Summary
本协议描述了一种使用小鼠脾的技术来发现改变分子时钟基因表达的病原相关分子模式。
Abstract
从行为到基因表达, 昼夜节律调节几乎所有生理学方面。在这里, 我们提出了一个方法来挑战鼠脾与病原体相关的分子模式 (PAMPs) 脂多糖 (LPS), ODN1826 和热杀死李斯特菌, 并检查其对分子昼夜节律的影响时钟。以前, 研究重点研究了脂多糖对分子时钟的影响, 使用各种模型 (如鼠、鼠 、人) 的体内和体外方法。该协议描述了脾的分离和挑战, 以及通过定量 PCR 评估时钟基因表达后挑战的方法。这种方法不仅可以用来评估微生物成分对分子时钟的影响, 而且还能评价其他分子, 这可能改变时钟的表达。这种方法可以用来取笑玉兰受体相互作用如何影响时钟表达的分子机制。
Introduction
主时钟在哺乳动物, 协调 24 h 振荡为几乎生理学和行为的所有方面, 位于视交叉上核之内 (SCN) 下丘脑1,2。除了调节生物过程的生物体水平, 主时钟也同步周围的蜂窝时钟在整个身体3,4,5。虽然分子时钟机械包括至少三联锁转录-平移反馈回路, 核心是由周期(Per1-3),隐花色素(Cry1-2), Bmal1,和时钟基因6,7.除了保持核心分子时钟的准确时间, 一些辅助时钟基因产品 (例如, erbα和Dbp) 也调节非时钟基因的表达,即时钟控制基因 (CCGs)6,7。
在不同的免疫组织 (如脾脏和淋巴结)8和细胞 (如B 细胞, 树突状细胞, 巨细胞)8,9描述了功能分子时钟。这些细胞通过先天免疫识别受体 (如类似收费受体 (TLRs)10) 检测和反应与病原体相关的分子模式 (PAMPs), 保守的微生物成分。到目前为止, 已经描述了13种功能性 TLRs, 它能识别细菌细胞壁成分, 鞭毛蛋白和微生物核酸10等微生物成分。玉兰, 脂多糖 (LPS), TLR4 承认革兰阴性菌的细胞壁成分, 已被证明改变昼夜节律的生物体和分子水平。例如,在体内的挑战, LPS 诱导光样相延迟的活动, 以小鼠11和导致减少时钟基因表达在 SCN 和肝脏, 由原位杂交和定量 PCR 确定,分别在大鼠12。在体内对 LPS 的挑战后, 对人外周血白细胞13和皮下脂肪组织14的分析显示, 通过 qPCR 测量的数个时钟基因的表达改变。最后,体内LPS 对人巨噬细胞和小鼠腹腔巨噬细胞的挑战, 也导致了 qPCR14测量的时钟表达的改变。
在这里, 我们描述了一个评估 PAMPs LPS, ODN1826 (含有非甲基化的合成寡核苷酸) 和热杀死李斯特菌 (HKLM) 的影响的协议, 分别由 TLR4、TLR9 和 TLR2 识别, 对小鼠脾的分子时钟基因表达。该协议包括小鼠脾切除术、脾分离和挑战、RNA 提取、cDNA 合成和 qPCR, 以评估几个时钟基因的表达。该协议允许及时获得大量的小动物或细胞操作的免疫细胞, 然后在体内使用各种 PAMPs 来挑战。分子时钟已经被证明可以调节免疫应答的各个方面8,15,16, 因此, 分子时钟的中断很可能会损害适当的时间依赖性的变化免疫应答。此外, 由于昼夜节律的中断可能导致严重的病理17,18,19,20, 它可能会感兴趣的研究人员挑战脾与广泛的分子和评估他们对时钟的影响。
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Protocol
在这项研究中, 动物护理和治疗符合国家卫生机构的政策, 是按照机构的指导方针, 并获得了哈特福德大学动物机构动物保育和使用委员会的批准。
1. 动物的夹带
注: 研究中使用二十周大的雄性 B6129SF2/J 小鼠。
- 实验前2周, Entrain 小鼠到 12 h 光 (标准架空白光)/12 h 黑暗周期。
注: 这里授时时间 (ZT) 0 对应于灯和 ZT12 关灯, 同时保持所有其他环境因素 (例如,食物、水和室温) 恒定21。
2. 编写文书、培养基和挑战媒介
