Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine Technik, mit der Maus splenocyten, um Pathogen-assoziierte molekulare Muster zu entdecken, die molekulare Uhr Genexpression verändern.
Abstract
Vom Verhalten, Genexpression regulieren ZIRKADIANE Rhythmen fast alle Aspekte der Physiologie. Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode zur Maus splenocyten mit der Pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMPs) Lipopolysaccharid (LPS), ODN1826 und Hitze getötet Listeria Monocytogenes hinterfragen und prüfen ihre Wirkung auf die molekularen zirkadianen Uhr. Bisher haben Studien untersuchen den Einfluss von LPS auf der molekularen Uhr mit einer Vielzahl von in Vivo und ex Vivo Ansätze aus einem Sortiment von Modellen (z. B. Maus, Ratte und Mensch) fokussiert. Dieses Protokoll beschreibt die Isolation und die Herausforderung des splenocyten sowie die Methodik zur Uhr Gen Ausdruck nach Herausforderung über quantitative PCR zu beurteilen. Dieser Ansatz lässt sich nicht nur der Einfluss der mikrobielle Komponenten auf der molekularen Uhr aber auch andere Moleküle zu bewerten, die Ausdruck der Uhr ändern kann. Dieser Ansatz könnte genutzt werden, um die molekularen Mechanismen wie PAMP-Toll-Like-Rezeptor-Interaktion beeinflusst Uhr Ausdruck auseinander zu necken.
Introduction
Der master-Clock bei Säugetieren, der 24 h Schwingungen für fast alle Aspekte der Physiologie und Verhalten orchestriert, liegt in den suprachiasmatischen Kern (SCN) des Hypothalamus1,2. Neben der Regulierung der biologischen Prozesse auf organismal Ebene, synchronisiert der master-Clock auch periphere zelluläre Uhren im gesamten Körper3,4,5. Während der molekularen Uhr Maschinen aus mindestens drei ineinandergreifenden transkriptionelle translationale Feedback-Schleifen besteht, besteht der Kern der Periode (Per1-3), Cryptochrome (Cry1-2), Bmal1, und Uhr Gene6,7. Neben der Pflege des genaue Timing der molekularen Uhr Kern, einige ergänzende Uhr Genprodukte (z. B. Rev-Erbα und Dbp) regulieren auch Ausdruck des nicht-uhrengene, d. h. Uhr kontrollierten Gene (KVG)6 , 7.
Funktionelle Molekulare Uhren wurden in verschiedenen immun Gewebe (z. B. Milz und Lymphknoten)8 und Zellen (z. B. B Zellen, Dendritische Zellen, Makrophagen)8,9beschrieben. Diese Zellen erkennen und reagieren auf Pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMPs), konservierte mikrobielle Komponenten über angeborene immune Anerkennung Rezeptoren wie Toll-Like-Rezeptoren (TLR)10. Bisher wurden 13 funktionale TLRs beschrieben, erkennen die mikrobielle Bestandteile wie bakterielle Zellwand-Komponenten, flagellar Protein und mikrobielle Nukleinsäuren10. PAMP, Lipopolysaccharid (LPS), eine Zellwand-Komponente von Gram-negativen Bakterien erkannt von TLR4, nachweislich zirkadianen Rhythmen auf organismal und molekularer Ebene zu verändern. Z. B. in Vivo Herausforderung der LPS induzierte photic-ähnliche Phase Verzögerungen Aktivität in Mäusen11 gemessen und führte zu reduzierten Uhr gen-Expression in der SCN und Leber in Situ Hybridisierung und quantitative PCR bestimmt, bzw. in Ratten12. Nach einer in-Vivo -Herausforderung mit LPS ergab die Analyse der menschlichen peripheren Blut Leukozyten13 und subkutanem Fettgewebe14 veränderte Expression von mehreren uhrengene gemessen über qPCR. Zu guter Letzt geändert ex Vivo LPS Herausforderungen des menschlichen Makrophagen und Maus peritonealen Makrophagen, führte auch zu Uhr Ausdruck qPCR14gemessen.
