أنواع الخلايا الفردية، يمكن أن تكون الخلايا معزولة عن طريق فرز الخلية المغناطيسية، كما تم وصفه سابقا9،15 وثم بعد ذلك الطعن. بالإضافة إلى ذلك، يتقلب السكان خلية الطحال خلال الدورة اليومية، التي يمكن أن تلعب أيضا دوراً في حساسية بمب خاص والآثار اللاحقة على مدار الساعة8.
يسمح هذا الأسلوب لعزل عدد كبير من الخلايا المناعية التي تتألف غالبية ب الخلايا (~ 58%)، T الخلايا (~ 21%)، والخلايا الجذعية (~ 5%)، والضامة (~ 4 في المائة)25. ويوفر عدد كبير من الخلايا الفرصة للطعن في سبلينوسيتيس مع مجموعة متنوعة من بامبس في تجربة واحدة. إجراءات عزل سبلينوسيتي من السهل جداً القيام به، يمكن أن تكتمل في غضون دقائق (اعتماداً على العدد من الحيوانات)، ومع الحد الأدنى التلاعب الحيوان أو الخلوية، هو أمر أساسي عند دراسة على مدار الساعة الجزيئية لأنه وكما ذكر أعلاه، هذه الإجراءات يمكن أن تعطل توقيت ساعة فضلا عن الجينات التي تسيطر على مدار الساعة. النتائج لهذا الإجراء تم استنساخه بشدة، كدلالة بين الطعن والخلايا دون منازع قد تحقق مع ثلاثة فقط من الحيوانات وكانت النتائج متسقة مع العمل المنشورة سابقا23 (الشكل 1). تجدر الإشارة إلى أن زيادة عدد الحيوانات كل مجموعة قد كشفت فروق معتد بها إحصائيا بين مجموعة التحدي والسيطرة (مثلاً، ODN 1826 و القس-erbα).
المضي قدما، في حين يتناول هذا البروتوكول سوى آثار حادة على التعبير الجيني ساعة بعد التحدي بمب، أنها يمكن أن توفر دليلاً على المبدأ لإجراء مزيد من التحقيقات. على سبيل المثال، يمكن أن يستخدم هذا التحليل كنموذج فك الآليات الجزيئية بخصوص TLR-بمب التفاعل، وكيف أنها تؤثر على مدار الساعة الجزيئية. ويمكن استخدامه أيضا لتحديد طول الوقت الذي يستغرقه لساعة جزيئية لاسترداد بعد تحديا بمب، التي يمكن أن تحددها في إجراء تجربة الزمن بالطبع (أي تقييم التعبير بعد أوقات متفاوتة وظيفة التحدي). وكما ذكر أعلاه، يمكن إجراء التجارب اللاحقة لدراسة التحدي بمب على السكان خلية سبلينوسيتي محددة. حيث حفز العديد من مسببات الأمراض TLRs متعددة عند الإصابة، سيكون من المثير للاهتمام أن استخدام هذا البروتوكول للتحقيق في حالة صعبة مع بامبس متعددة أثر تآزري على التعبير الجيني على مدار الساعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس له علاقة بالكشف عن صاحب البلاغ.
Acknowledgments
هذا العمل كان يدعمها المنح "البحثية كلية" من مكتب بكلية الآداب والعلوم عميد في جامعة هارتفورد.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Frosted slides | Fisher | 12-550-343 | |
| Cell strainers | Fisher | 22363547 | |
| Lipopolysaccharide | InvivoGen | ltrl-eklps | |
| ODN1826 | InvivoGen | Tlrl-1826-1 | |
| HKLM | InvivoGen | Tlrl-hklm | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| PBS | Gibco | 20012-043 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 or 74106 | |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| 6-well cell culture plate | Denville | T1006 | |
| 50 mL tubes | Corning | 352070 | |
| 15 mL tubes | Corning | 352097 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher | 4368814 | |
| TaqMan Gene Expression Assays b-actin | ThermoFisher | Mm00607939_s1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Per2 | ThermoFisher | Mm00478113_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Rev-erba | ThermoFisher | Mm00520708_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Bmal1 | ThermoFisher | Mm00500226_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Dbp | ThermoFisher | Mm00497539_m1 | |
| qPCR machine StepOnePlus | ThermoFisher | ||
| TaqMan Gene Expression Master Mix | ThermoFisher | 4369016 | |
| MicroAmp Fast 96-well reaction plate (0.1 mL) | ThermoFisher | 4346907 | |
| Statistical Analysis Software | Prism 7.0a |
References
- Bell-Pedersen, D., et al. Circadian rhythms from multiple oscillators: lessons from diverse organisms. Nat. Rev. Genet. 6, 544-556 (2005).