- 高压釜钳和解剖剪刀。裹在铝箔和高压釜的磨砂显微镜幻灯片。
- 通过将胎牛血清 (血清) 添加到 RPMI 1640 到最后浓度 10%, 制备培养基。在50毫升管中加入以下 PAMPs, 以培养培养基 (RPMI 10%), 制备10毫升的挑战培养基;LPS (5 µg/毫升), ODN1826 (5 µg/毫升), 热杀死李斯特菌 (108 HKLM/毫升), 或另一玉兰在其建议浓度。
- 暖培养基和挑战培养基到37°c 在水浴, 并保持约70毫升不育磷酸盐缓冲盐水 (PBS, pH 7.2) 在室温下。
- 添加10毫升培养基, 使用10毫升吸管和吸管帮助50毫升管和放置在冰上。
- 将大约30毫升70% 乙醇添加到100毫升烧杯中, 将解剖剪刀和镊子的两端放入烧杯中, 以防止微生物污染。
- 在50毫升管中加入10µL β巯基乙醇 (在通风罩下), 为每1毫升的缓冲 RLT 制备 RNA 分离的裂解缓冲液。只制作需要的量 (每个样本600µL, 由大约 1 x 106个单元格组成)。
注意: 缓冲 RLT 是 rna 提取套件的一个组成部分, 它支持 rna 与二氧化硅膜的结合。
3. 脾隔离和挑战
- 弄死小鼠在特定的授时时间通过麻醉保持他们在他们的原始笼子和增加 co2到笼子在流动率3升/分钟. 在呼吸停止后继续供应 co2为1分钟。
- 通过将拇指和食指放在头骨底部的颈部两侧, 确认颈部脱位死亡。或者, 在头骨底部按一根棒, 同时快速拉 (用另一只手) 尾部或后肢的底部, 使颈椎从头骨22分离。
- 用70% 乙醇喷洒小鼠树干, 用纸巾擦拭。把鼠标放在它的背部, 稍微倾斜到它的右侧。剪掉毛皮, 用解剖剪刀, 沿着老鼠的左边, 大约在前后两腿之间。
- 使用镊子, 抓住腹膜, 小心做切口, 以免损伤脾脏。用镊子将脾脏取出, 放入50毫升的无菌管, 在冰上含有大约10毫升培养基。对其余的动物重复。
注: 脾脏是芸豆的颜色, 比肾脏更长、更平坦。 -
转移一脾脏与2毫升培养基到一个小不育培养皿。
- 融汇在两个不育的磨砂片的磨砂部分之间磨碎脾脏。如果可能, 在均匀化过程中保持介质中的问题和单元格。
- 一旦彻底均匀化, 吸管2毫升培养基中含有脾通过40µm 尼龙细胞过滤器成50毫升管。
- 重复上述步骤, 其余的脾使用新的磨砂幻灯片, 50 毫升管与培养基和细胞过滤器。
- 将8毫升的冷培养基添加到含有脾的50毫升管中的每一个, 总体积为10毫升/管。使用 hemocytometer 确定每个毫升的单元格数。
- 增加大约 1 x 106细胞/井到6井培养板材。将单元格添加到与实验所用的不同 PAMPs 数对应的井数中, 并包括一个控制井。添加3毫升培养基或3毫升的挑战培养基到各自的水井。
- 孵育板材在37°c 在 5% CO2为 3 h。
- 使用连接到 P1000 微的1000µL 吸管尖, 从井底刮出细胞。用相同的1000µL 吸管尖端将含有细胞的培养基转移到15毫升管上。
- 在室温下以 167 x g为5分钟, 通过离心法将细胞颗粒状。取出上清液, 用5毫升的 PBS 清洗细胞颗粒。
- 第二次将细胞以 167 x g为5分钟, 取出上清, 并在细胞颗粒中加入600µL 的溶解缓冲液, 以溶解细胞。然后进行 RNA 分离。
4. RNA 分离和 cDNA 合成
- 根据制造商的说明, 使用 rna 提取试剂盒将 rna 从脾中分离出来, 并执行 "选择性" 的列 DNA 消化。
- 在 cdna 合成之前, 用 microvolume 分光光度法测定 rna 浓度, 以验证其浓度是否在 cdna 合成试剂盒的最佳 RNA 范围内 (高达2µg)。
- 根据制造商的指示, 使用反向转录试剂盒合成每个样品的 cDNA。在20µL 总反应量中, 每个样品使用10µL RNA。在完成反向转录 (thermocycler 运行) 增加 20 ul H2O 到每个反应.