Hier beschreiben wir ein Protokoll, um den Einfluss der PAMPs LPS, ODN1826 (synthetische Oligonukleotide mit unmethylated CpG Motive), zu bewerten und Hitze getötet Listeria Monocytogenes (HKLM), anerkannt von TLR4, TLR9 und TLR2, bzw. auf Molekulare Uhr Genexpression in Maus splenocyten. Das Protokoll enthält Maus Splenektomie, Splenocyte Isolierung und Herausforderung, RNA Extraktion, cDNA Synthese und qPCR Ausdruck mehrere uhrengene bewerten. Dieses Protokoll ermöglicht für den rechtzeitigen Erwerb einer großen Anzahl von Immunzellen mit sehr kleinen Tier oder zellulären Manipulation, die dann ex Vivo mit verschiedenen PAMPs in Frage gestellt. Die molekulare Uhr hat gezeigt, dass verschiedene Aspekte der Immunantwort8,15,16modulieren, Störung der molekularen Uhr beeinträchtigt daher höchstwahrscheinlich die richtige zeitabhängige Variation von der Immunantwort. Darüber hinaus da Störungen des zirkadianen Rhythmen zu schweren Pathologien17,18,19,20führen können, kann es von Interesse für Forscher, splenocyten mit einer breiten Palette von Herausforderung sein Moleküle und deren Einfluss auf die Uhr zu beurteilen.
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Protocol
Während der Studie Tierpflege und Behandlung National Institutes of Health Policy eingehalten, wurden in Übereinstimmung mit Richtlinien und wurden von der University of Hartford institutionelle Animal Tierpflege und Use Committee genehmigt.
(1) die Mitnahme von Tieren
Hinweis: Zwanzig Wochen alten männlichen B6129SF2/J Mäusen werden in der Studie verwendet.
- Mitzureißen Mäuse auf ein 12 h Licht (standard Overhead weißes Licht) / 12 h Dunkel-Zyklus für 2 Wochen vor dem Experiment.
Hinweis: Hier Zeitgeber Zeit (ZT) 0 entspricht, leuchtet und ZT12 Licht aus, unter Beibehaltung aller anderen Umweltfaktoren (z.B. Nahrungsmittel, Wasser und Raumtemperatur) konstant 21.
2. Vorbereitung der Instrumente, Kultur, und Herausforderung Medium
- Autoklaven-Zange und sezierenden Scheren. Wickeln Sie Paare von satiniertem Objektträger in Aluminiumfolie und Autoklaven.
- Bereiten Sie Kulturmedium durch Zugabe von fetalen bovine Serum (FBS), RPMI 1640, eine Endkonzentration von 10 %. Vorbereitung 10 mL Medium Herausforderung in 50 mL Röhrchen durch Hinzufügen der folgenden PAMPs zu dem Kulturmedium (RPMI mit 10 % FBS); LPS (5 µg/mL), ODN1826 (5 µg/mL), Hitze-getötet Listeria Monocytogenes (108 HKLM/mL), oder ein anderes PAMP in der empfohlenen Konzentration.
- Kultur und Herausforderung Medium auf 37 ° C im Wasserbad erwärmen und etwa 70 mL sterile Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7,2) bei Zimmertemperatur aufbewahren.
- Hinzugeben Sie 10 mL Kulturmedium mit 10 mL-Pipette und Pipette Hilfen für eine 50 mL-Tube und Platz auf dem Eis.
- Fügen Sie etwa 30 mL 70 % igem Ethanol zu einem 100 mL Becherglas und Ort endet sezieren Scheren und Pinzetten in das Becherglas, mikrobielle Kontamination zu verhindern.
- Bereiten Sie Lyse Puffer RNA Isolierung durch Zugabe von 10 µL β-Mercaptoethanol (unter einem Abzug vor) zu jeder 1 mL Puffer RLT in ein 50 mL-Tube. Machen Sie nur die Menge, die benötigten (600 µL pro Probe) werden ca. 1 x 106 Zellen bestehend.
Hinweis: Der Puffer RLT ist ein Bestandteil der RNA-Extraktion-Kit, das die Bindung der RNA der Kieselsäure Membran unterstützt.
3. Splenocyte Isolation und Herausforderung
- Einschläfern Sie Mäuse zu einem bestimmten Zeitgeber Zeitpunkt über Narkose halten sie in ihrem ursprünglichen Käfig und den Käfig mit einer Durchflussrate von 3 L/min. weiter liefert CO2 für 1 min nach Atmung stoppt CO2 hinzufügen.