- Mohawk, J. A., Green, C. B., Takahashi, J. S. Central and Peripheral Circadian Clocks in Mammals. Annu. Rev. Neurosci. 35, 445-462 (2012).
- Balsalobre, A., Damiola, F., Schibler, U. A serum shock induces circadian gene expression in mammalian tissue culture cells. Cell. 93, 929-937 (1998).
- Yoo, S. -H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 5339-5346 (2004).
- Yamazaki, S. Resetting Central and Peripheral Circadian Oscillators in Transgenic Rats. Science. 288, 682-685 (2000).
- Lowrey, P. L., Takahashi, J. S. Genetics of circadian rhythms in mammalian model organisms. Adv. Genet. 74, 175-230 (2011).
- Curtis, A. M., Bellet, M. M., Sassone-Corsi, P., O'Neill, L. A. J. Circadian Clock Proteins and Immunity. Immunity. 40, 178-186 (2014).
- Keller, M., et al. A circadian clock in macrophages controls inflammatory immune responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21407-21412 (2009).
- Silver, A. C., Arjona, A., Hughes, M. E., Nitabach, M. N., Fikrig, E. Circadian expression of clock genes in mouse macrophages, dendritic cells, and B cells. Brain. Behav. Immun. 26, 407-413 (2012).
- Kawai, T., Akira, S. The role of pattern-recognition receptors in innate immunity update on Toll-like receptors. Nat. Publ. Gr. 11, 373-384 (2010).
- Marpegán, L., Bekinschtein, T. A., Costas, M. A., Golombek, D. A. Circadian responses to endotoxin treatment in mice. J. Neuroimmunol. 160, 102-109 (2005).
- Okada, K., et al. Injection of LPS Causes Transient Suppression of Biological Clock Genes in Rats. J. Surg. Res. 145, 5-12 (2008).
- Haimovich, B., et al. In vivo endotoxin synchronizes and suppresses clock gene expression in human peripheral blood leukocytes. Crit. Care Med. 38, 751-758 (2010).
- Curtis, A. M., et al. Circadian control of innate immunity in macrophages by miR-155 targeting Bmal1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 7231-7236 (2015).
- Silver, A. C., Arjona, A., Walker, W. E., Fikrig, E. The Circadian Clock Controls Toll-like Receptor 9-Mediated Innate and Adaptive Immunity. Immunity. , (2012).
- Gibbs, J. E., et al. The nuclear receptor REV-ERB α mediates circadian regulation of innate immunity through selective regulation of inflammatory cytokines. PNAS. 109, 582-587 (2012).
- Zee, P. C., Attarian, H., Videnovic, A. Circadian rhythm abnormalities. Contin. Lifelong Learn. Neurol. 19, 132-147 (2013).
- Bovbjerg, D. H. Circadian disruption and cancer: sleep and immune regulation. Brain. Behav. Immun. 17, 48-50 (2003).
- Fu, L., Lee, C. C. The circadian clock: pacemaker and tumour suppressor. Nat. Rev. Cancer. 3, 350-361 (2003).
- Germain, A., Kupfer, D. J. CIRCADIAN RHYTHM DISTURBANCES IN DEPRESSION. Hum. Psychopharmacol. 23, 571-585 (2008).
- Basic Mouse Care and Maintenance. JoVE. , Cambridge, MA. JoVE Science Education Database (2018).
- Leary, S., et al. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals : 2013 Edition. AVMA. , (2013).
- Silver, A. C. Pathogen-associated molecular patterns alter molecular clock gene expression in mouse splenocytes. PLoS One. , 12-15 (2017).
- Silver, A. C., et al. Daily oscillations in expression and responsiveness of Toll-like receptors in splenic immune cells. Heliyon. , 00579 (2018).
- Flow-cytometric Anal. 11 strains mice. MPDJaxpheno6. Mouse Phenome Database web Resour. (RRIDSCR_003212). Jackson Lab. , Bar Harb. Maine USA. Available from: https//phenome.jax.org (2018).