- 使用 P10 或 P20 微构造标准曲线, 将一些控制样本 (例如, 5 µL 从2个样本中总共10个µL) 池中的 mRNA 放入0.5 毫升管中制备 cDNA。
- 添加10µL 2x 逆转录酶主组合。
- 在反向转录完成后, 将10µL 的 H2O 添加到反应管中, 这将作为标准曲线稀释系列中的起始浓度 ("1")。
- 执行10倍稀释系列 (1 到 10-4) 通过添加45µL 水使用 P100 或 P200 微到四0.5 毫升管指定 10-1, 10-2, 10-3, 和 10-4.
- 加入5µL 的起始浓度 "1" 进入第一管 (10-1) 使用 P20 micropipettor, 混合吹打上下几次, 然后转移5µL 从 10-1管进入管指定 10-2和混合。
- 转移5µL 使用 P20 微从 10-2管进入管指定 10-3和混合。转移5µL 使用 P20 micropipettor 从 10-3管进入管指定 10-4和混合。
5. 定量聚合酶链反应 (qPCR)
- 通过 qPCR 测定 mRNA 水平的相对定量。在实验设置中, 选择 "定量相关标准曲线" 和 "探针" 化学。将反应量更改为10µL. 将相关信息输入到板块布局中 (如目标基因、标准曲线、记者等)。
- 准备反应, 使其包含0.5 µL 的底漆/探针检测, 5 µL 基因表达主混合, 2 µL 的 H2O 和2.5 µL 的 cDNA (10–100 ng)。
- 通过将前面的每种试剂 (cDNA 除外) 乘以反应的数量来准备一个主混合, 确保包括从标准曲线、负控制、重复执行每一个反应, 以及2额外的反应, 将会考虑到吹打变异。
- 吸管7.5 µL 的准备大师混合成预先确定的水井在一个96井反应板与微或多通道吸管。吸管2.5 µL 的 cDNA 入适当井为未知数和标准, 并且2.5 µL2O 入消极控制井。
- 包括对各种分子时钟基因的底漆/探针测定, 还包括对内源性控制 (如β肌动蛋白) 的检测。
- 为了确定相对表达式值, 计算每个复制的平均相对数量, 然后对每个样本, 将目标基因的平均相对数量除以β肌动蛋白的平均相对数量。
6. 统计分析
- 使用统计分析软件, 在 "列统计" 选项下, 将数据输入到程序中。选择一个单向方差分析与 Dunnett 的后专项测试, 以评估差异的平均值的时钟基因表达后玉兰挑战与控制。
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Representative Results
小鼠在 ZT13 被牺牲, 脾被隔绝了和挑战前体内与 PAMPs LPS, ODN1826 或 HKLM。3小时后, RNA 被分离, qPCR 被用来评估分子时钟基因时钟、 Per2、 Dbp和 erbα的相对表达水平, 而非挑战控制细胞。在玉兰挑战之后,时钟表达式水平与控制单元中的表达式没有显著的差异 (图 1A)。Per2表达水平显著升高的细胞与 LPS 和 ODN1826 的挑战相比, 与无挑战的控制 (图 1B)。LPS 是唯一的玉兰改变 erbα表达, 因为 mRNA 水平明显低于无挑战性的控制 (图 1C)。最后, 与对照组相比, PAMPs 后, 对Dbp的 mRNA 水平显著降低 (图 1D)。与以前所显示的一致, 在所有的时钟相关基因检查, Dbp表达倾向于最受玉兰挑战23。
图 1: 在玉兰挑战后, 小鼠脾的时钟基因表达改变.脾被隔离在 ZT13 和挑战与 LPS, ODN1826, 或 HKLM。相对时钟 mRNA 水平 (规范化的β肌动蛋白) 是由 qPCR 3 小时后, 挑战。每个数据点表示1个动物的表达式级别。给出了实验平均 + SEM。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001。所表明的挑战与对照组 (无挑战细胞) 的差异有显著性 (Dunnett)。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