- Tod durch zervikale Dislokation zu bestätigen, indem Sie Daumen und Zeigefinger auf beiden Seiten des Halses an der Basis des Schädels. Oder drücken Sie einer Rute an der Basis des Schädels und schnell ziehen (mit der anderen Hand) die Basis für das Heck oder der hinteren Gliedmaßen, Trennung der Halswirbel vom Schädel22zu verursachen.
- Sprühen Sie den Maus-Stamm mit 70 % Ethanol und mit einem Papiertuch abwischen. Platzieren Sie den Mauszeiger auf seinen Rücken und schräg auf der rechten Seite. Schneiden Sie das Fell, Schere mit sezieren, entlang der Maus links über auf halbem Weg zwischen der Vorder- und Hinterbeine.
- Mit Pinzette, schnappen Sie sich das Bauchfell und einen Einschnitt nicht zu beschädigen die Milz aufmerksam machen. Milz mit einer Pinzette entfernen und in eine sterile 50 mL Röhrchen mit etwa 10 mL der Nährmedien auf Eis legen. Wiederholen Sie für die restlichen Tiere.
Hinweis: Die Milz ist die Farbe der Kidney-Bohnen, und er ist länger und flacher als der Niere. -
Übertragen Sie eine Milz mit 2 mL Kulturmedium auf eine kleine sterile Petrischale.
- Die Milz durch Schleifen zwischen den mattierten Teil zwei sterile mattierte Folien zu homogenisieren. Halten Sie wenn möglich die Ausgabe und die Zellen im Medium bei der Homogenisierung.
- Einmal gründlich homogenisiert, pipettieren der 2 mL Kulturmedium mit der splenocyten durch ein 40 µm Nylon Zelle Sieb in ein 50 mL-Tube.
- Wiederholen Sie die obigen Schritte für die verbleibenden Milz mit neuen Paare mattierte Folien, 50 mL Röhrchen mit Nährmedium und Zelle Siebe.
- Hinzugeben Sie 8 mL kalte Kulturmedium zu jedem der 50 mL Röhrchen mit splenocyten für ein Gesamtvolumen von 10 mL/Tube. Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen pro Milliliter mit einem Hemocytometer.
- Fügen Sie hinzu, ca. 1 x 106 Zellen/Well Kultur 6-Well-Platten. Anzahl der Bohrungen, die entsprechen der Anzahl der verschiedenen PAMPs für das Experiment verwendet wird und ein Steuerelement fügen Sie auch Zellen hinzu. Fügen Sie 3 mL Kulturmedium oder 3 mL Herausforderung Medium in die jeweiligen Vertiefungen.
- Inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C in 5 % CO2 für 3 h.
- Kratzen Sie die Zellen aus der Tiefe der nun mit einer 1.000 µL pipettieren Tipp mit einer Mikropipette P1000 verbunden. Die Zellen mit der gleichen 1.000 µL pipettieren Spitze, eine 15 mL Tube-haltigem Medium zu übertragen.
- Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 167 X g für 5 min bei Raumtemperatur. Den überstand zu entfernen und Waschen der Zelle Pellet mit 5 mL PBS.
- Pellet-Zellen ein zweites Mal bei 167 X g für 5 min, überstand zu entfernen und die Zelle Pellet 600 µL Lyse Puffer hinzufügen, um die Zellen lysiert. Fahren Sie dann mit RNA isoliert.
(4) RNA Isolation und cDNA Synthese
- RNA von splenocyten mit dem RNA-Extraktion-Kit nach Herstellerangaben zu isolieren und die "optionale" auf Spalte DNA Verdauung führen.
- Bestimmen Sie vor cDNA Synthese RNA-Konzentration mit einer Microvolume Spektralphotometer, stellen Sie sicher, dass die Konzentration im optimalen Bereich der RNA (bis zu 2 µg) die cDNA-Synthese-Kit.
- Synthese cDNA für jede der Proben mit der reversen Transkription-Kit nach Herstellerangaben. Verwenden Sie 10 µL RNA für jede der Proben in eine gesamte Reaktionsvolumen von 20 µL. Fügen Sie am Ende der reversen Transkription (Thermocycler laufen) 20 μL H2O, jede Reaktion.
- Der standard geschwungenen mit P10 und P20 Mikropipette mRNA von ein paar Kontrollproben (z. B. 5 µL aus 2 Proben für eine Gesamtmenge von 10 µL) in ein 0,5 mL Röhrchen zur Vorbereitung der cDNA Pool zu bauen.
- Fügen Sie 10 µL 2 x Reverse-Transkriptase-master-Mix.
- Fügen Sie bei der Fertigstellung der reversen Transkription 10 µL H2O das Reaktionsgefäß hinzu, dienen als Ausgangspunkt Konzentration ("1") wird in der Verdünnungsreihe für die Standardkurve.
- Führen Sie ein 10-divisibel Verdünnungsreihe (1 bis 10-4) durch Zugabe von Wasser mittels einer Mikropipette P100 oder P200 in vier 0,5 mL Röhrchen benannt 10-410-1, 10-2und 10-345 µL.
- Fügen Sie 5 µL der Ausgangspunkt Konzentration "1" in das erste Rohr (10-1) mit einem P20 Micropipettor, Mix von oben und unten pipettieren mehrmals, dann Transfer 5 µL aus der 10-1 Tube in die Röhre bezeichnet, 10-2 und Mix.
- 5 µL mit einer Mikropipette P20 aus der Tube 10-2 in die Röhre bezeichnet 10-3 zu übertragen und zu mischen. 5 µL mit einem P20 Micropipettor aus der Tube 10-3 in das Rohr benannt 10-4 zu übertragen und zu mischen.
5. Quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR)
- Bestimmen Sie relative Quantifizierung der mRNA-Niveaus durch qPCR. Innerhalb der experimentellen einzurichten, wählen Sie "Quantifizierung – Relative Standardkurve" und "TaqMan" Chemie. Änderung das Reaktionsvolumen zu 10 µL. Geben Sie die relevante Informationen in das Platte-Layout (z.B.Zielgen Standardkurve, Reporter, usw.).
- Die Reaktion so aufzubereiten, dass es 0,5 µL den Primer/Sonden-Assay, 5 µL der Gen-Expression-master-Mix, H2O 2 µL und 2.5 enthält µL cDNA (10 – 100 ng).
- Bereiten Sie einen master-Mix durch Multiplikation aller vorhergehenden Reagenzien (mit Ausnahme der cDNA) durch die Anzahl der Reaktionen, achten Sie darauf, gehören diejenigen von der Standardkurve Negativkontrollen, Durchführung jeder Reaktion in Duplikat und 2 zusätzliche Reaktionen, die berücksichtigt werden pipettieren Variation.
- Pipettieren 7,5 µL bereit master-Mix in vorgegebenen Vertiefungen in einer Reaktion der 96-Well-Platte mit einer Mikropipette oder einer Mehrkanal-Pipette. Pipettieren 2,5 µL cDNA in den entsprechenden Brunnen für die unbekannten und Standards und 2,5 µL von H2O in die negativ-Kontrolle-Brunnen.
- Beinhalten Sie Primer/Sonden-Assays für die verschiedenen molekularen uhrengene und auch einen Test für eine endogene Steuerung (z. B. β-Aktin).
- Um relative Ausdruckswerte zu ermitteln, berechnen Sie die mittlere relative Menge für jede Wiederholung, dann für jede Probe, teilen Sie die mittlere relative Menge für das jeweilige Zielgen durch die mittlere relative Menge für β-Aktin.
6. statistische Analyse
- Statistische Analyse-Software verwenden, geben Sie Daten in das Programm unter der Spalte Statistik-Option. Wählen Sie eine einfache ANOVA mit der Dunnett post-hoc-Test zur Bewertung der Unterschiede zwischen den Mittelwerten der Uhr Genexpression nach PAMP Herausforderung gegenüber der Kontrolle.