在本协议中, microvolume 分光光度计可用于量化和评估用于确定基因表达的 RNA 的纯度。核酸吸收紫外光在260毫微米, 蛋白质通常吸收光在280毫微米, 而其他潜在污染物使用在 RNA 提取过程 (例如,苯酚) 是可检测的在230毫微米。因此, 通过评估吸光度 (A) 比在260/280 毫微米 (rna 到蛋白质) 和260/230 毫微米 (rna 到非蛋白质污染物) 可以评估 rna 的质量。高质量的 RNA 在1.8–2.1 之间有 A260/280 的比值, 因为较低的比值表明蛋白质污染。一个纯 RNA 样本将有一个 A260/230 比为2.0。
在确定目标基因 (即 Per2、时钟、erbα和Dbp) 的相对表达时, 还必须选择一种内源控制基因 (在该基因中, 表达水平在样本之间不存在差异)。然后将目标基因的相对表达式规范化为内源控制基因的表达。起始材料的差异 (脾的数量), 逆转录酶效率的变化, RNA 降解的变化率等, 将由内源控制基因 (本议定书中的β肌动蛋白) 来纠正。然而, 明智的做法是验证正在检查的治疗不会改变内源性控制基因的表达。这可以通过评估β肌动蛋白的水平, 从几个相同数量的细胞复制 (治疗与非治疗) 来完成。理论上, 他们的β肌动蛋白水平应该是相同的。另一种防止内源性控制变异的方法是使用一组内源性控制 (如β肌动蛋白、Gapdh和 18S rRNA 基因)。
在研究 PAMPs 对分子时钟的影响时, 必须考虑到老鼠被安乐死和脾的时间。Tlr表达式和响应性以前已被证明可以显示日变化8,15, 因此, 当 Tlr 响应率处于峰值时, 可能会导致更大的影响时钟。此外, 分子时钟基因的表达也会在脾的一天内波动, 因此, 如果在峰值表达9时进行检查, 则由于玉兰的挑战, 时钟基因表达的减少将是最重要的。由于Dbp和erbα已经证明在脾和脾脏免疫细胞周围的光-暗间8,9,23 显示显著的表达峰值,24 (ZT12), 在目前的方法, 细胞被隔离和挑战在 ZT13, 以便有更大的机会, 以检测减少这些基因。反之, 一个玉兰, 可以增加时钟表达, 很可能会被观察到, 如果看一个时间的时候, 时钟表达的最低。
因为老鼠是夜行动物, 他们的休息阶段是在轻的期间, 对应于人类活动。因此, 理想的情况下, 老鼠将被安置在一个最小的交通和一个包含白噪声机器, 以减少日间干扰, 因为这可能扰乱老鼠的昼夜节律的房间。此外, 在试验日期前应做好网箱的更换工作。在动物室的任何工作 (包括动物的安乐死) 在黑暗时期, 应该在红灯下进行, 以避免扰乱老鼠的节奏。
昼夜节律受到环境刺激 (如光或食物) 的作用, 被称为 zeitgebers。在 12 light/12 h 暗循环的情况下, 授时 (即,光) 将时钟重置为24小时。虽然大多数昼夜节律都是昼夜节律 (即在没有外部提示的情况下每天的节律), 但它们并不是真正的昼夜节律, 直到它们在恒定的环境条件下以大约24小时的周期振荡。.因此, 这一程序可以使用在恒定条件下的小鼠, 这将需要引鼠到光黑暗循环如上所述, 但然后保持在恒定的黑暗中的动物在取样前3天。这类实验被称为暗暗 (DD) 实验, 取样的时间点将被称为 CT (昼夜节律), 而不是 ZT。
虽然这种方法可以识别在脾内改变时钟基因表达的 PAMPs, 但它并不考虑这些 PAMPs 如何影响整个身体的主时钟或外围时钟。由于脾脏是由不同的细胞组成的, 个体 PAMPs 可能对每种细胞类型的影响有所不同。例如, 小鼠脾脏中的Tlr9表达节律不同于脾、巨噬细胞、B 淋巴细胞和 DCs15。此外, Tlr1、 Tlr3、 Tlr4、 Tlr6、 Tlr7和 Tlr8在一个黏附的脾人口中显示了重要的每日振荡, 但只有Tlr2和Tlr6的经验每日在丰富的脾脏巨噬细胞的振荡24。因此, 为了调查对单个细胞类型的挑战的结果, 细胞可以通过磁性细胞分类分离, 如前所述9、15 , 随后被挑战。此外, 脾脏细胞的数量在每天的周期中波动, 这也可能对特定的玉兰和随后对时钟8的影响起到敏感作用。
这种方法可以隔离大量的免疫细胞, 它们主要由 B 细胞 (~ 58%)、T 细胞 (~ 21%)、树突状细胞 (~ 5%) 和巨细胞 (~ 4%)25组成。大量的细胞提供了机会挑战脾与各种 PAMPs 在一个单一的实验。脾隔离程序是非常容易执行, 可以在几分钟内完成 (取决于动物的数量), 并与最小的动物或细胞操作, 这是必要的, 当检查分子时钟, 因为如上所述,这些动作会扰乱时钟的定时和时钟控制的基因。这一程序的结果是高度重现性的, 因为挑战和无挑战的细胞之间的意义, 只有三只动物达到, 结果与以前发表的工作23 (图 1) 一致。应该指出的是, 增加每组动物的数量可能揭示了挑战组与控制之间的统计学差异 (例如, ODN 1826 和erbα)。