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Representative Results
Mäuse wurden geopfert, bei ZT13, splenocyten wurden isoliert und ex Vivo mit den PAMPs LPS, ODN1826 oder HKLM in Frage gestellt. Nach 3 h RNA wurde isoliert und qPCR wurde verwendet, um relative Ausdruck Niveaus der molekularen uhrengene zu beurteilen, die Uhr, Per2, Dbp, und Rev-Erbα im Vergleich zu unangefochten Kontrollzellen. Nach PAMP Herausforderung waren Uhr Ausdruck Niveaus nicht wesentlich anders als Ausdruck in der Kontrollzellen (Abb. 1A). Per2 Ausdruck Niveaus waren in den Zellen vor der Herausforderung, LPS und ODN1826 im Vergleich zu unangefochten Steuerelemente (Abbildung 1B) deutlich erhöht. LPS war die einzige PAMP, Rev-Erbα Ausdruck zu verändern wie mRNA-Niveaus deutlich niedriger als in den unangefochtenen Kontrollen (Abbildung 1C). Zu guter Letzt wurden deutlich niedrigeren mRNA Dbp nach Herausforderung mit jedem PAMPs im Vergleich zu den Kontrollen (Abbildung 1D) beobachtet. Was zuvor ist, aus all den verbundenen uhrengene untersucht gezeigt worden, Dbp Ausdruck tendenziell PAMP Herausforderung23am stärksten betroffen werden, entsprechen.
Abbildung 1 : Uhr veränderten Genexpression in Maus splenocyten nach ex-Vivo PAMP Herausforderung. Splenocyten wurden bei ZT13 isoliert und mit LPS, ODN1826 oder HKLM in Frage gestellt. Relative Uhr mRNA-Niveaus (normiert auf β-Aktin) wurden vom qPCR 3 h nach Herausforderung festgelegt. Jeder Datenpunkt stellt Ausdruck für 1 Tier dar. Experimentelle Mittel + SEM sind gegeben. p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Die angegebenen Herausforderungen unterschieden sich signifikant von der Steuerung (unangefochten Zellen) wie pro One-Way ANOVA mit der Dunnett post-hoc-Test. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Innerhalb dieses Protokolls kann ein Microvolume Spektralphotometer zur Quantifizierung und Beurteilung der Reinheit der verwendeten bei der Bestimmung der Genexpression RNA verwendet werden. Nukleinsäuren absorbieren UV-Licht bei 260 nm, Proteine in der Regel absorbieren Licht bei 280 nm, während andere potentielle Schadstoffe verwendet, während ein RNA-Extraktionsverfahren (z. B. Phenol) nachweisbar bei 230 sind nm. Daher, durch die Beurteilung der Extinktion (A) Verhältnis bei 260/280 nm (RNA zum Protein) und 260/230 nm (RNA-Protein Schadstoffe) die Qualität der RNA beurteilt werden kann. Qualitativ hochwertige RNA hat ein A260/280 Verhältnis zwischen 1,8 – 2.1, als niedrigere Werte Protein Verschmutzung geben. Eine reine RNA-Probe wird eine A260/230 Verhältnis von 2.0 haben.
Bei der Festlegung des relativen Ausdrucks eines Ziel-Gens (d. h. Per2, Uhr, Rev-Erbα und Dbp), eine endogene Steuerung-gen (ein Gen in welcher Ausdruck Ebenen nicht zwischen Proben unterscheiden) muss ebenfalls aktiviert sein. Relative Expression des Zielgens wird dann auf die Expression des Gens endogene Steuerung normalisiert. Unterschiede im Ausgangsmaterial (Anzahl der splenocyten), Variation in Reverse-Transkriptase-Effizienz, unterschiedlichen Zinssätzen der RNA-Abbau, etc., werden durch das endogene Steuerung-gen (β-Aktin in diesem Protokoll) korrigiert werden. Allerdings ist es ratsam zu überprüfen, ob die Behandlung untersucht die Expression des Gens endogene Steuerung nicht verändert wird. Dies kann erreicht werden durch die Beurteilung der β-Aktin Ebenen von mehreren Wiederholungen aus einer gleichen Anzahl von Zellen ( vs. nicht-Behandlung). In der Theorie sollten ihre β-Aktin -Ebenen identisch sein. Ein anderer Ansatz zum Schutz gegen endogene Steuerung Variante wäre, eine Gruppe von endogenen Steuerelemente (z. B. β-Aktin, Gapdh, und 18 s rRNA-Gen) verwenden.
Bei der Untersuchung der Auswirkungen von PAMPs auf der molekularen Uhr muss die Tageszeit als Mäuse werden eingeschläfert und splenocyten werden anschließend herausgefordert berücksichtigt werden. TLR -Expression und Reaktionsfähigkeit zuvor nachweislich zeigen Tageszeit-abhängige Variation8,15, einer Tageszeit wann TLR Reaktionsfähigkeit auf ihrem Höhepunkt ist könnte daher einen größeren Einfluss auf die Uhr. Darüber hinaus Ausdruck der molekularen uhrengene wird auch im Laufe des Tages in splenocyten schwanken, wäre daher eine Reduktion der Clock-gen-Expression durch PAMP Herausforderung bedeutendsten, wenn während der Zeit des Peak Ausdruck9untersucht. Da Dbp und Rev-Erbα gezeigt haben, dass deutliche Ausdruck Gipfeln in splenocyten zeigen und Milz Immunzellen um die hell-dunkel 8,9,23, Interphase 24 (ZT12), in der aktuellen Methode, Zellen isoliert und bei ZT13 um eine größere Chance, bei der Erkennung einer Verringerung dieser Gene in Frage gestellt wurden. Im Gegensatz dazu würde ein PAMP, die Uhr Ausdruck erhöhen könnte wahrscheinlich beobachtet werden wenn sich eine Tageszeit wann Uhr Ausdruck auf dem niedrigsten Stand ist.
Da Mäuse nachtaktive Tiere sind, ist ihre Ruhephase während der lichtperiode, die menschliche Tätigkeit entspricht. Daher werden im Idealfall Mäuse untergebracht werden, in einem Raum mit minimalem Verkehr und eine, die eine weißes Rauschen Maschine enthält, um tagsüber Störungen zu reduzieren, da dies den Tagesrhythmus der Mäuse stören könnten. Darüber hinaus sollte Käfig Änderungen rechtzeitig vor dem Experiment Datum erfolgen. Jede Arbeit in den tierraum (einschließlich Euthanasie der Tiere) während der dunklen Periode sollte unter Rotlicht um nicht zu stören die Rhythmen der Mäuse durchgeführt werden.
Tagaktive Rhythmen unterliegen Reize aus der Umwelt (z. B. Licht oder Lebensmittel), die Zeitgeber bezeichnet werden. Bei einem 12 h Licht/12 h Dunkel-Zyklus, der Zeitgeber (z.B. Licht) setzt die Uhr auf einen 24-Stunden-Zeitraum. Während die meisten tagaktive Rhythmen circadiane sind (d.h., Tagesrhythmus, die in Ermangelung von einem externen Cue auftreten), sie sind nicht wahr zirkadianen Rhythmen, bis sie gezeigt haben, mit einem ungefähren 24-Stunden-Zeitraum unter Konstanten Umweltbedingungen zu schwingen . Daher konnte dieses Verfahren mit Hilfe von Mäusen unter konstanten Bedingungen, die Schleppmittel Mäuse, Hell-Dunkel-Zyklus mit sich bringen würde, wie oben beschrieben, aber dann hielt die Tiere in ständiger Dunkelheit für 3 Tage vor der Probennahme durchgeführt werden. Diese Art von Experiment bezeichnet man ein dunkel-dunkel (DD) experimentieren und der Zeitpunkt der Probenahme würde als CT (circadiane Zeit) nicht ZT bezeichnet werden.
Während diese Methode PAMPs, die Clock-gen-Expression in splenocyten zu ändern identifizieren kann, dauert es nicht zu berücksichtigen wie dieser PAMPs Hauptuhr oder peripheren Uhren im ganzen Körper beeinflussen. Da die Milz eine heterogene Bevölkerung der Zellen zusammengesetzt ist, könnte einzelne PAMPs jeden Zelltyp unterschiedlich auswirken. Beispielsweise unterscheiden sich Tlr9 Ausdruck Rhythmen in der Maus Milz zwischen DCs15, splenocyten, Makrophagen und B-Zellen. Darüber hinaus Tlr1, Tlr7, Tlr3und Tlr4, Tlr6und Tlr8 wichtige tägliche Schwingungen in einer festhaftenden Splenocyte Bevölkerung angezeigt aber nur Tlr2 und Tlr6 erleben Sie täglich Schwingungen in angereicherten Milz Makrophagen24. Daher, um das Ergebnis von einem Foulspiel an einzelnen Zelltypen zu untersuchen, Zellen isoliert werden konnte über magnetischen Zellsortierung, wie zuvor9,15 beschrieben und dann anschließend in Frage gestellt. Darüber hinaus schwankt die Milz Zellpopulation über die täglichen Zyklus, der auch eine Rolle in der Empfindlichkeit zu einer bestimmten PAMP und weiteren Auswirkungen auf die Uhr8spielen könnte.