向前迈进, 虽然该协议只解决了玉兰挑战后时钟基因表达的急性影响, 但它可以提供进一步调查的原则证据。例如, 这种分析可以作为一个模型来破译分子机制的 TLR-玉兰相互作用和它如何影响分子时钟。它还可以用来确定分子时钟在玉兰挑战后恢复所需的时间长短, 这可以通过进行时间课程实验 (即在不同时代后的挑战后评估表达式) 来确定。如前所述, 可以进行后续实验以检查玉兰对特定脾细胞种群的挑战。由于一些病原体刺激多种 TLRs 感染, 这将是有趣的是使用此协议来调查, 如果有挑战性的多 PAMPs 对时钟基因表达有协同作用。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了美国哈特福德大学艺术与科学学院院长办公室的师资研究补助金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Frosted slides | Fisher | 12-550-343 | |
| Cell strainers | Fisher | 22363547 | |
| Lipopolysaccharide | InvivoGen | ltrl-eklps | |
| ODN1826 | InvivoGen | Tlrl-1826-1 | |
| HKLM | InvivoGen | Tlrl-hklm | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| PBS | Gibco | 20012-043 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 or 74106 | |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| 6-well cell culture plate | Denville | T1006 | |
| 50 mL tubes | Corning | 352070 | |
| 15 mL tubes | Corning | 352097 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher | 4368814 | |
| TaqMan Gene Expression Assays b-actin | ThermoFisher | Mm00607939_s1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Per2 | ThermoFisher | Mm00478113_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Rev-erba | ThermoFisher | Mm00520708_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Bmal1 | ThermoFisher | Mm00500226_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Dbp | ThermoFisher | Mm00497539_m1 | |
| qPCR machine StepOnePlus | ThermoFisher | ||
| TaqMan Gene Expression Master Mix | ThermoFisher | 4369016 | |
| MicroAmp Fast 96-well reaction plate (0.1 mL) | ThermoFisher | 4346907 | |
| Statistical Analysis Software | Prism 7.0a |
References
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