Diese Methode ermöglicht die Isolation einer großen Anzahl von Immunzellen, die überwiegend der B Zellen (~ 58 %), T Zellen (~ 21 %), Dendritische Zellen (~ 5 %) und Makrophagen (~ 4 %)25bestehen. Die große Anzahl von Zellen bietet die Möglichkeit, splenocyten mit einer Vielzahl von PAMPs in einem einzigen Experiment herauszufordern. Das Splenocyte-Isolierung-Verfahren ist sehr einfach durchzuführen, können Sie innerhalb von Minuten (abhängig von der Anzahl der Tiere) und mit minimalen Tier- oder zelluläre Manipulation, was wesentlich ist bei der Untersuchung der molekularen Uhr weil abgeschlossen werden wie bereits erwähnt, Diese Maßnahmen können das Timing der Uhr sowie Uhr gesteuert Gene stören. Die Ergebnisse dieses Verfahrens wurden sehr reproduzierbar, wie Bedeutung zwischen herausgefordert und unangefochtene Zellen wurde mit nur drei Tiere erreicht und die Ergebnisse stimmten mit zuvor veröffentlichte Arbeit23 (Abbildung 1). Es sei darauf hingewiesen, dass die Zahl der Tiere pro Gruppe statistisch signifikante Unterschiede zwischen einem Challenge-Gruppe und Kontrolle (z. B. ODN 1826 und Rev-Erbα) offenbart haben könnte.
Voran, während dieses Protokoll nur die akuten Wirkungen auf die Uhr Genexpression nach PAMP Herausforderung anspricht, kann es grundsätzlich zur weiteren Untersuchung nachweisen. Beispielsweise könnte dieser Assay als Modell verwendet werden, um zu entschlüsseln, die molekularen Mechanismen über TLR - PAMP Interaktion und wie es die molekulare Uhr beeinflusst. Es könnte auch verwendet werden, um die Länge der Zeit zu bestimmen, was man für die molekulare Uhr braucht, nach einem Zweikampf PAMP, die ermittelt werden konnte, durch die Durchführung eines Experiments Zeitverlauf (d. h. Beurteilung Ausdruck nach unterschiedliche Zeiten Herausforderung post) zu erholen. Wie oben erwähnt, können nachfolgende Experimente durchgeführt werden, um PAMP Herausforderung auf bestimmte Splenocyte-Zell-Populationen zu untersuchen. Da mehrere Erreger mehrere TLRs auf Infektion fördern, wäre es interessant, dieses Protokoll zu verwenden, um zu untersuchen, ob anspruchsvolle mit mehreren PAMPs einen synergistischen Effekt auf die Genexpression der Uhr haben.
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Disclosures
Der Autor hat nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Fakultät Forschung aus der College of Arts and Sciences Dean Büro an der University of Hartford gewährt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Frosted slides | Fisher | 12-550-343 | |
| Cell strainers | Fisher | 22363547 | |
| Lipopolysaccharide | InvivoGen | ltrl-eklps | |
| ODN1826 | InvivoGen | Tlrl-1826-1 | |
| HKLM | InvivoGen | Tlrl-hklm | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| PBS | Gibco | 20012-043 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 or 74106 | |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| 6-well cell culture plate | Denville | T1006 | |
| 50 mL tubes | Corning | 352070 | |
| 15 mL tubes | Corning | 352097 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher | 4368814 | |
| TaqMan Gene Expression Assays b-actin | ThermoFisher | Mm00607939_s1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Per2 | ThermoFisher | Mm00478113_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Rev-erba | ThermoFisher | Mm00520708_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Bmal1 | ThermoFisher | Mm00500226_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Dbp | ThermoFisher | Mm00497539_m1 | |
| qPCR machine StepOnePlus | ThermoFisher | ||
| TaqMan Gene Expression Master Mix | ThermoFisher | 4369016 | |
| MicroAmp Fast 96-well reaction plate (0.1 mL) | ThermoFisher | 4346907 | |
| Statistical Analysis Software | Prism 7.0a |
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